專利名稱：觀察工具及使用該工具的觀察方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及物體的觀察技術(shù)，特別是涉及細(xì)胞等透明的微小物體的觀察技術(shù)。
背景技術(shù)：
以前，觀察細(xì)胞等微小物體時(shí)，使用透射觀察顯微鏡。而且，為了以高對(duì)比度觀察無(wú)染色的活細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和形態(tài)，需要使用相位差顯微鏡、無(wú)輸出相位差顯微鏡、微分干涉顯微鏡、偏振光顯微鏡等，這些顯微鏡具備有相位差環(huán)的特殊聚光器或微分干涉棱鏡等，并具有特殊透鏡。
具體的，作為顯微鏡觀察培養(yǎng)液中的細(xì)胞等透明的微小物體的方法，廣泛采用以相位差法、偏斜照明法、微分干涉法等為代表的特殊觀察法(參閱特開平7-225341號(hào)公報(bào)等)。特殊觀察法的光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)如圖16所示，一般的透射清晰視場(chǎng)觀察的結(jié)構(gòu)由以下構(gòu)成光源713，用于產(chǎn)生照明光；瞄準(zhǔn)透鏡741，用于使由光源713發(fā)出的照明光的方向一致；反射鏡742，用于使前進(jìn)方向一致的照明光的前進(jìn)方向偏向垂直方向；窗口透鏡743，用于集聚照明光線；聚光鏡頭744，用于對(duì)含有觀察物體的樣本708照射已聚集的照明光；物鏡706，用于擴(kuò)大投影樣本708；成像透鏡746，用于將樣本708的像成像于成像面745上；載物臺(tái)717，用于調(diào)整樣本708的觀察位置。對(duì)于該結(jié)構(gòu)，在聚光透鏡744的入射孔位置添加照明調(diào)制元件747，在物鏡706的射出孔位置添加成像調(diào)制元件748。在照明調(diào)制元件747上使用環(huán)形隙縫、在成像調(diào)制元件748上使用相位板的是相位差法，在照明調(diào)制元件上使用偏心孔徑的是偏斜照射法，在照明調(diào)制元件747和成像照明元件748上使用偏光板和微分干涉棱鏡的是微分干涉法。通過(guò)使用特殊觀察法，如果和周圍的媒質(zhì)的折射率不同，即使是透明物體也能以明暗的對(duì)比度進(jìn)行觀察。這樣特殊的觀察方法，對(duì)本來(lái)透明的、以原來(lái)狀態(tài)難以看見的生物體組織以良好的對(duì)比度進(jìn)行觀察中特別有效。

發(fā)明內(nèi)容
但是，在這些特殊的觀察方法中，必須在上述的聚光透鏡744或者物鏡706的孔位置配置特殊的調(diào)制元件。這些特殊的調(diào)制元件價(jià)格非常高，并且產(chǎn)生例如物鏡706的倍率改變時(shí)該調(diào)制元件也需要改變的問(wèn)題等，在使用上有很多不便。
本發(fā)明是鑒于上述情況進(jìn)行的，本發(fā)明的目的在于提供一種技術(shù)，不使用觀察透明微小物體時(shí)的特殊觀察法需要的特殊調(diào)制元件，并且能夠簡(jiǎn)單地進(jìn)行觀察。
本發(fā)明的觀察工具是具備有反射面的觀察目標(biāo)收存部的觀察工具。另外，該觀察工具是通過(guò)具有物鏡的光學(xué)系統(tǒng)由反射照明光照明、對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的觀察方法中使用的觀察目標(biāo)收存用的觀察工具，設(shè)置了觀察時(shí)反射上述反射照明光的反射面。
上述反射面可以設(shè)置在觀察時(shí)與上述物鏡對(duì)置的面，也可以設(shè)置在與上述物鏡對(duì)置的面的相反面。
另外，也可以形成上述觀察目標(biāo)經(jīng)過(guò)的流徑。另外，收存上述觀察目標(biāo)的收存部也可以具備注入含有觀察目標(biāo)的口和使其流出的口。
另外，本發(fā)明的觀察方法的特征在于它是通過(guò)具有物鏡的光學(xué)系統(tǒng)由反射照明光照明對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的方法，在收存上述觀察目標(biāo)的觀察工具中設(shè)置觀察時(shí)反射上述反射照明光的反射面，在上述觀察工具中收存觀察目標(biāo)，并對(duì)上述觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察。
上述反射面可以設(shè)置在觀察時(shí)與上述物鏡對(duì)置的面上，也可以設(shè)置在與上述物鏡對(duì)置的面的相反面上。
另外，上述觀察目標(biāo)也可以是微小透明體。
另外，上述觀察工具具有能夠保持液體的容器，上述容器也可以同時(shí)收存含有觀察對(duì)象的液體。在此，上述觀察目標(biāo)也可以是細(xì)胞，上述液體也可以是培養(yǎng)液。
另外，也可以在上述觀察工具中收存上述觀察目標(biāo)，以使上述觀察目標(biāo)和上述反射面的距離為上述光學(xué)系統(tǒng)的焦點(diǎn)深度的一半以下。
具體的，也可以在上述觀察工具中收存上述觀察目標(biāo)，以使上述觀察目標(biāo)和上述反射面的距離d滿足以下公式(1)。
d≤W/(2NA2)…(1)(式中d表示觀察目標(biāo)和反射面的距離，W表示所用光的波長(zhǎng)，NA表示光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑。)進(jìn)而，也可以在上述的觀察工具中收納上述觀察目標(biāo)，以使與上述觀察目標(biāo)相對(duì)的照明光的數(shù)值孔徑比物鏡的數(shù)值孔徑小。
具體的，也可以在上述觀察工具中收納上述觀察目標(biāo)，以使上述觀察目標(biāo)和上述反射面之間的距離d滿足以下公式(2)。
d＞F/(4tan(sin-1NA))…(2)(式中d表示觀察目標(biāo)和反射面之間的距離，F(xiàn)表示光學(xué)系統(tǒng)的視場(chǎng)直徑，NA表示光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑。)若按照本發(fā)明，不用特殊的光學(xué)單元就能夠以良好的對(duì)比度觀察細(xì)胞等透明的微小物體。
即，使用本發(fā)明的細(xì)胞觀察工具，利用普通的光學(xué)顯微鏡或者使用普通的透鏡和CCD攝像機(jī)的監(jiān)控器，能夠?qū)?xì)胞、例如嗜中性白血球、嗜酸性白血球、嗜堿性白血球、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴球等血液細(xì)胞或其它的動(dòng)物細(xì)胞，或者植物的原生質(zhì)體等甚至含有的顆粒成分的清晰的像，從而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，不需要使用現(xiàn)有技術(shù)的如相位差顯微鏡的特殊的裝置。


圖1(A)～(C)是涉及第一實(shí)施方式的觀察工具的剖面圖。
圖2(A)(B)是具有包含反射面的結(jié)構(gòu)體40的觀察工具的剖面圖。
圖3(A1)～(C)是具有覆蓋收存部的蓋的觀察工具的剖面圖。
圖4是涉及第一實(shí)施方式的觀察工具的其它使用的例，(A)是在覆蓋玻璃上承載結(jié)構(gòu)體1時(shí)的剖面圖。(B)是顯示設(shè)置能讓液體通過(guò)的孔時(shí)的概略圖的剖面圖。(C)是(B)的觀察工具的斜視圖。
圖5是在收存部刻上刻度的觀察工具的一例的上視圖。
圖6(A)是整體作成管型的觀察工具的剖面圖。(B)是(A)的虛線AB方向的剖面圖。
圖7是顯示第二實(shí)施方式的觀察裝置的結(jié)構(gòu)的圖形。
圖8是顯示本發(fā)明的觀察法的光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)的圖形。
圖9是顯示培養(yǎng)皿和培養(yǎng)細(xì)胞的圖形。
圖10是顯示本發(fā)明的物體的對(duì)比度獲取方法的圖形。
圖11(a)是顯示在第二實(shí)施方式中的成像模擬的計(jì)算模型的圖形。圖11(b)及(c)是表示成像模擬的計(jì)算結(jié)果的圖形。
圖12(a)是表示第二實(shí)施方式中的成像模擬計(jì)算模型的圖形。圖12(b)～(f)是顯示細(xì)胞302和反射鏡涂層307的距離為1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm以及1.8μm時(shí)成像模擬的計(jì)算結(jié)果的圖形。
圖13是顯示反射面引起的照明光的數(shù)值孔徑的降低的圖形。
圖14(a)是顯示用于照明光的數(shù)值孔徑比物鏡的數(shù)值孔徑小時(shí)的物體像的模擬例的計(jì)算模型的圖形。圖14(b)～(f)時(shí)顯示照明光的數(shù)值孔徑為物鏡鏡頭的數(shù)值孔徑的100％、80％、60％、40％以及20％時(shí)的成像模擬的計(jì)算結(jié)果的圖形。
圖15是表示第三實(shí)施方式的微小流徑觀察裝置的結(jié)構(gòu)的圖形。
圖16是顯示現(xiàn)有的特殊觀察法的光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)的圖形。
圖17是顯示現(xiàn)有的透射觀察顯微鏡的物體的對(duì)比度的獲取方法的圖形。
圖18是使用圖3(A2)所示的觀察工具觀察嗜酸性白血球時(shí)所照的照片。
具體實(shí)施例方式
下面，參照

本發(fā)明的一實(shí)施方式。首先，說(shuō)明涉及應(yīng)用本發(fā)明的第一實(shí)施方式的觀察工具。
本發(fā)明的觀察工具是用于使用顯微鏡以反射光觀察乃至檢測(cè)細(xì)胞等的工具，具有收存細(xì)胞等的部分，即觀察目標(biāo)收存部。并且，至少具有反射該觀察工具進(jìn)行觀察的波長(zhǎng)區(qū)域的光的面，即形成反射面的面。
圖1～圖6中顯示涉及本發(fā)明的觀察工具結(jié)構(gòu)的一例。并且，在圖中，箭頭X表示通過(guò)物鏡由X方向?qū)τ^察目標(biāo)進(jìn)行觀察。
圖1(A)所示的觀察工具中，1是由玻璃、合成樹脂、金屬、硅等構(gòu)成的結(jié)構(gòu)體，2是收存細(xì)胞等的觀察目標(biāo)的槽。在收存部2的底面3設(shè)置反射觀察的波長(zhǎng)區(qū)域的光的反射鏡。作為構(gòu)成反射面的反射鏡，例如有對(duì)玻璃、合成樹脂、金屬等進(jìn)行鍍銀或者鍍鉻等的金屬電鍍，或者粘結(jié)金屬箔而形成反射鏡面。另外，例如有金屬、硅晶片等的、其自身可以加工成鏡面的物質(zhì)來(lái)構(gòu)成結(jié)構(gòu)體1、在設(shè)置槽的加工時(shí)，底面就直接形成反射鏡、設(shè)置槽后，對(duì)槽的底面進(jìn)行反射鏡加工等。在此，如果至少底面3是反射鏡就可以，結(jié)構(gòu)體的表面全部都是反射鏡也可以。
以硅晶片構(gòu)成圖1(A)的結(jié)構(gòu)體1時(shí)，例如通過(guò)機(jī)械研磨、化學(xué)蝕刻等常用方法加工硅晶片，可以通過(guò)形成收存細(xì)胞的槽進(jìn)行制作。例如，圖1(A)的情況，反射鏡3通過(guò)使硅晶片的底面呈鏡面狀態(tài)而形成。進(jìn)而，通過(guò)上述槽的形成工序不能充分呈現(xiàn)鏡面狀態(tài)時(shí)，根據(jù)需要，也可以進(jìn)一步進(jìn)行使槽的底面形成鏡面的加工。
尺寸的大小為在普通的顯微鏡上能使用的尺寸就可以。例如為詳細(xì)觀察細(xì)胞的顆粒結(jié)構(gòu)，收存部的深度，最好是細(xì)胞大致排列一層的深度。例如，收存部深度為1～100μm、圓形的情況下直徑為1～5mm就足夠，但是并不限于此，可以按照需要選擇適宜的尺寸。
另外，作為結(jié)構(gòu)體1的材質(zhì)，其自身通過(guò)可能的鏡面(反射面)加工、電鍍等也可以形成反射面。可以使用例如，玻璃、石英等無(wú)機(jī)化合物；聚苯乙烯、合成樹脂、聚丙烯、聚乙烯、氯乙烯、聚苯基醚、聚苯撐硫等塑膠；不銹鋼、鋁、青銅等金屬或合金；陶瓷等非金屬無(wú)機(jī)材料。
圖1(B)所示的觀察工具以例如玻璃、塑膠等構(gòu)成結(jié)構(gòu)體1、設(shè)置收存部2。進(jìn)而，在收存部2的底部4形成表面平滑并且高反射率的材料的反射層。例如，粘結(jié)硅晶片的箔或膜、鍍銀等。
圖1(C)所示的觀察工具的特征在于在與物鏡對(duì)置的面的相反面41上設(shè)置反射面。結(jié)構(gòu)體1由透過(guò)觀察的波長(zhǎng)區(qū)域的光的材質(zhì)構(gòu)成。例如，由玻璃、石英等無(wú)機(jī)化合物、聚苯乙烯、合成樹脂、聚丙烯、聚乙烯、氯乙烯、聚苯基醚、聚苯撐硫等塑膠等構(gòu)成。按照該觀察工具，即使在清洗收存部時(shí)等也不能損傷到反射面，反射面的維護(hù)容易。
結(jié)合結(jié)構(gòu)體1的材質(zhì)，通過(guò)進(jìn)行電鍍加工可以形成反射面41。電鍍例如是可使表面平滑并且反射率高的材料、如銀等金屬的電鍍。
圖2(A)所示的觀察工具在透過(guò)光的結(jié)構(gòu)體1和結(jié)構(gòu)體40之間設(shè)置反射面。該觀察工具通過(guò)在結(jié)構(gòu)體1的收存部2的相反面粘上形成反射面的結(jié)構(gòu)體40來(lái)制作。該觀察工具制作容易，因?yàn)槭欠謩e對(duì)結(jié)構(gòu)體1和結(jié)構(gòu)體40進(jìn)行加工、最后使其結(jié)合制作的。結(jié)構(gòu)體1和結(jié)構(gòu)體40也可以用例如香脂、光硬化型合成樹脂粘結(jié)劑等的光學(xué)粘結(jié)劑粘結(jié)。另外，不使用粘結(jié)劑等，觀察時(shí)也可以將結(jié)構(gòu)體1和結(jié)構(gòu)體40重疊起來(lái)使用。重疊起來(lái)使用時(shí)，將結(jié)構(gòu)體1和結(jié)構(gòu)體40重疊起來(lái)、用夾子等固定工具扶持固定來(lái)使用。
圖2(B)所示的觀察工具與圖2(A)所示的觀察工具類似，但在以下點(diǎn)上不同透過(guò)光的結(jié)構(gòu)體40的、與物鏡對(duì)置的面的相反面43上設(shè)置反射面。結(jié)構(gòu)體1由透過(guò)光的材質(zhì)構(gòu)成。根據(jù)該觀察工具，通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)體40的厚度，能夠容易地對(duì)觀察目標(biāo)的位置與反射面的距離進(jìn)行調(diào)節(jié)。
為將本實(shí)施方式的觀察工具用于細(xì)胞的觀察，將培養(yǎng)液與細(xì)胞一同放入收存部，如圖3(A1)所示，以覆蓋玻璃(圖3的5)覆蓋，在物鏡中使用導(dǎo)入可見光的照明裝置，以普通的顯微鏡觀察乃至檢測(cè)，或者使用與物鏡結(jié)合的CCD攝像機(jī)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。作為導(dǎo)入光的照明裝置，可以使用例如作為一般照明裝置的市場(chǎng)上出售的日本光學(xué)制造“尼康EPI-U”等。
另外，圖3(A1)中示出在結(jié)構(gòu)體1的上部設(shè)置覆蓋玻璃5的情況，但是，如圖3(A2)所示，也可以使用使整體上下順序相反、由下方進(jìn)行觀察的的使用方法。
另外，也可以是如圖3(B)(C)的觀察工具。圖3(B)的觀察工具如以下構(gòu)成將觀察目標(biāo)放入收存部2的槽中后，以結(jié)構(gòu)體40覆蓋收存部2，結(jié)構(gòu)體40在與物鏡對(duì)置的面44上具有反射面。
另外，圖3(C)的細(xì)胞觀察工具在透過(guò)光的結(jié)構(gòu)體40的、與物鏡對(duì)置的面的相反面45上設(shè)置反射面。按照該觀察工具，通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)體40的厚度，能夠容易地改變觀察目標(biāo)的位置與反射面的距離。
另外，本實(shí)施方式的觀察工具，如圖4(A)所示，可以設(shè)置注入觀察目標(biāo)的注入口6、在覆蓋玻璃5上承載結(jié)構(gòu)體1來(lái)使用。此時(shí)由下方進(jìn)行觀察。例如，能夠由注入口6同時(shí)注入細(xì)胞和培養(yǎng)液，觀察操作簡(jiǎn)便。
另外，使用本實(shí)施方式的觀察工具進(jìn)行觀察時(shí)，觀察目標(biāo)、例如細(xì)胞，不需要與玻璃面粘結(jié)，也能夠觀察浮游狀態(tài)、例如在液體中處于流動(dòng)狀態(tài)的細(xì)胞。即，如圖4(B)(C)所示，為使液體能夠通過(guò)到結(jié)構(gòu)體1，設(shè)置孔7、8，由一個(gè)孔流入含有細(xì)胞的液體，也能夠觀察流動(dòng)中的細(xì)胞的狀態(tài)。為此目的，如圖6所示，也可以在具有細(xì)胞收存部9的透明的管12的內(nèi)壁11上形成反射面。
上述說(shuō)明的觀察工具根據(jù)需要，如圖5所示，在收存部上刻上刻度，能夠進(jìn)行細(xì)胞等的計(jì)算。即使此種情況，根據(jù)本實(shí)施方式的觀察工具能夠以好的對(duì)比度觀察微小透明物體，所以計(jì)算容易。
使用本實(shí)施方式的細(xì)胞觀察工具時(shí)，使用普通的光學(xué)顯微鏡通過(guò)肉眼進(jìn)行觀察時(shí)、或者通過(guò)使用普通的透鏡和CCD攝像機(jī)的監(jiān)控器進(jìn)行觀察時(shí)，能夠?qū)?xì)胞、例如嗜中性白血球、嗜酸性白血球、嗜堿性白血球、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴球等血液細(xì)胞或其它的動(dòng)物細(xì)胞，或者植物的原生質(zhì)體等甚至含有的顆粒成分的清晰的像，從而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，不需要使用現(xiàn)有技術(shù)的如相位差顯微鏡的特殊的裝置。
其次，作為應(yīng)用本發(fā)明的第二實(shí)施方式，對(duì)使用了上述中說(shuō)明的細(xì)胞觀察工具的觀察方法進(jìn)行更加詳細(xì)的說(shuō)明。
本發(fā)明的觀察方法的特征在于能夠以良好的對(duì)比度對(duì)細(xì)胞等微小透明物體進(jìn)行觀察。在此，說(shuō)明涉及本發(fā)明的觀察方法前，簡(jiǎn)單地說(shuō)明關(guān)于通過(guò)本發(fā)明的觀察方法能夠以良好的對(duì)比度觀察微小透明物體的原理。
在現(xiàn)有的透射觀察顯微鏡中觀察目標(biāo)像的對(duì)比度的獲取方法如圖17所示。即，照明光入射波陣面103透過(guò)媒質(zhì)101中的觀察目標(biāo)102時(shí)，由于媒質(zhì)101和物體102的折射率不同，射出觀察目標(biāo)的射出波陣面104遭受變形。射出波陣面的微小要素105沿垂直于各自波陣面的方向前進(jìn)。因此，遭受變形的射出波陣面的微小要素105沿與入射波陣面104前進(jìn)方向不同的方向前進(jìn)。物鏡106以由數(shù)值孔徑表示的某一定角度范圍的波陣面形成物體的像。通過(guò)觀察目標(biāo)102的周邊部分等遭受很強(qiáng)變形的射出波陣面的微小要素105的一部分脫離以物鏡106的數(shù)值孔徑表示的角度范圍前進(jìn)時(shí)，在像的一部分中產(chǎn)生陰影，觀察目標(biāo)102隨對(duì)比度而成像。但是，例如培養(yǎng)液中的細(xì)胞等，物體102和媒質(zhì)101的折射率幾乎沒(méi)有差時(shí)，遭受變形的射出波陣面的微小要素105也在以物鏡106的數(shù)值孔徑表示的角度范圍內(nèi)前進(jìn)，所以物體像中幾乎沒(méi)有明暗的對(duì)比度。因此，以普通的透射觀察顯微鏡難以觀察培養(yǎng)液中細(xì)胞的像。
與此相對(duì)，本發(fā)明的觀察方法中，觀察目標(biāo)的像的對(duì)比度的獲取方法如圖10所示。即，通過(guò)以反射照明觀察貼近反射面207的物體202，入射波陣面203透過(guò)觀察目標(biāo)202一次后由反射面207反射，進(jìn)而再一次透過(guò)觀察目標(biāo)202。通過(guò)入射波陣面203兩次透過(guò)觀察目標(biāo)202而形成的入射波陣面204遭受到現(xiàn)有的透射觀察顯微鏡情況下的兩倍的變形。在現(xiàn)有的透射觀察顯微鏡中，射出波陣面的微小要素205的一部分在以物鏡206的數(shù)值孔徑表示的角度范圍內(nèi)前進(jìn)，但是如果按照本發(fā)明的觀察方法，可以脫離該范圍前進(jìn)，所以在觀察目標(biāo)的像上形成陰影。因此，與現(xiàn)有的透射觀察顯微鏡相比容易得到像中明暗的對(duì)比度。并且，即使是以普通的透射觀察顯微鏡難以觀察的培養(yǎng)液中的細(xì)胞，也可能以良好的對(duì)比度清晰地進(jìn)行觀察。
以下，參照附圖對(duì)本發(fā)明的第二實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。
圖7是應(yīng)用本發(fā)明的一實(shí)施方式的觀察裝置的概略圖。如圖所示，本實(shí)施方式的觀察裝置具有反射觀察顯微鏡311和在底面使用了反射鏡涂層307的培養(yǎng)皿312。
反射觀察顯微鏡311由以下構(gòu)成鏡筒315、載物臺(tái)317、光源部313、反射照明管314和物鏡306，以及一起支撐這些的鏡基座316。載物臺(tái)317能夠在其上面設(shè)置培養(yǎng)皿312。載物臺(tái)317與鏡基座316相連接，通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)對(duì)焦柄318可以在上下方向上移動(dòng)。
圖8中，示出反射觀察顯微鏡311的光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。如圖8所示，光學(xué)系統(tǒng)由以下構(gòu)成光源813，用于產(chǎn)生照明光；校準(zhǔn)透鏡841，用于使由光源813發(fā)出的照明光的前進(jìn)方向一致；半透鏡842，用于使前進(jìn)方向一致了的照明光的前進(jìn)方向偏向垂直方向；物鏡806，用于將照明光聚集在含有觀察物體的標(biāo)本808上，同時(shí)擴(kuò)大投影標(biāo)本808；成像透鏡846，用于使標(biāo)本808的像成在在成像板上；反射鏡849，具有反射面807，該反射面反射透過(guò)標(biāo)本808一次的照明光使其返回。
成像透鏡846放置在鏡筒315中。光源813放置在光源部313中，校準(zhǔn)透鏡841及半透鏡842放置在反射照明管314中。
使用如以上構(gòu)成的觀察裝置觀察目標(biāo)時(shí)，如以下所示。
如圖9所示，將培養(yǎng)液301與觀察目標(biāo)(例如細(xì)胞302)同時(shí)放入觀察工具的收存部。將培養(yǎng)皿設(shè)置于載物臺(tái)317上面。適當(dāng)調(diào)節(jié)來(lái)自光源313的照明光的亮度。通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)對(duì)焦柄318在上下方向上移動(dòng)載物臺(tái)317，對(duì)焦并進(jìn)行觀察。
在本實(shí)施方式的觀察方法中，觀察目標(biāo)和上述反射面的距離d最好滿足下述公式(1)。
d≤W/(2NA2)…(1)(式中d表示觀察目標(biāo)和反射面的距離，W表示觀察中所用光的波長(zhǎng)，NA表示光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑。)觀察目標(biāo)和反射面的距離d能夠通過(guò)調(diào)節(jié)媒質(zhì)的密度來(lái)調(diào)整。例如，如果觀察目標(biāo)比媒質(zhì)密度高，觀察目標(biāo)通過(guò)重力作用自動(dòng)地沉淀于培養(yǎng)皿312的底部，接近在此處的反射面。
進(jìn)而，通過(guò)滿足上述公式，對(duì)能夠以良好的對(duì)比度進(jìn)行觀察的的原理作如下說(shuō)明。滿足上述公式時(shí)，在觀察的光學(xué)系統(tǒng)的焦點(diǎn)深度的約一半以內(nèi)的距離、接近反射面設(shè)置觀察目標(biāo)。并且，透過(guò)觀察目標(biāo)一次的入射波陣面，大致不變形，再一次通過(guò)觀察目標(biāo)。由此，特別在觀察目標(biāo)的一端射出波陣面清晰地彎折。因此，能夠以良好地對(duì)比度對(duì)觀察目標(biāo)的像進(jìn)行觀察。下面，以模型進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。
圖11示出使用以下計(jì)算模型時(shí)的進(jìn)行成像模擬的結(jié)果該計(jì)算模型將細(xì)胞302作為直徑4μm、高度2μm的旋轉(zhuǎn)橢圓體，將細(xì)胞302的折射率定為1.4，培養(yǎng)液301的折射率定為1.33。另外，圖11是成像的略圖。在此，521是中心線，522是中心線上的強(qiáng)度分布，523是細(xì)胞302的成像。觀察中使用的光的波長(zhǎng)為550nm。在本模擬中，反射照明光往復(fù)兩次透過(guò)細(xì)胞302，因此，能夠按照?qǐng)D11(b)所示，以明暗清晰的對(duì)比度觀察細(xì)胞302的輪廓。另一方面，通過(guò)現(xiàn)有的透過(guò)觀察方法對(duì)相同條件的細(xì)胞302進(jìn)行觀察時(shí)，進(jìn)行成像模擬的結(jié)果如圖11(c)所示，細(xì)胞302的輪廓不清晰。
但是，細(xì)胞302和反射鏡涂層307的距離拉大時(shí)，細(xì)胞像的對(duì)比度下降。在本實(shí)施例中的觀察光學(xué)系統(tǒng)的焦點(diǎn)深度Δ由以下的公式求得。
Δ＝W/NA2＝0.55μm/0.452＝2.7μm(式中W表示使用光的波長(zhǎng)，NA表示反射觀察顯微鏡311中安裝的物鏡306的數(shù)值孔徑。)即，焦點(diǎn)深度Δ的一半約為1.4μm。圖12(b)～(f)中示出使用以下計(jì)算模型的成像模擬的結(jié)果該計(jì)算模型如圖12(a)所示，改變細(xì)胞302和反射鏡涂層307之間的距離。距離d分別為(b)1μm、(c)1.2μm、(d)1.4μm、(e)1.6μm、(f)1.8μm。如圖所示，隨著距離d由1μm開始增加，細(xì)胞302的輪廓的對(duì)比度降低，距離d超過(guò)1.4μm時(shí)幾乎就不能看見。
由上述可知細(xì)胞302與反射鏡涂層307的間隔最好為焦點(diǎn)深度Δ的約一半以下。
另外，在本實(shí)施方式的一例中，觀察目標(biāo)與反射面的距離d最好滿足以下的公式(2)。
d＞F/(4tan(sin-1NA))…(2)(式中d表示觀察目標(biāo)與反射面的距離，F(xiàn)表示對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的光學(xué)系統(tǒng)的視場(chǎng)直徑，NA表示對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑。)使用圖3(A2)所示的觀察工具時(shí)，由于重力觀察目標(biāo)位于覆蓋玻璃5上，因此通過(guò)加工調(diào)節(jié)收存部2的槽的深度a，能夠調(diào)節(jié)觀察目標(biāo)和反射面的距離d。
另外，圖1(c)的觀察工具等情況，通過(guò)加工調(diào)節(jié)收存部槽的深度，從而調(diào)節(jié)槽的底面與反射面的距離，所以能夠調(diào)節(jié)觀察目標(biāo)與反射面的距離。圖2(B)的觀察工具等的情況，通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)體40的厚度能夠調(diào)節(jié)觀察目標(biāo)和反射面的距離。
另外，觀察目標(biāo)和反射面的距離d可以通過(guò)調(diào)節(jié)媒質(zhì)的密度進(jìn)行調(diào)整。例如，如果觀察目標(biāo)比媒質(zhì)密度小，觀察目標(biāo)自動(dòng)地由培養(yǎng)皿312的底部離開，與在該處的反射面相距一定的距離。
另外，由于滿足上述計(jì)算公式2，對(duì)能夠以良好的對(duì)比度進(jìn)行觀察的原理進(jìn)行如下說(shuō)明。滿足上述計(jì)算公式2時(shí)，反射面在某種程度上遠(yuǎn)離觀察目標(biāo)。實(shí)際上照明光的數(shù)值孔徑降低。所以，能夠以良好的對(duì)比度觀察物體。
更具體的，考慮以下情況如圖13所示，在物鏡1006的焦點(diǎn)位置處配置物體1002，與物體1002相距d的位置上配置具有反射面1007的反射鏡1049，以反射照明觀察物體1002。由物鏡1006直接照射物體1002附近的照射區(qū)域1009通過(guò)物鏡1006或者含由物鏡的光學(xué)系統(tǒng)的規(guī)格被直徑F限制。由物鏡1006射出、透過(guò)物體1002近旁一次、由反射面1007反射，再次照射物體的照明光通過(guò)反射面1007的鏡像作用，猶如照射區(qū)域1009的鏡像1009′成為光源面對(duì)物體1002進(jìn)行照射。此時(shí)，由物體1002來(lái)看的照射光的最大角度θi_max由下式給出。
tanθi_max＝F/(4d)…(3)因此，對(duì)于物體1002實(shí)質(zhì)的照射光的數(shù)值孔徑sinθi_max由公式sinθi_max＝sin(tan-1F/(4d))…(4)給出。這如果是比物鏡1006的數(shù)值孔徑NA小的條件NA＞sinθi_max…算式5即d＞F/(4tan(sin-1NA))…(2)，實(shí)質(zhì)照明光的數(shù)值孔徑就比物鏡的數(shù)值孔徑小，物體1002的觀察像的對(duì)比度得到提高。
照明光的數(shù)值孔徑比物鏡的數(shù)值孔徑小時(shí)，通過(guò)圖14對(duì)計(jì)算物體的觀察像對(duì)比度提高的狀況的模擬例進(jìn)行說(shuō)明。圖14(a)示出在培養(yǎng)液1101中的細(xì)胞1102的計(jì)算模型，細(xì)胞1102作為直徑5μm、厚度2μm的旋轉(zhuǎn)橢圓體。細(xì)胞的折射率定為1.4，培養(yǎng)液的折射率定為1.33。照明光的波長(zhǎng)定為550nm。物鏡的數(shù)值孔徑定為0.45。圖14(b)～(f)示出以下計(jì)算例照明光的數(shù)值孔徑為物鏡的數(shù)值孔徑的(b)100％、(c)80％、(d)60％、(e)40％、(f)20％?？芍S著照明光的數(shù)值孔徑變得比物鏡的數(shù)值孔徑小，物體像的對(duì)比度提高。
其次說(shuō)明作為應(yīng)用本發(fā)明的第三實(shí)施方式的微小流徑觀察裝置。第三實(shí)施方式的微小流徑觀察裝置以觀察目標(biāo)收存部為特征，適用于細(xì)胞的移動(dòng)的觀察。
觀察目標(biāo)收存部如圖15所示，具有微小流徑612。微小流徑612構(gòu)建在硅襯底631上。在本實(shí)施方式中，通過(guò)未圖示的倒立型反射照射顯微鏡由下方對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察。圖15中的606表示物鏡。
微小流徑612中設(shè)置一個(gè)入口632、3個(gè)出口633。入口632和出口633在微小流徑612內(nèi)部相連接。微小流徑612以如下方法制造使用半導(dǎo)體制造技術(shù)，在硅襯底上進(jìn)行由氧化硅634的圖形的形成，以玻璃板635作為蓋子來(lái)覆蓋該模型。
另外，氧化硅634的膜厚形成與細(xì)胞602大致相同的厚度。因此，細(xì)胞602通過(guò)微小流徑612時(shí)，細(xì)胞602處于幾乎與硅襯底表面607相接觸的狀態(tài)，所以能以良好的對(duì)比度觀察細(xì)胞602的輪廓。
進(jìn)而，形成與該微小流徑612的入口632連接、細(xì)胞滯留的部分，可以使微小流徑612中流動(dòng)的細(xì)胞602作暫時(shí)停留。此時(shí)，細(xì)胞滯留部分的硅襯底開一個(gè)深孔，由此，以該部分作為反射面進(jìn)行作用的硅襯底的表面遠(yuǎn)離玻璃板635。如上所作，在該細(xì)胞滯留部分中，實(shí)質(zhì)的照明光的數(shù)值孔徑降低，所以能夠以良好的對(duì)比度觀察位于細(xì)胞滯留部分中的細(xì)胞602。
另外，如圖所示，微小流徑612中安裝由電壓控制裝置650、可變電壓發(fā)生裝置660以及兩個(gè)電極665構(gòu)成的電場(chǎng)發(fā)生裝置。兩個(gè)電極665安裝在微小流徑612的側(cè)面，對(duì)微小流徑612側(cè)面施加電連接的可變電壓裝置660產(chǎn)生的電壓，因此使微小流徑內(nèi)部產(chǎn)生電場(chǎng)?？勺冸妷喊l(fā)生裝置660與電壓控制裝置電連接，基于利用未圖示的倒立型反射顯微鏡的細(xì)胞602的觀察方法，控制可變電壓發(fā)生裝置660產(chǎn)生的電壓，來(lái)分配細(xì)胞602的前進(jìn)方向向三個(gè)出口663中的哪一個(gè)方向去。多個(gè)細(xì)胞602由入口632順次流入微小流徑612內(nèi)，通過(guò)物鏡606進(jìn)行反射觀察。硅襯底的表面607作為反射面而使用，能夠以良好的對(duì)比度觀察微小流徑612內(nèi)的細(xì)胞602?；谠撚^察的信息，電場(chǎng)發(fā)生裝置變換微小流徑612內(nèi)的電場(chǎng)強(qiáng)度。由內(nèi)部的電場(chǎng)強(qiáng)度控制前進(jìn)方向，使微小流徑612內(nèi)的細(xì)胞602區(qū)分三個(gè)出口633放出。
這樣，如果使用本實(shí)施方式的微小流徑觀察裝置，作為細(xì)胞602的觀察單元使用了反射照明顯微鏡，能夠在硅襯底631上構(gòu)建微小流徑612。硅襯底631上的微小流徑由于能夠使用半導(dǎo)體制造技術(shù)，所以與現(xiàn)有的玻璃襯底上構(gòu)建微小流徑的情況相比，能夠以低價(jià)大量地生產(chǎn)。進(jìn)而，與現(xiàn)有的使用特殊顯微鏡的觀察方法相比，不需透射照明裝置，使保持微小流徑612的載物臺(tái)簡(jiǎn)化等，使觀察裝置整體小型化，同時(shí)低價(jià)構(gòu)建成為可能。
另外，在上述第三實(shí)施方式中，同第二實(shí)施方式中說(shuō)明的一樣，觀察目標(biāo)和反射面(鏡面)的距離滿足公式(1)及公式(2)為好。
以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行了說(shuō)明。
在上述實(shí)施方式中，能夠以良好的對(duì)比度對(duì)現(xiàn)有的非常難以觀察的微小透明物體進(jìn)行觀察。
另外，若按照上述實(shí)施方式，因?yàn)椴恍枰糜谕干湔彰鞯墓鈱W(xué)系統(tǒng)，所以具有可能謀求觀察裝置整體的小型化的優(yōu)點(diǎn)。另外，具有以下優(yōu)點(diǎn)即使物體移動(dòng)困難的情況，通過(guò)觀察裝置整體的移動(dòng)，能夠容易地調(diào)整物體觀察部位。
若按照上述實(shí)施方式，通過(guò)在容器內(nèi)設(shè)置反射面，能夠容易地實(shí)現(xiàn)物體接近反射面的狀態(tài)。另外，在玻璃器皿的底面設(shè)置反射鏡，在該玻璃器皿中注入含有觀察的物體的媒質(zhì)時(shí)，物質(zhì)如果比媒質(zhì)密度大，由于重力作用物質(zhì)自動(dòng)地沉淀到玻璃器皿地底部，接近于在該處的反射面。
另外，本發(fā)明并不限定于上述的實(shí)施方式，在該要點(diǎn)的范圍內(nèi)的各種變形都是可能的。
(實(shí)施例)圖18示出使用圖3(2A)所示的觀察工具、由下方觀察攝影細(xì)胞情況的照片。使用的觀察工具為結(jié)構(gòu)體1由硅晶片構(gòu)成，覆蓋玻璃5和反射面的距離a為5μm。另外，攝影條件如下。
攝影機(jī)器CCD數(shù)字影像攝像機(jī)CL-211H(Watec America Co.，Las Vegas，Nev)照射裝置EPI-U(Nikon Kawasaki，Japan)物鏡×20培養(yǎng)液使用RPMI1640緩沖液中加入20mM HEPES以及0.1％牛血清蛋白質(zhì)的培養(yǎng)液。
細(xì)胞嗜酸性白血球?qū)τ谌搜褐械念w粒白血球劃分，使用通過(guò)由抗CD16抗體結(jié)合的磁性塊的陰極選擇精選的嗜酸性白血球。另外，磁性塊中使用動(dòng)力學(xué)磁性粒子集中器(Dynal A.S.，Oslo，Norway)，按照產(chǎn)品所附的使用方法操作。
如圖18所示，可知，能夠以良好的對(duì)比度對(duì)微小透明物體、即酸性白血球以及細(xì)胞內(nèi)的顆粒進(jìn)行觀察。
權(quán)利要求
1.一種觀察工具，具備有反射鏡的觀察目標(biāo)收存部。
2.一種觀察工具，該觀察工具是通過(guò)具有物鏡的光學(xué)系統(tǒng)以反射照明光照明、對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的觀察方法中使用的觀察目標(biāo)收存部用的觀察工具，其特征在于設(shè)置一反射面，該反射面觀察時(shí)反射上述反射照明光。
3.如權(quán)利要求2中的觀察工具，其特征在于上述反射面設(shè)置在觀察時(shí)與物鏡對(duì)置的面。
4.如權(quán)利要求2中的觀察工具，其特征在于上述反射面設(shè)置在觀察時(shí)與物鏡對(duì)置的面的相反面。
5.如權(quán)利要求2～4中任意一項(xiàng)中的觀察工具，其特征在于設(shè)置上述觀察目標(biāo)通過(guò)的流徑。
6.如權(quán)利要求2～5中任意一項(xiàng)中的觀察工具，其特征在于收納上述觀察目標(biāo)的收存部具有注入含有觀察目標(biāo)的液體的口和流出含有觀察目標(biāo)的液體的口。
7.一種觀察方法，該觀察方法通過(guò)具有物鏡的光學(xué)系統(tǒng)由反射照明光照明、對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察，其特征在于在收納上述觀察目標(biāo)的觀察工具上設(shè)置觀察時(shí)反射上述反射照明光的反射面，上述觀察工具收納觀察目標(biāo)，并對(duì)上述觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察。
8.如權(quán)利要求7中的觀察方法，其特征在于上述反射面設(shè)置于觀察時(shí)與物鏡對(duì)置的面。
9.如權(quán)利要求7中的觀察方法，其特征在于上述反射面設(shè)置在觀察時(shí)與物鏡對(duì)置的面的相反面。
10.如權(quán)利要求7～9中的任意一項(xiàng)中的觀察方法，其特征在于上述觀察目標(biāo)是微小透明體。
11.如權(quán)利要求7～10中任意一項(xiàng)中的觀察方法，其特征在于上述觀察工具具有能夠保持液體的容器，上述容器同時(shí)收存觀察目標(biāo)與包含它的液體。
12.如權(quán)利要求11中的觀察方法，其特征在于上述對(duì)象物體是細(xì)胞，上述液體是培養(yǎng)液。
13.如權(quán)利要求7～12任意一項(xiàng)中的觀察方法，其特征在于在上述觀察工具中收存上述觀察目標(biāo)，以使上述觀察目標(biāo)與上述反射面的距離為上述光學(xué)系統(tǒng)的焦點(diǎn)深度的一半以下。
14.如權(quán)利要求7～13中任意一項(xiàng)中的觀察方法，其特征在于上述觀察工具中收存上述觀察目標(biāo)，以使上述觀察目標(biāo)和上述反射面的距離d滿足以下公式(1)d≤W/(2NA2) …(1)(式中d表示觀察目標(biāo)和反射面的距離，W表示觀察中使用的光的波長(zhǎng)，NA表示光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑。)
15.如權(quán)利要求7～14中任意一項(xiàng)中的觀察方法，其特征在于在上述觀察工具中收存上述觀察目標(biāo)，以使與上述觀察目標(biāo)相對(duì)的照明光數(shù)值孔徑比物鏡的數(shù)值孔徑小。
16.如權(quán)利要求7～15中任意一項(xiàng)中的觀察方法，其特征在于在上述觀察工具中收存上述觀察目標(biāo)，以使上述觀察目標(biāo)與上述反射面的距離d滿足以下公式(2)d＞F/(4tan(sin-1NA)) …(2)(式中d表示觀察目標(biāo)與反射面的距離，F(xiàn)表示光學(xué)系統(tǒng)的視場(chǎng)直徑，NA表示光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑。)
全文摘要
不使用特殊觀察法中需要的特殊調(diào)制元件、并且可以簡(jiǎn)便地對(duì)細(xì)胞等透明的微小物體進(jìn)行觀察。一種通過(guò)具有物鏡的光學(xué)系統(tǒng)由反射照明光照明、對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行觀察的觀察方法中使用的觀察目標(biāo)收存用的觀察工具，其具有觀察時(shí)對(duì)反射照明光進(jìn)行反射的反射面。反射面設(shè)置在與物鏡對(duì)置的面或者對(duì)置的面的相反面。觀察工具具有保持液體的容器。使用上述觀察工具，同時(shí)觀察細(xì)胞等和培養(yǎng)液。
文檔編號(hào)C12M1/34GK1798996SQ20048000835
公開日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月27日
發(fā)明者金崎士朗, 林真市 申請(qǐng)人:艾菲克特細(xì)胞研究所股份有限公司