牛膝皂苷在制備預防腫瘤轉移藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體設及牛膝皂巧在制備預防腫瘤轉移藥物中的應 用。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是一種對人類生命有嚴重危害的眾多疾病之一，由于現代社會人們生活 習慣改變、環(huán)境污染加劇、食品中含有不良化學添加劑等因素的影響發(fā)病人數呈現逐年上 升趨勢。惡性腫瘤一旦發(fā)生轉移，會大大提高病人的死亡率。
[0003]腫瘤的轉移是指腫瘤細胞從身體癌變部位出發(fā)，遷移到身體其他部位。在運一過 程中能夠看到對腫瘤轉移起關鍵作用的是細胞間和細胞-外基質之間的黏附、基底膜的降 解、細胞的遷移情況(定向遷移)、血管的形成狀況W及細胞外的基質情況和微環(huán)境。抑制并 調控腫瘤的轉移就必須尋找出能夠切斷腫瘤轉移過程的藥物，中草藥作為一種具有較低毒 副作用的藥物，在預防腫瘤及轉移方面具有天然優(yōu)勢，同時還能夠提高機體的免疫功能。因 此，從中草藥中尋找預防腫瘤細胞轉移的新藥具有深遠意義。
[0004]中藥牛膝是我國的傳統中藥，有著悠久的歷史，始載于《神農本草經》，被列為上 品?！吨袊幍洹分惺蛰d的牛膝品種有兩種，即寬科牛膝屬植物的懷牛膝(學名 Aiofen紅紅B1.)和杯寬屬的川牛膝(學名：分別如知舊知5足化?打)。
[0005]懷牛膝是寬科牛膝屬多年生草本植物牛膝的干燥根，味甘苦酸，性平，入肝、腎經。 其主要化學成分有皂巧類、醬酬類、糖類、黃酬類、生物堿類等，W及多種微量元素。現代藥 理表明其具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛等功效。
[0006]川牛膝為寬科杯寬屬多年生草本植物川牛膝的干燥根，性平、味甘、微苦。其化學 成分W醬酬類、多糖類、皂巧類、異黃酬類等為主?，F代藥理研究表明，川牛膝在抗炎、抗腫 瘤、增強免疫等方面有明顯的作用。
[0007]牛膝的抗腫瘤作用主要是通過調節(jié)機體免疫機制W及改變細胞膜生活特性來實 現的，其對多種免疫細胞具有活性，從而提高免疫因子的表達，增強機體的體液免疫。Li Qin-Lin等人研究發(fā)現，C57化/6小鼠體內的肺癌細胞在低劑量的牛膝多糖下，肺癌細胞的 增長得到明顯的抑制。但牛膝皂巧類在腫瘤轉移方面的作用目前還未有報導。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供牛膝皂巧在制備預防腫瘤轉移藥物中的應用。
[0009]牛膝皂巧在制備預防腫瘤轉移藥物中的應用。
[0010] 所述牛膝皂巧制備方法為將懷牛膝或川牛膝清洗、干燥后娠成粉末；取牛膝粉末 2邑，加入40mL70%乙醇溶液回流提取2次，每次回流提取3小時，抽濾，合并濾液；得到的濾 液用旋轉蒸發(fā)儀旋蒸至無乙醇，加入20mL純水超聲分散后抽濾，收集濾液；依次加入等體 積的石油酸、水飽和正下醇分別萃取3次；正下醇層旋蒸至干，加入1-5mL純水超聲溶解， D101大孔吸附樹脂上樣，依次W3倍體積的水、20%乙醇、80%乙醇、95%乙醇溶液分別進行 洗脫；收集80%乙醇洗脫部分，旋蒸至干，得到牛膝皂巧提取物。
[0011] 所述藥物劑型包括：片劑、膠囊劑、滴丸、口服液、顆粒劑、緩釋劑。
[001引包括內容有： (1)將懷牛膝或川牛膝清洗、干燥后娠成粉末，經乙醇回流、乙酸萃取、水飽和的正下醇 萃取及大孔樹脂分離后得到相應牛膝皂巧提取物。
[0013] (2)所述牛膝皂巧對人結腸癌細胞（HT-29)的生長增殖有一定抑制作用，并且對 HT29細胞遷移運動具有明顯的抑制作用，而且懷牛膝皂巧的抑制作用優(yōu)于川牛膝皂巧。另 夕F，牛膝皂巧還可抑制MDA-MB-231人乳腺癌細胞對人廝靜脈內皮細胞（HUVEC)的黏附。牛 膝皂巧提取物具有較低的細胞毒性，并且有明顯的抗腫瘤細胞運動遷移轉移能力和抗腫瘤 細胞粘附能力，符合腫瘤轉移預防藥物的基本特點。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：牛膝藥材(包括：懷牛膝和川牛膝）中提取的皂巧成分具有明 顯的抗細胞遷移、粘附血管的能力和較低的細胞毒性，不同于現有細胞毒抗癌藥物，因此可 望開發(fā)適合長期服用的腫瘤轉移預防藥物。本發(fā)明拓展了牛膝皂巧類提取物的應用，也為 腫瘤轉移的預防提供了新思路和新方法。
【附圖說明】
[001引圖1不同濃度的懷牛膝皂巧（AB)和川牛膝皂巧（RC)作用0h，24h，48h及72h下，HT-29細胞的生長增殖情況。
[0016] 圖2Transwell實驗考察50yg/mL懷牛膝皂巧和川牛膝皂巧處理24小時后，對 HT-29細胞遷移運動能力的影響。
[0017] 圖3Transwell實驗考察50yg/mL懷牛膝皂巧和川牛膝皂巧處理48小時后，對 HT-29細胞遷移運動能力的影響。
[0018] 圖4用50yg/mL懷牛膝皂巧或川牛膝皂巧處理48小時，對MDA-MB-231乳腺癌 細胞人廝靜脈內皮細胞（HUVEC)上黏附的影響。
【具體實施方式】
[0019] 下面將結合【具體實施方式】進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護的范圍并不局限 于下列實施方式。
[0020] 實施例1懷牛膝和川牛膝皂巧的提取方法 將懷牛膝或川牛膝清洗、干燥后娠成粉末。取牛膝粉末2g，加入40mL70%乙醇溶液回 流提取2次，每次回流提取3小時，抽濾，合并濾液。得到的濾液用旋轉蒸發(fā)儀旋蒸至無乙 醇，加入20mL純水超聲分散后抽濾，收集濾液。依次加入等體積的石油酸、水飽和正下醇 分別萃取3次。正下醇層旋蒸至干，加入3血純水超聲溶解，D101大孔吸附樹脂上樣，依次 W3倍體積的水、20%乙醇、80%乙醇、95%乙醇溶液進行洗脫。收集80%乙醇洗脫部分，旋 蒸至干，得到牛膝皂巧提取物。該皂巧提取物的水溶液在用力振搖下，產生持久性蜂窩狀泡 沫。
[0021] 實施例2懷牛膝和川牛膝皂巧對人結腸癌細胞的增值抑制作用 收集對數期HT-29細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100yL鋪板使待測細胞調密度 2000/孔。解育條件為：5%濃度的0)2, 37°C，在此條件下使細胞單層鋪滿孔底（96孔平底 板)，向其中加入懷牛膝皂巧、川牛膝皂巧濃度分別為1yg/mL、10yg/mL、50yg/mL、100yg/mL，每孔200化，設3-5個復孔。解育時間選擇0h、6h、24h、48h、72h小時后進 行MTT檢測。每孔加入10yLMIT溶液（5mg/mU即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培 養(yǎng)，小屯、的去孔內部的培養(yǎng)液。每孔加入150iiL二甲基亞諷，放置于搖床之上低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀選擇波長492nm處測量各孔的吸光值。
[002引 細胞存活率（1%)的計算方法如下：1% =(A-A0)/ (A1 -A0)X100% 式中：A-一受測試樣組OD值； A1--溶劑對照組OD值； A