礎(chǔ)代謝量的測(cè)定方法>
[0267] 基礎(chǔ)代謝量的測(cè)定方法如以下所述。使用Tam投予后第7日的小鼠，絕食4小時(shí) 并使其安靜后，使用Oxymax Equal Flow System(Columbus Instruments，950N. Hague Ave; Columbus，OH USA)測(cè)定氧消耗量（VO2)及二氧化碳產(chǎn)生量（VCO2)。此外，運(yùn)動(dòng)活性（運(yùn)動(dòng) 的數(shù)量）也一并使用DAS system (Neuro Science，Inc.，Japan)進(jìn)行測(cè)定D圖15為顯示滑 膜蛋白基因剔除小鼠中的基礎(chǔ)代謝量的圖。統(tǒng)計(jì)處理是進(jìn)行非配對(duì)樣品T檢驗(yàn)。
[0268] 如圖15所示，CAG-Cre-ER ;SyvnlfWfl°x小鼠的基礎(chǔ)代謝量比對(duì)照小鼠的基礎(chǔ)代謝 量顯著地較多。
[0269] 該結(jié)果暗示，SYVNl在體內(nèi)會(huì)增強(qiáng)線粒體活性。
[0270] (實(shí)施例17 :滑膜蛋白與脂肪燃燒的關(guān)系）
[0271] 進(jìn)行野生型WT小鼠與滑膜蛋白KO小鼠各組織中脂聯(lián)素與滑膜蛋白的蛋白印跡 法。圖16為顯示野生型WT與滑膜蛋白KO的各組織中脂聯(lián)素與滑膜蛋白的蛋白印跡法的 圖式的替代照片。圖中α-微管蛋白為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。從圖16可知藉由將滑膜蛋白基因剔除 會(huì)增加脂聯(lián)素的量，并促進(jìn)脂肪酸燃燒。
[0272] (實(shí)施例18 :PGC-1 β的半衰期的測(cè)定）
[0273] 為了確認(rèn)SYVNl與PGC-I β的相互作用對(duì)于SYVNl媒介的PGC-I β的分解是否重 要，故測(cè)定了 PGC-I β的半衰期。
[0274] 試驗(yàn)是對(duì)于以往公知的方法（Yamasaki, S.，et al. EMBO J. 26, 113-122(2007)及 Bernasconi, R.，et al.J. Cell Biol. 188, 223-235(2010))進(jìn)行了 如以下的修正。在來 自滑膜蛋白基因剔除小鼠的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF Syno-/-)上利用Iyg的pcDNA3 滑膜蛋白/FLAG、空的載體、或1. 5 μ g的pcDNA3滑膜蛋白進(jìn)行Δ SyU/FLAG和0. 75 μ g pcDNA3HAPGC-10的轉(zhuǎn)染。從轉(zhuǎn)染開始48小時(shí)后，將細(xì)胞以40 μΜ Cycloheximide處理 0· 5、1、2、或 4 小時(shí)，再將細(xì)胞以緩沖液（IOmM Tris-HCl ρΗ8· 0, 150mM NaCl, ImM EDTA, 1% NP-40, ImM DTT, protease inhibitors)進(jìn)行溶解，然后使用抗PGC-I β、抗-SYVN1、或抗 α 微管蛋白抗體進(jìn)行免疫印跡解析。各試驗(yàn)至少進(jìn)行3次。結(jié)果示于圖17。圖17中，野生 型的滑膜蛋白（SYVN1WT)將PGC-I β的半衰期大幅地縮短，但SYVNl ASyU卻沒怎么促進(jìn) PGC-I β的分解。因此，這顯示PGC-I β的蛋白水平是在轉(zhuǎn)錄后的過程中受到與滑膜蛋白的 結(jié)合所媒介的負(fù)調(diào)控。這也強(qiáng)烈暗示滑膜蛋白是PGC-I β的主要Ε3連接酶。
[0275] (實(shí)施例19 :滑膜蛋白的泛素化活性抑制劑LS-102對(duì)線粒體功能的影響）
[0276] 對(duì)7~8周齡的C57BL/6J小鼠于腹腔內(nèi)投予1日約50mg/kg體重的LS-102或作 為對(duì)照的溶劑（DMSO)，將第57日小鼠的脂肪組織切片利用電子顯微鏡觀察。其結(jié)果示于圖 18。圖18為顯示LS-102造成的脂肪組織的線粒體的形態(tài)變化的電子顯微鏡照片。電子顯 微鏡的倍率為2, 500倍及10, 000倍，反白的杠表示比例尺（2, 500倍時(shí)為2 μ m，10, 000倍 時(shí)為 500nm)。
[0277] 從圖18可知LS-102處理引發(fā)脂肪組織細(xì)胞中的線粒體的數(shù)量與體積密度的增 加。這暗示若LS-102使得滑膜蛋白的E3連接酶活性被抑制時(shí)，會(huì)引起PGC-I β的超活性 化而促進(jìn)線粒體的生合成。
[0278] (實(shí)施例20 :PGC-1 β的半衰期）
[0279] 在滑膜蛋白的 KO小鼠所樹立的 MEF (mouse embryoinic fibriblasts)上 PGC-1 β 的表達(dá)載體與空載體（對(duì)照組：C0NT)、滑膜蛋白野生型（SYVN1WT)、滑膜蛋白獨(dú)特結(jié)構(gòu)域 (缺少β的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的突變型滑膜蛋白（SYVNlASyU)分別依照的常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 經(jīng)過48小時(shí)后，將代表性的蛋白翻譯抑制劑放線菌酮（40 μΜ)以圖示的時(shí)間（0.5小時(shí)、1 小時(shí)、2小時(shí)及4小時(shí)）處理，再針對(duì)各細(xì)胞抽提物進(jìn)行蛋白印跡法。其結(jié)果示于圖19。圖 19為顯示PGC-I β的半衰期的蛋白印跡法。如圖19所示，證明了 PGC-I β在細(xì)胞內(nèi)的半衰 期分別為4. 8小時(shí)、1. 6小時(shí)、3. 6小時(shí)。
[0280] 該結(jié)果顯示因滑膜蛋白的存在使得PGC-I β的半衰期、也就是分解受到控制，并 且SyU結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄淇刂剖潜仨毜摹?br>[0281] (實(shí)施例21 :泛素化的評(píng)價(jià)）
[0282] 結(jié)合試驗(yàn)是使用以下的測(cè)定系。將2 μ gMBP-PGC-Ι β His (l_367aa)、2 μ gGST滑膜 蛋白突變體于緩沖液（20mM Tris-HCl ρΗ8.0, IOOmM NaClUmM EDTA、0. 1%ΝΡ-40、5%糖基 化I、蛋白酶抑制劑）內(nèi)結(jié)合12小時(shí)，藉由抗PGC-I β抗體檢測(cè)PGC-I β。
[0283] 泛素測(cè)定是使用以下的測(cè)定系。將El-His 125ng、UbcH5C 150ng、 MBP-SYVN1 Δ TM-His 150ng、GST-PGC-I β (l-367aa ;GST-P5)、HA-泛素（HA-Ub) 750ng 于緩 沖液（50mM Tris-HCL pH7.5,5mM MgCl2,0.6mM DTT，2mM ATP)中 30°C反應(yīng) 2 小時(shí)進(jìn)行泛素 化。之后，于GST洗凈緩沖液（50mM Tris-HCl pH7. 5,0. 5M NaCl，l%聚乙二醇辛基苯基醚 X，ImM EDTA，ImM DTT，蛋白酶抑制劑）中與谷胱甘肽瓊脂糖凝膠（Glutathione Sepharose) 結(jié)合。利用GST洗凈緩沖液洗凈后，透過使用抗PGC-I β抗體及抗HA抗體的蛋白印跡法檢 測(cè)PGC-I β的泛素化。圖20為表示體外泛素化試驗(yàn)的結(jié)果。
[0284] 圖20顯示滑膜蛋白（SYVNl)會(huì)將PGC-I β直接泛素化。
[0285] (實(shí)施例22 :受測(cè)物質(zhì)的泛素化抑制）
[0286] 為了研究受測(cè)物質(zhì)348、349造成的滑膜蛋白（SYVNl)對(duì)于PGC-I β的泛素化抑制 活性的濃度相關(guān)性，進(jìn)行了與實(shí)施例11相同的體外結(jié)合試驗(yàn)。圖21為顯示受測(cè)物質(zhì)348、 349對(duì)于PGC-I β的泛素化抑制活性的濃度相關(guān)性的蛋白印跡法。從圖21可知，任何一個(gè) 受測(cè)物質(zhì)與ΙμΜ相比，ΙΟμΜ對(duì)于PGC-Ιβ的泛素化抑制活性較高。亦即顯示出受測(cè)物質(zhì) 的泛素化抑制活性是有濃度相關(guān)性的。
[0287] (實(shí)施例23 :斷片化突變滑膜蛋白與PGC-I β的結(jié)合）
[0288] 實(shí)施例5顯示滑膜蛋白（SYVNl)在第236~270號(hào)的結(jié)構(gòu)域（SyU結(jié)構(gòu)域）與 PGC-I β結(jié)合的可能性很高。本實(shí)施例為了找出SyU結(jié)構(gòu)域當(dāng)中與PGC-I β結(jié)合的可能性 高的部位而進(jìn)行了以下的實(shí)驗(yàn)。
[0289] 圖22為多種中SyU結(jié)構(gòu)域的胺基酸序列。進(jìn)行滑膜蛋白（SYVNl)的236-240、 241-245、246-250、251-255、256-260、261-265、266-270 部位相當(dāng)?shù)拿?5 個(gè)胺基酸被取代成 丙胺酸的SYVNlSyU突變體與PGC-I β的結(jié)合。其結(jié)果示于圖23。圖23為SYVNlSyU突變 體的蛋白印跡法。圖23顯示256-260、266-270aa部位對(duì)于PGC-I β的結(jié)合是重要的。
[0290] (實(shí)施例24 :斷片化突變滑膜蛋白與PGC-I β的結(jié)合）
[0291] 266-270aa部位的胺基酸序列為RRAIR。準(zhǔn)備胺基酸序列AAAAA者（對(duì)照）、第266 號(hào)的R被取代成A者（R266A)、第267號(hào)的R被取代成A者（R267A)、第270號(hào)的R被取代成 A者（R270A)、第266號(hào)及第267號(hào)的R被取代成A者（R266，267A)、第266號(hào)及第270號(hào)的R 被取代成A者（R266，270A)、第267號(hào)及第270號(hào)的R被取代成A者（R267，270A)、3個(gè)R皆 被取代成A者（3A)所構(gòu)成的勝肽，以與實(shí)施例5相同的方式進(jìn)行了蛋白印跡法。其結(jié)果示 于圖24。圖24為SYVN1266-270aa突變體的蛋白印跡法。從圖24可知，再SYVN1266-270aa 媒介的PGC-I β的結(jié)合上理想的是至少有2個(gè)精胺酸殘基。
[0292] 產(chǎn)業(yè)上可利用性
[0293] 本發(fā)明的線粒體功能的調(diào)節(jié)劑可增大線粒體的數(shù)量及尺寸，使脂肪酸β氧化及 線粒體生合成增強(qiáng)，可適用在肥胖癥的治療或預(yù)防上。因此，本發(fā)明可利用在制藥業(yè)。
[0294] 獨(dú)立文本的序列表
[0295] 序列編號(hào)2 :合成RNA
[0296] 序列編號(hào)3 :合成RNA
[0297] 序列編號(hào)4 :合成RNA
[0298] 序列編號(hào)5 :合成RNA
[0299] 序列編號(hào)6 :合成RNA
[0300] 序列編號(hào)7 :合成RNA
[0301] 序列編號(hào)8 :引物
[0302] 序列編號(hào)9:引物
[0303] 序列編號(hào)10:引物
[0304] 序列編號(hào)11:引物
[0305] 序列編號(hào)12:引物
[0306] 序列編號(hào)13:引物
[0307] 序列編號(hào)14:引物
[0308] 序列編號(hào)15:引物
[0309] 序列編號(hào)16:引物
[0310] 序列編號(hào)17:引物
[0311] 序列編號(hào)18:引物
[0312] 序列編號(hào)19:引物
[0313] 序列編號(hào)20:引物
[0314] 序列編號(hào)21:引物
[0315] 序列編號(hào)22:引物
[0316] 序列編號(hào)23:引物
[0317] 序列編號(hào)24:引物
[0318] 序列編號(hào)25:引物
[0319] 序列編號(hào)26:引物
[0320] 序列編號(hào)27:引物
[0321] 序列編號(hào)28:引物
[0322] 序列編號(hào)29:引物
[0323] 序列編號(hào)30:引物
[0324] 序列編號(hào)31:引物
[0325] 序列編號(hào)32:引物
[0326] 序列編號(hào)33:引物
[0327] 序列編號(hào)34:引物
[0328] 序列編號(hào)35:引物
[0329] 序列編號(hào)36:引物
[0330] 序列編號(hào)37:引物
[0331] 序列編號(hào)38:引物
[0332] 序列編號(hào)39:引物
[0333] 序列編號(hào)40:引物
[0334] 序列編號(hào)41:引物
[0335] 序列編號(hào)42:引物
[0336] 序列編號(hào)43:引物
[0337] 序列編號(hào)44:引物
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種PGC-IP蛋白的功能調(diào)整劑，其特征在于： 含有滑膜蛋白的表達(dá)抑制劑或滑膜蛋白的活性抑制劑作為有效成分來調(diào)節(jié)PGC-I0蛋白的功能。2.如權(quán)利要求1所述的PGC-IP蛋白的功能調(diào)整劑，其特征在于： 其用于PGC-I0蛋白對(duì)于脂肪酸0氧化的促進(jìn)，及線粒體的表達(dá)或活性促進(jìn)的任一者 或兩者。3. -種線粒體的活性化劑，其特征在于： 包含權(quán)利要求1所述的PGC-IP蛋白的功能調(diào)整劑。4.如權(quán)利要求3所述的線粒體的活性化劑，其特征在于： 其用于導(dǎo)致線粒體表達(dá)數(shù)的增加及線粒體尺寸的增大的任一者或兩者。5. -種篩檢PGC-IP蛋白的功能調(diào)整劑的方法，其特征在于： 包含以下工序：使脂肪組織的細(xì)胞或動(dòng)物個(gè)體與被驗(yàn)物質(zhì)作用；測(cè)定或檢測(cè)脂肪組織 的細(xì)胞中 滑膜蛋白的表達(dá)量， 滑膜蛋白與PGC-IP蛋白的結(jié)合，及 滑膜蛋白對(duì)于PGC-IP蛋白的泛素化， 的至少一者。6. -種線粒體的活性化劑的檢測(cè)方法，其特征在于： 使用權(quán)利要求5所述的篩檢方法。7. -種肥胖癥的治療劑或預(yù)防劑的檢測(cè)方法，其特征在于： 使用權(quán)利要求5所述的篩檢方法。
【專利摘要】提供一種對(duì)肥胖癥的治療或預(yù)防有效的線粒體功能的調(diào)節(jié)劑及其篩檢方法。本發(fā)明的線粒體功能的調(diào)節(jié)劑為含有以滑膜蛋白為標(biāo)的PGC-1β蛋白的功能調(diào)整劑作為有效成份，又本發(fā)明的篩檢方法在于包含以下工序：使脂肪組織的細(xì)胞或動(dòng)物個(gè)體與被驗(yàn)物質(zhì)作用；測(cè)定或檢測(cè)脂肪組織的細(xì)胞中(1)滑膜蛋白的表達(dá)量，(2)滑膜蛋白與PGC-1β蛋白的結(jié)合，及(3)滑膜蛋白對(duì)于PGC-1β蛋白的泛素化，中的至少一者。
【IPC分類】G01N33/15, G01N33/50, A61P43/00, A61P3/04, C12Q1/68, A61K45/00
【公開號(hào)】CN105007943
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380073873
【發(fā)明人】中島利博, 藤田英俊, 荒谷聰子, 八木下尚子
【申請(qǐng)人】中島利博
【公開日】2015年10月28日
【申請(qǐng)日】2013年12月26日
【公告號(hào)】EP2954905A1, US20150330981, WO2014104224A1