無細胞百日咳疫苗的制作方法
【專利說明】無細胞百日咳疫苗
[0001] 本發(fā)明涉及健康護理領(lǐng)域。更確切地說，本發(fā)明涉及無細胞百日咳疫苗領(lǐng)域。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis)是百日咳的病原體。在1940年代 引入已殺死的全細胞百日咳博德特氏菌（wP)疫苗已成功降低了兒童和嬰兒因百日咳所導 致的發(fā)病率和死亡率[http://www. cdc. gov/vaccines/pubs/pinkbook/downloads/pert. pdf ;比斯1 加德(Bisgard), K. M. http://www. cdc. gov/vaccines/pubs/pertussisguide/ downloads/chapterl. pdf. 2000 ;愛德華（Edwards)，Κ· M.和德克爾（Decker)，M. D.百日咳 疫苗（Pertussis vaccines)，見《疫苗》（Vaccines)(編輯普洛特金（Plotkin)，S. A.，奧倫 斯坦（Orenstein)，W.A.以及奧菲特（Offit)，P.A.)愛思唯爾健康科學出版社（Elsevier Health Sciences) ,2008.467-517 ;這一讀本在下文被稱為"《疫苗》，普洛特金2008"]。盡 管如此，在世界范圍內(nèi)，百日咳仍為兒童中的一個重要問題。來自WHO的評估表明，在2008 年發(fā)生了約1，600萬例百日咳，并且約195,000名兒童死于這一疾病。
[0004] 自1990年代以來，WP疫苗已在大部分高收入國家并且近年來也在一些中等收入 國家被無細胞百日咳（aP)疫苗替換。無細胞百日咳疫苗與wP疫苗相比誘發(fā)相對更少的副 作用，這些wP疫苗與發(fā)燒〇38°C)、在注射部位的反應(yīng)原性以及（盡管程度較?。@厥 和低滲性低應(yīng)答間期（hypotonic-hyporesponsive episode)的高風險相關(guān)[張（Zhang)， 科克倫系統(tǒng)綜述數(shù)據(jù)庫（Cochrane Database Syst Rev) 2011]。
[0005] 在引入aP疫苗后十到二十年，青少年和成人百日咳通報升高已被若干國家報導， 包括US、UK、澳大利亞、挪威以及荷蘭?？赡艿慕忉尠ㄒ迅纳频脑\斷和監(jiān)測、循環(huán)百日咳 博德特氏菌菌株適應(yīng)成疫苗、和/或與aP疫苗相關(guān)的免疫性減弱的增加[田中（Tanaka)， 《美國醫(yī)學會雜志》（Jama) 2003, 290:2968-2975 ;佐藤（Satoh)，《比較免疫學、微生物學與 傳染病》（Comp Tmmunol Microbiol Infect Dis) 2010, 33: e81_88 ;策普（Zepp)，《柳葉刀 傳染病》（Lancet Infect Dis) 2011 ;德格里夫（De Greeff)，《第一公共科學圖書館》（PLoS 0ne)2010，：el4183 ;談（Tan)，《兒科傳染病雜志》（Pediatr Infect Dis J)2005, 24(5 增 刊）：S10-18]〇
[0006]目前，所有被許可的aP疫苗由最少一種、但多數(shù)情況是多種、直到最多五種（已被 脫毒的）百日咳博德特氏菌毒力因子組成。所有aP疫苗含有百日咳類毒素（PT)。多組分 aP疫苗至少包括PT和百日咳博德特氏菌表面粘附素絲狀血凝素（FHA)。在價數(shù)增加的情 況下，另外存在粘附素百日咳桿菌粘附素（PRN)和2型和3型菌毛（F頂2和F頂3,在此合起 來稱為F頂或FHC/3)中的一種或多種[愛德華，見《疫苗》，普洛特金，2008. 467-517]。
[0007] WO 96/34883描述了每一人類劑量1-10 μ g F頂?shù)膭┝?，以aP疫苗中每一人類劑 量10和5 μ g的劑量為例，而實際上僅測試每一人類劑量5 μ g的劑量，并且測試疫苗被認 為有效。
[0008] 普遍認為aP5疫苗（具有五種組分PT、FHA、PRN、F頂2/3的無細胞百日咳疫苗； DTaP5為進一步包含破傷風類毒素和白喉類毒素的aP5疫苗）為當前可獲得的最有效的aP 疫苗。可購得的已注冊aP5疫苗中存在的aP組分的單獨量（以每一人類劑量的微克數(shù)為 單位）：2. 5-20PT、5-20FHA、3PRN 以及 5FIM。
[0009] 在1990年代中期歐洲進行的若干無細胞百日咳疫苗功效試驗中，嘗試測定單 獨aP疫苗組分的保護的免疫相關(guān)性。使用來自瑞典DTaP5 (PT+FHA+PRN+F頂2/3)試驗 的數(shù)據(jù)，證明了臨床保護與暴露前血清中的針對PRN、F頂2以及PT(而不是針對FHA) 的IgG抗體的存在之間的統(tǒng)計學上顯著的相關(guān)性[斯托薩特（Storsaeter)，《疫苗》 1998, 16:1907-1916]。FHO似乎為DTaP5內(nèi)的非保護組分[波曼（Poolman)，《疫苗專家評 論》（Expert Reviews Vaccines) 2007, 6:47-56] 〇
[0010] 在德國從來自疫苗試驗的受試者所采集的血清允許評估與保護相關(guān)的針對PT、 FHA、PRN以及F頂2的抗體的具體水平，它顯示僅針對PRN和PT的抗體與保護顯著相關(guān) [斯蒂爾（Stehr)，1998,《兒科學》（Pediatrics) 101:1-11;徹麗（Cherry)，1998,《疫苗》 16:1901-1906]。此外，臨床前研究已顯示，添加 PRN增強了在鼠類鼻內(nèi)感染模型中由含有 PT和FHA的疫苗所賦予的保護水平[吉索（Guiso)，1999,《疫苗》17:2366-2376 ;德諾埃 (DeNoel)，2005,《疫苗》23:5333-5341]并且針對PRN的抗體是調(diào)理吞噬百日咳博德特氏菌 的關(guān)鍵[赫爾維希（Hellwig)，2003,《傳染病雜志》（JID) 188:738-742]。這些數(shù)據(jù)合起來 表明PT和PRN為當前無細胞百日咳疫苗的主要保護性抗原。
[0011] 作為前瞻性aP疫苗功效試驗的一部分，歷經(jīng)18個月的時間，測量了從參與者獲得 的連續(xù)血清樣品中的針對PT、FHA、PRN以及F頂2/3的保護性IgG。歷經(jīng)18個月，針對PT 的IgG衰減的百分比最強（幾何平均IgG效價減少73% )并且顯著高于針對PRN、FHA以 及F頂?shù)目贵w減少的百分比。相比之下，針對PRN的IgG抗體具有最低衰減率（幾何平均 IgG效價減少56 % )[萊（Le)，2004,《傳染病雜志》，190:535-544]。
[0012] 組合I) PT和PRN為aP疫苗中的主要保護性抗原和2)針對PT的抗體具有比針對 PRN的抗體顯著更高的衰減率這兩個觀察結(jié)果，突出了抗PRN抗體為提供aP介導的針對百 日咳博德特氏菌感染的長期保護的關(guān)鍵。
[0013] 然而，在過去的幾年中，已在全世界觀察到不表達PRN的百日咳博德特氏菌菌 株的出現(xiàn)，例如在法國、日本、荷蘭、USA、芬蘭、挪威以及瑞典[布歇（Bouchez)，2009,《疫 苗》27:6034-41 ;黑格勒（Hegerle)，2012,《臨床微生物學和感染》（Clin. Microbiol. Infect.) 18:E340-346 ;大冢（Otsuka)，2012,《第一公共科學圖書館》7:e31985 ;阿德瓦尼 (Advani)，2013,《臨床微生物學雜志》（J. Clin. Micro) 51:422-428]。美國最近一項研究顯 示，在2011年和2012年間由來自在費城就醫(yī)的兒童的樣本所培養(yǎng)的百日咳博德特氏菌的 12種分離株中的11種事實上為PRN陰性[昆南（Queenan)，2013,《新英格&醫(yī)學雜志》(N Engl T Med.) 368:583_4]。目前不了解此菌株適應(yīng)是否主要為疫苗推動的。有可能這些PRN 陰性菌株可以避開疫苗誘發(fā)的免疫性，尤其在抗PT效價已衰退時，并且這已造成所觀察到 的百日咳博德特氏菌疾病增加。
[0014] 目前已被許可并銷售的aP疫苗因此似乎不夠有效，尤其針對新近出現(xiàn)的PRN陰性 菌株。仍需要其他aP疫苗，這些aP疫苗具有特別是針對這些PRN陰性百日咳博德特氏菌 菌株的改善的功效。
[0015] 發(fā)明概沐
[0016] 我們已意外發(fā)現(xiàn)包含高劑量F頂2/3的aP疫苗顯示顯著改善的抵抗PRN陰性百日 咳博德特氏菌菌株的保護。本發(fā)明提供一種無細胞百日咳（aP)疫苗組合物，該疫苗組合 物包含百日咳博德特氏菌抗原百日咳類毒素（PT)、絲狀血凝素（FHA)以及2型和3型菌毛 (F頂)、和任選地百日咳桿菌粘附素（PRN)，其中F頂是以每一人類劑量12-100 μ g的一個量 存在。
[0017] 在某些實施例中，F(xiàn)IM是以每一人類劑量15-80、15-60、20-60、或12-50、15-50、 20-50、20-30、20-25、或12-30、或12-25、或約13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或 25 μ g的一個量存在。
[0018] 在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的aP疫苗包含百日咳桿菌粘附素（PRN)。
[0019] 在某些實施例中，PT被基因地脫毒。
[0020] 在某些實施例中，本發(fā)明的組合物進一步包含來自除百日咳博德特氏菌以外的一 種或多種病原體的抗原。
[0021] 在其某些實施例中，這些組合物包含以下一者或多者：
[0022] a)破傷風類毒素；b)白喉類毒素；c)b型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae) (Hib)寡糖或多糖結(jié)合物；d) B型肝炎病毒表面抗原（HBSAg);以及e)失活的 脊髓灰質(zhì)炎病毒（IPV)。在某些實施例中，本發(fā)明的組合物包含據(jù)本發(fā)明的無細胞百日咳疫 苗組合物、破傷風類毒素以及白喉類毒素。
[0023] 在某些實施例中，根據(jù)本發(fā)明的組合物進一步包含一種佐劑。在某些實施例中，該 佐劑包含鋁鹽，如磷酸鋁、氫氧化鋁、或磷酸鋁和氫氧化鋁兩者。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種在受試者中誘發(fā)抵抗百日咳博德特氏菌的免疫反應(yīng)或?qū)υ?受試者進行疫苗接種以抵抗百日咳博德特氏菌的方法，該方法包括給予該受試者根據(jù)本發(fā) 明的組合物。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種保護受試者免受由百日咳博德特氏菌的一種PRN陰性菌株 感染所引起的百日咳的方法，該方法包括給予該受試者根據(jù)本發(fā)明的組合物。
[0026] 本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的組合物，用于通過給予受試者該組合物在受試者中 誘發(fā)抵抗百日咳博德特氏菌的免疫反應(yīng)或?qū)υ撌茉囌哌M行疫苗接種以抵抗百日咳博德特 氏菌。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的組合物，用于制備通過給予受試者該組合物在受試者 中誘發(fā)抵抗百日咳博德特氏菌的免疫反應(yīng)或?qū)υ撌茉囌哌M行疫苗接種以抵抗百日咳博德 特氏菌的藥劑。在某些實施例中，需要免疫反應(yīng)來抵抗的百日咳博德特氏菌包括PRN陰性 菌株。
[0027] 本發(fā)明還提供了一種對人類受試者進行疫苗接種以抵抗百日咳博德特氏菌、任選 地百日咳博德特氏菌的一種PRN陰性菌株的方法，該方法包括給予該受試者以下百日咳博 德特氏菌抗原：百日咳類毒素（PT)、絲狀血凝素（FHA)以及2型和3型菌毛（F頂)、和任選 地百日咳桿菌粘附素（PRN)，其中F頂是以12-100 μ g的一個量給予。
[0028] 附圖簡要說明
[0029] 圖1.接種DTaP5疫苗（aP5)或aP5+F頂?shù)男∈笤诒莾?nèi)激發(fā)后第0天、第2天、第 5天以及第8天每一個肺的百日咳博德特氏菌的平均IoglOCFU。小鼠在4周和7周齡時進 行疫苗接種并且在9周時用不同的百日咳博德特氏菌菌株經(jīng)鼻內(nèi)激發(fā):WH0 18323(圖1A)、 一種臨床PRN陰性分離株P(guān)RN-STOP (圖1B)以及一種臨床PRN陰性分離株P(guān)RN-IS (圖1C)。
[0030] *p〈0. 05使用威爾科克森精確檢驗（Wilcoxon Exact Test)，比較在接種aP5和 aP5+F頂后在每一特定時間點的平均IoglOCFU計數(shù)。
[0031] #p〈0. 01使用協(xié)方差分析，比較接種aP5和aP5+F頂后從第0天到第8天的 IoglOCFU反應(yīng)-時間概況。
[0032] 圖2.在4周和7周齡時接種1/10人類劑量的aP2疫苗外加漸增量的F頂后，在 第9周用PRN陰性百日咳博德特氏菌菌株1195激發(fā)的小鼠的肺的平均LoglOCFU計數(shù)。關(guān) 于詳情，參見實例2。
[0033] 圖3.在4周和7周齡時接種添加或未添加5 μ g F頂?shù)?/10人類劑量的aP5疫苗 后，在第9周用4種百日咳博德特氏菌菌株激發(fā)后5天的小鼠的肺的平均LoglOCFU計數(shù)。 關(guān)于詳情，參見實例3。
[0034] 發(fā)明的詳細說明
[0035] 本發(fā)明涉及組合物，這些組合物包含已脫毒的百日咳博德特氏菌毒力因子，特別 是百日咳類毒素（PT)、絲狀血凝素（FHA)以及2型和3型菌毛（F頂)、和任選地百日咳桿菌 粘附素（PRN)，其中F頂是以每一人類劑量12-100 μ g的一個量存在。這些組合物可被用 作無細胞百日咳（aP)疫苗，并且在此被證明意外地比當前可獲得的業(yè)界最好aP5疫苗更有 效。
[0036] 具體來說，增加劑量的F頂與這一組分先前描述和推薦的劑量相比，產(chǎn)生與已銷 售的aP5疫苗和其他已銷售的aP疫苗相比改善的針