PGC-1β蛋白的功能調(diào)整劑、線粒體功能的調(diào)節(jié)劑、抗肥胖劑及其篩檢方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于一種PGC-I β蛋白的功能調(diào)整劑、線粒體功能的調(diào)節(jié)劑、抗肥胖劑 及其篩檢方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 包含細胞的呼吸或脂肪酸的β氧化的能量代謝或線粒體生物合成中，一般認 為細胞核受體或該輔助激活因子扮演著中心的角色。過氧化物酶體增殖物活化受體 γ (Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs))形成細胞核受體超級家族， 存在有PPAR a、PAR β / δ及PPAR γ 3種異型體（參照非專利文獻1)。PPAR的輔助激活因 子已知有PGC-I a、PGC-I β及PGC-I關(guān)連輔助激活因子（PRC) 3種（參照非專利文獻2~ 4)〇
[0003] 若PGC-I β過表達，則培養(yǎng)細胞中線粒體的數(shù)量與呼吸功能會提升（參照非專利 文獻5)。又，有報告指出PGC-I β基因轉(zhuǎn)殖小鼠具有對于高能量消耗與肥胖癥的抗性（參 照非專利文獻6)。
[0004] PGC-I β已知與褐色脂肪決定及/或分化、細胞代謝、脂肪酸氧化、線粒體的功能 及/或呼吸等的控制有關(guān)（參照專利文獻1)。又，PGC-I β已知與脂質(zhì)生合成及脂質(zhì)輸送 的控制有關(guān)（參照專利文獻2)。
[0005] 先行技術(shù)文獻
[0006] 專利文獻
[0007] 專利文獻1:日本專利特表2008-517931號公報
[0008] 專利文獻2:日本專利特表2005-514921號公報
[0009] 非專利文獻
[0010] 非專利文獻 I:Viana Abranches, et al. (2〇11) · Peroxisome proliferator-activatedreceptor:effects on nutritional homeostasis,obesity and diabetes mellitus. Nutr Hosp 26,271-279.
[0011] 非專利文獻 2:AnderssonlL and Scarpulla RC.，（2001)Pgc-l_related coactivator, a novel,serum-inducible coactivator of nuclear respiratory factor 1-dependenttranscription in mammalian cells. Mol Cell Biol. 21,3738-3749.
[0012] 非專利文獻3:Kressler，D. et al.，（2002) · The PGC-1-related protein PERC is aselective coactivator of estrogen receptor alpha. J Biol Chem 277, 13918-13925.
[0013] 非專利文獻 4:Lin，J. (2001) · Peroxisome Proliferator-activated Receptor gammaCoactivator lbeta (PGC-Ibeta), A Novel PGC-1-related Transcription CoactivatorAssociated with Host Cell Factor. J Biol Chem 277, 1645-1648.
[0014] 非專利文獻 5:St-Pierre，J.，et al.，（2003). Bioenergetic analysis of peroxisomeproliferator-activated receptor gamma coactivators !alpha and Ibeta(PGC-lalphaand PGC-lbeta)in muscle cells. J Biol Chem 278,26597-26603.
[0015] 非專利文獻 6:Kamei，Y.，et al.，（2003) · PPARgamma coactivator lbeta/ ERR ligand Iis an ERR protein ligand,whose expression induces a high-energy expenditureand antagonizes obesity.Proc Natl Acad Sci USA 100, 12378-12383.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 發(fā)明所欲解決的課題
[0017] 如上所述，PPAR輔助激活因子I(PGC-I) β具有各種功能。因此，目前期盼能夠提 供一種方法，篩檢出提高PGC-I β活性的物質(zhì)或像那樣的物質(zhì)。
[0018] 本發(fā)明的目的在于提供一種方法，篩檢出提高PGC-I β活性的物質(zhì)或像那樣的物 質(zhì)。
[0019] 本發(fā)明的目的在于提供一種對于肥胖癥的治療或預(yù)防有效的線粒體功能調(diào)節(jié)劑 及其篩檢方法。
[0020] 解決課題的手段
[0021] 本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，滑膜蛋白的條件性基因剔除小鼠中β氧化及/或線粒體生合 成相關(guān)的基因群有顯著地上調(diào)，在白色脂肪細胞中線粒體的數(shù)量會顯著增加，并且控制前 述基因群的轉(zhuǎn)錄的輔助激活因子PGC-I β會因滑膜蛋白而被負調(diào)控，從而完成本發(fā)明。
[0022] 本發(fā)明的第1方面是關(guān)于一種PGC-Ιβ蛋白的功能調(diào)整劑（本發(fā)明的劑）。該 PGC-I β蛋白的功能調(diào)整劑含有滑膜蛋白的表達抑制劑或滑膜蛋白的活性抑制劑來作為有 效成分。此外，PGC-I β蛋白的功能調(diào)整劑，例如以提高PGC-I β蛋白的活性的方式進行調(diào) 節(jié)，藉此促進脂肪酸β氧化，并促進線粒體的表達或活性。因此，本發(fā)明的PGC-Ιβ蛋白的 功能調(diào)整劑在例如PGC-I β蛋白關(guān)連的肥胖等癥狀的治療或預(yù)防上是有效的。
[0023] 亦即，本發(fā)明的劑透過抑制滑膜蛋白而可提高PGC-I β蛋白的活性，藉此可提高 線粒體的活性，故在肥胖癥的預(yù)防或治療上是有益的。
[0024] 本發(fā)明的第1方面相關(guān)的PGC-I β蛋白的功能調(diào)整劑的優(yōu)選態(tài)樣，其用于PGC-I β 蛋白對于脂肪酸β氧化的促進，及線粒體的表達或活性促進的任一者或兩者。
[0025] 特別是，本發(fā)明的PGC-Ιβ蛋白的功能調(diào)整劑可優(yōu)選用于線粒體的活性化。因此， 本發(fā)明亦可提供線粒體的活性化劑。該線粒體的活性化劑可用于例如導(dǎo)致線粒體表達數(shù)的 增加及線粒體尺寸的增大的任一者或兩者。
[0026] 本發(fā)明的第2方面是關(guān)于一種篩檢PGC-I β蛋白的功能調(diào)整劑的方法。該方法首 先使脂肪組織的細胞或動物個體與被驗物質(zhì)作用。然后，對于脂肪組織的細胞中滑膜蛋白 的表達量、滑膜蛋白與PGC-Ιβ蛋白的結(jié)合、及滑膜蛋白對于PGC-Ιβ蛋白的泛素化的至少 一者進行測定或檢測。如先前所述，本發(fā)明是根據(jù)抑制滑膜蛋白的活性會導(dǎo)致提高PGC-I β 蛋白的活性的見解。因此，透過評價滑膜蛋白的表達或活性，可篩檢出PGC-I β蛋白的功能 調(diào)整劑（具有調(diào)節(jié)PGC-I β蛋白功能的作用的物質(zhì)）。
[0027] 本發(fā)明的第2方面的某一態(tài)樣是關(guān)于一種線粒體的活性化劑的檢測（篩檢）方 法，其使用了對于先前所述的PGC-I β蛋白的功能調(diào)整劑進行篩檢的方法。
[0028] 本發(fā)明的第2方面的某一態(tài)樣是關(guān)于一種肥胖癥的治療劑或預(yù)防劑的檢測（篩 檢）方法，其使用了對于先前所述的PGC-I β蛋白的功能調(diào)整劑進行篩檢的方法。
[0029] 發(fā)明功效
[0030] 本發(fā)明可提供一種例如PGC-I β蛋白的功能調(diào)整劑及其篩檢方法、對于肥胖癥的 治療或預(yù)防有效的線粒體功能調(diào)節(jié)劑及其篩檢方法。
【附圖說明】
[0031] [圖1]圖1為表示來自滑膜蛋白基因剔除小鼠的白色脂肪細胞中β氧化及線粒 體關(guān)連基因的轉(zhuǎn)錄水平的圖；
[0032] [圖2]圖2為來自滑膜蛋白基因剔除小鼠的白色脂肪細胞中線粒體的電子顯微 鏡照片，左側(cè)的照片為作為對照的野生型小鼠 （syno WT)，右側(cè)為滑膜蛋白基因剔除小鼠 (synocKO)，電子顯微鏡的倍率為5, 000倍；
[0033] [圖3]圖3為表示體外中PGC-I β與滑膜蛋白結(jié)合的蛋白印跡法；
[0034] [圖4]圖4為表示PGC-I β及斷片化PGC-I β的概念圖及體外中斷片化PGC-I β 與滑膜蛋白的結(jié)合的蛋白印跡法，圖4中的簡稱如下所述:AD :活性化結(jié)構(gòu)域，LXXLL :LXXLL 模體，E :麩酰胺酸富含結(jié)構(gòu)域，SR :絲胺酸-精胺酸富含結(jié)構(gòu)域，RRM :RNA識別模體；
[0035] [圖5]圖5為表示滑膜蛋白及斷片化滑膜蛋白的概念圖及體外中PGC-Ιβ與斷片 化滑膜蛋白的結(jié)合的蛋白印跡法，圖5中的簡稱如下所述：SP :訊息肽，TM :膜貫通結(jié)構(gòu)域， SyU :滑膜蛋白中獨特的結(jié)構(gòu)域，RING :RING指結(jié)構(gòu)域，PR :脯胺酸富含結(jié)構(gòu)域；
[0036] [圖6A]圖6A為表示體內(nèi)中PGC-I β與滑膜蛋白的結(jié)合的蛋白印跡法；
[0037] [圖6Β]圖6Β為表示體內(nèi)中PGC-I β與滑膜蛋白的結(jié)合的其它蛋白印跡法；
[0038] [圖7]圖7為表示PGC-I β及滑膜蛋白的局部的熒光顯微鏡照片；
[0039] [圖8Α]圖8Α為表示體外時的滑膜蛋白對于PGC-I β的泛素化的蛋白印跡法；
[0040] [圖8Β]圖8Β為表示體內(nèi)時的滑膜蛋白對于PGC-I β的泛素化的蛋白印跡法；
[0041] [圖8C]圖8C為表示體內(nèi)時的滑膜蛋白基因剔除對于PGC-I β的蛋白水平的影響 的蛋白印跡法；
[0042] [圖8D]圖8D為表示體內(nèi)時的滑膜蛋白基因剔除對于PGC-Ιβ蛋白分解的影響的 蛋白印跡法；
[0043] [圖9Α]圖9Α為表示滑膜蛋白siRNA對于PGC-I β蛋白表達的影響的蛋白印跡 法；
[0044] [圖9Β]圖9Β為表示滑膜蛋白siRNA對于PGC-I β的菜單達的影響的蛋白印跡 法；
[0045] [圖9C]圖9C為表示滑膜蛋白的過表達對于PGC-I β的菜單達的影響的圖；
[0046] [圖9D]圖9D為表示滑膜蛋白SiRNA對于線粒體的形態(tài)變化的電子顯微鏡照片；
[0047] [圖10]圖10為表示滑膜蛋白的Ε3泛素連接酶活性抑制劑對于滑膜蛋白與 PGC-I β的結(jié)合抑制效果的蛋白印跡法；
[0048] [圖11-1]圖11-1為表示被驗物質(zhì)349及348對于滑膜蛋白與PGC-I β的結(jié)合抑 制效果的蛋白印跡法（上圖），及評價被驗物質(zhì)349及348的結(jié)合能力的圖（下圖）；
[0049] [圖11-2]圖11-2為表示被驗物質(zhì)槲皮素及351對于滑膜蛋白與PGC-I β的結(jié)合 抑制效果的蛋白印跡法（上圖），及評價被驗物質(zhì)槲皮素及351的結(jié)合能力的圖（下圖左及 右）；
[0050] [圖11-3]圖11-3為表示各種被驗物質(zhì)的結(jié)合抑制效果的蛋白印跡法；
[0051] [圖11-4]圖11-4為表示被驗物質(zhì)對于滑膜蛋白與PGC-I β的結(jié)合抑制效果的其 它蛋白印跡法，結(jié)合的程度是將結(jié)合試驗后的蛋白印跡法進行影像解析，以intensity的 方式用圖來表不；
[0052] [圖12]圖12為表示被驗物質(zhì)對于PGC-I β功能的效果的圖；
[0053] [圖13]圖13為表示被驗物質(zhì)對于線粒體的形態(tài)變化的電子顯微鏡照片；
[0054] [圖14]圖14為表示滑膜蛋白基因剔除小鼠中脂肪細胞的氧消耗量的圖；
[0055] [圖15]圖15為表示滑膜蛋白基因剔除小鼠中基礎(chǔ)代謝量的圖；
[0056] [圖16]圖16為表示替代野生型WT與滑膜蛋白KO的各組織中脂聯(lián)素與滑膜蛋白 的蛋白印跡法的圖式的照片；
[0057] [圖17]圖17為表示用以測定PGC-I β的半衰期的蛋白印跡法的圖；
[0058] [圖18]圖18為表示LS-102對于脂肪組織的線粒體的形態(tài)變化的電子顯微鏡照 片；
[0059] [圖19]圖19為表示PGC-I β的半衰期的蛋白印跡法；
[0060] [圖20]圖20為表示體外泛素化試驗的結(jié)果的圖；
[0061] [圖21]圖21為表示受測物質(zhì)348、349對于PGC-I β的泛素化抑制活性的濃度相 關(guān)性的蛋白印跡法；
[0062] [圖22]圖22為多種中SyU結(jié)構(gòu)域的胺基酸序列；
[0063] [圖23]圖23為SYVNlSyU突變體的蛋白印跡法；
[0064] [圖24]圖24為SYVN1266-270aa突變體的蛋白印跡法。
【具體實施方式】
[0065] 本發(fā)明的第1方面是關(guān)于一種PGC-1 β蛋白的功能調(diào)整劑（本發(fā)明的劑）。 PGC-Ιβ意指PPAR輔助激活因子1β。PGC-Ιβ蛋白的功能調(diào)整劑為一種例如用以調(diào)節(jié)先 前所述的PGC-I β蛋白的各種功能的藥劑。PGC-I β蛋白具有各種功能。因此調(diào)節(jié)PGC-I β 蛋白的功能在PGC-I β蛋白關(guān)連的各種活體功能的解析上是有益的。
[0066] 該PGC-I β蛋白的功能調(diào)整劑含有滑膜蛋白的表達抑制劑或滑膜蛋白的活性抑 制劑作為有效成分。滑膜蛋白的表達抑制劑及滑膜蛋白的活性抑制劑為公知。另一方面，