專利名稱：催淚蛋白的部分肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有催淚蛋白(Iacritin)的特定部分序列的多肽，所述催淚蛋白是淚液中的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多肽可以促進(jìn)細(xì)胞粘附、特別是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的細(xì)胞 粘附。而且，本發(fā)明的多肽可以促進(jìn)淚液分泌。
背景技術(shù)：
已知細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附涉及細(xì)胞的生存、運(yùn)動(dòng)性等各種功能。這是控制個(gè) 體的正常發(fā)育、組織的維持、或從損傷或感染中恢復(fù)的必需過程?；谶@種細(xì)胞粘附的信號(hào) 通路的異常有時(shí)導(dǎo)致發(fā)育異常、循環(huán)系統(tǒng)疾病、細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)移。另外，已報(bào)道了當(dāng)細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間的粘附受到抑制時(shí)，細(xì)胞陷入被稱作“失巢 凋亡(anoikis)”的細(xì)胞死亡，因此，與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附對(duì)于細(xì)胞的生存是重要的(參見 非專利文獻(xiàn)1)。催淚蛋白是被鑒定為淚液分泌促進(jìn)因子或類生長(zhǎng)因子蛋白的蛋白質(zhì)(參見專利 文獻(xiàn)1和2以及非專利文獻(xiàn)2)。關(guān)于催淚蛋白，下述1) 5)被報(bào)道1)催淚蛋白具有作為角膜上皮細(xì)胞和淚腺腺泡細(xì)胞的生長(zhǎng)因子的活性；2)催淚蛋白顯示出對(duì)淚液蛋白質(zhì)分泌的促進(jìn)效果；3)催淚蛋白表達(dá)于源于例如淚腺、耳下腺、小唾液腺、顎下腺、甲狀腺、乳腺及角膜 上皮等組織的細(xì)胞；4)含有催淚蛋白的滴眼劑可以用于治療例如干眼綜合癥、斯耶格倫氏綜合癥或角 膜上皮創(chuàng)傷等眼疾；5)利用表達(dá)催淚蛋白受體的細(xì)胞，通過催淚蛋白依賴的信號(hào)為指標(biāo)，可以篩選出 與催淚蛋白或催淚蛋白受體結(jié)合的化合物。另外，已報(bào)道在3H-胸苷攝取的檢測(cè)試驗(yàn)中，催淚蛋白或其兩端的一部分缺失的肽 具有促進(jìn)唾液腺細(xì)胞分裂的作用(參見非專利文獻(xiàn)3)。然而，至今沒有關(guān)于催淚蛋白或其片段(部分肽)涉及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)粘附的 報(bào)道。另外，還沒有關(guān)于催淚蛋白片段對(duì)來自淚腺腺泡細(xì)胞的淚液蛋白質(zhì)的分泌具有促進(jìn) 作用的報(bào)道。專利文獻(xiàn)1 :W002/065943專利文獻(xiàn)2 :W005/119899非專利文獻(xiàn)1 =Frisch, S. M. et al. , Journal of Cell Biology 124， pp. 619-626(1994)非專利 文 獻(xiàn) 2 =Sanghi, S. et al. , Journal of Molecular Biology 310， pp. 127-139(2001)非專利文獻(xiàn)3:Wang，J. et al. Journal of Cell Biology 174，pp. 689-700 (2006)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的目的是提供能夠促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間特別是角膜上皮細(xì)胞與細(xì)胞 外基質(zhì)之間粘附的物質(zhì)和/或具有促進(jìn)來自淚腺腺泡細(xì)胞的淚液蛋白質(zhì)分泌的作用的物質(zhì)。解決問題的方法本發(fā)明人鑒于上述問題已進(jìn)行深入研究，并發(fā)現(xiàn)具有催淚蛋白特定部分序列的多 肽可以促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附，并可以進(jìn)一步促進(jìn)來自淚腺腺泡細(xì)胞 的淚液蛋白質(zhì)的分泌，從而完成本發(fā)明。因此，本申請(qǐng)發(fā)明如下。[1]多肽，其包含SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列并具有70個(gè)殘基以下的氨基酸 長(zhǎng)度。[2]多肽，其包含SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列，其中1至3個(gè)氨基酸被缺失、置 換或添加，并具有與上述[1]所述的多肽等同的活性并具有70個(gè)殘基以下的氨基酸長(zhǎng)度。[3]如上述[1]所述的多肽，其中SEQ ID NO 1所示氨基酸序列以外的部分由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的部分序列組成。[4]多肽，其由上述[3]所述的多肽序列組成，其中1至3個(gè)氨基酸被缺失、置換或 添加，并具有與上述[3]所述的多肽等同的活性。[5]如上述[1]所述的多肽，其由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的部分序列組 成。[6]多肽，其由上述[5]所述的多肽序列組成，其中1至3個(gè)氨基酸被缺失、置換或 添加，并具有與上述[5]所述的多肽等同的活性。[7]多肽，其由SEQ ID NO :3 5任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成。[8]多肽，其由SEQ ID NO :3 5任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成，其中1至3個(gè)氨 基酸被缺失、置換或添加，并具有與上述[7]所述的多肽等同的活性。[9]細(xì)胞粘附促進(jìn)劑，其包含上述[1] [8]任一項(xiàng)所述的多肽。[10]促進(jìn)細(xì)胞粘附的方法，其包括將上述[1] [8]任一項(xiàng)所述的多肽以有效濃 度與細(xì)胞接觸。[11]淚液分泌促進(jìn)劑，其包含上述[1] [8]任一項(xiàng)所述的多肽。發(fā)明效果本發(fā)明可以提供一種新的多肽，所述多肽能夠促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間、特別 是角膜上皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附。本發(fā)明的多肽可通過將所述多肽加入用于制備 移植用角膜上皮片的培養(yǎng)基中來制備防止細(xì)胞脫落而長(zhǎng)期穩(wěn)定發(fā)揮功能的角膜上皮片。并 且，本發(fā)明可以提供一種新的多肽，所述多肽能夠發(fā)揮對(duì)源自淚腺腺泡細(xì)胞的淚液分泌的 促進(jìn)作用。直接作用于淚腺并且能夠發(fā)揮對(duì)淚液分泌的促進(jìn)作用的物質(zhì)可以是預(yù)防或治療 干眼癥以及干眼癥相關(guān)疾病的有用藥物。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的多肽的一個(gè)實(shí)施方式是包含由以下SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的多肽。QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO 1)
SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列相當(dāng)于由138殘基組成的SEQ ID NO 2所示的源 于人的全長(zhǎng)催淚蛋白(參見GenBank/EBI數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)NM_033277和ay005150 (基因組)) 中的69 102位。而且，本發(fā)明的多肽只要與上述多肽具有等同的活性，其可以是包含SEQ ID NO 1 所示的氨基酸序列的多肽，其中1至3個(gè)、優(yōu)選地1至2個(gè)、更優(yōu)選地1個(gè)氨基酸被缺失、置 換或添加。本發(fā)明的多肽的氨基酸長(zhǎng)度通常為70個(gè)殘基以下，優(yōu)選為60個(gè)殘基以下、特別優(yōu)選為32至58個(gè)殘基，最優(yōu)選為34至55個(gè)殘基。還優(yōu)選為35至55個(gè)殘基。只要本發(fā)明多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO :1所示氨基酸序列(或SEQ ID NO 1所示氨基酸序列，其中1至3個(gè)氨基酸被缺失、置換或添加)，它的其他部分可以是任意的 氨基酸序列。所述任意的氨基酸序列可以在SEQ ID NO :1所示氨基酸序列(或SEQ ID NO 1所示氨基酸序列，其中1至3個(gè)氨基酸被缺失、置換或添加)的N末端側(cè)、C末端側(cè)、或同 時(shí)在N末端側(cè)和C末端側(cè)存在。任意的氨基酸序列的實(shí)例包括SEQ ID NO :2所示的氨基酸 序列的部分序列(下述)。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽除了 SEQ ID NO :1所示氨基酸序列以外，僅由SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的部分序列組成。SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的部分序列是指SEQ ID NO :2所示氨基酸序列(催淚蛋白的氨基酸序列)中的任意部分序列，并且可以包含SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的一部分或全部。SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的部分序列可以被添 加至SEQID NO 1所示的氨基酸序列的N末端側(cè)、C末端側(cè)、或N末端側(cè)和C末端側(cè)二者。當(dāng)SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的部分序列被添加至SEQ ID NO :1所示氨基酸序 列的N末端側(cè)和C末端側(cè)二者時(shí)，它們可以是在SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中相互連續(xù) 的，也可以是不連續(xù)的，或者可以部分或全部相互重疊。此處，所獲得的多肽可以具有這樣的氨基酸序列，其中1至3個(gè)、優(yōu)選1至2個(gè)、更 優(yōu)選1個(gè)氨基酸被缺失、置換或添加，只要它具有與所述多肽等同的活性，即只要它維持所 述多肽的細(xì)胞粘附促進(jìn)作用和/或淚液分泌促進(jìn)作用。本發(fā)明的多肽更優(yōu)選地為具有70個(gè)殘基以下的包含SEQ ID NO=I所示氨基酸序 列的多肽，并且作為整體是由催淚蛋白的連續(xù)的部分肽組成。即，本發(fā)明的多肽的一個(gè)實(shí)施 方式是具有70個(gè)殘基以下的催淚蛋白的部分肽，其由SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的33 至138位部分的連續(xù)氨基酸序列組成。此處，所獲得的多肽可以具有這樣的氨基酸序列，其中1至3個(gè)、優(yōu)選1至2個(gè)、更 優(yōu)選1個(gè)氨基酸被缺失、置換或添加，只要它具有與所述多肽等同的活性，即只要它維持所 述多肽的細(xì)胞粘附促進(jìn)作用和/或淚液分泌促進(jìn)作用。本發(fā)明多肽的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式是由這樣的氨基酸序列組成的多肽，所述氨 基酸序列由下列SEQ ID NO 3-5任一項(xiàng)組成。VQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO 3)QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGG(SEQ ID NO 4)QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGGKQFIENGSEF(SEQ ID NO 5)SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列分別相當(dāng)于催淚蛋 白氨基酸序列(SEQ ID NO 2)的68至102位、69至113位或69至123位。換言之，由SEQID NO :3至5所示的氨基酸序列組成的本發(fā)明的多肽為催淚蛋白的部分肽。本發(fā)明的多肽的還另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式為由以下的SEQ ID NO :8組成的氨基酸序 列所組成的多肽。EISGPAEPASPPETTTTAQETSAAAVQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO 8)SEQ ID NO 8所示氨基酸序列相當(dāng)于催淚蛋白氨基酸序列(SEQ IDNO 2)的43至 102位。換言之，由SEQ ID NO :8所示氨基酸序列組成的本發(fā)明的多肽為催淚蛋白的部分肽。本發(fā)明的多肽是上述催淚蛋白的部分肽，可以具有這樣的氨基酸序列，其中1至3 個(gè)、優(yōu)選1至2個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)氨基酸被缺失、置換或添加，只要它與所述多肽具有等同的活 性，即，只要它維持所述多肽所具有的細(xì)胞粘附促進(jìn)作用和/或淚液分泌促進(jìn)作用。本說明書中，“氨基酸”通常是指“天然的氨基酸”。但是，只要滿足本發(fā)明的目的， 也可以是“非天然的氨基酸”。此處，“天然的氨基酸”是指天然的氨基酸的L-異構(gòu)體。天然 的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、苯丙 氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、組氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、 精氨酸、鳥氨酸以及賴氨酸。除非明確指出，本說明書中的所有氨基酸為L(zhǎng)型。但是，使用 D型氨基酸的實(shí)施方式也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此處，“非天然的氨基酸”是指蛋白質(zhì)中通常 不存在的氨基酸。非天然的氨基酸的實(shí)例包括正亮氨酸、對(duì)硝基苯丙氨酸、高苯丙氨酸、對(duì) 氟苯丙氨酸、3-氨基-2-芐基丙酸、高精氨酸的D型或D-苯丙氨酸。本說明書中，“部分肽”是由SEQ ID NO 2所示催淚蛋白的氨基酸序列的一部分所 組成的多肽。本說明書中，“氨基酸的缺失”是指從氨基酸序列的任意位置去除組成氨基酸。本說明書中，“氨基酸的置換”是指在氨基酸序列的任意位置用其他氨基酸置換組 成氨基酸。作為氨基酸的置換，保守置換是優(yōu)選的。保守置換是指氨基酸被具有等同性質(zhì) 的其他氨基酸替代的置換，原因在于肽化學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員期望多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親 水性質(zhì)沒有實(shí)質(zhì)變化。關(guān)于相互間保守置換的氨基酸組，通常已知為下列(1)甘氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；(2)丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮 氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；(3)甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨 酸；(4)亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；(5)谷氨酰胺和天冬酰胺；(6)谷氨酸和天冬氨酸；(7) 精氨酸、賴氨酸和組氨酸；(8)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。本說明書中，“氨基酸的添加”是指在氨基酸序列的任意位置添加任意氨基酸，并 包括氨基酸的插入。 如上所述，只要具有與所述多肽具有等同的活性，本發(fā)明的多肽可以具有這樣的 氨基酸序列，其中1至3個(gè)、優(yōu)選1至2個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)氨基酸被缺失、置換或添加，并且上 述多肽也屬于本發(fā)明的范圍。此處，“具有等同的活性”是指具有氨基酸缺失、置換或添加 前的多肽的細(xì)胞粘附促進(jìn)作用的約80%以上、優(yōu)選約90%以上。作為細(xì)胞粘附促進(jìn)作用， 促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間粘附的作用可以作為實(shí)例列舉。該作用可如下述實(shí)施例所述測(cè) 定將測(cè)試多肽添加在用適合的細(xì)胞外基質(zhì)包覆的板上，在其上形成角膜上皮細(xì)胞層，將細(xì) 胞培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間并對(duì)粘附的細(xì)胞計(jì)數(shù)?？蛇x地，“具有等同的活性”是指具有氨基酸缺失、置換或添加前的多肽的淚液分泌促進(jìn)作用的約80%以上、優(yōu)選約90%以上。作為淚液分泌促 進(jìn)作用，促進(jìn)來自淚腺腺泡細(xì)胞的淚液蛋白質(zhì)(例如乳鐵蛋白)的分泌作用可以作為實(shí)例 列舉。該作用可如下述實(shí)施例所述測(cè)定培養(yǎng)適合的淚腺腺泡細(xì)胞，將測(cè)試多肽添加至其培 養(yǎng)基中，并對(duì)培養(yǎng)基中所分泌的淚液蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。 另外，在不影響其活性的范圍內(nèi)，上述各多肽可以是衍生物，其中N末端氨基、C末 端羧基或氨基酸側(cè)鏈的官能團(tuán)被化學(xué)修飾。衍生化的實(shí)例包括在氨基添加保護(hù)基(例如乙 ?；⒓柞；?、Boc化、Fmoc化)、羧基的酯化(乙基化等)等。當(dāng)谷氨酰胺存在于N末端時(shí)， 側(cè)鏈可以是閉環(huán)以產(chǎn)生焦谷氨酸。各多肽可以根據(jù)已知方法以鹽的形式存在。作為多肽的鹽，藥理學(xué)上可接受的堿 (例如堿金屬)鹽或酸鹽以及藥理學(xué)上可接受的酸加成鹽是特別優(yōu)選的。藥理學(xué)上可接 受的酸加成鹽的實(shí)例包括無機(jī)酸(例如鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)鹽、有機(jī)酸(例如醋酸、 蟻酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、安息香酸、甲磺酸、苯磺 酸)鹽等等。本發(fā)明的多肽可以通過常規(guī)化學(xué)合成方法、重組DNA技術(shù)等等產(chǎn)生。當(dāng)本發(fā)明的多肽通過化學(xué)合成方法產(chǎn)生時(shí)，其可以根據(jù)已知的肽合成方法產(chǎn)生。 肽合成方法的實(shí)例包括固相合成法、液相合成法等，優(yōu)選固相合成法。固相合成法的實(shí)例包 括Fmoc法。Fmoc法是這樣的方法用9-芴甲氧羰基(Fmoc)基團(tuán)保護(hù)氨基、用叔丁醇 保護(hù)基保護(hù)側(cè)鏈官能團(tuán)，其中在用作為仲胺的哌啶對(duì)Fmoc基進(jìn)行去保護(hù)的同時(shí)Fmoc氨基 酸被縮聚，最后通過如三氟乙酸的弱酸去除側(cè)鏈保護(hù)基。即，從要合成的肽的C末端側(cè)反復(fù) 進(jìn)行選擇性去除α“氨基保護(hù)基和縮聚被保護(hù)的氨基酸的一系列操作以構(gòu)建被保護(hù)的肽 鏈，并且去除側(cè)鏈官能團(tuán)的保護(hù)基以得到目標(biāo)肽。在固相肽合成法中，也通常采用利用自動(dòng)肽合成裝置的合成(例如《新生化 學(xué)實(shí)驗(yàn)講座1蛋白質(zhì)IV》(1992)日本生化學(xué)會(huì)編，東京化學(xué)同人；“The Peptides Analysis, Synthesis, Biology" Vol.1-5, ed. by E. Gross, J. Meienhofer ；Vol. 6-9, ed. by S. Udenfriend, J. Meienhofer, Academic Press, New York(1979-1987))。當(dāng)通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽時(shí)，例如，基于編碼該多肽的cDNA堿基序 列設(shè)計(jì)引物，并以適合的cDNA文庫(kù)作為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行 擴(kuò)增，由此可以產(chǎn)生編碼多肽的cDNA。這種PCR方法是本技術(shù)領(lǐng)域熟知的并在例如“PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications”，Academic Press，Michael，et al.， eds. , 1990中描述。然后，將編碼本發(fā)明多肽的DNA并入到適合的表達(dá)載體中，然后將其引 入真核生物或原核生物細(xì)胞中，并表達(dá)各鏈以得到所需多肽?？捎糜诒景l(fā)明多肽表達(dá)的宿 主細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于原核生物宿主例如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿 菌(Bacillus subtilis)等和真核生物宿主例如酵母、真菌、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。 載體是可以轉(zhuǎn)染至細(xì)胞且在細(xì)胞基因組中或獨(dú)立于細(xì)胞基因組而可復(fù)制的單鏈或雙鏈核 酸分子。表達(dá)載體包括驅(qū)動(dòng)DNA表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)，并可以進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)序 列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列、3’非編碼區(qū)、增強(qiáng)子等。用于原核生物宿主的啟動(dòng) 子的實(shí)例包括bla啟動(dòng)子、cat啟動(dòng)子、IacZ啟動(dòng)子，用于真核生物宿主的實(shí)例包括小鼠金 屬硫蛋白I基因序列的啟動(dòng)子、皰疹病毒TK啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、酵母糖酵解酶基因 序列基因啟動(dòng)子等。載體的例子包括但不限于PBR322、pUC118、pUC119、AgtlO, AgtlUpMAM-neo、pKRC、BPV、牛痘(vaccinia)、SV40、2_micron 等。表達(dá)載體優(yōu)選含有一個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記從而可選擇含有該載體的宿主細(xì)胞。作為標(biāo)記，可使用那些為互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主提供營(yíng)養(yǎng)、提供抗生物抗性(例如氨芐青霉素、四環(huán) 素、新霉素、潮霉素、遺傳霉素等)或提供重金屬抗性的的標(biāo)記(例如銅)。而且，可以構(gòu)建這樣的載體從而利用信號(hào)序列使本發(fā)明的多肽分泌并表達(dá)、或者 使本發(fā)明的多肽以與不同多肽的融合多肽形式表達(dá)。通過使用融合多肽，可以改善多肽的 穩(wěn)定性、或者可以促進(jìn)純化。這種表達(dá)載體的構(gòu)建在本技術(shù)領(lǐng)域是熟知的。被構(gòu)建為表達(dá)本發(fā)明多肽的載體可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合、原生質(zhì)體融合、電穿孔、 粒子槍技術(shù)、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射等引入適合的宿主細(xì)胞。通過將含有載體的細(xì)胞在 適合的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，從細(xì)胞或培養(yǎng)基回收所需的重組多肽以及純化 多肽，可獲得本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的多肽也可以這樣產(chǎn)生通過例如Kimkel法或缺口雙鏈體法等已知方法 或其類似方法，在缺失、置換或添加氨基酸的位置加入修飾以得到編碼多肽的cDNA，并將基 因用于與上述重組DNA技術(shù)類似的重組DNA技術(shù)中。通過例如使用基于位點(diǎn)特異性突變 引入法的的突變引入試劑盒(例如 Mutant-K (Takara Bio Inc.)，Mutant-G (Takara Bio Inc.))等或TakaraBio Inc.的LA PCR體外突變系列試劑盒，可將突變引入基因?？梢允褂靡阎姆椒▽?duì)如上所述得到的本發(fā)明多肽進(jìn)行分離和純化。已知的分離 和純化方法的實(shí)例包括鹽析、溶劑沉淀、透析、超濾、凝膠過濾、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、 離子交換色譜、親和層析、逆相高效液相色譜、等電聚焦等。由此所得的本發(fā)明的多肽促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間特別是角膜上皮細(xì)胞與細(xì) 胞外基質(zhì)之間的粘附。以下對(duì)其具體用途進(jìn)行說明。(1)含有本發(fā)明多肽的角膜上皮片制備用培養(yǎng)液本發(fā)明的多肽在制備移植用角膜上皮片時(shí)，尤其可以促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞與基底的 粘附，原因在于對(duì)角膜上皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間粘附的促進(jìn)效果。角膜上皮片是活體角膜的代用物并且用于角膜渾濁的治療以恢復(fù)視力等。其用 于治療例如史蒂文斯約翰遜綜合癥、化學(xué)創(chuàng)傷等難治愈的角膜上皮疾病。角膜上皮片可這 樣制備例如在含有血清的培養(yǎng)基中將細(xì)胞例如角膜上皮細(xì)胞等加至基底例如羊膜或膠 原蛋白片上，培養(yǎng)細(xì)胞，通過與3T3成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)或氣升等而分層(Ophthalmology， vol.42, No. 3，pages245-250，2000)。作為角膜上皮片的制備方法，采用 W003/043542、 JP-A-2004-298447、JP-A-2004-261533、JP-A-2002-331025 等描述的已知方法。在角膜上皮片的產(chǎn)生方法中，可使用用于產(chǎn)生角膜上皮片的已知基底，而且可使 用源于活體生物的基底和人工制備的基底中的任一種。具體而言，對(duì)于源于活體生物的基 底可以是羊膜，對(duì)于源于人工的基底可以是膠原蛋白片。羊膜覆蓋子宮和胎盤最外層，并在 分娩過程中與胎盤一起被排出體外。作為用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以使用用于制備角膜上皮片的已知培養(yǎng)基，例 如 EpiLife 培養(yǎng)基(Cascade Biologies Inc.制造)、DMEM/F12 培養(yǎng)基(Invitrogen Corporation制造)、DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen Corporation制造)等，并且培養(yǎng)基可以 含有已知血清。盡管只要上述細(xì)胞可以生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)溫度不具體限制，但是通常為約 15°C _45°C。盡管只要上述細(xì)胞可以生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)時(shí)間不具體限制，但是通常為約1-30天。
被添加至培養(yǎng)基中用于制備角膜上皮片的本發(fā)明多肽可以是用于促進(jìn)角膜上皮 細(xì)胞與基底之間的粘附的活性成分。培養(yǎng)基中的多肽濃度通常為0. 0001w/v% -0. lw/v%, 優(yōu)選為0. 001w/v% -0. 01w/v%。本發(fā)明的多肽促進(jìn)基底的細(xì)胞外基質(zhì)與角膜上皮細(xì)胞之 間的固定，并且可以進(jìn)行牢固的角膜上皮片的制備，該角膜上皮片通過防止細(xì)胞脫落而長(zhǎng) 時(shí)間穩(wěn)定地發(fā)揮功能。(2)含有本發(fā)明多肽的藥物由于本發(fā)明的多肽促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附，其可用作細(xì)胞粘附促進(jìn) 齊U。本發(fā)明的粘附促進(jìn)劑可以用于源于哺乳動(dòng)物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、鳥、綿羊、馬、牛、 豬、猴子、黑猩猩、人等)的細(xì)胞(例如角膜上皮細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)膜細(xì)胞等)，優(yōu)選地 用于源于人的角膜上皮細(xì)胞。只要能夠與細(xì)胞粘附，細(xì)胞外基質(zhì)不具體限制并包括(1)纖 維狀蛋白質(zhì)例如膠原蛋白、彈性蛋白等，(2)細(xì)胞粘附糖蛋白例如纖連蛋白、層粘連蛋白、玻 連蛋白等，(3)復(fù)合糖例如包含肝素、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等的糖胺聚糖等，以及由這些細(xì) 胞外基質(zhì)組成的基膜(例如前彈力層、后彈力層、羊膜等)。已報(bào)道與細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞粘附對(duì)于細(xì)胞存活是重要的(Frisch，S.M. et al., J. Cell Biol. 1994,124,619. , Porcu, Μ. , et al. , Cornea 2007,26,73.) 還報(bào)道了在角膜 中，由于作為細(xì)胞外基質(zhì)之一的層粘連蛋白5的消失引起的抑制細(xì)胞粘附促進(jìn)了角膜上皮 細(xì)胞的死亡。由于本發(fā)明的多肽促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞粘附至由細(xì)胞外基質(zhì)組成的角膜上皮 的基膜(前彈力層等)，它抑制了眼表層上的角膜上皮細(xì)胞的死亡。另外，已知由分裂、移 動(dòng)(伸展)和粘附組成的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)參與角膜上皮的修復(fù)(Suzuki, K. et al.，Prog. Retin. EyeRes. 2003，22，113)。本發(fā)明的多肽促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中的粘附過程，從而促進(jìn)角膜上皮損傷 (即，創(chuàng)傷或缺損)的修復(fù)。因此，包含本發(fā)明多肽的藥物對(duì)于角膜上皮病癥的治療是有用的。作為引起角膜 上皮病癥的具體疾病可以是由物理或化學(xué)性刺激、過敏、細(xì)菌或真菌或病毒感染等引起的 角膜炎、角膜潰瘍、角膜上皮剝離(角膜糜爛)、角膜上皮浮腫、角膜熱傷、化學(xué)物質(zhì)等引起 的角膜腐蝕、干眼癥、眼球干燥癥、慢性表層角膜炎、淺層點(diǎn)狀角膜病變、角膜上皮糜爛、持 續(xù)性角膜上皮缺損等。本發(fā)明的多肽對(duì)于這些疾病相關(guān)的角膜上皮病癥的治療尤其有用。另外，本發(fā)明的多肽具有對(duì)源于淚腺腺泡細(xì)胞的淚液分泌的促進(jìn)作用。淚液覆蓋 由角膜和結(jié)膜組成的眼球表面，保持角結(jié)膜的濕潤(rùn)性并防止干燥。然而，近年來，由于淚液 減少相關(guān)的干燥的角結(jié)膜表面、戴隱形眼睛過程中干眼、或辦公自動(dòng)化設(shè)備操作過程中干 眼等，越來越多的人抱怨各種癥狀例如疲勞感、異物感，即干眼癥。干眼癥有時(shí)伴隨由角膜 上皮細(xì)胞病癥引起的角膜上皮病癥或角膜上皮糜爛等，嚴(yán)重的情況下可發(fā)生角膜潰瘍或眼 部感染。為了緩解這些與干燥相關(guān)的各種癥狀，使用主要含有鹽例如氯化鈉等的人工淚液， 以及含有羥乙基纖維素、硫酸軟骨素或透明質(zhì)酸等的滴眼劑。但是，就目前情況，還沒有發(fā) 展出令人滿意的試劑。雖然這些癥狀療法能夠減輕癥狀，但是它不是用于根治性治療的原 因療法。淚液由于其內(nèi)在功能而被認(rèn)為具有治療干眼引起的角結(jié)膜病癥的效果，因此，直接 作用于淚腺以促進(jìn)淚液分泌的物質(zhì)被期待為對(duì)于干眼癥及干眼癥相關(guān)疾病有用的預(yù)防和 治療藥物。盡管含有本發(fā)明多肽的藥學(xué)產(chǎn)物的劑量形式不具體限制，但是優(yōu)選為滴眼劑、洗眼劑、眼軟膏、片劑等，更優(yōu)選為滴眼劑或眼軟膏。這些可以通過廣泛使用的技術(shù)制備。例 如，滴眼劑可以通過適當(dāng)?shù)鼗旌咸砑游锢绲葷B劑、緩沖劑、PH調(diào)節(jié)劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn) 定劑、保存劑等來制備。另外，穩(wěn)定的滴眼劑也可通過添加PH調(diào)節(jié)劑、增稠劑、分散劑等并 懸浮藥物來獲得。等滲劑的實(shí)例包括甘油、丙二醇、氯化鈉、氯化鉀、山梨醇、甘露醇等。緩沖劑的實(shí)例包括磷酸、磷酸鹽、檸檬酸、醋酸、ε “氨基己酸、氨丁三醇等。ρΗ調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括鹽酸、檸檬酸、磷酸、醋酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、硼酸、四硼酸 鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉等。增溶劑的實(shí)例包括聚山梨酸酯80、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚乙二醇4000等。增稠劑和分散劑的實(shí)例包括纖維素聚合物例如羥丙基甲基纖維素、羥基丙基纖維 素等、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。另外，穩(wěn)定劑的實(shí)例包括依地酸、依地酸鈉等。 常規(guī)保存劑的實(shí)例包括山梨酸、山梨酸鉀、苯扎氯銨、芐索氯銨、對(duì)羥基苯甲酸甲 月旨、對(duì)羥基苯甲酸丙脂、氯丁醇等。這些保存劑也可以組合使用。含有本發(fā)明多肽的滴眼劑期望地具有4至8的ρΗ以及約為1的滲透壓比。在含有本發(fā)明多肽的藥學(xué)產(chǎn)物中，本發(fā)明多肽的濃度可以根據(jù)癥狀、年齡等設(shè)定 而不具體限制。例如，當(dāng)本發(fā)明的多肽被包含在滴眼劑、洗眼劑等時(shí)，其濃度為0. OOlw/ v% -lw/v%，優(yōu)選為0. 05w/v% -0. 5w/v%。例如，在滴眼劑中的劑量是每次滴注一滴至數(shù) 滴，每天一次至數(shù)次。滴眼劑可以是通常的滴注液或當(dāng)使用時(shí)被溶解的滴注液。含有本發(fā)明多肽作為有效成分的藥學(xué)產(chǎn)物可用于例如哺乳動(dòng)物(例如大鼠、小 鼠、豚鼠、鳥、綿羊、馬、牛、豬、猴子、黑猩猩、人等)等。實(shí)施例下面通過參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但實(shí)施例不被解釋為具有限定性。實(shí)施例1多肽的合成通過固相合成法合成多肽。具體地，將芴甲氧羰基(Fmoc)基引入氨基酸并用樹脂 支持該氨基酸。然后，使用二氯甲烷作為溶劑，2- (1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基 脲(HBTU)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)作為交聯(lián)劑進(jìn)行酰胺鍵形成反應(yīng)。使用DMF/20%哌啶 去除保護(hù)基。所得的產(chǎn)物通過高效液相色譜(柱0DS、溶劑水/乙腈/0. 05% TFA)純化。 由此，獲得由下列氨基酸序列組成的多肽1-3。多肽1 :VQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ IDNO 3)白色粉末 MALDI-T0F-MS 計(jì)算值3750. 13 ；實(shí)際值3752. 27 ；純度(HPLC A/ Α% )96· 207%多肽2 QGTAKVTS SRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGG(SEQID NO 4)白色粉末MALDI-T0F-MS 計(jì)算值4588. 35 ；實(shí)際值4590. 14 ；純度(HPLC A/ Α% )96· 88%多肽3:QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKAGKGMHGGVPGGKQFIENGSEF(SEQ ID NO 5)白色粉末MALDI-T0F-MS 計(jì)算值5768. 64 ；實(shí)際值5767. 61 ；純度(HPLC A/ Α% )95· 15%
實(shí)施例2多肽的合成通過固相合成法合成多肽。具體地，將芴甲氧羰基(Fmoc)基引入氨基酸并用樹脂 支持該氨基酸。并且，使用二氯甲烷作為溶劑以及2-(1Η-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四 甲基脲(HBTU)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)作為交聯(lián)劑進(jìn)行酰胺鍵形成反應(yīng)。使用DMF/20% 哌啶去除保護(hù)基。所得的產(chǎn)物通過高效液相色譜(柱0DS、溶劑水/乙腈/0. 05% TFA) 純化。由此，獲得由下列氨基酸序列組成的多肽6和7。多月太6:QGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQAL AKA(SEQ ID NO 1)白色粉末 MALDI-T0F-MS 計(jì)算值3653. 27 ；實(shí)際值3652. 28 ；純度(HPLC A/ Α% )99· 26%多肽7:EISGPAEPASPPETTTTAQETSAAAVQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILLTEQALAKA(SEQ ID NO 8)白色粉末MALDI-T0F-MS 計(jì)算值6148. 92 ；實(shí)際值6146. 82 ；純度(HPLC A/ Α% )87· 47%對(duì)比實(shí)施例1以上述實(shí)施例1相同的方法，得到由下列氨基酸序列組成的多肽4和5。多肽4 :EISGPAEPASPPETTTTAQETSAAAVQGTAKVT(SEQ ID NO 6)白色粉末MALDI-T0F-MS 計(jì)算值3197. 56 ；實(shí)際值3199. 98 ；純度(HPLC A/ Α% )99· 53%多肽5 :QGTAKVTSSRQELNPL(SEQ ID NO 7)白色粉末MALDI-TOF-MS 計(jì)算值1728. 94 ；實(shí)際值1728. 82 ；純度(HPLC A/ Α% )98· 01%實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1 催淚蛋白的部分肽對(duì)人角膜上皮細(xì)胞向細(xì)胞外基質(zhì)粘附的促進(jìn)作 用將細(xì)胞外基質(zhì)溶液(10μg/mL，膠原蛋白型 IV =Becton, Dickinson and Company) 加入96孔板(Iwaki Glass Company, Limited)。將溶液在37°C培養(yǎng)1小時(shí)以用細(xì)胞外基 質(zhì)包覆板。除去過量的細(xì)胞外基質(zhì)溶液后，加入0. 的BSA溶液(Sigma-Aldrich Co.)以 封閉沒有用細(xì)胞外基質(zhì)包覆的區(qū)域。接著，去除BSA溶液并用PBS洗滌板2次，將實(shí)施例1 和對(duì)比實(shí)施例1合成的多肽1-5 (濃度100 μ g/mL)以每孔50 μ L添加。而且，將建立的人 角膜上皮細(xì)胞(HCE-T 可通過Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995，36，614所描述的方法制 備)在無血清的條件下過夜培養(yǎng)，并以2X104個(gè)細(xì)胞/IOOyL DMEM/F12培養(yǎng)基/孔添加至 板。將板在37°C溫育20分鐘以使細(xì)胞粘附于板。通過MTT測(cè)試(D0JIND0 LABORATORIES) 計(jì)算所粘附細(xì)胞的數(shù)量。以未添加多肽作為100%計(jì)算細(xì)胞粘附比率并顯示于表1。表權(quán)利要求
1.一種多肽，其包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列并具有70個(gè)殘基以下的氨基酸 長(zhǎng)度。
2.一種多肽，其包含SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，其中1至3個(gè)氨基酸被缺失、置 換或添加，具有與權(quán)利要求1所述的多肽等同的活性并且具有70個(gè)殘基以下的氨基酸長(zhǎng)度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中SEQID NO 1所示氨基酸序列以外的部分由SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的部分序列組成。
4.一種多肽，其由根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽的氨基酸序列組成，其中1至3個(gè)氨基酸 被缺失、置換或添加，并且具有與根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽等同的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其由SEQID NO :2所示的氨基酸序列的部分序列組成。
6.一種多肽，其由根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽的序列組成，其中1至3個(gè)氨基酸被缺 失、置換或添加，并且具有與權(quán)利要求5所述的多肽等同的活性。
7.一種多肽，其由SEQ ID NO :3-5任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成。
8.一種多肽，其由SEQ ID NO :3 5任一項(xiàng)所示的氨基酸序列組成，其中1至3個(gè)氨 基酸被缺失、置換或添加，并且具有與根據(jù)權(quán)利要求7所述的多肽等同的活性。
9.一種細(xì)胞粘附促進(jìn)劑，其包含權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽。
10.一種促進(jìn)細(xì)胞粘附的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的多肽以有效 濃度與細(xì)胞接觸。
全文摘要
本發(fā)明公開了包含催淚蛋白部分序列的多肽，其可促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附。本發(fā)明還公開了包含催淚蛋白部分序列的多肽，其具有淚液分泌促進(jìn)活性。本發(fā)明具體公開了包含SEQ ID NO1(其是催淚蛋白特定部分序列)所示氨基酸序列并且具有70個(gè)以下殘基的氨基酸長(zhǎng)度的多肽。所述多肽可促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附。所述多肽還可促進(jìn)淚腺腺泡細(xì)胞中的淚液分泌。
文檔編號(hào)C12N15/00GK102083974SQ200980109468
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月19日
發(fā)明者東光佳, 中島毅 申請(qǐng)人:千壽制藥株式會(huì)社