BL/6小鼠交配，獲得新霉素序列被除去的小鼠。此外，并入目標載體的外顯子-Long arm間的IoxP序列在同源性重組時可能有缺陷，故以PCR確認其存在。
[0164] 將所得的新霉素去除小鼠與CAG-Cre小鼠交配，獲得CAG-Cre ;syn〇fWfl°x小鼠 (具有同型組合型的在CMV強化子與雞β -actin啟動子的控制下導入有IoxP的滑膜蛋 白對偶基因與 Cre-ER 導入基因（參照 Hayashi, S·，and McMahon，A.P. (2002) .Efficient recombination in diverse tissues by a tamoxifen (他莫昔芬）-inducible form of Cre:a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev Biol 244, 305-318.))。
[0165] 前述小鼠可透過他莫昔芬（Tam)來誘發(fā)滑膜蛋白基因剔除。
[0166] 他莫昔芬在 CAG-Cre ; synofWfl°x小鼠 （syno cKO)及同型組合型 syno fwfklMHt (syno WT)出生后、7~8周間后進行投予。為了使投予的他莫昔芬成為20mg/ml而使用溶 解于玉米油（WAKO)者。他莫昔芬的投予量，一日約125mg/kg的他莫昔芬溶液于腹腔內連 續(xù)5日投予。
[0167] 其中，他莫昔芬投予讓滑膜蛋白被基因剔除，是藉由對基因體上的滑膜蛋白進行 PCR的方法、滑膜蛋白mRNA進行實時PCR的方法、滑膜蛋白蛋白進行蛋白印跡法的方法等來 確認。
[0168] (實施例1 : β氧化及線粒體生合成相關連的因子的轉錄）
[0169] 為了研究滑膜蛋白使末梢性的能量消耗改變的可能性，使用微數(shù)組對于來自滑膜 蛋白基因剔除小鼠的白色脂肪細胞徹底地進行基因表達解析。
[0170] 其結果可知，與滑膜蛋白WT小鼠相比，滑膜蛋白基因剔除小鼠中Ppara、Cptlb、 Cpt、Acox2、Ehhadh、Acsll、Acat2等β氧化相關的許多基因，及Pgc-lα、UCP3、cidea、 C〇x8b等線粒體生合成相關的基因有顯著的表達增大。
[0171] 然后，使用實時RCR確認該基因的表達。具體而言，從來自滑膜蛋白基因剔除小鼠 (syno cKO)的白色脂肪細胞中藉由例行方法粹取總RNA，進行實時PCR。實時PCR所使用的 引物是使用下述表1所示的各種引物。
[0172] [表 1]
[0174] F :前進，R :倒退
[0175] 此外，對照是使用來自滑膜蛋白野生型小鼠 （syno WT)的白色脂肪細胞以同樣方 式進行實時PCR。
[0176] 其中，實時PCR的反應條件如下所述。
[0177] Stagel (聚合酶活性化）：95°C IOmin
[0178] Stage2(熱變性）：95°C Isec
[0179] (黏合/延伸反應）60°C 20sec
[0180] Stage3 :將 Stage2 進行 40cycle
[0181] 又，即時 PCR 裝置使用的是 Step One Plus (Applied Biosystems 公司制）。
[0182] 其中，各測定值是利用作為內源性對照組的18s ribosomal RNA進行標準化，syno WT的平均值（η = 3)作為1并以此比例表示。結果示于圖1。
[0183] 從圖1可知，β氧化及線粒體生合成相關的基因群的轉錄有增加。因此，教示白 色脂肪細胞內的線粒體是滑膜蛋白基因剔除小鼠的標靶。
[0184] (實施例2 :滑膜蛋白基因剔除小鼠中線粒體的觀察）
[0185] 對于實施例所用的來自滑膜蛋白基因剔除小鼠 （syno cKO)的白色脂肪細胞 使用電子顯微鏡并藉由例行方法來觀察線粒體。作為對照是將來自滑膜蛋白野生型小鼠 (syno WT)的白色脂肪細胞以相同方式進行觀察。結果示于圖2左。
[0186] 又，來自脂肪細胞特異性地將基因剔除滑膜蛋白的小鼠 （syno Adipose K0)的白 色脂肪細胞亦以相同方式進行觀察。結果示于圖2右。其中，脂肪特異性滑膜蛋白基因剔 除小鼠的制作，首先是將Syvnl fl°x/fl°x小鼠與脂肪酸結合蛋白4 (aP2) -Cre小鼠 （Jackson Immunoresearch Laboratories)交配，獲得包含 aP2_Cre_ER ;Syvnlfl°x/+小鼠等的復合 異型合子，接著將aP2-Cre ;SyvnlfW+小鼠與Syvnl fWfl°M、鼠交配作為二次交配，獲得 aP2-Cre ;SyvnlfWfl°x小鼠。其中，將具有Syvnl fWfl°x的基因型，欠缺Cre轉基因的小鼠作 為對照小鼠。
[0187] 從圖2A及B可知，與滑膜蛋白來自野生型小鼠的白色脂肪細胞相比，來自滑膜蛋 白基因剔除小鼠的白色脂肪細胞中線粒體的數(shù)量有顯著地增加，此外線粒體的尺寸有顯著 地增大。
[0188] (實施例3 :滑膜蛋白與PGC-I β在體外的結合）
[0189] 至今，具有控制β氧化與線粒體的復制兩者的活性的因子已知有與脂肪細胞的 分化和活性密切相關的轉錄因子家族PPAR (PPAR a、PPAR γ )與它的轉錄輔助激活因子PGC 家族（PGC-1 a，PGC-I β，PRC)。因此，將前述各因子與滑膜蛋白蛋白的結合進行確認。
[0190] 首先，將缺少膜貫通結構域的GST融合滑膜蛋白（GST syno Δ TM)與谷胱甘肽-瓊 脂糖凝膠4B培養(yǎng)。前述GST融合蛋白與來自表達HA PPARy、HA PPARa、HA PGC-I α或 HA PGC-I β的ΗΕΚ-293Τ的各種全細胞抽提物一起培養(yǎng)。將結合的蛋白溶出，用SDS-PAGE 分離，再以抗HA抗體進行蛋白印跡法。對照是使用未與蛋白融合的GST。其結果示于圖3。
[0191] 圖3中，對照的GST未與任何一種蛋白結合。另一方面，GST syno Δ TM雖與HA PGC-I β結合，但未與HA PGC-Ia、HA PPARy及HA PPARa結合。因此，顯示出PGC-I β與 滑膜蛋白蛋白選擇性結合。
[0192] (實施例4 :滑膜蛋白與斷片化突變PGC-I β在體外的結合）
[0193] 為了鑒別與滑膜蛋白結合的PGC-I β的結合部位，使用PGC-I β的斷片化突變的 系列（參照圖4)進行GST pulldown試驗。
[0194] 具體而言，是藉由已發(fā)表論文（Aratani, S. st al.，（2001) · Dual roles of RNA helicase A in CREB-dependent transcription. Mol Cell Biol 21,4460-4469·)所述的 方法利用PCR法進行PGC-I β的斷片化。各斷片化PGC-I β突變體的概念圖示于圖4。使 用在體外轉錄/翻譯的帶HA標簽的PGC-I β斷片化突變體和GST或GST-滑膜蛋白Δ TM 進行體外結合試驗。將該蛋白溶出，用SDS-PAGE分離，再以抗HA抗體進行蛋白印跡法。結 果示于圖4。
[0195] 從圖4可知滑膜蛋白會和PGC-I β中包含獨特的LXXLL模體的PGC-I β結構域 (195~367胺基酸結構域）結合。關于PGC-I β的195~367胺基酸結構域，是在PGC-I α、 PRC中不存在的獨特序列。
[0196] (實施例5 :斷片化突變滑膜蛋白與PGC-I β在體外的結合）
[0197] 為了鑒別與PGC-I β結合的滑膜蛋白的結構域，使用滑膜蛋白的斷片化突變的系 列（參照圖5及已發(fā)表論文Yamasaki et al·，2007)進行GST pulldown試驗。以與實施 例4相同的方式培養(yǎng)在體外轉錄/翻譯所制作的HA PGC-I β和GST或與GST融合的滑膜 蛋白斷片化突變體，利用抗HA抗體進行蛋白印跡法。結果示于圖5。
[0198] 從圖5可知PGC-I β會與包含滑膜蛋白中獨特且保留的結構域（第236號~第 270號的胺基酸序列，以下稱"SyU結構域"）的滑膜蛋白的中央部分結合。又，可知在與 PGC-I β的結合方面僅SyU結構域即已足夠，以及從syno Δ TM可知SyU結構域有缺陷的突 變體（Syno ATMASyU)無法與PGC-I β結合。由此可知，SyU結構域為與PGC-I β結合的 最小結構域。
[0199] (實施例6 :滑膜蛋白與PGC-I β在體內的結合）
[0200] 對于滑膜蛋白與PGC-I β在體內是否會實際形成復合體進行驗證。具體而言，首 先將表達帶有HA標簽的PGC-I β (HA PGC-I β)的質粒與表達帶有FLAG標簽的滑膜蛋白 (SYVN1/FLAG)或滑膜蛋白突變體（SYVNIASyU/FLAG)的質粒轉染至HEK-293T細胞中。從 轉染了前述表達質粒的HEK-293T細胞中準備全細胞抽提物，利用抗FLAG抗體進行免疫沉 淀。將與抗FLAG抗體結合的蛋白溶出，用SDS-PAGE分離，再以抗HA抗體及抗FLAG抗體進 行蛋白印跡法。結果示于圖6A。
[0201] 圖 6A 中，HA PGC-I β 與 SYVN1/FLAG 共免疫沉淀，但未與 SYVNl Δ SyU/FLAG 共免 疫沉淀。這顯示在體內，滑膜蛋白（SYVNl)會經(jīng)由SyU結構域而與PGC-I β結合。
[0202] 為了進一步調查滑膜蛋白與PGC-Ιβ的物理上的結合，將表達滑膜蛋白與 PGC-I β的ΗΕΚ-293Τ細胞的全細胞溶解液利用抗滑膜蛋白抗體進行沉淀，再利用抗 PGC-I β抗體進行免疫印跡法。結果示于圖6Β。
[0203] 圖6Β中，內源性的PGC-I β與抗滑膜蛋白抗體沈降而被檢測出。另一方面，非免 疫小鼠 IgG則未檢測出。這件事顯示滑膜蛋白與PGC-I β在體內有物理上的結合。
[0204] (實施例7 :滑膜蛋白及PGC-I β的細胞內定位）
[0205] 目前已知滑膜蛋白為ER常在性的蛋白，PGC-Ιβ會往核內移動，故調查滑膜蛋白 及PGC-I β的細胞內定位。將HA PGC-I β及/或syno/FLAG、滑膜蛋白3S/FLAG或滑膜蛋 白Δ SyU/FLAG表達質粒轉染至HEK-293T細胞中，24小時后使用抗HA抗體及抗FLAG抗體 進行由免疫熒光染色來調查滑膜蛋白及PGC-I β的細胞內定位。結果示于圖7。
[0206] 從圖7可知，當僅使HA PGC-Ιβ過表達時，如同目前為止的報告（Kelly et al.，2009)，HA PGC-I β主要是位于核中。另一方面，當HA PGC-I β與syno/FLAG -起表達 時，HA PGC-I β并非位于核內，而主要是與syno/FLAG -起位于核周邊結構域。此外，當令 HA PGC-Ιβ與滑膜蛋白ASyU/FLAG-起表達時，HA PGC-Ιβ是位于核中。因此，該結果暗 示，滑膜蛋白會在核周邊結構域將PGC-I β進行捕捉，及體內中該隔離需要SyU結構域。
[0207] (實施例8 :滑膜蛋白造成的PGC-I β的泛素化）
[0208] 滑膜蛋白已知為一種Ε3泛素化酶（參照Amano, Τ.，et al. (2003).滑膜蛋白/ Hrdlj an E3ubiquitin ligase, as a novel pathogenic factor for arthropathy. Genes Dev 17,2436-2449.)，故對于PGC-I β是否為E3泛素化酶滑膜蛋白的基質進行了驗證。 使用在體外轉錄及翻譯的PGC-I β (FLAG - PGC)、泛素活性化酶El (El-His)、泛素結合酶 E2(UBE2G2-His)、及泛素（PK-His-HA-Ub)和 GST 結合滑膜蛋白突變體（Syno (236-338))進 行體外泛素化試驗。結果示于圖8A。
[0209] 圖 8A 中，ATP、PK-His-HA-Ub、El-His、UBE2G2-His 及 Syno(236-338)皆存在的條 件下有檢測出聚泛素化的PGC-I β。這可確認出體外中PGC-I β是滑膜蛋白的基質。
[0210] 接著，調查體內中PGC-Ιβ的泛素化。將ubiquitin/FLAG、HA PGC-1、及滑膜蛋白 或滑膜蛋白3S表達質粒轉染至HEK-293T細胞中。然后將前述HEK-293T細胞的全細胞抽 提物利用抗HA抗體進行免疫沉淀。將結合的蛋白溶出，用SDS-PAGE分離，再以抗FLAG抗 體進行蛋白印跡法。結果示于圖8B。
[0211] 圖8B中，表達滑膜蛋白WT的細胞中HA PGC-I β有被泛素化，但表達滑膜蛋白3S 的細胞中并沒有被泛素化。
[0212] 該結果暗示PGC-I β在體外及體內是滑膜蛋白推定上的基質。
[0213] 泛素化的蛋白會被蛋白酶體分解已為人熟知。因此，為了確認PGC-I β的蛋白水 平受到滑膜蛋白控制而進行了以下試驗。
[0214] 對于新生后滑膜蛋白經(jīng)基因剔除的小鼠 （syno cKO)，利用蛋白印跡法調查睪丸上 體及腸間膜中滑膜蛋白及PGC-I β的蛋白水平。
[0215] 圖8C中，來自滑膜蛋白基因剔除小鼠的白色脂肪細胞中PG