一種褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及脂質(zhì)體領(lǐng)域，具體是一種褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 褐藻酸寡糖（alginate oligosaccharides，A0S)主要是通過采用化學(xué)或是生物 方法降解褐藻膠得到的，它是由是2~10個a-L-古洛糖醛酸（G)或者其C5差向異構(gòu)體 β-D-甘露糖醛酸（M)通過β-1，4糖苷鍵連接而成的糖鏈。褐藻膠寡糖有很多功能：抗腫 瘤，褐藻膠寡糖對非特異性免疫或特異性免疫系統(tǒng)具有良好的激活和促進作用，能激活巨 噬細胞，激活后具有細胞毒作用，可抑制腫瘤細胞增殖從而殺死腫瘤；抗凝血作用，褐藻膠 寡糖保持了良好的抗凝活性，又有較小的副作用；降血糖血脂作用，合適劑量的褐藻膠寡糖 能較好地防止高膽固醇血癥的形成，有降脂、維護心血管正常功能的作用；免疫調(diào)節(jié)活性作 用等。但是褐藻膠寡糖的價格較為昂貴，因此提高褐藻膠寡糖的生物利用度尤為重要。
[0003] 脂質(zhì)體作為一種新型藥物載體，有利于增強藥物的靶向性，提高藥物的生物利用 度，增加藥物的穩(wěn)定性，降低藥物的毒副作用，達到藥物控釋緩釋的目的。納米脂質(zhì)體的制 備方法主要有薄膜分散法、乙醇注入法、逆向蒸發(fā)法、凍融法等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是通過逆相蒸發(fā)法制備得到褐藻膠寡糖脂質(zhì)體，本發(fā)明制備的褐藻 膠寡糖脂質(zhì)體穩(wěn)定而均勻，生物利用度高，可用于食品、保健品、藥品、飼料、添加劑等。
[0005] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是： 一種褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟： 步驟一、稱取一定量的膽固醇和大豆卵磷脂于小燒杯中，溶解于有機溶劑中； 步驟二、用PBS配制褐藻膠寡糖溶液，然后倒入配制好的有機溶劑中，磁力攪拌，超聲， 再磁力攪拌，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使有機溶劑全部揮發(fā)，在圓底燒瓶底部形成均勻的薄膜； 步驟三、用PBS溶液定容洗膜，再加入一定量的吐溫-80制備得到褐藻膠寡糖脂質(zhì)體， 將溶解后的液體超聲并置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0006] 進一步的，備得到的褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的組分為：褐藻膠寡糖，卵磷脂，膽固醇，吐 溫，其余為PBS。
[0007] 進一步的，所述有機溶劑是氯仿和乙醚，其體積比為2:3。
[0008] 進一步的，所述膽固醇和大豆卵磷脂重量比為4. 5:1。
[0009] 進一步的，所述褐藻膠寡糖的濃度為8. 5mg/mL。
[0010] 進一步的，外內(nèi)水相之比為5:1。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是：應(yīng)用本發(fā)明制備的脂質(zhì)體，質(zhì)量穩(wěn)定，脂質(zhì)體均勻，分布范 圍窄，褐藻膠寡糖的包封率為66. 07%，粒徑為338. 2nm，制備的脂質(zhì)體儲藏穩(wěn)定性好。本發(fā) 明利用逆相蒸發(fā)法來制備褐藻膠寡糖脂質(zhì)體，包封率比較高，穩(wěn)定性比較強。
【附圖說明】
[0012] 圖1是制備褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的方法流程圖。
[0013] 圖2是葡萄糖含量對吸光度的標準曲線圖。
[0014] 圖3是脂膽比對褐藻膠寡糖脂質(zhì)體制備的包封率影響圖； 圖4是褐藻膠寡糖濃度對褐藻膠寡糖脂質(zhì)體制備的包封率影響圖； 圖5是吐溫含量對褐藻膠寡糖脂質(zhì)體制備的包封率影響圖； 圖6是外內(nèi)水相之比對褐藻膠寡糖脂質(zhì)體制備的包封率影響圖； 圖7是脂膽比與外內(nèi)水相之比交互作用的響應(yīng)面示意圖； 圖8是脂膽比與吐溫交互作用的響應(yīng)面示意圖； 圖9是褐藻膠寡糖濃度與外內(nèi)水相之比交互作用的響應(yīng)面示意圖； 圖10是吐溫與外內(nèi)水相之比交互作用的響應(yīng)面示意圖； 圖11是褐藻膠寡糖脂質(zhì)體14天的釋放率示意圖。
【具體實施方式】
[0015] 為了更清晰地闡明本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合【具體實施方式】做進一步闡述。
[0016] 一種褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的制備方法，所述褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的組分及其含量：褐 藻膠寡糖8. 5mg/mL，卵磷脂99mg，膽固醇22mg，吐溫1% (1%的PBS量)，其余為PBS。
[0017] 1、褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的制備 稱取一定量的膽固醇和大豆卵磷脂(共121mg)于小燒杯中，溶解于15ml有機溶劑中 (氯仿：乙醚=2:3)。用PBS配制褐藻膠寡糖溶液3mL，然后倒入配制好的有機溶劑中，磁力 攪拌30min，超聲5min，再磁力攪拌5min，38°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使乙醚和氯仿全部揮發(fā)掉，使之在 圓底燒瓶底部形成一個均勻的薄膜；用PBS溶液定容洗膜，再加入一定量的吐溫-80制備得 到褐藻膠寡糖脂質(zhì)體，將溶解后的液體超聲17min于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0018] 2、空白脂質(zhì)體的制備 稱取一定量的膽固醇和大豆卵磷脂(共120mg)于50mL的小燒杯中，加入有機溶劑氯仿 和乙醚溶劑15mL (氯仿：乙醚=2:3)，用3mL的PBS代替上面的褐藻膠寡糖溶液，倒入配制 好的有機溶劑中，磁力攪拌30min，超聲5min，38°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使乙醚和氯仿全部揮發(fā)掉，使 之在圓底燒瓶底部形成一個均勻的薄膜；用PBS溶液定容洗膜，再加入0. 45mL的吐溫-80 制備得到空白脂質(zhì)體，將溶解后的液體超聲17min于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0019] 3、標準曲線的制備 精密稱取干燥恒重的葡萄糖200mg，用PBS溶解并稀釋至100ml，備用。精密吸取備用 液IOml加 PBS稀釋至100mL定容，得葡萄糖標準液，用pH=7. 4的磷酸鹽緩沖液（PBS)配制 成0. 2 mg/mL的標準溶液。精密吸取標準液100、200、…700微升，分別置于試管內(nèi)，各加 水使成2ml，再各加6%苯酚試劑I. 0ml，各管迅速滴加濃硫酸5. 0ml，立刻搖勻。沸水加熱 15分鐘，迅速冷卻，另取2mlPBS，同法操作加入試劑作空白對照。
[0020] 4、單因素試驗 固定脂膽比3:1、褐藻膠寡糖濃度6 mg/mL、吐溫含量1. 5%、外內(nèi)水相之比為5 :1這四 個因素中的三個因素來考察剩下的一個因素對包封率和粒徑的影響。
[0021] 5、響應(yīng)面優(yōu)化試驗 多因素試驗采用Box-Behnken設(shè)計，利用響應(yīng)曲面法進行分析優(yōu)化綜合之前的單因素 試驗結(jié)果，選擇脂膽比、褐藻膠寡糖濃度、外內(nèi)水相之比、吐溫含量為考察因素，以包封率為 響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0軟件進行優(yōu)化實驗的設(shè)計，進行四因素三水平的響應(yīng)面 分析實驗，分析結(jié)果，同時對模型進行驗證。
[0022] 6、包封率的測定 精密吸取Iml褐藻膠寡糖脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體于IOmL容量瓶中，定容后倒入到離心管 中，5000 r /min離心30 min，取上清液，用空白脂質(zhì)體作為對照組，在490nm處測定其吸光 值，代入回歸方程，測得游離寡糖的濃度（P游離)。
[0023] 精密吸取Iml褐藻膠寡糖脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體于IOml容量瓶中，加入9ml無水乙 醇破乳，再定容至l〇ml，倒入離心管，漩禍3 min，然后以5000 r /min離心30 min,取沉淀 溶解，用空白脂質(zhì)體作為對照組，在490nm處測定其吸光值，帶入代入回歸方程測得總寡糖 的濃度（PS)。
[0024] 包封率計算為：包封率（％) = (P總-P游離）/P總X 100% 7、粒徑的測定 使用馬爾文2000進行粒徑的測定，其測量范圍在0. 1-1000 μπι，設(shè)定水的折射率為 1. 33,使用通用的計算模型計算出粒徑大小。
[0025] 8、脂質(zhì)體穩(wěn)定性的評價
【主權(quán)項】
L一種褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟： 步驟一、稱取一定量的膽固醇和大豆卵磷脂于小燒杯中，溶解于有機溶劑中； 步驟二、用PBS配制褐藻膠寡糖溶液，然后倒入配制好的有機溶劑中，磁力攪拌，超聲， 再磁力攪拌，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使有機溶劑全部揮發(fā)，在圓底燒瓶底部形成均勻的薄膜； 步驟三、用PBS溶液定容洗膜，再加入一定量的吐溫-80制備得到褐藻膠寡糖脂質(zhì)體， 將溶解后的液體超聲并置于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>2. 如權(quán)利要求1所述的褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于：制備得到的褐藻 膠寡糖脂質(zhì)體的組分為：褐藻膠寡糖，卵磷脂，膽固醇，吐溫，其余為PBS。
3. 如權(quán)利要求1所述的褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于：所述有機溶劑是 氯仿和乙醚，其體積比為2:3。
4. 如權(quán)利要求2所述的褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于：所述膽固醇和大 豆卵磷脂重量比為4. 5:1。
5. 如權(quán)利要求2所述的褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于：所述褐藻膠寡糖 的濃度為8. 5mg/mL。
6. 如權(quán)利要求2所述的褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于：外內(nèi)水相之比為 5:1〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種褐藻膠寡糖脂質(zhì)體的制備方法，包括：步驟一、稱取一定量的膽固醇和大豆卵磷脂于小燒杯中，溶解于有機溶劑中；步驟二、用PBS配制褐藻膠寡糖溶液，然后倒入配制好的有機溶劑中，磁力攪拌，超聲，再磁力攪拌，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使有機溶劑全部揮發(fā)，在圓底燒瓶底部形成均勻的薄膜；步驟三、用PBS溶液定容洗膜，再加入一定量的吐溫-80制備得到褐藻膠寡糖脂質(zhì)體，將溶解后的液體超聲并置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。本發(fā)明制備的脂質(zhì)體，質(zhì)量穩(wěn)定，脂質(zhì)體均勻，分布范圍窄，褐藻膠寡糖的包封率為66.07%，粒徑為338.2nm，制備的脂質(zhì)體儲藏穩(wěn)定性好。本發(fā)明利用逆相蒸發(fā)法來制備褐藻膠寡糖脂質(zhì)體，包封率比較高，穩(wěn)定性比較強。
【IPC分類】A61P37-00, A61P9-00, A61K31-702, A61P35-00, A61P7-02, A61K9-127, A61P37-02, A61P3-06, A61P3-10
【公開號】CN104814929
【申請?zhí)枴緾N201510244873
【發(fā)明人】戴賢君, 張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)
【申請人】中國計量學(xué)院
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年5月14日