抗惡性黑色素瘤的干細(xì)胞制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗惡性黑色素瘤的干細(xì)胞制劑及其制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)研宄技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)是皮膚腫瘤的一種，是所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長(zhǎng)最快的腫瘤，年增長(zhǎng)率約3-5%。惡性黑色素瘤是由位于表皮基底部的黑色素細(xì)胞惡變形成的，多由痣或色素斑發(fā)展而來(lái)，一旦進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，則預(yù)后差、死亡率高，尤其是轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤，患者中位生存期僅約5-11月，I年總生存率只有27%，5年生存率<5%。惡性黑色素瘤90%發(fā)生于皮膚，最常見(jiàn)于背部，胸腹部和腿部，足底、指趾、甲下、頭皮等部位也不少見(jiàn)；少數(shù)發(fā)生于外陰、消化道和眼內(nèi)。
[0003]對(duì)于腫瘤的治療，目前常采用的方案為化療、放療及手術(shù)治療。化療對(duì)于惡性黑色素瘤并不敏感；同時(shí)黑色素瘤被認(rèn)為是一種抗輻射的惡性腫瘤，對(duì)于放療也不敏感，對(duì)于淋巴轉(zhuǎn)移或腫瘤很多手術(shù)效果不好的患者，此方法只能作為姑息治療的一種手段。這些措施對(duì)于很多癌癥病例的治療效果不大，而且化療和放療方法副作用太大，往往嚴(yán)重破壞患者的免疫系統(tǒng)。手術(shù)治療對(duì)于早期實(shí)體瘤治療效果較好，而大多數(shù)已發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性黑色素瘤患者在多數(shù)組織中已存在廣泛的病變，因此已無(wú)法進(jìn)行切除些有孤立病灶未見(jiàn)遠(yuǎn)處播散，僅有黑色素瘤結(jié)節(jié)的患者，也常常因?yàn)榇嬖谖⑥D(zhuǎn)移因而不能通過(guò)手術(shù)切除來(lái)控制其長(zhǎng)期存活的可能。對(duì)于那些喪失手術(shù)機(jī)會(huì)的IV期黑色素瘤患者的化療與放療目前無(wú)明顯進(jìn)展。但手術(shù)仍然是惡性黑色素瘤的一項(xiàng)重要治療手段。
[0004]因此，惡性黑色素瘤的治療目前仍是醫(yī)學(xué)界的一個(gè)難題，探索惡性黑色素瘤新的治療方法十分必要。腫瘤的免疫毒素治療是最近十幾年發(fā)展起來(lái)的新療法。免疫毒素(Immunotoxins, ITs)是將具有導(dǎo)向能力的腫瘤特異性分子與毒素蛋白偶聯(lián)而成的一種雜合分子。
[0005]由于導(dǎo)向分子可以特異地識(shí)別腫瘤細(xì)胞，所以免疫毒素在體內(nèi)可以像“導(dǎo)彈”一樣定向?qū)ふ夷[瘤細(xì)胞，并將其殺死，但同時(shí)對(duì)正常組織又不會(huì)造成損傷，因此又被稱為腫瘤治療的“生物導(dǎo)彈”。用于構(gòu)建免疫毒素“彈頭”的是毒素蛋白，如綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin，PE)、白喉毒素(Diphtheriatoxin，DT)以及萬(wàn)麻毒素(Ricin)。這些毒素分子對(duì)細(xì)胞的殺傷能力非常強(qiáng)，一般認(rèn)為，只要一個(gè)毒素分子進(jìn)入細(xì)胞，就可以使該細(xì)胞死亡，而且腫瘤細(xì)胞一般不會(huì)對(duì)毒素產(chǎn)生耐藥性。由于免疫毒素療法采取的是一種殺傷性策略，避免了停藥后復(fù)發(fā)和腫瘤產(chǎn)生耐藥性的缺點(diǎn)，是極具潛力的一種抗腫瘤治療方法。
[0006]腫瘤發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)外因素及分子生物學(xué)基礎(chǔ)涉及多種癌基因與抑癌基因的異常表達(dá)。近年來(lái)原癌基因Axl成為研宄的熱點(diǎn)之一，可作為惡性黑色素瘤診斷、預(yù)后與治療的靶向分子應(yīng)用于臨床工作中，已證實(shí)其作為新的靶向分子藥物的有效性。
[0007]Axl (Anexelekto)是編碼受體酪氨酸激酶基因之一，大小約140kD(ID=Iu)的跨膜分子，定位于19ql3.1，全長(zhǎng)42185 kb，由698個(gè)腺嘌呤、972個(gè)胞嘧啶、931個(gè)鳥(niǎo)嘌呤和626個(gè)胸腺嘧啶構(gòu)成，有20個(gè)外顯子。與Tyro3和Mer共同組成受體酪氨酸激酶亞家族(TAM family)，其核苷酸序列具有相似的分子結(jié)構(gòu)，均由胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)3部分組成。Axl及其配體生長(zhǎng)停滯特異性基因6( grow th arrest-specific protein 6，Gas6)參與細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞黏附與轉(zhuǎn)移、血液凝固的穩(wěn)定性以及調(diào)節(jié)炎癥因子釋放等作用，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤性血管生成及侵襲性等病理過(guò)程中扮演重要角色。
[0008]導(dǎo)向分子是免疫毒素治療的基礎(chǔ)，免疫毒素對(duì)腫瘤特異性的殺傷作用依賴于腫瘤細(xì)胞上特異性表達(dá)的標(biāo)志物。Axl廣泛高表達(dá)于多同的腫瘤組織和細(xì)胞系，包括惡性黑色素瘤。有研宄表明，是一個(gè)重要的黑色素瘤致癌基因。許多證據(jù)表明，在腫瘤的血管形成、月中瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，Axl發(fā)揮著重要作用。已證實(shí)應(yīng)用Axl蛋白的抗體靶向抑制試驗(yàn)，下調(diào)即Axl蛋白表達(dá)的同時(shí)，也抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而降低腫瘤的惡性程度。
[0009]免疫毒素革El向治療腫瘤需要考慮的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是如何確保免疫毒素選擇性地靶向殺傷腫瘤組織而且保護(hù)周圍的正常組織免受“誤傷”。傳統(tǒng)的免疫毒素雖然也能夠選擇性的靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，但是由于其天然的局限性:(A)難以滲透到腫瘤局部并達(dá)到一定的藥物濃度；(B)在非靶點(diǎn)組織的聚集降低了耐藥濃度且縮窄了治療窗口，因此臨床應(yīng)用受到很大的限制。因此，選擇合適的載體工具使免疫毒素在腫瘤內(nèi)起作用顯得非常重要。
[0010]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有取材方法簡(jiǎn)單，體外擴(kuò)增容易，外源基因表達(dá)穩(wěn)定具、分化潛力大、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低、取材方便、無(wú)道德倫理問(wèn)題的限制、易于工業(yè)化制備等諸多優(yōu)點(diǎn)，為我們展示了良好的研宄及應(yīng)用前景。大量文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞的優(yōu)良特點(diǎn)，如迀移能力和腫瘤趨化作用，可以作為良好的基因治療運(yùn)載工具。根據(jù)這一特點(diǎn)，將惡性黑色素瘤細(xì)胞特異性的免疫毒素基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，使其成為能夠分泌產(chǎn)生免疫毒素的細(xì)胞，可將免疫毒素基因帶到腫瘤局部持續(xù)表達(dá)并發(fā)揮作用。
[0011]基于以上背景，我們開(kāi)發(fā)一種可以分泌特異性重組免疫毒素Gas6-PE38KDEL的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，從而靶向治療惡性黑色素瘤。本制劑首先構(gòu)建Axl配體(Gas6)和綠膿奸菌外毒素衍生物PE38KEDL組成的特異性免疫毒素Gas6_PE38KDEL腺病毒載體，體外感染間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證實(shí)間充質(zhì)千細(xì)胞分泌的Gas6-PE38KDEL能夠特異性地靶向殺傷惡性黑色素瘤細(xì)胞。進(jìn)一步可將表達(dá)該特異性免疫毒素的間充質(zhì)干細(xì)胞回輸體內(nèi)，利用間充質(zhì)干細(xì)胞的趨瘤性，實(shí)現(xiàn)在腫瘤組織局部持續(xù)表達(dá)特異性免疫毐素Gas6-PE38KDEL，從而對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷效應(yīng)，為惡性黑色素瘤靶向治療提供新的治療策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是結(jié)合基因工程技術(shù)和干細(xì)胞生物技術(shù)開(kāi)發(fā)一種生物治療制劑:抗惡性黑色素瘤的干細(xì)胞制劑。
[0013]本發(fā)明同時(shí)提供了一種抗惡性黑色素瘤的干細(xì)胞制劑的制備方法。
[0014]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn): 一種抗惡性黑色素瘤的干細(xì)胞制劑是由可以分泌特異性重組免疫毒素GAS
6-PE38KDEL的間充質(zhì)干細(xì)胞制備而成。
[0015]進(jìn)一步的，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于骨髓、臍帶或胎盤(pán)，優(yōu)選來(lái)自骨髓源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0016]上述的一種抗黑色素瘤的干細(xì)胞制劑的制備方法，由以下步驟組成:
步驟一，構(gòu)建Axl配體(Gas6)和綠膿奸菌外毒素衍生物PE38KEDL組成的特異性免疫毒素Gas6_PE38KDEL腺病毒載體；
步驟二，以感染復(fù)數(shù)為800-1000的腺病毒體外感染間充質(zhì)干細(xì)胞，收集感染后3-18天的間充質(zhì)干細(xì)胞制備成干細(xì)胞制劑。
[0017]一種抗黑色素瘤的干細(xì)胞制劑的制備方法，所述的步驟一包括:
a、通過(guò)PCR獲得Gas6胞外端基因片段和綠膿桿菌外毒素衍生物PE38KDEL基因；
b、通過(guò)酶切手段及連接反應(yīng)，構(gòu)建出穿梭質(zhì)粒pAdTrack-Gas6_PE38KDEL，氯化鈣法制備含有骨架質(zhì)粒PAdEasy-1的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；
c、用限制性內(nèi)切酶PmeI線性化處理后與上述感受態(tài)細(xì)胞在細(xì)菌中進(jìn)行同源性重組，構(gòu)建重組腺病毒載pAd-Gas6-PE38KDEL ；
d、構(gòu)建重組腺病毒載pAd-Gas6-PE38KDEL的提取。
[0018]一種抗黑色素瘤的干細(xì)胞制劑的制備方法，所述的步驟二包括:
a、常規(guī)培養(yǎng)方法制備骨髓、臍帶或胎盤(pán)源間充質(zhì)干細(xì)胞，取其中生長(zhǎng)狀態(tài)良好的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行感染處理；
b、將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的間充質(zhì)干細(xì)胞按4xl05個(gè)/ml的密度接種于10mm培養(yǎng)皿，每皿加入8ml的含10%血清的正常細(xì)胞培養(yǎng)液(不含有抗生素)；
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