一種新型干細(xì)胞制劑及其治療腦出血的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新型干細(xì)胞制劑、以及其用于治療腦出血的用途，特別地，本發(fā)明涉及來自羊膜的干細(xì)胞制劑用于治療腦出血。
【背景技術(shù)】
[0002]腦出血(cerebral hemorrhage)又稱腦溢血，是指非外傷性腦實質(zhì)內(nèi)的自發(fā)性出血，病因多樣，絕大多數(shù)是高血壓小動脈硬化的血管破裂引起。腦出血是中老年人常見的急性腦血管病，病死率和致殘率都很高，是我國腦血管病中死亡率最高的臨床類型。高血壓腦出血的治療可分為內(nèi)科保守治療和外科手術(shù)治療?；颊叱鲅坎欢啵窠?jīng)功能損害較輕，或者患者一般情況較差不能手術(shù)治療的患者可選擇內(nèi)科保守治療。用藥物減輕血腫造成的繼發(fā)性損害，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)；防止并發(fā)癥。出血量大，病情較重需外科手術(shù)，清除血腫，減輕腦組織受壓，盡最大努力保證神經(jīng)功能。但神經(jīng)功能都會不同程度地受損。所以加速神經(jīng)功能的恢復(fù)是亟待解決的問題。
[0003]近年來，掀起干細(xì)胞治療的熱潮。干細(xì)胞具有多項分化潛能和自我更新能力。目前，干細(xì)胞的種類較多，如胚胎干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、臍帶干細(xì)胞、羊膜干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等。
[0004]胚胎干細(xì)胞目前尚存在倫理問題，骨髓及脂肪干細(xì)胞成體干細(xì)胞，相對成熟。羊膜在胎盤的最內(nèi)層，含羊水包裹著胎兒。胚胎發(fā)育I個月時，羊膜囊已發(fā)育完畢，羊膜較臍帶發(fā)育的更早。羊膜為孕婦生產(chǎn)時的廢棄物，不存在倫理問題而且來源豐富，可作為干細(xì)胞的極佳來源。
[0005]21世紀(jì)，是干細(xì)胞治療的時代，干細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞營養(yǎng)因子，包括EGF，bFGF，IGF, HGF, TNF- β等，這些因子能改善機(jī)體細(xì)胞生長的微環(huán)境，促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)自身組織損傷的修復(fù)，使之恢復(fù)功能。另外干細(xì)胞有多項分化潛能，可分化替代損傷的組織細(xì)胞并發(fā)揮功能。因此對于腦出血的術(shù)后治療選擇一種適合的干細(xì)胞及科學(xué)可行的治療方案，是目前亟待解決的問題。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0007]I采用羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，來源豐富，不存在倫理問題。細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。
[0008]2干細(xì)胞移植方式根據(jù)疾病不同而采取不同的方式，本發(fā)明是采用腦室內(nèi)損傷局部直接注射。而且在腦出血患者做引流術(shù)手術(shù)后留置引流管，待選擇合適時機(jī)通過引流管將干細(xì)胞注入，可避免因腦內(nèi)干細(xì)胞移植再次開顱創(chuàng)傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供了一種干細(xì)胞制劑，其中所述干細(xì)胞制劑包含治療有效量的間充質(zhì)干細(xì)胞、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基和bFGF，其中所述的間充質(zhì)干細(xì)胞來自哺乳動物的羊膜干細(xì)胞。
[0010]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的干細(xì)胞制劑，其中治療有效劑量是每kg病人體重大約I X 16個間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0011]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的干細(xì)胞制劑，其中間質(zhì)干細(xì)胞的濃度為5X 106-1.25X 107/ml，且 4ml DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)液中含 10ng/ml bFGF。
[0012]進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的干細(xì)胞制劑，其中所述哺乳動物是人。
[0013]進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的干細(xì)胞制劑，其被配制成干細(xì)胞混懸液。
[0014]另一方面，本發(fā)明提供了一種制備干細(xì)胞制劑的方法，所述方法包括以下步驟:
[0015]I)培養(yǎng)來自哺乳動物羊膜的間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0016]2)傳代擴(kuò)增步驟I)中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0017]3)用胰蛋白酶消化傳代擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)基終止消化作用；
[0018]4)將步驟3)的間充質(zhì)干細(xì)胞以5X 16-L 25X 107/ml的濃度混懸于含有bFGF的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基中。
[0019]另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的干細(xì)胞制劑、或根據(jù)本發(fā)明的方法制備的干細(xì)胞制劑在用于制備治療哺乳動物腦出血的患者的藥物中的用途。
[0020]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中所述干細(xì)胞制劑通過腦室施用。
【附圖說明】
[0021]圖1顯示患者鉆孔開顱，引流后，留置引流管。
[0022]圖2顯示將干細(xì)胞懸液注入到腦室內(nèi)。
[0023]圖3顯示縫合皮膚，將引流管埋于皮下，備第二次移植。
[0024]圖4A-圖4H表明流式細(xì)胞術(shù)檢測羊膜干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物，其中CD105、⑶73、和⑶90陽性的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)多95%，表面標(biāo)記物⑶45、⑶34、⑶14、⑶19、HLA-DR陽性的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)< 2%。
[0025]應(yīng)當(dāng)了解，所附附圖并非按比例地顯示了本發(fā)明的基本原理的圖示性的各種特征的略微簡化的畫法。本文所公開的本發(fā)明的具體設(shè)計特征包括例如具體尺寸、方向、位置和外形將部分地由具體所要應(yīng)用和使用的環(huán)境來確定。
[0026]在這些圖形中，貫穿附圖的多幅圖形，附圖標(biāo)記引用本發(fā)明的同樣的或等同的部分。
【具體實施方式】
[0027]本發(fā)明的目的在于提供一種針對腦出血術(shù)后促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的干細(xì)胞制劑，和臨床治療途徑。
[0028]第一方面內(nèi)容:
[0029]治療腦出血干細(xì)胞制劑的制備
[0030]I提取細(xì)胞:
[0031]A原料:健康孕婦剖宮產(chǎn)胎兒羊膜，供者肝炎病毒標(biāo)志物、梅毒、HIV檢測均陰性。供者對實驗知情同意，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。
[0032]B無菌條件下從胎盤剝離羊膜，用PBS洗滌數(shù)次，去除羊膜上的血絲及粘稠物。
[0033]C在生物安全柜內(nèi)，在培養(yǎng)皿中將羊膜剪成小塊，加入胰蛋白酶消化，血清中和。
[0034]D清除羊膜片上消化下來的上皮細(xì)胞后將羊膜片剪碎，用PBS洗滌，離心后的沉淀接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并傳代擴(kuò)增。
[0035]2制備腦出血干細(xì)胞制劑
[0036]A細(xì)胞增殖到一定數(shù)量后，將細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，用大量的不含血清的培養(yǎng)基來終止消化作用。
[0037]B干細(xì)胞制劑的制備
[0038]細(xì)胞營養(yǎng)液的配制:成分:DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液，bFGF。
[0039]用配好的細(xì)胞營養(yǎng)液4ml懸浮準(zhǔn)備好的干細(xì)胞，混勻后裝入注射瓶中，無菌密封。
[0040]第二方面
[0041]干細(xì)胞治療方案
[0042]I腦出血患者術(shù)前，對患者交代干細(xì)胞治療的作用和意義
[0043]2患者簽署干細(xì)胞臨床試驗治療知情同意書
[0044]3行血腫引流術(shù)。
[0045]4手術(shù)結(jié)束時，在腦室或血腫腔放置的引流管埋在皮下，無菌包扎。
[0046]5術(shù)后I周，生命體征平穩(wěn)，行干細(xì)胞治療。打開包扎的引流管，用注射器從瓶中抽出干細(xì)胞懸液后拔掉針頭，將注射器接到引流管上，緩慢注入干細(xì)胞混懸液。再注射2ml鹽水沖洗引流管中殘留細(xì)胞。
[0047]6拔下注射器，將引流管埋在皮下，無菌包扎，以備第二次干細(xì)胞移植。
[0048]7共通過此引流管移植3次，后拔出引流管，縫合頭皮，包紗布。
[0049]第三方面
[0050]干細(xì)胞治療后，與不移植相比，肢體功能明顯改善。
[0051]實施例
[0052]I提取細(xì)胞:
[0053]A原料:健康孕婦剖宮產(chǎn)胎兒羊膜，供者肝炎病毒標(biāo)志物、梅毒、HIV檢測均陰性。供者對實驗知情同意，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。:
[0054]B無菌條件下從胎盤剝離羊膜，用PBS洗滌數(shù)次，去除羊膜上的血絲及粘稠物。
[0055]C在生物安全柜內(nèi)，在培養(yǎng)皿中將羊膜剪成小塊，加入濃度為0.125%的胰蛋白酶消化30min后，血清中和。
[0056]D清除羊膜片上消化下來的上皮細(xì)胞后將羊膜片剪碎，用PBS洗滌，離心后的沉淀接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)并傳代擴(kuò)增。
[0057]使用流式細(xì)胞術(shù)檢測了來自羊膜的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物，其中CD105、⑶73、和⑶90陽性的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)多95%，表面標(biāo)記物⑶45、⑶34、⑶14、⑶19、HLA-DR陽性的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)< 2%。
[0058]2制備干細(xì)胞制劑
[0059]A細(xì)胞營養(yǎng)液的配制:DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液4ml含10ng/mlbFGF。
[0060]B細(xì)胞增殖到總數(shù)約達(dá)5X 17個時，將細(xì)胞用濃度為0.25%的胰酶消化，用相當(dāng)于5倍胰酶量的不含血清的培養(yǎng)基來終止消化作用。1000RPM，離心。用配好的細(xì)胞營養(yǎng)液懸浮離心沉淀的干細(xì)胞，混勻后裝入注射瓶中，無菌密封，其中，間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度時I X 17個 /ml ο
[0061]3腦出血患者的移植治療
[0062]做血腫引流術(shù)的腦出血患者
[0063]A術(shù)前，對患者交代干細(xì)胞治療的作用和意義
[0064]B患者簽署干細(xì)胞治療知情同意書
[0065]C手術(shù)結(jié)束時，在腦室或血腫腔放置引流管，無菌包扎。
[0066]D術(shù)后I周，生命體征平穩(wěn)，行干細(xì)胞治療，細(xì)胞濃度為I X 17個/ml，共4ml。打開包扎的引流管，放出6ml的腦脊液，用注射器從瓶中抽出4ml干細(xì)胞懸液后拔掉針頭，將注射器接到引流管上，緩慢注入干細(xì)胞混懸液。再注射2ml生理鹽水，沖洗引流管中殘留細(xì)胞。
[0067]E拔下注射器，將引流管埋在皮下，無菌包扎，以備第二次干細(xì)胞移植。
[0068]第二次和第三次移植步驟同第一次。間隔7天。I個療程3次。
[0069]第一次治療后5天，肌張力也有所下降，肌力增加。治療一個療程后，陸續(xù)顯現(xiàn)療效，包括患者語言障礙減輕，肢體偏癱導(dǎo)致的運動障礙均有改善。
【主權(quán)項】
1.一種干細(xì)胞制劑，其中所述干細(xì)胞制劑包含治療有效量的間充質(zhì)干細(xì)胞、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基和bFGF，其中所述的間充質(zhì)干細(xì)胞來自哺乳動物的羊膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞制劑，其中治療有效劑量是每kg病人體重大約IX 16個間充質(zhì)干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞制劑，其中間質(zhì)干細(xì)胞的濃度為5X10 6-1.25X 17/ml，且 5ml DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)液中含 10ng/ml bFGF。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞制劑，其中所述哺乳動物是人。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞制劑，其被配制成干細(xì)胞混懸液。
6.一種制備干細(xì)胞制劑的方法，所述方法包括以下步驟: 1)培養(yǎng)來自哺乳動物羊膜的間充質(zhì)干細(xì)胞； 2)傳代擴(kuò)增步驟I)中培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞； 3)用胰蛋白酶消化傳代擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)基終止消化作用； 4)將步驟3)的間充質(zhì)干細(xì)胞以5X16-L 25XlOVml的濃度混懸于含有bFGF的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的干細(xì)胞制劑、或根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法制備的干細(xì)胞制劑在用于制備治療哺乳動物腦出血的患者的藥物中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述干細(xì)胞制劑通過腦室施用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型干細(xì)胞制劑及其治療腦出血的用途，特別地，發(fā)明涉及包含治療有效量的間充質(zhì)干細(xì)胞、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、和bFGF用于治療腦出血的用途。
【IPC分類】A61K35-50, A61P7-04, A61P25-00
【公開號】CN104546916
【申請?zhí)枴緾N201510063669
【發(fā)明人】畢薇薇, 李志剛
【申請人】吉林省拓華生物科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年2月6日