一種t細(xì)胞高活性的啟動(dòng)子及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種啟動(dòng)子，具體地，涉及一種人工合成的嵌合 啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在T細(xì)胞中具有高活性。本發(fā)明還涉及含有該啟動(dòng)子的重組載體、重組病 毒、以及所述啟動(dòng)子控制外源基因在轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞治療中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 針對惡性腫瘤的免疫治療近年來發(fā)展迅速，取得令人矚目的臨床療效。2011年， Nature及臨床腫瘤最頂級雜志JC0分別發(fā)表相同題目"腫瘤免疫治療的時(shí)代已經(jīng)來臨"的 評論文章（Nature. 2011 ;480 (7378) :480;JClinOncol. 2011 ;29 (36) :4828)，認(rèn)為腫瘤免 疫細(xì)胞治療即將迎來新一輪的研宄高潮，未來有可能在腫瘤治療中占據(jù)相當(dāng)重要的地位。 而在產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域，2013年8月美國高盛報(bào)告，八大可能改變世界的領(lǐng)域創(chuàng)新，癌癥免疫療法 排名第二，其預(yù)計(jì)到2025年有100-150億美元的市場只是個(gè)開始。目前該療法仍被用于晚 期腫瘤患者治療，但它將來可能像化療一樣，成為癌癥治療的一線方法。最近，花旗銀行分 析師認(rèn)為未來10年60%的晚期癌癥病人將用免疫治療，在美國達(dá)350億美元。
[0003]目前，免疫治療兩大熱點(diǎn)分別是：1.免疫檢查點(diǎn)單抗治療，包括CTLA-4單抗與 H)-l單抗；2.轉(zhuǎn)基因CAR-T細(xì)胞治療（經(jīng)嵌合抗原受體基因修飾后的T細(xì)胞）或轉(zhuǎn)基因 TCR-T細(xì)胞治療（經(jīng)T細(xì)胞受體基因修飾的T細(xì)胞）。圍繞這兩個(gè)熱點(diǎn)的商業(yè)并購與投資案 例頻頻上演。因而，如能通過轉(zhuǎn)基因修飾的手段，利用T細(xì)胞表達(dá)具有功能活性的單抗（例 如，免疫檢查點(diǎn)單抗），則能協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞免疫（主要由殺傷性T細(xì)胞介導(dǎo)）與體液 免疫（主要由抗體介導(dǎo)）的雙重效應(yīng)，發(fā)揮更好的抗腫瘤效果。為達(dá)到該目的，構(gòu)建一個(gè)合 適的全長抗體表達(dá)系統(tǒng)非常關(guān)鍵。
[0004] 啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游，是RNA聚合酶識(shí)別、 結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)全酶（holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活 化RNA聚合酶，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。啟動(dòng) 子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動(dòng)子是高效率表達(dá)外源基因的 關(guān)鍵。
[0005] 根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類：組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng) 子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所謂組成型啟動(dòng)子是指在組成型啟動(dòng)子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育 階段的基因表達(dá)沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動(dòng)子。
[0006] 哺乳動(dòng)物中常用的組成型啟動(dòng)子包括病毒來源：鼠或人巨細(xì)胞病毒（CMV)啟動(dòng)子 (分別簡稱mCMV與hCMV)、猴空泡病毒SV40啟動(dòng)子；人基因組天然來源：EFla啟動(dòng)子、泛素 啟動(dòng)子（Ubiquitin，簡稱Ubi)、0 -actin啟動(dòng)子、PGK-1啟動(dòng)子、Rosa26啟動(dòng)子、HSP70啟動(dòng) 子、GAPDH啟動(dòng)子、eIF4Al啟動(dòng)子、Egrl啟動(dòng)子、FerH啟動(dòng)子、SM22a啟動(dòng)子、Endothelin-1 啟動(dòng)子等。
[0007] 哺乳動(dòng)物常用組織特異性啟動(dòng)子包括：B29啟動(dòng)子（B細(xì)胞特異性）、⑶14啟動(dòng)子 (單個(gè)核細(xì)胞特異性）、CD43啟動(dòng)子（淋巴細(xì)胞及血小板特異性）、CD45及INF-0啟動(dòng)子 (造血細(xì)胞特異性）、⑶68啟動(dòng)子（巨噬細(xì)胞特異性）、Desmin及Myoglobin啟動(dòng)子（肌肉 細(xì)胞特異性）、CD105及CD102啟動(dòng)子（內(nèi)皮細(xì)胞特異性）、GFAP啟動(dòng)子（星形膠質(zhì)細(xì)胞特 異性）、GPIIb啟動(dòng)子（巨核細(xì)胞特異性）、SurfactantProteinB啟動(dòng)子（肺特異性）、NSE 啟動(dòng)子（成熟神經(jīng)元細(xì)胞特異性）、Alb啟動(dòng)子（肝特異性）等。
[0008] 常用腫瘤特異性啟動(dòng)子包括:AFP啟動(dòng)子（肝癌特異性）、CCKAR啟動(dòng)子（胰腺癌特 異性）、PSA啟動(dòng)子（前列腺癌特異性）、Tyr啟動(dòng)子（黑色素瘤特異性）、hTERT啟動(dòng)子/CEA 啟動(dòng)子/Survivin啟動(dòng)子 /CXCR4 啟動(dòng)子 /C0X_2/L-plastin啟動(dòng)子/epididymisprotein 4啟動(dòng)子/E2F1啟動(dòng)子（腫瘤廣譜特異性）等。
[0009] 常用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括：基于四環(huán)素（Tet)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（包括Tet-On或 Tet-off)、脫皮激素類誘導(dǎo)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、FK506調(diào)控系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、納巴霉 素誘導(dǎo)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、RU486誘導(dǎo)系統(tǒng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等。
[0010] 盡管在之前的研宄中，我們已經(jīng)建立腺病毒介導(dǎo)的全長抗體基因表達(dá)系統(tǒng)，并初 步實(shí)現(xiàn)了在T細(xì)胞中表達(dá)具有功能活性的全長抗體，但由于缺乏合適的啟動(dòng)子，抗體表達(dá) 量難以達(dá)到治療濃度。因而，為實(shí)現(xiàn)在T細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)外源基因特別是全長抗體基因，急 需設(shè)計(jì)并構(gòu)建新的T細(xì)胞內(nèi)高活性啟動(dòng)子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗(yàn)和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，設(shè)計(jì)構(gòu)建了一系列新型嵌合啟動(dòng)子， 并從中篩選獲得一組能在T細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)的啟動(dòng)子。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，與其它并行 構(gòu)建的嵌合啟動(dòng)子不同，本發(fā)明啟動(dòng)子序列穩(wěn)定，不會(huì)隨著其在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞內(nèi)的 轉(zhuǎn)移而發(fā)生序列丟失現(xiàn)象。該啟動(dòng)子特別適用于驅(qū)動(dòng)外源基因（如全長抗體基因）在T細(xì) 胞內(nèi)的高效表達(dá)。由此提供了下述發(fā)明：
[0012] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種分離的多核苷酸，其包含元件1和元件2，
[0013]其中，
[0014] 所述元件1為EF1a啟動(dòng)子和/或含內(nèi)含子的EF1a啟動(dòng)子；
[0015] 所述元件2為選自mCMV增強(qiáng)子、hCMV增強(qiáng)子和⑶3e增強(qiáng)子中的任意一個(gè)、兩個(gè) 或者三個(gè)。
[0016] 具體地，所述多核苷酸為啟動(dòng)子；更具體地，為嵌合啟動(dòng)子。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸由所述元件1和所述元件2組成。
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述元件1為單拷貝或者多拷貝，和/或所述元件2 為單拷貝或者多拷貝。
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述元件2中所選的mCMV增強(qiáng)子、hCMV增強(qiáng)子或 ⑶3e增強(qiáng)子獨(dú)立地為單拷貝或者多拷貝。
[0020] 不拘于理論的限制，mCMV增強(qiáng)子與hCMV增強(qiáng)子來源于不同種屬的同一類型病毒 基因組（分別是鼠巨細(xì)胞病毒屬，以及人巨細(xì)胞病毒屬），功能相近，相應(yīng)的DNA序列同源 性較高。因而，既往研宄通常將其作為功能替代的順式作用元件而單獨(dú)使用，即便有將它 們聯(lián)合使用的考慮，鑒于兩者序列相似度高，也存在序列不穩(wěn)定容易丟失的風(fēng)險(xiǎn)。一個(gè)重 要原因是，無論是原核表達(dá)載體還是真核表達(dá)載體，其在宿主內(nèi)復(fù)制，就涉及DNA聚合酶 的參與，而DNA聚合酶在對重復(fù)序列的復(fù)制過程中由于模板的復(fù)雜性，有可能會(huì)將某些重 復(fù)單元漏過，導(dǎo)致序列的丟失。這在基因操作領(lǐng)域?qū)儆谝环N共識(shí)。相應(yīng)的文獻(xiàn)可以參考PCR過程中DNA聚合酶的對重復(fù)序列模板擴(kuò)增時(shí)存在的錯(cuò)配現(xiàn)象。Biasandartifacts inmultitemplatepolymerasechainreactions(PCR).JBiosciBioeng. 2003 ； 96(4) : 317-23。
[0021] 根據(jù)上面任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中，所述元件2位于所述元件1的上游（5' 端）。
[0022] 根據(jù)上面任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其依次包含：
[0023] (l)mCMV增強(qiáng)子+hCMV增強(qiáng)子+EFla啟動(dòng)子，
[0024] (2)CD3e增強(qiáng)子+EFla啟動(dòng)子，
[0025] (3)CD3e增強(qiáng)子+mCMV增強(qiáng)子+hCMV增強(qiáng)子+EF1a啟動(dòng)子，
[0026] (4)mCMV增強(qiáng)子+hCMV增強(qiáng)子+含內(nèi)含子的EF1a啟動(dòng)子，
[0027] (5)⑶3e增強(qiáng)子+含內(nèi)含子的EFla啟動(dòng)子，或者
[0028] (6)⑶3e增強(qiáng)子+mCMV增強(qiáng)子+hCMV增強(qiáng)子+含內(nèi)含子的EF1a啟動(dòng)子。
[0029] 根據(jù)上面任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中，
[0030] 所述mCMV增強(qiáng)子的核苷酸序列如SEQIDN0 :17所示；
[0031] 所述hCMV增強(qiáng)子的核苷酸序列如SEQIDN0 :18所示；
[0032] 所述CD3e增強(qiáng)子的核苷酸序列如SEQIDN0 :19所示；
[0033] 所述EF1a啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示；和/或
[0034] 所述含內(nèi)含子的EFla啟動(dòng)子的核苷酸序