聯(lián)合細胞模型及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種聯(lián)合細胞模型，它包括Caco-2細胞模型和L-02肝細胞模型，所述Caco-2細胞模型與L-02肝細胞細胞模型以半透膜相隔。本發(fā)明還公開了該聯(lián)合細胞模型的制備方法，以及使用該聯(lián)合細胞模型篩藥的方法。本發(fā)明聯(lián)合細胞模型可同時、準確、高效地檢測藥物的吸收和代謝過程，提高檢測效率，具有良好的市場應用價值。
【專利說明】聯(lián)合細胞模型及其制備方法和用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種聯(lián)合細胞模型。

【背景技術】
[0002] 據(jù)估計，在新藥開發(fā)中，臨床檢測發(fā)現(xiàn)50%的候選藥物藥效不理想，40%的候選藥 物存在安全性問題，導致開發(fā)失敗，前期開發(fā)工作浪費。若能提前對候選藥物的活性和毒性 進行體外評估，可W極大降低藥物開發(fā)成本。ADME/Tox模式，藥物代謝和毒性檢測模式，是 近年發(fā)展起來的、全新的，是在細胞水平上早期進行吸收、分布、代謝、清除和毒性實驗的新 型新藥研究模式，其可W提前對候選藥物的活性和毒性進行體外評估，近年來在國外各大 制藥企業(yè)中得到廣泛應用。
[0003] 對候選藥物進行早期篩選時，可W根據(jù)研究的需要，選用相應的高通量ADME/Tox 體外模型，對藥物進行早期的活性/毒性篩選。
[0004] 化C0-2細胞模型，人結腸腺癌細胞，用于研究藥物吸收的細胞模型。孫敏捷等， "化C0-2細胞單層模型的建立與驗證"，中國藥學雜志2006年9月第41卷第18期公開了一 種化C0-2細胞模型的制備方法：將化C0-2細胞模型在T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為MEM/ 邸SS肥AA(抑7. 4,含胎牛血清10%、心谷氨醜胺2mmol/L、H巧巧S lOmmol/L、青霉素、鏈 霉素），在37°C，含5% C〇2培養(yǎng)箱中全濕度培養(yǎng)，按1:3比例傳代后，將細胞接種在24孔 Millicell插入式培養(yǎng)皿中，接種密度為ImL含8X IO4個，每孔400 y以基底側加入培養(yǎng)液 600 y L培養(yǎng)液培養(yǎng)21天，期間換液。
[0005] k02肝細胞模型，用于研究藥物代謝的細胞模型。
[0006] 利用細胞模型研究藥物的吸收和代謝過程如果于單個細胞模型的順序使用，只能 分別考察藥物的吸收和代謝，浪費時間，同時相較于體內藥物代謝研究，缺少肝腸循環(huán)該一 重要環(huán)節(jié)，存在較多干擾因素導致檢測不準確。
[0007] 中國專利CN102876633A公開了一種聯(lián)合細胞模型，它包括化CO-2細胞模型和大 鼠原代肝細胞模型。該模型采用大鼠肝細胞模型與化CO-2細胞模型相加，與人體間具有種 屬差異，且大鼠原代肝細胞培養(yǎng)操作復雜。因此，需要發(fā)明一種與人體內環(huán)境更加相似的聯(lián) 合細胞模型。


【發(fā)明內容】

[0008] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種與人體內環(huán)境更加相似的聯(lián)合細胞模型， 它包括化CO-2細胞模型和k02肝細胞模型，所述化CO-2細胞模型與k02肝細胞模型W 半透膜相隔。
[0009] 所述半透膜為聚碳酸醋膜、聚醋膜或混合纖維素膜，膜孔徑為0. 4?8. 0 y m。
[0010] 所述聚醋膜為Millicell息掛式培養(yǎng)皿。
[0011] 所述的化CO-2細胞模型是細胞跨膜電阻值> 550 Q 'cm2的細胞系。所述的化CO-2 細胞模型是細胞跨膜電阻值為550?800 Q ? cm2的細胞系。
[0012] 所述聯(lián)合細胞模型是按照如下方法制備而成：
[0013] a、取化CO-2細胞，復蘇，加入DMEM-20%培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按1:3傳代，培養(yǎng)2代后， 換成DMEM-IO %培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)；
[0014] b、取鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿和步驟a制備的第3?15代中任意一代細胞，調整細 胞密度為1. 5 X IO5個/mU從AP側接種到鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿上，在培養(yǎng)皿化側加入 DMEM-10%培養(yǎng)液，置于37°C，含5% C〇2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)17?25天，期間更換 培養(yǎng)液，得載有化CO-2細胞模型的培養(yǎng)皿；
[0015] 〇、取心02肝細胞，復蘇，加入0161-20%培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按1:3傳代，培養(yǎng)2代后， 換成DMEM-IO %培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)；
[0016] t取步驟C制備的k02肝細胞混息液，調整細胞密度為1. 5 X IO5個/ml,接種于 鋪有鼠尾膠原的細胞培養(yǎng)板上，每孔加入2ml并每天換液，培養(yǎng)1?5天，得載有k02肝細 胞模型的細胞培養(yǎng)板；
[0017] e、將步驟b所得載有化CO-2細胞模型的培養(yǎng)皿，置于步驟d所得載有k02肝細 胞模型的細胞培養(yǎng)板之上，即可。
[0018] 步驟b中，AP側指頂端，化指底端。
[001引其中，步驟b中：
[0020] 鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿是按照如下方法制備：取Millicell息掛式培養(yǎng)皿，加入 濃度為50y g/ml的I型鼠尾膠原，加樣量為IOOy l/cm2,紫外照射1小時，放入37°C，5% C〇2培養(yǎng)箱內過夜，PBS清洗3次，即可；
[0021] 取第4代細胞；連續(xù)培養(yǎng)21天；更換培養(yǎng)液的方式為接種2化后更換培養(yǎng)液，前一 周隔天換液，一周后每天換液。
[0022] 其中，步驟d中，培養(yǎng)3天。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種制備前述聯(lián)合細胞模型的方法，它包括如下步驟：
[0024] a、取化CO-2細胞，復蘇，加入DMEM-20%培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按1:3傳化培養(yǎng)2代后， 換成DMEM-IO %培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)；
[00巧]b、取鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿和步驟a制備的第3?15代中任意一代細胞，調整細 胞密度為1. 5 X IO5個/mU從AP側接種到鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿上，在培養(yǎng)皿化側加入 DMEM-10%培養(yǎng)液，置于37°C，含5% C〇2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)17?25天，期間更換 培養(yǎng)液，得載有化CO-2細胞模型的培養(yǎng)皿；
[0026] 〇、取心02肝細胞，復蘇，加入0161-20%培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按1:3傳代，培養(yǎng)2代后， 換成DMEM-IO %培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)；
[0027] t取步驟C制備的k02肝細胞混息液，調整細胞密度為1. 5X IO5個/ml,接種于 鋪有鼠尾膠原的細胞培養(yǎng)板上，每孔加入2ml并每天換液，培養(yǎng)1?5天，得載有k02肝細 胞模型的細胞培養(yǎng)板；
[0028] e、將步驟b所得載有化CO-2細胞模型的培養(yǎng)皿，置于步驟d所得載有k02肝細 胞模型的細胞培養(yǎng)板之上，即可。
[002引其中，步驟b中：
[0030] 鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿是按照如下方法制備：取Millicell息掛式培養(yǎng)皿，加入 濃度為50y g/ml的I型鼠尾膠原，加樣量為IOOy l/cm2,紫外照射1小時，放入37°C，5% C化培養(yǎng)箱內過夜，用PBS清洗3次，即可；
[0031] 取第4代細胞；連續(xù)培養(yǎng)21天；更換培養(yǎng)液的方式為接種2化后更換培養(yǎng)液，前一 周隔天換液，一周后每天換液。
[0032] 其中，步驟d中，培養(yǎng)3天。
[0033] 本發(fā)明還提供了前述聯(lián)合細胞模型的篩藥方法，它包括如下步驟：
[0034] ①采用前述聯(lián)合細胞模型，取待檢藥物，從化CO-2細胞模型一側施藥；
[00巧]②收集k02肝細胞模型一側樣品，檢測，根據(jù)檢測結果評價待檢藥物。
[0036] 將化CO-2細胞模型和k02肝細胞模型作為一個聯(lián)合細胞模型整體來使用，不僅 可W使聯(lián)合細胞模型更加準確地模擬人體藥物吸收和代謝過程，使得研究結果更加準確， 對高通量的藥物篩選有著重要意義，還避免了細胞模型與人體間存在種屬差異，本發(fā)明提 供了一種與人體內環(huán)境更加相似的聯(lián)合細胞模型。同時，本發(fā)明k〇2肝細胞的培養(yǎng)方法簡 便。
[0037] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0038] W下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容 所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 圖1聚醋膜內化CO-2細胞培養(yǎng)10天后的形態(tài)
[0040] 圖2聚醋膜內化CO-2細胞培養(yǎng)21天后的形態(tài)
[0041] 圖3透射電鏡觀察聚醋膜內化CO-2細胞培養(yǎng)21天后的形態(tài)
[0042] 圖4培養(yǎng)24小時的k02肝細胞形態(tài)
[0043] 圖5培養(yǎng)3天的k02肝細胞形態(tài)
[0044] 圖化-02肝細胞第1-7天的ALB，BUN分泌情況
[0045] 圖7ADME/TOX并聯(lián)測試體系示意圖
[0046] 圖8模型組給藥后2化細胞形態(tài)
[0047] 圖9空白DMEM色譜圖
[0048] 圖10空白DMEM溶液加內標卡馬西平色譜圖
[0049] 圖11吳萊英堿、吳萊英次堿和內標卡馬西平混合物色譜圖
[0050] 圖12上細胞前吳萊英水提物色譜圖
[0051] 圖13吳萊英水提物經細胞作用色譜圖

【具體實施方式】
[0052] 本發(fā)明【具體實施方式】中使用的原料、設備均為已知產品，通過購買市售產品獲得。
[0053] 實施例1本發(fā)明聯(lián)合細胞模型的建立
[0054] 1實驗材料
[00巧]1. 1 細胞株化。〇-2 細胞株購自美國 ATCC(American Type Qilture Collection)。
[0056] I. 2細胞株k02細胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中也CCTCC (化ina Center化r Type Culture Collection)
[0057] I. 3主要試劑和藥品DMEM培養(yǎng)基、膜蛋白酶購自Gibco公司，皿SS、I型鼠尾膠原、 邸TA，2化、肥陽S、非必需氨基酸購自Sigma公司，胎牛血清購自PAA公司，青霉素和鏈霉素 購自Amresco公司，其余試劑均為國產分析純。所用緩沖液為皿SS溶液，pH 7. 2?7. 35。
[0058] 1. 4主要器材和儀器；6孔板（Costar)，Millicell息掛式培養(yǎng)皿（聚醋膜， 孔徑LOym)、90mm平板過濾器、Millicell-ERS跨膜電阻儀、超純水系統(tǒng)（Millipore， 美國），3111水套式C02培養(yǎng)箱（Forma,美國），DMLL倒置相差顯微鏡（Leica，德國）， XSZ-H7雙目生物顯微鏡（重慶），SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公 司），ALLEGRAX-15R臺式冷凍離也機炬eckman,美國），MLS-3070高壓滅菌鍋（H洋，日 本），YDS-50B-80液氮容器（樂山市東亞機電工貿有限公司），CP-22抓型精密電子天平 (Sartorius)，PB-IO酸度計（Sartorius)，抑-ID-50冷凍干燥機（北京博醫(yī)康），7020全自 動生化測試儀（日立，日本），XW-80A縱潤混旋儀（海青浦滬西）。
[00則 2實驗方法
[0060] 2. 1建立Caco-2細胞模型
[0061] 2. 1. lCaco-2細胞的復蘇及傳代
[0062] 從液氮中取出化CO-2細胞，立即放入37C水浴?？焖偃诨?，將化CO-2細胞轉移 至盛有8ml DMEM-20% (37C)培養(yǎng)液的離也管中，混勻，在900轉的速度下離也5min，如此 重夏貿心3次后,得到化c〇-2細胞息浮液。將化c〇-2細胞息浮液轉移至細胞抬養(yǎng)瓶中，放 入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天換液，W后隔天換液。當培養(yǎng)瓶內細胞匯合達到約80%左右 時，傾去舊的培養(yǎng)液，加入0. 25 %膜蛋白酶-0. 02%邸TA溶液消化。在倒置相差顯微鏡下 觀察細胞形態(tài)變化，約2min后，細胞間隙變大，細胞變圓，立即停止消化，倒掉消化液，加入 6ml DMEM-20%培養(yǎng)液，輕輕將細胞吹落至瓶底并混勻，轉移至離也管中，在900轉的速度下 離也5min，倒去上清液，加入6ml DMEM-20%培養(yǎng)液，混勻，按1 ;3傳代。用DMEM-20%培養(yǎng) 液繼續(xù)培養(yǎng)兩代后，換成DMEM-IO %培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0063] 2. 1. 2MiIlicell膜涂鋪I型鼠尾膠原
[0064] 將Millicell息掛式培養(yǎng)皿放入6孔培養(yǎng)板，加入濃度為50 U g/ml的I型鼠尾膠 原IOOy l/cm2(452 y 1)，將培養(yǎng)板在超凈工作臺內用紫外線照射，1小時后，放入37°C，5% 〇化培養(yǎng)箱內過夜，拿出后，用皿SS清洗Millicell膜3次，備用。
[0065] 2. 1. 3Cac〇-2細胞的接種及培養(yǎng)
[0066] 實驗時，取復蘇第4代W后的細胞，按2. 1. 1項下傳代，調整密度為1. 5 X 1〇5個/ 血，接種在Mi 11 icel 1膜上。在Mi 11 icel 1膜的AP偵U，加入混勻的細胞息液2ml，化側加入 DMEM-10%培養(yǎng)液4ml。將細胞置于37C，含5% C〇2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種2化后更換培養(yǎng) 液。前一周隔天換液，之后每天換液，連續(xù)培養(yǎng)21天。
[0067] 2. 1. 4Cac〇-2細胞模型的驗證
[0068] ①倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)；每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。 細胞接種化后開始貼壁，生長至第4天左右時匯合達80%，膜上可看到細胞形態(tài)。由圖1 可知，生長10天W后細胞邊界清晰，為不規(guī)則多邊形。由圖2可知，生長21天時，各細胞間 如鋪路石鑲嵌排列，互不重疊，為典型單層形態(tài)。
[0069] ②透射電鏡觀察細胞形態(tài)；由圖3可知，細胞生長至21天時，由微絨毛形成的刷狀 緣非常整齊致密，細胞之間的緊密連接和橋粒出現(xiàn)在腔側。
[0070] ③跨膜電阻值的測定：用Millicell-邸S跨膜電阻儀隔天測定Caco-2細胞的跨膜 電阻值，每次測量電阻前，電極用PBS浸泡過夜，使用前用75%己醇浸泡30min，然后用培養(yǎng) 液浸泡15min備用。
[0071] 化CO-2細胞的跨膜電阻值=(測定值一空白膜電阻值）XMillicell膜面積
[0072] 化CO-2細胞的TE邸值在前6天增長迅速，6天后TE邸值維持在一個穩(wěn)定的范圍 內，21天時，Cac〇-2細胞跨膜電阻值大于550 Q ? cm2。
[0073] 2. 1. 5 小結
[0074] 上述方法建立的化CO-2細胞模型重復性好，通過電阻值測定發(fā)現(xiàn)，21天時，T邸R 值大于550 Q ? cm2。
[00巧]2. 2建立k02肝細胞模型
[0076] 2. 2.比-02肝細胞的復蘇及傳代
[0077] 從液氮中取出k02肝細胞，立即放入37C水浴?？焖偃诨螅瑢02肝細胞轉移 至盛有8ml DMEM-20% (37C)培養(yǎng)液的離也管中，混勻，在900轉的速度下離也5min，如此 重復離也3次后，得到k02肝細胞息浮液。將k02肝細胞息浮液轉移至細胞培養(yǎng)瓶中，放 入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天換液，W后隔天換液。當培養(yǎng)瓶內細胞匯合達到約80%左右 時，傾去舊的培養(yǎng)液，加入0. 25%膜蛋白酶-0. 02%邸TA溶液消化。在倒置相差顯微鏡下 觀察細胞形態(tài)變化，約2min后，細胞間隙變大，細胞變圓，立即停止消化，倒掉消化液，加入 6ml DMEM-20%培養(yǎng)液，輕輕將細胞吹落至瓶底并混勻，轉移至離也管中，在900轉的速度下 離也5min，倒去上清液，加入6mlDMEM-20%培養(yǎng)液，混勻，按1 ;3傳代。用DMEM-20%培養(yǎng) 液繼續(xù)培養(yǎng)兩代后，換成DMEM-IO %培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0078] 2. 2. 2k02肝細胞的接種及培養(yǎng)
[0079] 實驗時，取復蘇第4代W后的k02肝細胞，按2. 2. 1項下傳代，調整密度為 1. 5 X 1〇5個/mL,接種于鋪有鼠尾膠原的6孔板上，每孔加入2ml細胞息液，并每天更換培 養(yǎng)液。
[0080] 2. 2. 3k02肝細胞模型的驗證
[0081] ①用臺盼藍染色排斥法測定肝細胞活力；將肝細胞息液與0.4%的臺盼藍溶液 1 : 1混勻，立即用全自動細胞分析儀計算活細胞百分率。
[0082] 圖像顯示活肝細胞呈透亮，圓形，立體感較強，死肝細胞被藍染，細胞膜模糊已破 損，經計數(shù)后，肝細胞存活率在95 % -98 %。
[0083] ②倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)；每天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞情況。
[0084] 取復蘇第4代W后的k02肝細胞，接種于鋪有鼠尾膠原的6孔板上。24小時后， 肝細胞已經貼壁，培養(yǎng)3天的肝細胞鏡下可見相互之間連接成片，可見細胞核呈單核或雙 核（圖4、圖5)。
[0085] ③k02肝細胞功能學檢測；連續(xù)培養(yǎng)肝細胞7天，每天換液，取細胞培養(yǎng)上清液 Iml，300化/min離也5min后取上清，全自動生化儀測定ALB、BUN濃度。
[0086] 如圖6所示，L-02肝細胞的分泌功能在第1、2天開始恢復，其ALB的分泌功能在第 3天出現(xiàn)高峰，然后逐漸衰退，BUN的分泌在第3-4天是其活躍的高峰期，其后也開始衰退。
[0087] 2. 2. 4 小結
[008引本發(fā)明建立了 k02肝細胞模型。通過對肝細胞存活率的檢測，形態(tài)變化的觀察， W及對其分泌功能的檢測，結果顯示，本實驗建立的肝細胞存活率在95% -98%，ALB的分 泌在第3天達到高峰，BUN的分泌在第3、4天達到高峰。因此，W第3天為給藥時間。
[0089] 2. 3聯(lián)合模型的建立
[0090] 在化CO-2細胞模型建立21天時，用皿SS清洗化CO-2細胞3次后，顯微鏡下觀察 細胞，選用細胞膜完整、排列緊密無脫落且電阻值大于550 Q 'cm2的化CO-2細胞。用皿SS 清洗已培養(yǎng)3天的肝細胞3次，盡量將死細胞洗去，鏡下見細胞形態(tài)清晰，連接呈島狀，多數(shù) 呈雙核。將可用的化CO-2細胞（Millicell膜）提出，輕放入種有k02肝細胞的6孔板上， 即得本發(fā)明聯(lián)合細胞模型，如圖7所示。
[0091] 經觀察，兩種細胞之間無相互抑制作用，證明本發(fā)明成功建立了吸收和代謝的聯(lián) 合細胞模型。
[0092] 實施例2用本發(fā)明聯(lián)合細胞模型考察吳萊英ADME特征
[0093] 吳萊英為蕓香料植物吳萊英Evodia rutaeca巧a (Juss) Benth,石虎Evodia TUtaecarpa(JuSs)Benth var officinalis (Dode)Huang 或疏毛 吳萊英 Evodia !11136。3巧3(]1133)86]11：11.￥31'130(1；[]1161'；[值0(16)化3叫的干燥近成熟果實。能散寒止痛，降 逆止嘔，助陽止瀉。為溫中止痛的必備藥。吳萊英含有多種化學成分，目前從中分離的主要 有生物堿類、苦味素類、揮發(fā)類等化學成分，其中生物堿類成分是吳萊英的主要化學和生物 活性成分。生物堿類成分中吳萊英堿巧VO)、吳萊英次堿（Rut)是其主要活性成分。
[0094] 本實施例通過吳萊英水提物（WZY)中吳萊英堿巧VO)、吳萊英次堿（Rut)的吸收代 謝來考察本發(fā)明聯(lián)合細胞模型的準確性，設置2組對照組，分別為化C0-2細胞模型組，L-02 肝細胞模型組。
[0095] 根據(jù)現(xiàn)有技術，吳萊英堿巧VO)、吳萊英次堿（Rut)在化C0-2細胞模型和大鼠體內 的吸收代謝方式為；Rut在大鼠在體腸吸收模型中的吸收為被動擴散過程。Rut在化C0--2 細胞模型中的吸收W被動擴散為主，載體參與的協(xié)助擴散同時存在。Evo和Rut體內代謝研 究表明二者均主要W原形方式代謝排泄。
[0096] 具體地；1、化C0-2細胞模型組因缺少肝細胞模型，其最終得到的樣品中吳萊英堿 (Evo)和吳萊英次堿（Rut)含量應當高于聯(lián)合模型組；2、肝細胞模型組中因未經過化C0-2 細胞吸收而直接作用于肝細胞，樣品中吳萊英堿、吳萊英次堿含量應當高于化C0-2細胞模 型組和聯(lián)合模型組。
[0097] 1實驗材料和方法 [009引 1. 1實驗材料
[0099] 1. 1. 1受試樣品吳萊英水提物（WZY)由四川省中醫(yī)藥科學院中藥化學研究所提 供。
[0100] 1. 1. 2 細胞株化。〇-2 細胞株購自美國 ATCC (American Type Qilture Collection), 1^-02細胞株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中也CCTCC(Qiina Center for Type Culture Collection)
[0101] I. I. 3主要試劑和藥品；DMEM培養(yǎng)基、膜蛋白酶、IV型膠原酶購自Gibco公司， 皿SS、I型鼠尾膠原、邸TA ? 2化、肥陽S、非必需氨基酸購自Sigma公司，胎牛血清購自PAA 公司青霉素和鏈霉素購自Amresco公司，吳萊英堿標準品（含量> 98% )、吳萊英次堿標準 品（含量>98%)購自成都曼思特生物科技有限公司；內標物卡馬西平，購自中國食品藥 品檢定研究院，色譜純甲醇購自美國fisher公司，其余試劑均為國產分析純。
[0102] 1. 1. 4主要器材和儀器；6孔板（Costar)，息掛式培養(yǎng)皿（聚醋膜，孔徑1. 0 U m)、 90mm平板過濾器、Millicell-ERS跨膜電阻儀、超純水系統(tǒng)（Millipore，美國），3111水套 式C02培養(yǎng)箱（Forma,美國），DMLL倒置相差顯微鏡（Leica，德國），XSZ-H7雙目生物顯微 鏡（重慶），SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），ALLEGRAX-15R臺式 冷凍離也機炬eckman，美國），MLS-3070高壓滅菌鍋（H洋，日本），YDS-50B-80液氮容器 (樂山市東亞機電工貿有限公司），美國Agilent 1200RRLC-6410 triple qua化upole液質 聯(lián)用系統(tǒng)，配有G1312B二元粟、G1322B真空脫氣機、G1329B自動進樣器和G131她柱溫箱， 使用Mass化nter軟件控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理。CP-22抓型精密電子天平（Sartorius) ,PB-IO 酸度計（Sartorius),抑-ID-50冷凍干燥機（北京博醫(yī)康），7020全自動生化測試儀（日 立，日本），XW-80A縱潤混旋儀（海青浦滬西）。
[0103] 1.2實驗方法
[0104] 1.2. 1分組及給藥
[0105] ①聯(lián)合模型組（本發(fā)明聯(lián)合細胞模型）；在化CO-2細胞AP側加入2ml吳萊英水 提物，肝細胞側炬L側）加入3ml DMEM液，分別于1、2、24小時后收集肝細胞側樣品，-2(TC 凍存。
[0106] ②肝細胞模型組；在肝細胞模型中加入2ml吳萊英水提物，作用24小時后收集樣 品，-2(TC凍存。
[0107] ③化CO-2模型組：在化CO-2模型AP側加入2ml吳萊英水提物，化側加入3ml DMEM液，分別于1、2、24小時后收集化側樣品，-2(TC凍存。
[010引 1.2. 2細胞樣品處理
[0109] 微量加樣器精密吸取待測細胞培養(yǎng)液DMEM 600 y 1，內標物卡馬西平 4〇111巧04叫.1111-1)、置1.51]11離也管中、冷凍干燥后，加入60〇111甲醇溶解，潤旋混勻11]1；[]1， 12 000轉離也lOmin，0. 22 y m微孔濾膜過濾，取上清液10 y 1進樣測定。
[0110] 2分析方法
[0111] 2.1色譜條件
[011引 色譜柱；Welch Materials Xtimate-Cis, (2. 1 X 150mm, 3 Ji m);流動相：甲醇-水 (85:15)含10臟01.。己酸饋；流速；0.21111.111111-1;柱溫；301：;進樣量；10^1。
[011引 2. 2質譜條件
[0114] 采用電噴霧離子化源巧SI),正離子模式，噴霧電壓4000V，源溫度為IOCTC ;霧化 氣為氮氣，霧化壓力為40psi ;去溶劑氣為氮氣，溫度35(TC，流速為lOL/min ;碰撞氣為高純 氮氣，壓力為0. IMPa ;采用MRM模式對藥物檢測，質譜條件如下：
[011 引

【權利要求】
1. 一種聯(lián)合細胞模型，其特征在于：它包括Caco-2細胞模型和L-02肝細胞模型，所述 Caco-2細胞模型與L-02肝細胞模型以半透膜相隔。
2. 根據(jù)權利要求1所述的聯(lián)合細胞模型，其特征在于：所述半透膜為聚碳酸酯膜、聚酯 膜或混合纖維素膜，膜孔徑為〇. 4?8. 0 y m。
3. 根據(jù)權利要求2所述的聯(lián)合細胞模型，其特征在于：所述聚酯膜為Millicell懸掛 式培養(yǎng)皿。
4. 根據(jù)權利要求1所述的聯(lián)合細胞模型，其特征在于：所述Caco-2細胞模型是細胞跨 膜電阻值大于等于550 Q ? cm2的細胞系。
5. 根據(jù)權利要求1所述的聯(lián)合細胞模型，其特征在于：其是按照如下方法制備而成： a、 取Caco-2細胞，復蘇，加入DMEM-20%培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按1:3傳代，培養(yǎng)2代后，換成 DMEM-10%培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)； b、 取鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿和步驟a制備的第3?15代中任意一代細胞，調整細胞 密度為1. 5X 105個/mL，從AP側接種到鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿上，在培養(yǎng)皿BL側加入 DMEM-10%培養(yǎng)液，置于37°C，含5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)17?25天，期間更換 培養(yǎng)液，得載有Caco-2細胞模型的培養(yǎng)皿； c、 取L-02肝細胞，復蘇，加入DMEM-20%培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按1:3傳代，培養(yǎng)2代后，換成 DMEM-10%培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)； d、 取步驟c制備的L-02肝細胞混懸液，調整細胞密度為1. 5 X 105個/ml，接種于鋪有 鼠尾膠原的細胞培養(yǎng)板上，每孔加入2ml并每天換液，培養(yǎng)1?5天，得載有L-02肝細胞模 型的細胞培養(yǎng)板； e、 將步驟b所得載有Caco-2細胞模型的培養(yǎng)皿，置于步驟d所得載有L-02肝細胞模 型的細胞培養(yǎng)板之上，即可。
6. 根據(jù)權利要求5所述的聯(lián)合細胞模型，其特征在于：所述步驟b中： 鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿按照如下方法制備：取Millicell懸掛式培養(yǎng)皿，加入濃度為 50y g/ml的I型鼠尾膠原，加樣量為100iil/cm2,紫外照射1小時，放入37°C，5% C02培養(yǎng) 箱內過夜，PBS清洗3次，即可； 取第4代細胞；連續(xù)培養(yǎng)21天；更換培養(yǎng)液的方式為接種24h后更換培養(yǎng)液，前一周隔 天換液，一周后每天換液。
7. 根據(jù)權利要求5所述的聯(lián)合細胞模型，其特征在于：步驟d中，培養(yǎng)3天。
8. -種制備權利要求1?7任意一項所述聯(lián)合細胞模型的方法，其特征在于：它包括 如下步驟： a、 取Caco-2細胞，復蘇，加入DMEM-20%培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按1:3傳代，培養(yǎng)2代后，換成 DMEM-10%培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)； b、 取鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿和步驟a制備的第3?15代中任意一代細胞，調整細胞 密度為1. 5 X 105個/mL，從AP側接種到鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿上，在培養(yǎng)皿BL側加入 DMEM-10%培養(yǎng)液，置于37°C，含5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)17?25天，期間更換 培養(yǎng)液，得載有Caco-2細胞模型的培養(yǎng)皿； c、 取L-02肝細胞，復蘇，加入DMEM-20%培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按1:3傳代，培養(yǎng)2代后，換成 DMEM-10%培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)； d、 取步驟c制備的L-02肝細胞混懸液，調整細胞密度為1. 5 X 105個/ml，接種于鋪有 鼠尾膠原的細胞培養(yǎng)板上，每孔加入2ml并每天換液，培養(yǎng)1?5天，得載有L-02肝細胞模 型的細胞培養(yǎng)板； e、 將步驟b所得載有Caco-2細胞模型的培養(yǎng)皿，置于步驟d所得載有L-02肝細胞模 型的細胞培養(yǎng)板之上，即可。
9. 根據(jù)權利要求8所述的制備方法，其特征在于：所述步驟b中： 鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿按照如下方法制備：取Millicell懸掛式培養(yǎng)皿，加入濃度為 50y g/ml的I型鼠尾膠原，加樣量為100iil/cm2,紫外照射1小時，放入37°C，5% C02培養(yǎng) 箱內過夜，用PBS清洗3次，即可； 取第4代細胞；連續(xù)培養(yǎng)21天；更換培養(yǎng)液的方式為接種24h后更換培養(yǎng)液，前一周隔 天換液，一周后每天換液； 所述步驟d中，培養(yǎng)3天。
10. 使用權利要求1?7任意一項所述聯(lián)合細胞模型篩選藥物的方法，其特征在于：它 包括如下步驟： ① 采用權利要求1?7任意一項所述的聯(lián)合細胞模型，取待檢藥物，從Caco-2細胞模 型一側施藥； ② 收集L-02肝細胞模型一側樣品，檢測，根據(jù)檢測結果評價待檢藥物。
【文檔編號】C12Q1/02GK104357398SQ201410624752
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月7日 優(yōu)先權日:2014年11月7日
【發(fā)明者】趙軍寧, 鄢良春 申請人:四川省中醫(yī)藥科學院