專利名稱：：不含有病毒編碼序列的高效逆病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及改良的用于基因治療的逆病毒載體。特別是，本發(fā)明涉及安全的和有效的逆病毒表達(dá)載體，其中，所有的逆病毒基因，即，gag，env和pol，被完全缺失；其中一種異源性內(nèi)含子，剪切受體，和/或非編碼序列被插入外源基因克隆位點(diǎn)的上游位置；其中一種異源性內(nèi)部啟動(dòng)子或一種內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(下文稱作“IRES”)被插入在該克隆位點(diǎn)的下游位置；并且其中5’LTR(長(zhǎng)末端重復(fù))的全長(zhǎng)U3序列或者一種強(qiáng)的異源性啟動(dòng)子控制外源基因的表達(dá)。背景逆病毒載體與其它任何一種載體相比更經(jīng)常被用于基因治療，被用于世界范圍內(nèi)已批準(zhǔn)的50％以上的臨床方案中(Wiley-基因醫(yī)學(xué)網(wǎng)絡(luò)位點(diǎn)雜志；http//www.wiley.co.uk/genetherapy)。雖然主要使用基于鼠白血病病毒(下文稱作“MLV”)的載體，但在臨床應(yīng)用中逆病毒載體仍存在許多問(wèn)題。最嚴(yán)重的問(wèn)題是它們的安全性；逆病毒載體是一種病毒載體，因而可在細(xì)胞中轉(zhuǎn)化成可復(fù)制的逆病毒(下文稱作“RCR”)?？傊ㄟ^(guò)同源重組導(dǎo)致的RCR產(chǎn)生是一個(gè)最令人們關(guān)心的問(wèn)題。所有的可使用的逆病毒載體含有相當(dāng)長(zhǎng)的病毒編碼序列。由于這些序列也存在于包裝載體被釋放的包裝細(xì)胞的基因組中，人們?cè)O(shè)想在包裝基因組和載體的相同的核苷酸序列之間可能發(fā)生同源重組，導(dǎo)致RCR的產(chǎn)生。參見(jiàn)Miller等，人類基因治療，15，1990。兩種類型的基于MLV的逆病毒載體，LN系列載體和MFG載體，經(jīng)常被用于基因治療(Miller和Roseman，生物技術(shù)，7980-990，1989；Dranoff等，美國(guó)科學(xué)院院刊903539-3543，1993)。在LN系列載體中外源基因的表達(dá)是由外源性內(nèi)部啟動(dòng)子或由LTR控制的，而MFG載體中的轉(zhuǎn)錄水平是在LTR的控制下的，并且外源基因是以基因組RNA或剪切的亞基因組RNA的形式表達(dá)的。LN系列載體通常被認(rèn)為是第一代的逆病毒載體，它含有420bp的gag編碼序列。雖然該區(qū)域被認(rèn)為在病毒包裝中起著重要的作用，已有報(bào)道顯示gag區(qū)域可被缺失而沒(méi)有顯著影響病毒的包裝和在某些條件下的滴度(Kim等，病毒學(xué)雜志，71994-1004，1998)。與LN系列載體相比，已知MFG載體以更為穩(wěn)定的方式和較高的水平驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)，并且在大多數(shù)來(lái)源于人類或小鼠的細(xì)胞中產(chǎn)生較高的病毒滴度(Byun等，基因治療，3780-788，1996)。但是，MFG載體含有更多的病毒表達(dá)的序列，420bp的gag，377bp的pol，和99bp的env，與LN系列的載體相比提高了產(chǎn)生RCR的可能性。為克服這些與常規(guī)的逆病毒載體相關(guān)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的發(fā)明人構(gòu)建了一種逆病毒載體(韓國(guó)專利申請(qǐng)97-48095)，它具有如下幾個(gè)特點(diǎn)●被克隆的基因的轉(zhuǎn)錄物被有效地剪切，產(chǎn)生較高的基因表達(dá)水平，●gag和env序列被完全缺失而沒(méi)有影響病毒滴度，●IRES被用于在載體中同時(shí)表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)基因，●在載體中插入多克隆位點(diǎn)，以便于外源基因的表達(dá)由于gag和env序列從逆病毒載體中缺失，相對(duì)于其它載體來(lái)說(shuō)該載體的安全性提高。但是，這一載體仍含有包含剪切受體序列的377bppol編碼序列以及含有284bp的env的引導(dǎo)(轉(zhuǎn)錄但不轉(zhuǎn)譯)序列的它的下游序列，因?yàn)椋琾ol序列的缺失導(dǎo)致不正常的和不充分的剪切。由于377bp的pol序列也存在與包裝系的基因組中，在載體中仍存在導(dǎo)致RCR產(chǎn)生的同源重組的可能性。為了開(kāi)發(fā)新型的具有較高的基因表達(dá)效率和較高的安全性的逆病毒載體，我們?cè)?jīng)構(gòu)建了不含有任何病毒編碼序列的逆病毒載體。本發(fā)明是通過(guò)構(gòu)建逆病毒載體進(jìn)行的，其中MLV衍生的pol基因被完全缺失，排除了在包裝細(xì)胞系中通過(guò)同源重組產(chǎn)生RCR的可能性；其中異源性內(nèi)含子，剪切受體，和/或非編碼序列被插入在外源基因克隆位點(diǎn)的上游；使基因表達(dá)的效率最大化；其中使用5’LTR或人類巨細(xì)胞病毒(下文稱作“HCMV”)主要立即早期啟動(dòng)子(MEIPiel基因的啟動(dòng)子)作為外源基因表達(dá)的調(diào)節(jié)的順式元件；并且其中異源性內(nèi)部啟動(dòng)子或者IRES被插入在克隆位點(diǎn)的下游位置，以允許同時(shí)表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)外源基因。發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種安全的逆病毒，其中，外源基因被高水平地表達(dá)并因而可被用于基因治療。按照本發(fā)明，上述目的可容易地達(dá)到。本發(fā)明提供了基于MLV的逆病毒載體，其中，MLV-編碼的gag，env和pol序列被完全缺失。在一個(gè)方面，本發(fā)明的基于MLV的逆病毒載體可含有異源性內(nèi)含子和/或異源性剪切受體，它們被插入在外源基因的克隆位點(diǎn)的上游。在另一方面，本發(fā)明的基于MLV的逆病毒載體可含有一種被插入在外源基因克隆位點(diǎn)的上游位置的異源性非編碼序列。在另一方面，MLV5’LTR的全長(zhǎng)U3序列(-419至-1bp)可用本發(fā)明的基于MLV的逆病毒載體的異源性啟動(dòng)子替換。在又一方面，本發(fā)明的基于MLV的逆病毒載體可在外源基因的克隆位點(diǎn)的下游含有一種異源性啟動(dòng)子。本發(fā)明也提供了用本發(fā)明的基于MLV的逆病毒載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株。本發(fā)明的其它一些特點(diǎn)見(jiàn)于下文。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1表示從MON載體切除pol編碼區(qū)域構(gòu)建ΔSA載體，然后將CAT基因插入ΔSA載體產(chǎn)生ΔSA-CAT載體的過(guò)程，圖2表示含有HCMViel(UL123)基因的內(nèi)含子和/或外顯子的逆病毒載體的結(jié)構(gòu)，圖3a表示其中SV40最小啟動(dòng)子-neo盒被IRES-neo盒替換得到MSN載體，然后通過(guò)將含有SV40最小啟動(dòng)子和MLV3’LTR插入pUC18構(gòu)建SN-3LTR載體的過(guò)程，圖3b表示其中含有HCMV主要立即早期啟動(dòng)子的嵌合LTR被插入SN-3LTR載體的過(guò)程，圖4a表示其中含有HCMViel(UL123)基因的外顯子1，內(nèi)含子A和部分外顯子2的DNA片段插入pCM載體構(gòu)建DON1.2載體，然后將細(xì)菌CAT基因插入DON1.2產(chǎn)生DON1.2-CAT的過(guò)程，圖4b表示其中含有HCMViel(UL123)基因的部分內(nèi)含子A和部分外顯子2的DNA片段插入pCM載體構(gòu)建DON2載體，然后將細(xì)菌CAT基因插入DON2產(chǎn)生DON2-CAT的過(guò)程，圖4c表示其中含有鼠免疫球蛋白基因的剪切受體和HCMViel(UL123)基因的外顯子1插入pCM載體構(gòu)建DONSA1載體，然后將細(xì)菌CAT基因插入DONSA1產(chǎn)生DONSA1-CAT的過(guò)程，圖5表示含有人類基因的內(nèi)含子和外顯子的逆病毒載體的結(jié)構(gòu)，圖6表示其中含有MLV5’和3’LTR的DNA片段的制備并被插入pUC18產(chǎn)生p53LTR載體，然后通過(guò)將從pCBIN分離出的IRES-neo盒插入p53LTR構(gòu)建MIN載體的過(guò)程，圖7a表示MIN-AI的構(gòu)建過(guò)程，其中，制備含有人類β-肌動(dòng)蛋白基因的基因組PCR產(chǎn)物，然后將含有人類β-肌動(dòng)蛋白的部分內(nèi)含子1，剪切受體和部分外顯子2插入MIN載體。圖7b表示MIN-EI的構(gòu)建過(guò)程，其中，制備含有人類EF1α基因的基因組PCR產(chǎn)物，然后將含有人類EF1α的部分內(nèi)含子1，剪切受體和部分外顯子2插入MIN載體。圖7c表示MIN-GI的構(gòu)建過(guò)程，其中，通過(guò)基因組PCR制備含有人類GAPDH基因的部分內(nèi)含子1，剪切受體和部分外顯子2的DNA片段，然后插入MIN載體。圖7d表示MIN-2的構(gòu)建過(guò)程，其中，將含有HCMViel(UL123)基因的部分內(nèi)含子A，剪切受體和部分外顯子2的DNA片段插入MIN載體。優(yōu)選實(shí)施方案詳細(xì)描述本發(fā)明提供了衍生于基于MLV的載體，特別是MON或MIN的安全和高效的逆病毒載體。在本發(fā)明的載體中，逆病毒基因(gag，env和pol編碼序列)被完全缺失；一種異源性內(nèi)含子，剪切受體，和/或非編碼序列被插入在外源基因克隆位點(diǎn)的上游位置；一種強(qiáng)的異源性啟動(dòng)子被包含在5’LTR中；并且，一種異源性啟動(dòng)子或一種IRES位于克隆位點(diǎn)的下游位置。特別是，在本發(fā)明的載體中，由于含有一種剪切受體的pol編碼序列被完全缺失，可以排除同源重組的可能性，而同源重組是常規(guī)的逆病毒載體的一個(gè)缺點(diǎn)。切除pol序列導(dǎo)致基因表達(dá)水平的降低。為了恢復(fù)降低了的表達(dá)效率和病毒滴度，本發(fā)明提供了各種不同的逆病毒載體，如下所示●本發(fā)明提供了逆病毒載體，其中，一種異源性內(nèi)含子和/或剪切受體被插入在外源基因克隆位點(diǎn)的上游位置，以彌補(bǔ)缺失的與pol編碼序列的3’部分交迭的剪切受體。所有的已知的病毒或細(xì)胞基因的內(nèi)含子和/或剪切受體均可用于這一目的，優(yōu)選HCMViel(UL123)基因、延長(zhǎng)因子1α(下文稱作“EF1α”)基因、甘油醛3-磷酸脫氫酶(下文稱作“GAPDH”)基因、β-肌動(dòng)蛋白基因等的內(nèi)含子或/或剪切受體?！癖景l(fā)明也提供了逆病毒載體，其中一種異源性非編碼序列被插入在克隆位點(diǎn)的上游位置。該非編碼序列被用于提高轉(zhuǎn)錄效率，并被定義為一種不翻譯成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄DNA序列，包括內(nèi)含子和不翻譯的外顯子。優(yōu)選該非編碼序列選自HCMViel(UL123)基因、EF1α基因、GAPDH基因、和β-肌動(dòng)蛋白基因的非編碼序列。異源性非編碼序列的插入使得外源基因轉(zhuǎn)錄物可有效剪切，并且亞基因組RNA可有效轉(zhuǎn)譯?！翊送?，本發(fā)明提供了逆病毒載體，其中，一種異源性內(nèi)部啟動(dòng)子或IRES被包含在克隆位點(diǎn)的下游位置?！褡詈螅景l(fā)明提供了逆病毒載體，其中，含有一種5’LTR的全長(zhǎng)U3序列或者一種強(qiáng)的異源性啟動(dòng)子。下文將詳細(xì)描述本發(fā)明。1.Pol編碼序列的切除ΔSA構(gòu)建為了開(kāi)發(fā)具有改良的安全性的逆病毒載體，即不具有同源重組活性的逆病毒載體，從MON載體(韓國(guó)專利申請(qǐng)97-48095)切除包括剪切受體的pol編碼序列，構(gòu)建一種缺失突變載體，ΔSA。此外，通過(guò)插入細(xì)菌CAT(；氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)作為報(bào)道基因構(gòu)建ΔSA-CAT載體(見(jiàn)圖1)。然后，制備用ΔSA-CAT轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系并進(jìn)行CAT檢測(cè)。CAT檢測(cè)顯示缺失突變體的病毒滴度與父本載體MON-CAT的病毒滴度相當(dāng)，但基因表達(dá)降低(見(jiàn)表1)。這些結(jié)果提示含有剪切受體的pol基因參與了載體中外源基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。從這一結(jié)果可以預(yù)期，如果異源剪切受體和/或內(nèi)含子被插入在外源基因的克隆位點(diǎn)的上游，從而與pol基因共同缺失的剪切位點(diǎn)互補(bǔ)，則外源基因的表達(dá)水平將被提高。但是，如果剪切發(fā)生太多，亞基因組RNA與亞基因組DNA的比率將被提高，導(dǎo)致病毒滴度的降低，即使具有高的基因表達(dá)水平。為了構(gòu)建理想的逆病毒載體，載體的設(shè)計(jì)應(yīng)使轉(zhuǎn)錄，剪切和轉(zhuǎn)移率在轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞系中平衡。也就是說(shuō)，優(yōu)選的載體中外源基因被大量轉(zhuǎn)錄，并且基因組RNA的量與亞基因組RNA的量平衡，從而產(chǎn)生足夠量的基因組RNA被包裝進(jìn)病毒顆粒，并且被大量翻譯成由外源基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供了逆病毒載體，其中各種來(lái)源于病毒或細(xì)胞基因的非編碼序列被插入缺失突變載體中，然后檢測(cè)這一插入是否對(duì)病毒滴度和基因表達(dá)水平具有效果。2.異源DNA序列的插入增強(qiáng)剪切和翻譯效率DON1.2，DON2和DONSA1構(gòu)建體。為了使剪切率和基因表達(dá)率保持平衡以及提高病毒RNA的總產(chǎn)率，構(gòu)建了逆病毒載體，其中，MLV5’LTR的U3區(qū)域被一種強(qiáng)啟動(dòng)子，HCMV立即早期啟動(dòng)子，替換，并且其中插入了異源性非編碼序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，HCMViel(UL123)基因的非翻譯性外顯子和/或內(nèi)含子被用作異源性非編碼序列，它被插入在載體的克隆位點(diǎn)的上游位置(見(jiàn)圖2)。已知HCMViel(UL123)基因的外顯子和/或內(nèi)含子序列當(dāng)被插入在表達(dá)載體中時(shí)提高翻譯效率。特別是，pCM載體的制備如下將所有的逆病毒編碼序列切除；將全長(zhǎng)的5’LTR的U3序列用HCMV主要立即早期啟動(dòng)子替換，保留MLV來(lái)源的3’LTR；并將SV40啟動(dòng)子-neo盒用作異源性內(nèi)部啟動(dòng)子。然后，通過(guò)將HCMViel(UL123)基因的外顯子1，內(nèi)含子A，和/或外顯子2插入pCM載體(見(jiàn)圖3a，圖3b，和圖4a至4b)制備DON1.2，DON2和DONSA1載體。然后通過(guò)CAT報(bào)道基因的插入制備DON1.2-CAT，DON2-CAT，DON2-CAT，和DONSA1-CAT載體。將用這些載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系進(jìn)行CAT檢測(cè)。CAT檢測(cè)的結(jié)果證實(shí)了所有三個(gè)載體比對(duì)照載體L-CAT-SN顯示出較高的剪切和基因表達(dá)效率(見(jiàn)表2)。2.可啟動(dòng)剪切和基因表達(dá)的細(xì)胞DNA序列的插入MIN-AI，MIN-EI，和MIN-GI構(gòu)建體在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)逆病毒載體進(jìn)行進(jìn)一步設(shè)計(jì)，使剪切率和基因表達(dá)率的平衡導(dǎo)致病毒滴度和基因表達(dá)的效率提高。在這些載體中，將人類基因的外顯子和/或內(nèi)含子序列插入逆病毒載體中外源基因克隆位點(diǎn)的上游位置(見(jiàn)圖5)。為構(gòu)建這些載體，制備出MIN載體，其中，所有的逆病毒編碼區(qū)域被切除；保留MLV來(lái)源的5’和3’LTR；并將EMCVIRES-neo盒用作異源性內(nèi)部啟動(dòng)子。具體地說(shuō)，MIN載體是通過(guò)以下步驟制備的擴(kuò)增含有MLV5’和3’LTR的DNA片段，將該片段插入pUC18載體，將IRES-neo盒插入該重組載體(見(jiàn)圖6)。將一個(gè)含有人類β-肌動(dòng)蛋白的部分內(nèi)含子和部分外顯子2，EF1α，或GAPDH基因插入MIN載體的克隆位點(diǎn)的上游位置，分別構(gòu)建MIN-AI，MIN-EI，或MIN-GI載體(見(jiàn)圖7a至7c)。為了比較使用細(xì)胞基因作為剪切受體的載體(如MIN-AI等)與使用病毒基因的載體(如DON1.2等)進(jìn)行比較，構(gòu)建了另一個(gè)基于MLV的載體MIN-2。具體地說(shuō)，將含有HCMViel(UL123)基因的部分內(nèi)含子A和部分外顯子2的DNA序列插入MIN載體(見(jiàn)圖7d)。這一插入與DON2載體的相同。然后，通過(guò)在相應(yīng)的載體中插入CAT報(bào)道基因制備MIN-CAT，MIN-AICAT，MIN-EICAT，MIN-GICAT和MIN-2CAT載體。將用這些載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系進(jìn)行CAT檢測(cè)。CAT檢測(cè)的結(jié)果顯示本發(fā)明的所有載體的病毒滴度與對(duì)照載體LXSN和MFG的相似，而用MIN-2和MIN-EI轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系的基因表達(dá)水平比含有對(duì)照載體的細(xì)胞細(xì)高(見(jiàn)表3)。實(shí)施例下文實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案。但是，應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本文公開(kāi)的基礎(chǔ)上可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修正，而不脫離本發(fā)明精神和范圍。實(shí)施例1從MON載體中切除pol基因(1-1)ΔSA構(gòu)建為了制備缺乏pol編碼序列的5’LTR下游序列，進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中MON載體(韓國(guó)專利申請(qǐng)97-48095)被用作模板，兩個(gè)被描述于SEQIDNO1(HHIR引物)和NO2(R523Bam引物)的單鏈合成寡核苷酸被用作引物。被擴(kuò)增的DNA片段相應(yīng)于從MLV5’LTR至+523bp的核苷酸序列(見(jiàn)圖1)。在這種情況下，+1表示MLV基因組的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，從+212至+523bp的序列是包裝基因組RNA所需要的非編碼序列。將該P(yáng)CR產(chǎn)物亞克隆進(jìn)pCRII(Invitrogen，CA，USA)，然后從得到的載體中制備HindIII-BamHI片段。將MON載體的部分HindIII-BamHI片段用PCR產(chǎn)物的HindIII-BamHI片段替換，構(gòu)建ΔSA載體。將該ΔSA載體用作逆病毒載體的基本骨架，它含有MLV5’和3’LTR，和含有剪切受體的5’非編碼序列，IRES-neo盒和聚嘌呤片段，其中全部的逆病毒編碼序列被缺失(見(jiàn)圖1)。(1-2)ΔSA-CAT構(gòu)建體為了研究上述基因操作對(duì)外源基因表達(dá)和逆病毒基因組RNA包裝的影響，將一種細(xì)菌CAT基因用作報(bào)道基因。通過(guò)PCR得到CAT基因，其中，pCAT3-基礎(chǔ)載體(Promega，WI，USA)被用作模板，兩個(gè)被描述于SEQIDNO3(CATATGN引物)和NO4(CATSTOP引物)的合成寡核苷酸被用作引物。將PCR產(chǎn)物插入pCRII(Invitrogen，CA，USA)，并將得到的載體的BamHI片段，含有CAT基因，導(dǎo)入pC3.1(Invitrogen，CA，USA)制備pC3.1-CAT。通過(guò)將CAT基因(Klenow處理的pC3.1-CAT的XbaI-HindIII片段)插入ΔSA載體的HpaI位點(diǎn)構(gòu)建ΔSA-CAT載體(見(jiàn)圖1).(1-3)CAT檢測(cè)用ΔSA-CAT和對(duì)照載體(MON-CAT)，與Gag-Pol和Env包裝載體一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(DuBridge等，分子細(xì)胞生物學(xué)，7379-387，1987)。在將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，抽提胞漿蛋白質(zhì)，測(cè)定CAT活性，這是一種外源基因表達(dá)水平的標(biāo)志。同時(shí)，通過(guò)用0.45μm濾膜過(guò)濾培養(yǎng)基得到的無(wú)細(xì)胞病毒上清液被用于轉(zhuǎn)導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞(ATCCCRL1658)。使用轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時(shí)后的蛋白質(zhì)提取物確定CAT活性的水平。CAT檢測(cè)使胺以下步驟進(jìn)行的首先，收獲細(xì)胞，并用1ml的PBS(磷酸緩沖液)洗滌，然后懸浮在0.25M的Tris緩沖液(pH7.5)中。通過(guò)重復(fù)冷凍(在干冰中)-解凍(在37℃水浴中)循環(huán)6次裂解細(xì)胞。在將得到的細(xì)胞提取物在60℃加熱7分鐘使脫酰基酶失活后，在12000rpm離心10分鐘，吸取上清液。按照Bradford‘s方法對(duì)提取物中的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量。將歸一化的提取物與1μl的14C-氯霉素(60mCi/mmole，0.1mCi/ml)，2μl的乙酰輔酶A(40mM)，和適當(dāng)體積的0.25MTris(pH7.5)混合。將該反應(yīng)混合物在37℃溫浴適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。在反應(yīng)之后，用乙酸乙酯抽提氯霉素，并在減壓下濃縮。將小團(tuán)重新懸浮在15μl的乙酸乙酯中并加樣到薄層層析(TLC)板上。在使用TLC顯影溶劑(95％氯仿，5％甲醇)進(jìn)行TLC后，將TLC板干燥，然后用X-射線膠板上曝光，或用磷圖像分析儀(phosphoimageanalyzer)處理，從而使氯霉素的乙?；娇梢员粶y(cè)定。樣品中CAT活性可從乙?；穆让顾氐姆派浠钚耘c總的氯霉素的放射活性的比率來(lái)計(jì)算。表1顯示用缺乏pol基因的ΔSA-CAT轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞系中的CAT活性低于用MON-CAT轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞系中的活性。這表明pol編碼序列參與了基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。此外，在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞系中的CAT活性顯示出與轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的相同的類型，暗示包裝效率與基因表達(dá)效率相關(guān)。表1，pol缺失對(duì)基因表達(dá)水平的影響實(shí)施例2HCMViel(UL123)基因的啟動(dòng)子和外顯子和/或內(nèi)含子的插入為了保持剪切率和翻譯率的平衡，以及提高病毒RNA的總產(chǎn)量，構(gòu)建了含有以下三個(gè)載體的來(lái)源于MON逆病毒的載體●DON1.2載體，其中MLV5’LTR的全長(zhǎng)U3序列被HCMV主要立即早期啟動(dòng)子替換；并且，MLV剪切受體被含有HCMViel(UL123)基因的外顯子1，內(nèi)含子A和部分外顯子2(剛好終止于起始密碼子的前面)的DNA片段替換，●DON2載體，其中，MLV5‘LTR的全長(zhǎng)U3序列被HCMV主要立即早期啟動(dòng)子替換；并且MLV剪切受體被含有HCMViel(UL123)基因的部分內(nèi)含子A和部分外顯子2的DNA片段替換，和●DONSA1載體，其中，MLV5‘LTR的全長(zhǎng)U3序列被HCMV主要立即早期啟動(dòng)子替換；并且MLV剪切受體被含有小鼠的免疫球蛋白基因的剪切受體和HCMViel(UL123)基因的外顯子1的DNA片段替換構(gòu)建這些載體的詳細(xì)方法描述于下(見(jiàn)圖3a，圖3b，和圖4a至4c)。(2-1)SN-3LTR構(gòu)建在三個(gè)突變載體中，SV40啟動(dòng)子-neo盒被插入在外源基因克隆位點(diǎn)的下游位置(見(jiàn)圖2)。為構(gòu)建這些突變載體，以下述方式制備含有SV40啟動(dòng)子-neo盒的載體(見(jiàn)圖3a盒3b)。為制備其中neo基因是在SV40啟動(dòng)子控制下表達(dá)的載體，通過(guò)PCR制備SV40啟動(dòng)子-neo盒。在PCR中，pC3.1(Invitrogen，CA，USA)被用作模板，兩個(gè)被描述于SEQIDNO5(SV40-5引物)和NO6(Neo-3引物)的合成寡核苷酸被用作PCR引物。在SV40啟動(dòng)子-neo盒被亞克隆進(jìn)pCRII(Invitrogen，CA，USA)后，將得到的載體的BamHI-XhoI片段插入MON的BamHI/XhoI位點(diǎn)。將得到的載體MSN用BamHI和EcoRI限制酶消化并將含有SV40啟動(dòng)子-neo盒和3’LTR的BamHI-EcoRI片段與pUC18的BamHI-EcoRI片段連接，從而構(gòu)建SN-3LTR載體(見(jiàn)圖3a)。(2-2)pCM構(gòu)建為制備其中5’LTR被一種強(qiáng)的異源啟動(dòng)子替換的逆病毒載體，進(jìn)行PCR。被用作PCR模板的是含有嵌合LTR的逆病毒載體MCC-CAT(韓國(guó)專利申請(qǐng)NO97-48095)，其中，MLV5’LTR的全長(zhǎng)U3序列(-419至-1bp)被全長(zhǎng)HCMV主要立即早期啟動(dòng)子替換。PCR引物是兩個(gè)合成的寡核苷酸，描述于SEQIDNO1(HHIR引物)和NO2(r523Bam引物)。PCR產(chǎn)物含有從嵌合5’LTR至+523bp的DNA序列并被亞克隆進(jìn)pCRII(Invitrogen，CA，USA)。將亞克隆序列的HindIII-BamHI片段插入SN-3LTR載體(在實(shí)施例2-1中得到的)的HindIII-BamHI位點(diǎn)，制備pCM載體(見(jiàn)圖3b)。在pCM中，所有的逆病毒編碼序列被切除，如實(shí)施例1-1中的ΔSA載體，而ΔSA載體的5’LTR和IRES-neo盒分別被嵌合LTR和SV40啟動(dòng)子-neo盒替換。PCM載體被用作DON1.2，DON2和DONSA1載體的起始材料，如實(shí)施例2-3至2-5所示。(2-3)DON1.2和DON1.2-CAT構(gòu)建體為了得到含有HCMViel(UL123)基因的外顯子1，內(nèi)含子A和外顯子2(至起始密碼子)，進(jìn)行PCR。PCR中的模板是含有從HCMV主要立即早期啟動(dòng)子到外顯子5的pEQ276載體(Biegalke等，病毒學(xué)，183381-385，1991)。兩個(gè)PCR引物分別描述于SEQIDNO7(RI5引物，與外顯子1雜交)和SEQIDNO8(CMV外顯子2.3引物，與外顯子2雜交)。PCR擴(kuò)增了1-kb的DNA片段，并含有HCMViel(UL123)基因的外顯子1，內(nèi)含子A和部分外顯子2(至起始密碼子)。將該P(yáng)CR產(chǎn)物插入pZero平頭載體(Invitrogen，CA，USA)，制備pZero1.2載體。然后，將pZero1.2的EcoRI片段用Klenow酶處理，使其成為平端。將實(shí)施例2-2得到的pCM載體用BamHI酶消化，并用Klenow酶處理。將兩個(gè)平端DNA片段與構(gòu)建的DON1.2載體連接。此外，通過(guò)將CAT基因插入Klenow處理的DON1.2的HindIII片段構(gòu)建DON1.2-CAT載體。(2-4)DON2和DON2-CAT的構(gòu)建制備實(shí)施例2-3的pZero1.2的HpaI-EcoRI片段，它含有內(nèi)含子A的112-bp3’區(qū)域和外顯子2的5’區(qū)域(從+837至+964，剛好在起始密碼子的前面)。然后，將該DNA片段用Klenow酶處理得到平端。另一方面，將實(shí)施例2-2得到的pCM載體用BamHI酶消化，并用Klenow酶處理。將上述兩個(gè)具有平端的DNA片段連接構(gòu)建DON2載體。此外，DON2-CAT載體的構(gòu)建是通過(guò)將CAT基因插入Klenow處理的DON2的HindIII片段進(jìn)行的(見(jiàn)圖4b)。(2-5)DONSA1和DONSA1-CAT的構(gòu)建為了制備小鼠免疫球蛋白基因的剪切受體，合成一種單鏈寡核苷酸，分別描述于SEQIDNO9(SA頂寡聚物)和NO10(SA底寡聚物)。兩個(gè)寡聚物的退火反應(yīng)產(chǎn)生具有粘性末端的剪切受體片段。PGEM4-SA載體是通過(guò)將該片段插入pGEM4載體的BamHI位點(diǎn)制備的(Promega，WI，USA)(見(jiàn)圖4c)。為了擴(kuò)增HCMViel(UL123)基因的外顯子1，進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中，使用實(shí)施例2-3的pEQ276載體作為模板，兩個(gè)描述于SEQIDNO7(RI5引物)和SEQIDNO11(外顯子13引物)作為引物。將擴(kuò)增的外顯子1片段亞克隆進(jìn)pZero-平端載體(Invitrogen，CA，USA)的EcoRI位點(diǎn)，產(chǎn)生pZero-外顯子1載體。然后，將pZero-外顯子1的EcoRI片段亞克隆進(jìn)pGEM4-SA的EcoRI位點(diǎn)制備pGEM-SA-外顯子1載體。將pGEM4-SA-外顯子1的XbaI-BamHI片段用Klenow處理得到平端，然后與Klenow處理的pCM(實(shí)施例2-2中制備)的BamHI片段連接，構(gòu)建DONSA1載體。此外，通過(guò)將CAT基因插入DONSA1的HpaI位點(diǎn)構(gòu)建DONSA1-CAT載體(見(jiàn)圖4c)。(2-6)CAT檢測(cè)將DON1.2-CAT，DON2-CAT，DONSA1-CAT，和L-CAT-SN載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系FlyA13(Cosset等，病毒學(xué)雜志，697430-7436，1995)。在將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系培養(yǎng)48小時(shí)后，制備無(wú)細(xì)胞病毒上清液，轉(zhuǎn)導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞系。將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系培養(yǎng)48小時(shí)。按照實(shí)施例1-3中的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染的或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系中的CAT活性，從而分析相對(duì)的基因表達(dá)水平。如表2所示，在用DON1.2-CAT或DON2-CAT轉(zhuǎn)染的FlyA13細(xì)胞系中觀察到了比對(duì)照細(xì)胞系(用L-CAT-SN轉(zhuǎn)染)顯著高的CAT活性水平。此外，穩(wěn)定地被DON1.2-CAT或DON2-CAT載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的NIH3T3細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞顯示出5-至10-倍高的CAT活性。在用DONSA1-CAT轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系的情況下，觀察到比對(duì)照稍微高一點(diǎn)的CAT活性。這些結(jié)果提示，如果參與剪切的異源性非編碼序列被插入到表達(dá)載體中外源基因的上游位置，剪切效率和基因表達(dá)效率可被提高。用DON2和DONSA1載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株分別被命名為T(mén)OP10-DON2和Top10-DONSA1。它們?cè)?998年6月5日被保藏在韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(KoreanCultureCenterofMicroorganism)(保藏號(hào)分別為KCCM-10128，KCCM-10127)。表2異源序列插入對(duì)基因表達(dá)水平的影響</tables>實(shí)施例3人類基因的內(nèi)含子和/或外顯子的插入在這一實(shí)施例中，構(gòu)建了MIN-衍生的逆病毒載體，MIN-AI，MIN-EI，MIN-GEI和MIN-2，從而使外源基因的轉(zhuǎn)錄，剪切率與翻譯在真核細(xì)胞中平衡。在MIN載體以及ΔSA載體中不含有病毒序列，但MIN含有IRES-neo盒而不是SV啟動(dòng)子-neo盒(見(jiàn)圖5)。上述四個(gè)啟動(dòng)子的特征如下●一種含有人類β-肌動(dòng)蛋白基因的內(nèi)含子，剪切受體和部分外顯子2的DNA片段被插入在MIN-AI載體中外源基因的上游位點(diǎn)。●一種含有人類EF1α基因的內(nèi)含子，剪切受體和部分外顯子2的DNA片段被插入在MIN-EI載體中外源基因的上游位點(diǎn)。●一種含有人類GAPDH基因的內(nèi)含子，剪切受體和部分外顯子2的DNA片段被插入在MIN-GI載體中外源基因的上游位點(diǎn)。除了這些構(gòu)建體外，制備了一種載體，其中，一種異源的病毒序列被插入。特別是，制備了MIN-2載體，其中，一種含有HCMViel(UL123)基因的內(nèi)含子，剪切受體，和部分外顯子2的DNA片段被插入在MIN載體的克隆位點(diǎn)的上游位點(diǎn)。MIN和MIN衍生的MIN-AI，MIN-EI，MIN-GI和MIN-2的構(gòu)建如下。(3-1)MIN的構(gòu)建為得到MLV3’LTR區(qū)域，進(jìn)行PCR，其中，pMLV(Shinnick等，自然，293543-548，1981)被用作模板，兩個(gè)描述于SEQIDNO12(3LTR5引物)和NO13(3LTR3引物)的合成寡核苷酸被用作引物。被擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物含有3’非翻譯區(qū)域，聚嘌呤區(qū)域，和MLV基因組的3’LTR。將亞克隆在pCRII載體(Invitrogen，CA，USA)中的PCR產(chǎn)物用BamHI和EcoRI酶消化，并將產(chǎn)生的片段插入在pUC18的BamHI-EcoRI位點(diǎn)，制備p3LTR載體(見(jiàn)圖6)。另一方面，為得到含有逆病毒5’LTR和剪切共體的非編碼序列，進(jìn)行PCR，其中，pMLV被用作模板和兩個(gè)被描述于SEQIDNO1(HHIR引物)和NO14(5LTR3引物)的合成寡核苷酸被用作引物。被擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物含有MLV基因組的從5’LTR至+623bp(剛好在gag編碼序列的前面)的核苷酸序列。在PCR產(chǎn)物被亞克隆在pCRII載體中后，該載體的HindIII-BamHI片段被插入在p3LTR的HindIII-BamHI位點(diǎn)，來(lái)制備p53LTR載體(見(jiàn)圖6)。最后，通過(guò)BamHI-XhoI消化從pCBIN(韓國(guó)專利申請(qǐng)97-48095)分離IRES/neo盒，然后插入在p53LTR載體的BamHI-XhoI位點(diǎn)，構(gòu)建MIN載體(見(jiàn)圖6)。通過(guò)將CAT基因插入MIN載體的BamHI位點(diǎn)也構(gòu)建出MIN-CAT載體，以分析MIN載體的表達(dá)效率。(3-2)MIN-AI構(gòu)建體為了制備將被插入在MIN載體中的人類核苷酸序列，從人類細(xì)胞中提取基因組DNA。首先，從人學(xué)中通過(guò)Ficoll-paque梯度離心分離外周血單核細(xì)胞。在洗滌一次或兩次并重新收集后，將細(xì)胞用TES(10mMTris-Cl(pH7.0)，10mMEDTA，0.7％SDS)裂解。在細(xì)胞裂解液中加入蛋白酶K(400μg/ml)并將裂解液在50-55℃溫浴1-2小時(shí)，然后進(jìn)行酚/氯仿抽提和乙醇沉淀。將分離的基因組DNA用作PCR的模板，擴(kuò)增出含有人類β-肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子，外顯子1，內(nèi)含子和部分外顯子2。用于PCR的引物是兩個(gè)合成的寡核苷酸，描述于SEQIDNO15(β-肌動(dòng)蛋白5引物)和NO16(β-肌動(dòng)蛋白3引物)。將PCR產(chǎn)物亞克隆進(jìn)Pcrii載體，然后將該載體的MluI-NheI片段插入pC3.1載體(Invitrogen，CA，USA)的MluI-NheI位點(diǎn)，制備pβactin。將Klenow處理的pβactin的BglI-BamHI片段(相應(yīng)于人類β-肌動(dòng)蛋白基因的+717--+849片段)插入T4-聚合酶-處理的MIN載體的ApaI/BamHI位點(diǎn)(見(jiàn)圖7a)。得到的載體被稱為MIN-AI。此外，通過(guò)將CAT基因插入MIN-AI載體的BamHI位點(diǎn)構(gòu)建MIN-AICAT載體，以分析MIN-AI的表達(dá)效率。(3-3)MIN-EI的構(gòu)建為得到人類EF1α基因的非編碼序列，進(jìn)行PCR。將實(shí)施例3-2中分離的基因組DNA用作模板，兩個(gè)描述于SEQIDNO17(EF1α5引物)和NO18(EF1α3引物)的合成寡核苷酸被用作引物。被擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物含有人類EF1α基因的啟動(dòng)子，外顯子1，內(nèi)含子和部分外顯子2。將PCR產(chǎn)物亞克隆在pCRII載體中，然后將該載體的MluI-NheI片段插入pC3.1載體(Invitrogen，CA，USA)的MluI-NheI位點(diǎn)，制備pEF1α。將Klenow處理的pEF1α的XhoI-BamHI片段(相應(yīng)于人類基因的EF1α的+772--+1008)插入T4-聚合酶-處理的MIN載體的ApaI/BamHI位點(diǎn)(見(jiàn)圖7b)。得到的載體被稱為MIN-EI。此外，通過(guò)將CAT盒插入MIN-EI載體的BamHI位點(diǎn)構(gòu)建MIN-EICAT載體，以分析MIN-EI的表達(dá)效率。將MIN-EICAT導(dǎo)入大腸桿菌菌株Top10并將該大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為MIN-EICAT(Top10)，在1999年6月2日保藏在韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(保藏號(hào)KCCM-10163)。(3-4)MIN-GI的構(gòu)建為得到人類GAPDH基因的非編碼序列，進(jìn)行PCR。將實(shí)施例3-2中分離的基因組DNA用作模板，兩個(gè)描述于SEQIDNO19(Gint5引物)和NO20(Gint3引物)的合成寡核苷酸被用作引物。被擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物含有人類GAPDH基因的部分內(nèi)含子和部分外顯子2，相應(yīng)與人類GAPDH基因的+185-+317。將PCR產(chǎn)物亞克隆在pCRII載體中，然后將該載體的MluI-BamHI片段插入MIN載體的MluI-BamHI位點(diǎn)。得到的載體被稱為MIN-GI(見(jiàn)圖7c)。此外，通過(guò)將CAT基因插入MIN-GI載體的BamHI位點(diǎn)構(gòu)建MIN-GICAT載體，以分析MIN-GI的表達(dá)效率。(3-5)MIN-2的構(gòu)建制備DON2的MluI-BamHI片段(相應(yīng)于HCMViel基因的+837--+964)，它含有HCMViel(UL123)基因的內(nèi)含子，剪切受體和部分外顯子2。將MluI-BamHI片段插入MIN載體的MluI-BamHI位點(diǎn)。得到的載體被稱為MIN-2(見(jiàn)圖7d)。此外，通過(guò)將CAT基因插入MIN-2載體的BamHI位點(diǎn)構(gòu)建MIN-2CAT載體，以分析MIN-2的表達(dá)效率。將MIN-2CAT導(dǎo)入大腸桿菌菌株Top10并將該大腸桿菌轉(zhuǎn)化體命名為MIN-2CAT(Top10)，在1999年6月2日保藏在韓國(guó)微生物培養(yǎng)中心(保藏號(hào)KCCM-10164)。(3-6)CAT檢測(cè)為了檢測(cè)上述四個(gè)載體的外源外源基因表達(dá)效率和包裝能力，對(duì)這些載體進(jìn)行CAT檢測(cè)，其中已知的逆病毒載體的CAT插入形式，MFG和LXSN，被用作對(duì)照載體(Miller等，生物技術(shù)，7980-990，1989；Ohashi等，美國(guó)科學(xué)院院刊，8911332-11336，1992)。將包裝細(xì)胞系Phoenix(Kinsella和Nolan，人類基因治療，71405-1413)用這些載體轉(zhuǎn)染，然后培養(yǎng)48小時(shí)。同時(shí)，將通過(guò)用0.45μm濾膜過(guò)濾培養(yǎng)基得到的無(wú)細(xì)胞病毒上清液用于轉(zhuǎn)導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞(ATCCCRL1658)。使用轉(zhuǎn)導(dǎo)2天后的蛋白質(zhì)提取物確定CAT的活性水平。對(duì)用每一種載體(見(jiàn)表3中“臨時(shí)轉(zhuǎn)染”和“轉(zhuǎn)導(dǎo)，臨時(shí)”欄)轉(zhuǎn)染的或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系以及抗生素抗性細(xì)胞群(見(jiàn)表3中“轉(zhuǎn)導(dǎo)，穩(wěn)定”)測(cè)定CAT活性。此外，對(duì)亞培養(yǎng)4周的穩(wěn)定細(xì)胞群(見(jiàn)表3中“轉(zhuǎn)導(dǎo)，穩(wěn)定(4周)”欄)測(cè)定CAT活性。從用每一種載體轉(zhuǎn)染的或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系測(cè)定的CAT活性確定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中基因的表達(dá)水平和病毒滴度。如表3所示，所有的逆病毒載體比MIN載體顯示出較高的CAT活性，除了LXSN載體。但是，根據(jù)插入的異源性序列CAT活性有所差別。特別是，MIN-EI和MIN-2產(chǎn)生出顯著高的基因表達(dá)水平。用MIN-EI或MIN-2穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)生出非常顯著高的基因表達(dá)水平，即使在亞培養(yǎng)4周之后。表3異源序列對(duì)逆病毒載體的效率的影響工業(yè)實(shí)用性如上文所述，本發(fā)明提供了具有許多基因治療優(yōu)點(diǎn)等的逆病毒載體。本發(fā)明的載體具有以下特征1.由于所有的逆病毒編碼序列(gag，env，和pol序列)被切除，這可完全避免通過(guò)同源重組產(chǎn)生具有復(fù)制能力的逆病毒的可能性。2.由于異源內(nèi)含子，剪切受體，和/或非編碼序列被插入在外源基因的克隆位點(diǎn)的上游位置，載體中的外源基因可被穩(wěn)定地或高效地表達(dá)。3.由于在5’LTR中的U3區(qū)域被特別是在人類細(xì)胞中強(qiáng)烈地誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的異源啟動(dòng)子替換，用這些載體轉(zhuǎn)染的來(lái)源于人細(xì)胞的包裝細(xì)胞系可產(chǎn)生較高水平的RNA，從而顯示出增高的病毒滴度。4.一種IRES或一種異源啟動(dòng)子被同時(shí)使用，在載體中表達(dá)兩個(gè)或多個(gè)外源基因。在這種情況下，可使用一種最低啟動(dòng)子作為插入的外源啟動(dòng)子，以減小外源內(nèi)部啟動(dòng)子的干擾和克隆具有較大尺寸的外源基因。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)看到，本文公開(kāi)的概念和特定的實(shí)施例可被用作進(jìn)一步改進(jìn)的基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出其它的實(shí)施方案并達(dá)到本發(fā)明的目的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員也將會(huì)看到，這樣的等同的實(shí)施方案沒(méi)有脫離本發(fā)明的精神和范圍。序列表<110>維絡(luò)麥德公司<120>不含有病毒編碼序列的高效逆病毒載體<130>9fpo-05-10<150>KR98-24478<151>1998-06-26<150>KR99-23398<151>1999-06-22<160>20<170>KOPATIN1.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>HHIR引物<400>1aagcttatctgaaagacccc20<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>R523Bam引物<400>2ggatcccaaaaattcagacgga22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>CATATGN引物<400>3ccatggagaaaaaaatcact20<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>CATSTOP引物<400>4ggatccttacgccccgccctgcca24<210>5<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>SV40-5引物<400>5cggatccgtcgacgttaactcatgcatctcaattagtca39<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>Neo-3引物<400>6ctcgagtcagaagaactc18<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>R15引物<400>7gggaattctcagatcgcctggagacgcc28<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>CMVexon2.3引物<400>1aagcttcgtgtcaaggacggt21<210>9<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>SATop寡聚物<400>9gatctctccacagga15<210>10<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>SA底部寡聚物<400>10agaggtgtcctctag15<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>外顯子13引物<400>11cgggatccgtcactcttggcacgggg26<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>3LTR5引物<400>12ggatcctcgaggataaaataaaagattttatttagtctcc40<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>3LTR3引物<400>13gaattcaatgaaagacccccgctgac26<210>14<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>5LTR3引物<400>14ggatccgcgggcccacgcgtattttcagacaaatacagaaacacagtcag50<210>15<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>beta-肌動(dòng)蛋白5引物<400>15acgcgtgcccagcaccccaaggcggccaacgccaaa36<210>16<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>beta-肌動(dòng)蛋白3引物<400>16gctagcggtgagctgcgagaatagccgggcgcgctgt37<210>17<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>EF1alpha5引物<400>17acgcgtggcaattgaaccggtgcctagagaaggtgg36<210>18<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>EF1alpha3引物<400>18gctagctttggcttttaggggtagttttcacgacac36<210>19<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>Gint5引物<400>19acgcgtatcgatagatctgtcgacgtgatgcggcgcgggct41<210>20<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>Gint3引物<400>20gcggccgcgttaacggatccatggtgtctgagcgatgtg39權(quán)利要求1.基于MLV的逆病毒載體，其中，MLV(小鼠白血病病毒)-編碼的gag，env和pol序列完全缺失。2.按照權(quán)利要求1所述的基于MLV的逆病毒載體，它含有異源性內(nèi)含子和/或異源性剪切受體，被插入在外源基因的克隆位點(diǎn)的上游。3.按照權(quán)利要求2所述的基于MLV的逆病毒載體，其中，所述的異源性內(nèi)含子和/或異源性剪切受體選自HCMV(人類肥大細(xì)胞病毒)iel(UL123)基因、EF1α(延長(zhǎng)因子1α)基因、GAPDH(甘油醛3-磷酸脫氫酶)基因、β-肌動(dòng)蛋白基因，和小鼠免疫球蛋白基因的內(nèi)含子和/或剪切受體。4.按照權(quán)利要求1所述的基于MLV的逆病毒載體，它含有一種被插入在外源基因克隆位點(diǎn)的上游位置的異源性非編碼序列。5.按照權(quán)利要求4所述的基于MLV的逆病毒載體，其中所述的異源性非編碼序列選自HCMViel(UL123)基因、EF1α基因、GAPDH基因、和β-肌動(dòng)蛋白基因的非編碼序列。6.按照權(quán)利要求1所述的基于MLV的逆病毒載體，其中MLV5’LTR的全長(zhǎng)U3序列(-419至-1bp)被一種異源性啟動(dòng)子替換。7.按照權(quán)利要求6所述的基于MLV的逆病毒載體，其中，該異源性啟動(dòng)子是HCMV主要立即早期啟動(dòng)子。8.按照權(quán)利要求1所述的基于MLV的逆病毒載體，它含有一種插入在外源基因的克隆位點(diǎn)的下游的異源性啟動(dòng)子。9.按照權(quán)利要求8所述的基于MLV的逆病毒載體，其中該異源性啟動(dòng)子是SV40最小啟動(dòng)子。10.按照權(quán)利要求2所述的基于MLV的逆病毒載體，它是DONSA1載體，其中，小鼠免疫球蛋白基因的剪切受體和HCMViel(UL123)基因的外顯子1被插入在外源基因的克隆位點(diǎn)的上游位置；MLV5’LTR的全長(zhǎng)U3序列(-419至-1bp)被HCMV主要立即早期啟動(dòng)子替換；并且SV40最小啟動(dòng)子被插入在外源基因的克隆位點(diǎn)的下游位置。11.按照權(quán)利要求2所述的基于MLV的逆病毒載體，它是DON2載體，其中，HCMViel(UL123)基因的部分內(nèi)含子A(112-bp3’片段)和部分外顯子2(從外顯子2的5’端至起始密碼子前的5’片段)被插入在外源基因的克隆位點(diǎn)的上游位置；MLV5’LTR的全長(zhǎng)U3序列(-419至-1bp)被HCMV主要立即早期啟動(dòng)子替換；并且SV40最小啟動(dòng)子被插入在外源基因的克隆位點(diǎn)的下游位置。12.按照權(quán)利要求4所述的基于MLV的逆病毒載體，它是MIN-EI載體，其中，含有人類EF1α基因的部分內(nèi)含子和部分外顯子2(+772至+1008bp)的DNA片段被插入在外源基因的克隆位點(diǎn)的上游位置。13.按照權(quán)利要求4所述的基于MLV的逆病毒載體，它是MIN2載體，其中，含有HCMViel(UL123)基因的部分內(nèi)含子A和部分外顯子2(+837至+964bp)的DNA片段被插入在外源基因的克隆位點(diǎn)的上游位置。14.用權(quán)利要求10的DONSA1載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株Top10-DONSA1(保藏號(hào)KCCM-10127)。15.用權(quán)利要求11的DON2載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株Top10-DON2(保藏號(hào)KCCM-10128)。16.用一種在權(quán)利要求12的載體的克隆位點(diǎn)含有細(xì)菌CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因的MIN-EICAT載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株MIN-EICAT(Top10)(保藏號(hào)KCCM-10163)。17.用一種在權(quán)利要求13的載體的克隆位點(diǎn)含有細(xì)菌CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因的MIN-2CAT載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株MIN-2CAT(Top10)(保藏號(hào)KCCM-10164)。全文摘要本發(fā)明涉及改良的用于基因治療的逆病毒載體。在本發(fā)明中從基于MLV的起始載體,MON和MIN構(gòu)建了具有高的安全性和有效性的逆病毒載體。該改良的載體具有以下特征:1)在載體中相應(yīng)于來(lái)源于MLV的pol基因被完全缺失,避免了常規(guī)載體中成為棘手問(wèn)題的同源重組,2)一種異源性內(nèi)含子,剪切受體和/或非編碼序列被插入在克隆位點(diǎn)的上游,通過(guò)高效率的剪切使外源基因的表達(dá)最大化,3)該載體含有5’LTR的全長(zhǎng)U3序列或者一種強(qiáng)的異源性啟動(dòng)子,使RNA大量表達(dá),4)IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))或者內(nèi)部SV40最小啟動(dòng)子被插入在克隆位點(diǎn)的下游,使兩個(gè)或多個(gè)外源基因同時(shí)表達(dá)。由于本發(fā)明的改良的逆病毒載體被證明是安全的和可高效表達(dá)外源基因,它們可被用于基因治療等。文檔編號(hào)A61K48/00GK1277636SQ99800828公開(kāi)日2000年12月20日申請(qǐng)日期1999年6月24日優(yōu)先權(quán)日1998年6月26日發(fā)明者金善榮,柳承信,金種默申請(qǐng)人:維絡(luò)麥德公司