專利名稱：：病毒載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及突變的病毒載體及其應(yīng)用，特別是在體外產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞系和以組成型方式產(chǎn)生蛋白方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：已從包括辛德畢斯病毒(SIN)(34)、Semliki森林病毒(SFV)(18)以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)(25)的不同病毒研發(fā)了a病毒(alphavims)表達載體。a病毒載體通?；赗NA復制子，在該復制子中結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)被異源基因替換。a病毒復制子在其5，末端含有編碼病毒復制酶(Rep)的ORF,當RNA被轉(zhuǎn)染到真核細胞時，該ORF得到翻譯。Rep以多蛋白(polyprotein)表達，其隨后被力口工成4個亞基(nsps1-4)(30)。未加工的Rep可以以負鏈RNA復制RNA載體，該過程僅發(fā)生于轉(zhuǎn)染或感染后的頭3-4小時內(nèi)。一旦得以加工，Rep將利用負鏈RNA作為模板合成更多復制子分子。加工后的Rep也可以識別負4連RNA中的內(nèi)部序列或亞基因組啟動子(subgenomicpromoter),由所述內(nèi)部序列或亞基因組啟動子，其將合成對應(yīng)于復制子3，末端的亞基因組正鏈RNA。這種亞基因組RNA將被翻譯，產(chǎn)生大量異源蛋白。通過用可提供反式病毒結(jié)構(gòu)蛋白的一種或多種輔助RNA共轉(zhuǎn)染細胞(2,4，8，25,29)，或通過利用穩(wěn)定包裝的細胞系(24)，也可以將復制子RNA包裝成病毒顆斗立。由于還未完全了解的機制，a病毒載體的復制在大多數(shù)哺乳動物細胞中是致細胞病變的(3，9,13)。這些載體誘發(fā)的致細胞病變效應(yīng)受不依賴p53的細胞凋亡的介導，并且通常發(fā)生于轉(zhuǎn)染或感染后48小時至72小時。據(jù)懷疑，nsp2,病毒復制酶的4個組分之一，可能在凋亡誘導中起重要作用(ll,12)。致細胞病變的a病毒載體已經(jīng)用于一系列的應(yīng)用中，包括體外蛋白的產(chǎn)生和表征(33)，以及用于有關(guān)接種的研究和癌癥的基因治療中(19,26)。然而，此類野生型病毒的重要缺陷在于，它們不能用于期望轉(zhuǎn)基因長久表達的應(yīng)用中。為了克服這個缺陷，幾個小組已經(jīng)鑒定了a病毒復制酶中可將這些致細胞病變的病毒載體轉(zhuǎn)變?yōu)榉侵录毎∽兊牟《据d體的一系列突變，從而使病毒載體表達的重組產(chǎn)物可以更長久地表達。這些研究已經(jīng)產(chǎn)生了衍生于SIN(7,22)、SFV(20-22)且更近期衍生于VEE和EEE(東部馬腦炎病毒)(23)的非致細胞病變載體。已經(jīng)將在a病毒中檢測到的大多數(shù)非致細胞病變突變定位于Rep亞基nsp2中。這種蛋白含有位于氨基末端的解旋酶結(jié)構(gòu)域和位于羧基末端的蛋白水解結(jié)構(gòu)域，后者與Rep的四個亞基的加工有關(guān)(30)。已經(jīng)證明，所述nsp2的非致細胞病變突變影響nsp2的蛋白水解結(jié)構(gòu)域，或者影響接近nspl/2或nsp2/3之間切割位點的位置，從而改變Rep的加工。在SIN中分離的非致細胞病變突變體，在nsp2的位置726處含有單氨基酸變化(用P換L)(nsp2的P726LSIN載體)，這表現(xiàn)出Rep的超加工(hyperprocessing)(7)。這種突變體能夠在BHK細月包中有效地連續(xù)復制。在這種突變體的相同位置引入不同的氨基酸變化表明，在RNA復制水平和載體的致細胞病變性之間存在強正相關(guān)性。這種非致細胞病變SIN載體已經(jīng)在體外廣泛利用，因為它可以提供長久的具有良好穩(wěn)定水平的轉(zhuǎn)基因表達，而其表達水平為用(野生型(wt))原始SIN載體所獲得的表達水平的約4%(1)。然而，盡管所述載體是非致細胞病變的，但缺少產(chǎn)生具有高表達水平的穩(wěn)定細胞系的能力。事實上，在用攜帶LacZ基因的P726LSIN載體產(chǎn)生的細胞系中，傳代5代后，45%的轉(zhuǎn)染細胞喪失了轉(zhuǎn)基因表達，且表達的穩(wěn)定性僅通過選擇個體克隆實現(xiàn)(l),這不可忽視地延遲了獲得大量可有效表達轉(zhuǎn)基因的細胞。即便如此，這些細胞系維持了低表達水平(為用wtSIN載體獲得的水平的4%)。此外，已經(jīng)描述了在亞基nsp2中含有突變P718T和R649H(R649H/p718T)、表達。票呤霉素抗性pac基因的非致細胞病變SFV載體，盡管其產(chǎn)生高表達的穩(wěn)定細胞系的能力尚未記載(Smerdou,C.etal.2004.SeventhInternationalSymposiumonPositiveStrandRNAViruses(第7次正鏈RNA病毒國際討論會)，S.Franciso，USA)。對于Petri等(22)描述的非致細胞病變的SFV突變體，包括突變體SF2A(nsp2中的突變L10T)和SF2C(nsp2中的突變L713P),以及Lundstr6m等(21)描述的雙突變體PD(nsp2中的S259P和R650D),事實是，它們可以表達與野生型病毒相似的、甚至高于野生型病毒的蛋白水平(突變體PD),但是，在所有的情況下，這些突變體仍然是致細胞病變的(參閱本說明書的實施例8)，并且尚未記載基于所述病毒載體產(chǎn)生表達異源蛋白的穩(wěn)定細胞系。與SFV-PD載體致細胞病變的作用相關(guān)的數(shù)據(jù)還受到Lundstr6m等(20)隨后所公布結(jié)果的支持，所述結(jié)果表明，在感染了攜帶LacZ或GFP作為標志物基因的SFV-PD載體的BHK細胞中，(3-gal或GFP的表達如何在48小時后達到最大值，并且稍后在接下來的3-4天內(nèi)顯著降低，這表明，致細胞病變作用發(fā)生于細胞內(nèi)(參閱所提到的參考文獻的圖2)。因此，盡管已經(jīng)描述了編碼a病毒SIN和SFV的nsp2蛋白的基因中的點突變體，并且盡管這些突變體的致細胞病變性已經(jīng)降低，但是沒有一個所述突變體表現(xiàn)出產(chǎn)生具有高表達水平的穩(wěn)定細胞系的能力。因此，仍然需要研發(fā)可替換的非致細胞病變病毒a病毒載體，用于產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞系，所述細胞系在選擇存在的情況下能穩(wěn)定地產(chǎn)生異源蛋白。發(fā)明概述a病毒載體可在不同類型的細胞中表達高重組蛋白水平。然而，這種表達由于病毒復制的致細胞病變特性是瞬時的。為了使這些載體適應(yīng)長期研究，已經(jīng)分離了辛德畢斯病毒(SIN)、Semliki森林病毒(SFV)以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)的非致細胞病變突變體。這些突變體中的大多數(shù)含有在nsp2中的變化，而nsp2是病毒復制酶的亞基。為了產(chǎn)生新的非致細胞病變SFV載體，已將所述用于產(chǎn)生非致細胞病變SIN載體的突變引入SFV中的保守位置。足以好奇的是，發(fā)現(xiàn)在nsp2中含有突變P718T并攜帶LacZ基因作為異源基因的SFV復制子(SFV-LacZ)產(chǎn)生非致細胞病變變體，所述變體形成在沒有施加選擇下表達卩-半乳糖苷酶(l3-gal)的集落，盡管事實上它顯然不能在這些細胞中的大多數(shù)中復制。建立的假設(shè)是非致細胞病變變體是由于次級適應(yīng)性突變(secondaryadaptivemutations)。為了分離這些變體，將噤呤霉素N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(pac)基因(選擇基因)導入突變體SFV-P718T中，并且選擇嘌呤霉素抗性的BHK細胞克隆。從一個所選擇的克隆中，拯救含有nsp2核定位信號中的另一突變、具體地突變R649H的非致細胞病變復制子。這種雙突變體，在本說明書中鑒定為SFV-S2-9,在nsp2中含有突變R649H和P718T,以比野生型SFV載體低60倍的水平復制，該事實與用在nsp2中含有雙突變R649H/P718T的SFV載體轉(zhuǎn)染的細胞中的致細胞病變性的缺失有關(guān)。在用SFV-S2-9-LacZ和SFV-LacZ轉(zhuǎn)染后24小時的轉(zhuǎn)染細胞中觀察到相似的(3-gal表達水平，該水平的范圍為約15pg/細胞(圖6)。足以令人驚訝的是，基于在nsp2中含有雙突變R649H/P718T的所述雙SFV突變體(SFV-S2-9)的非致細胞病變病毒載體，能產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞系，該細胞系在培養(yǎng)的至少10代中能表達p-gal(在每一代中通過X-gal染色測定的表達P-gal細胞的百分比，根據(jù)傳代在70%至90%變動，但在第10代，高于85%，這表明在選擇存在時，轉(zhuǎn)基因表達的極好穩(wěn)定性，這可從圖7中觀察到)，而且是組成型表達，因為其在轉(zhuǎn)染了SFV-S2-9-LacZ的細胞中隨著時間而增加，在轉(zhuǎn)染后48小時，穩(wěn)定在約30pg(3-gal/細胞。換句話說，通過用非致細胞病變的雙突變體SFV載體(R649H/P718T)轉(zhuǎn)染，表達在數(shù)量上達到了當用野生型SFV載體轉(zhuǎn)染細胞24小時后所實現(xiàn)的表達的2倍。所述非致細胞病變雙突變體SFV載體(R649H/P718T)也能產(chǎn)生能組成型地表達目的異源蛋白如大鼠心臟營養(yǎng)素-l(rCT)和人胰島素樣生長因子(IGF-I)的穩(wěn)定的細胞系，其表達水平與用野生型SFV載體獲得的水平相似。實際上，所述雙突變體SFV載體(R649H/P718T)能產(chǎn)生能以與用野生所述水平為約4.3pg/細胞(實施例9)。盡管在所分析的細胞系中觀察到載體的高穩(wěn)定性，但在由2個獨立的亞基因組啟動子表達rCT和pac的細胞系中，觀察到較用LacZ基因低的穩(wěn)定性，rCT的表達從第6代開始減少，到第ll代時基本上消失(圖16)。然而，利用編碼口蹄疫病毒(FMDV)自身蛋白酶2A的核苷酸序列作為連接子(linker)而融合的rCT和pac基因可產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞系，其中rCT的表達穩(wěn)定性在無變異的情況下保持至少IO代(圖17)。同樣，所述雙突變體SFV載體(R649H/P718T)也能產(chǎn)生能以用野生型SFV載體獲得的水平相當?shù)乃奖磉_IGF-I的穩(wěn)定的細胞系(圖19)，所述水平為約50pg/細胞(實施例10)。由2個獨立亞基因組啟動子表達IGF-I和pac的細胞系表現(xiàn)出多少低于野生型SFV載體的IGF-I表達水平(在第l代中低約2倍)，還表現(xiàn)出比用LacZ基因更低的穩(wěn)定性，表達從第5代開始降低，且在第1代至第10代降低了約80倍(圖20)。利用編碼FMDV自身蛋白酶2A的核苷S臾序列作為連接子而融合pac和IGF-I基因可產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞系，在該細胞系中，第1代中IGF-I的表達更接近野生型SFV載體的表達，且在該細胞系中，IGF-I表達的穩(wěn)定性僅具有小量變化，直到第IO代(在第10代中，僅比第一代中所觀察到的穩(wěn)定性低4倍)(圖20)。另外，如實施例8所能證實的，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中已確立的偏見，因為其證明，現(xiàn)有技術(shù)中存在且限定為非致細胞病變的突變的SFV載體保持致細胞病變性特征。如本發(fā)明所述，術(shù)語"穩(wěn)定細胞系，，指這樣的細胞系，即在該細胞系中，在第10代表達異源產(chǎn)物(如肽或異源蛋白等)的細胞的百分比高于85%,所述的百分比能在連續(xù)或隨后的傳代中得以維持或超越。如本文所用，術(shù)語"組成型表達，，指令人足夠驚訝地，上述穩(wěn)定細胞系所具有的其他能力，從而以在數(shù)量上的高水平(高于當用野生型載體轉(zhuǎn)導細胞時，轉(zhuǎn)導后24小時獲得的表達水平的50%)表達異源產(chǎn)物。同樣，如現(xiàn)有技術(shù)所知的，"RNA復制子"是利用互補RNA作為中間體單式復制的核苷酸序列，所述中間體可用作產(chǎn)生更多原始RNA分子的模板。為此目的，在RNA末端的特異性序列通常是必須的。本發(fā)明提供的病毒載體中包含的復制子，含有SFV復制所需的5，末端、編碼在nsp2區(qū)域具有突變P718T和R649H的SFV復制酶的序列、至少一個病毒SFV亞基因組啟動子、含有選擇基因的多核苷酸、含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸以及含有聚腺噤呤(PolyA)末端序列的、SFV復制所需的3，末端。在特定實施方案中，將含有選擇基因的所述多核苷酸以及所述含有編碼目的異源產(chǎn)物的核芬酸序列的多核苷酸置于2個獨立的亞基因組啟動子的下游，并可操作地連^l妻于所述啟動子(即，將一個所述多核苷酸置于亞基因組啟動子的下游并可操作地與之連接，而將另一個多核苷酸置于另一個亞基因組啟動子的下游并與之可操作連接)。在另一個特定的實施方案中，將所述含有選擇基因的多核苷酸以及所述含有編碼目的異源產(chǎn)物的核普酸序列的多核苷酸有利地通過含有編碼翻譯后蛋白水解切割位點(有利的翻譯后自身蛋白水解切割位點)的核苷酸序列的多核苷酸彼此融合，并放置于單個亞基因組啟動子的下游并可操作地與之連接。因此，本發(fā)明一方面涉及含有Semliki森林病毒(SFV)復制子的病毒載體(本發(fā)明的病毒載體)，其中所述復制子含有(i)編碼在nsp2亞基中具有突變P718T和R649H的SFV復制酶的核苷酸序列，(ii)含有選擇基因的多核苷酸，以及(iii)含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明另一方面涉及本發(fā)明的病毒載體體外產(chǎn)生能組成型地表達目的異源產(chǎn)物的穩(wěn)定細胞系的用途。本發(fā)明另一方面涉及能組成型地表達目的異源產(chǎn)物的穩(wěn)定細胞系，其中所述細胞系是用本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞系。本發(fā)明另一方面涉及體外產(chǎn)生能組成型地表達目的異源產(chǎn)物的所述穩(wěn)定細胞系的方法。本發(fā)明另一方面涉及所述穩(wěn)定細胞系體外產(chǎn)生目的異源產(chǎn)物的用途。本發(fā)明另一方面涉及體外產(chǎn)生目的異源產(chǎn)物的方法，其包括在一定條件下培養(yǎng)所述穩(wěn)定細胞系，所述條件為使用來產(chǎn)生所述穩(wěn)定細胞系的病毒載體所含目的異源產(chǎn)物表達的條件。附圖簡要i兌明圖1.攜帶SIN衍生的突變的SFV載體的致細胞病變性評估。如實施例所述，構(gòu)建在nsp2中含有突變P718T(pSFV-S2-LacZ)和P718F(pSFV-S3-LacZ)的質(zhì)粒pSFV-LacZ。由這些質(zhì)粒的每一個以及由原始pSFV3-LacZ體外轉(zhuǎn)錄RNA,并在BHK細胞中電穿孔，所述細胞以低匯合度接種于直徑35mm的平板，并在培養(yǎng)了指定的時間后，用X-gal染色。在SFV-S2-LacZ或SFV-S3-LacZ的情況下，培養(yǎng)96小時(h)后，將用所述載體轉(zhuǎn)染的細胞1:5傳代。每個載體RNA的示意圖顯示于每組圖像的上方。Cap:載體左末端的環(huán)，nsp:非結(jié)構(gòu)蛋白；水平箭頭SFV亞基因組啟動子；An:PolyA。圖2.在用不同的RNAs電穿孔后選擇的嘌呤霉素抗性BHK細胞。在有所示的SFVRNA載體或無RNA(無RNA)的情況下，將BHK細胞電穿孔，將其接種于直徑35mm的平板上，在加入5嗎/ml的嘌呤霉素前，使之恢復24小時。轉(zhuǎn)染后，在所示的時間內(nèi)，用曱基紫染色平板。圖3.nsp2在用SFVRNA轉(zhuǎn)染的細胞中的細胞內(nèi)定位。將BHK細胞用SFVRNA載體或無RNA的載體(無RNA)電穿孔，并在轉(zhuǎn)染后24小，通過免疫熒光分析。用對細胞核(ansp2-n)或細胞質(zhì)(ansp2-c)形式的nsp2具特異性的鼠單克隆抗體作為一抗，用對FITC偶聯(lián)的鼠IgGs具有特異性的多克隆兔血清作為二抗。用UV濾波器(Dapi)觀察相同細胞的Dapi染色的細^1包核。圖4.轉(zhuǎn)染的BHK細胞中SFVRNA分析。從復制子SFV-S2-9-pac電穿孔和用噪呤霉素選擇后(泳道l)獲得的穩(wěn)定BHK細胞系或從用SFV-S2-9-pac(泳道2-4)、SFV-pac(泳道5)、SFV-LacZ(泳道6)電穿孔或用復制子SFV-S2-9-pac和SFV-pac(泳道"共電穿孔獲得的BHK細胞中提取總RNA,并在電穿孔后24小時(泳道2、5-7)、48小時(泳道3)或72小時(泳道4)后分析。用對SFV亞基因組啟動子具特異性的"P-標記的寡核苷酸，通過Northern印跡，分析基因組(g)SFVRNAs和亞基因組(sg)SFVRANs的存在。在凝膠下方的數(shù)字表示每種情況下亞基因組RNA/基因組RNA(sg/g)的比。在泳道7中，它們分別表示SFV-S2-9-pac(pac)或SFV-LacZ(LacZ)sg/g的比。將凝膠的左側(cè)暴露72小時，而右側(cè)部分暴露1小時。圖5.非結(jié)構(gòu)蛋白的體外和體內(nèi)表達。A)在["S]-甲硫氨酸和["S]-半胱氨酸存在時，在兔網(wǎng)織紅細胞裂解物中翻譯原始SFV-pacRNA(野生型)或含有所示突變的SFV-pacRNA,并在8%的凝膠中通過SDS-PAGE分析，稍后進行放射自顯影。將含有相同樣品的兩種凝膠運行不同的時間，以便獲得具有高分子量條帶(上面的凝膠，最長遷移)的較好分離，并檢測具有較小分子量的單體nspl和3(較下方的凝膠，最短的遷移)。B)轉(zhuǎn)染的細胞中復制酶表達分析。利用對nsp2(上面的凝膠)或nsp3(中間的凝膠)具特異性的多克隆兔抗血清，通過免疫印跡，分析對照BHK細胞的裂解物、用復制子SFV-S2-9-pac電穿孔以及用嘌呤霉素選擇后(S2-9)獲得的裂解物或用突變體SFV-RHR-pac(RHR)的裂解物。用卩肌動蛋白特異性抗體作為內(nèi)部對照分析相同樣品。圖6.(3-gal表達分析。用所示RNAs電穿孔BHK細胞，并在電穿孔后所示的時間，測定每個細胞的(3-gal表達水平。x軸表示以小時表示的轉(zhuǎn)染后時間，y軸表示pg卩-gal/細胞。圖7.在用載體SFV-S2-9-LacZ-pac轉(zhuǎn)染的細胞中，P-gal的表達穩(wěn)定性。用SFV-S2-9-LacZ-pacRNA對BHK細胞進行電穿孔，在存在5嗎/ml嘌呤霉素時對其進行選擇。在存在或不存在嘌呤霉素的情況下，每隔2-3天，對所選擇的細胞傳代，通過X-gal染色，測定每次傳代中表達(3-gal的細胞的百分比。數(shù)據(jù)對應(yīng)于三次不同實驗的平均值，顯示了標準偏差。該圖顯示含有載體SFV-S2-9-LacZ-pac的BHK細胞的典型視界，所述細胞在噤呤霉素存在下傳代10次，并用X-gal染色。x軸表示傳代數(shù)，y軸表示染上藍色的細胞的百分比。圖8.RNA形式的、用于產(chǎn)生穩(wěn)定細胞系和產(chǎn)生穩(wěn)定蛋白的病毒載體的2個實施方案示意圖。SFV復制子的側(cè)翼為SFV復制所需的5，和3，序列，其中，3，序列合并了聚腺嘌呤(PolyA)末端序列。具有亞基nspl-nsp4的復制酶以及與nsp4重疊的SFV亞基因組啟動子(SG1)包括于復制子內(nèi)。為載體復制酶特點的突變R649H和P718T顯示于nsp2中。復制子也合并了選擇基因(PAC)和編碼重組蛋白的目的基因(GOI),所述蛋白是組成型地產(chǎn)生的。在實施例A和C中，復制子也合并了第二亞基因組啟動子(SG2),以致PAC和GOI的表達受不同SG啟動子、SG1或SG2的控制，而無根據(jù)所選擇的A或C構(gòu)建體的區(qū)別。在實施例B中，PAC和GOI的表達受相同SG1啟動子的控制，從而產(chǎn)生在插入PAC和GOI之間的特異性位點受蛋白酶切割的雜交蛋白。Cap:cap結(jié)構(gòu)。圖9.SFV-LacZ致細胞病變作用的評估。由質(zhì)粒pSFV-LacZ(野生型載體)體外轉(zhuǎn)錄RNA,并在BHK細胞中進行電穿孔。將細胞以低匯合度分布于35mm平板中，固定，并用X-gal在所示時間(d，天)染色。圖10.SFV-SF2A-LacZ致細胞病變作用評估。由質(zhì)粒pSFV-SF2A-LacZ體外轉(zhuǎn)錄RNA,并在BHK細胞中進行電穿孔。將細胞以低匯合度分布于35mm平板中，固定，并用x-gal在所示時間(d,天)染色。轉(zhuǎn)染后4天，將細胞1:5傳代。圖11.SFV-SF2C-LacZ致細胞病變作用評估。由pSFV-SF2C-LacZ體外轉(zhuǎn)錄RNA,并在BHK細胞中進行電穿孑L。將細胞以低匯合度分布于35mm平板中，固定，并用x-gal在所示時間(d,天)染色。轉(zhuǎn)染后4天，將細胞1:5傳代。圖12.SFV-PD-LacZ致細胞病變作用評估。由質(zhì)粒pSFV-PD-LacZ體外轉(zhuǎn)錄RNA，并在BHK細胞中進行電穿孑L。將細胞以低匯合度分布于35mm平板中，固定，并用x-gal在所示時間(d,天)染色。圖13.SFV-S2-LacZ致細胞病變作用評估。由質(zhì)粒SFV-S2-LacZ體外轉(zhuǎn)錄RNA，并在BHK細胞中進行電穿孔。將細胞以低匯合度分布于35mm平板中，固定，并用x-gal在所示時間(d，天)染色。轉(zhuǎn)染后4天，將細胞1:5傳代。這種突變體S2能使表達p-gal的細胞的集落形成。圖14.攜帶突變P718T和R649H的載體SFV-S2-9-LacZ的致細胞病變作用評估。由質(zhì)粒pSFV-S2-9-LacZ、pSFV-S2-LacZ或pSFV-LacZ體外轉(zhuǎn)錄RNA,并在BHK細胞中進行電穿孔。將細胞以低匯合度分布于35mm平板中，固定，并用x-gal在所示時間(d,天)染色。圖15.大鼠心臟營養(yǎng)素-l(rCT)表達分析。A)攜帶pac基因和rCT基因的2種非致細胞病變SFV載體的圖示。sgPr,亞基因組啟動子；2A,編碼口蹄疫病毒(FMDV)自身蛋白酶2A的核苷酸序列。B)rCT表達分析。用SFV-S2-9-rCT-pac(rCT畫pac)、SFV-S2-9-pac2A-rCT(pac-2A-rCT)或SFV-S2-9-pac(S2-9-pac)作為陰性對照的RNA，電穿孔BHK細胞，并在5嗎/ml的。票呤霉素存在下選擇。將經(jīng)選擇的細胞裂解，利用對心臟營養(yǎng)素(rCT)具特異性的抗體，通過免疫印跡，分析rCT表達(上面的凝膠)。作為數(shù)量對照，用抗肌動蛋白的抗體分析相同的樣品(較下方的凝膠)。WtCT,轉(zhuǎn)染后24小時獲得的用SFV-rCT轉(zhuǎn)染的BHK細胞的裂解物，并用作陽性對照。M,分子量標志物(kDa)。圖16.在來自載體SFV-S2-9-rCT-pac的BHK細胞中rCT表達穩(wěn)定性分析。將BHK細胞用SFV-S2-9-rCT-pacRNA電穿孔，并在5(ig/ml嘌呤霉素存在的情況下進行選擇。每2-3天將所選擇的細胞l:5傳代，最多連續(xù)ll代(pl-pll),通過用對心臟營養(yǎng)素具特異性的抗體(上面的凝膠)和對作為加樣對照的肌動蛋白具特異性的抗體(較下方的凝膠)進行免疫印跡，分析在每次傳代中細胞裂解物中rCT的表達。用數(shù)個量的純化的重組rCT(recCT)作為數(shù)量對照。顯示了代表產(chǎn)生相似表達和穩(wěn)定性結(jié)果的兩個進行的實驗的一個實驗。S2-9-pac，用載體SFV-S2-9-pac電穿孔的細胞的陰性對照。M表示分子量標志物(kDa)。圖17.來自載體SFV-S2-9-pac2A-rCT的BHK細胞中rCT表達穩(wěn)定性分析。將BHK細胞用SFV-S2-9-pac2A-rCTRNA電穿孔，并在5嗎/ml嘌呤霉素存在的情況下進行選擇。每2-3天將所選擇的細胞l:5傳代，最多連續(xù)10代(pl-p10)，通過用對心臟營養(yǎng)素具特異性的抗體(上面的凝膠)和對作為加樣對照的肌動蛋白具特異性的抗體(較下方的凝膠)進行免疫印跡，分析在每次傳代中細胞裂解物中rCT的表達。用數(shù)個量的純化的rCT(recCT)作為數(shù)量對照。顯示了代表產(chǎn)生相似表達和穩(wěn)定性結(jié)果的四個進行的實驗的一個實-瞼。S2-9-pac,用載體SFV-S2-9-pac電穿孔的細胞的陰性對照。M表示分子量標志物(kDa)。圖18.攜帶pac基因和IGF-I基因的非致細胞病變SFV載體的圖示。攜帶獨立病毒亞基因組啟動子(sgPr)控制下的pac基因和IGF-I基因的載體SFV-S2-9-IGF-pac，其中，利用編碼FMDV自身蛋白酶2A(2A)的核苷酸序列作為連接子，已經(jīng)將IGF-I基因與SFV衣殼翻譯增強子(bl)融合。載體SFV-S2-9-pac2A-IGF攜帶利用序列2A作為連接子與IGF-I基因融合的pac基因。圖19.IGF-I表達分析。用SFV-S2-9-IGF-pac、SFV-S2-9-pac2A-IGF或SFV-S2-9-pac(陰性對照)的RNA對BHK細胞進行電穿孑L，并在5嗎/ml嘌呤霉素存在的情況下進行選擇。將所選擇的細胞傳代一次(第l代)，在將它們接種后24、48或72小時，收集上清液。通過對人IGF-I具特異性的ELISA,分析每個上清液中IGF-I的表達。SFV-IGF-I,用野生型載體SFV-IGF-IRNA轉(zhuǎn)染的BHK細胞的上清液，其是在轉(zhuǎn)染后24小時獲得的，并用作陽性對照。圖20.來自不同載體的BHK細胞中IGF-I表達穩(wěn)定性分析。將BHK細胞用SFV-S2-9-IGF-pac或SFV-S2-9-pac2A-IGFRNA進行電穿孔，并在5嗎/ml。票呤霉素存在的情況下進行選擇。每2-3天將所選#^的細胞進行傳代，最多IO次連續(xù)傳代，將其接種后24小時，收集每次傳代的上清液。通過對人IGF-I具特異性的ELISA，分析每次傳代的上清液中IGF-I的表達。SFV-IGF-I，用載體SFV-IGF-I的RNA轉(zhuǎn)染的BHK細胞的上清液，其是在轉(zhuǎn)染24小時后獲得的，并用作陽性對照。發(fā)明詳述本發(fā)明的解說a病毒載體具有幾個優(yōu)勢，如高轉(zhuǎn)基因表達水平、廣泛的嗜性和便于操作。這些載體在大多數(shù)脊推動物細胞中引起的致細胞病變性，在某些應(yīng)用中可以是有利的，如接種和癌癥的基因治療，其中，轉(zhuǎn)導細胞的凋亡可導致能被免疫細胞攝取的抗原的釋放，這有利于分別針對表達的重組抗原或針對腫瘤抗原的免疫應(yīng)答(19)。然而，這些載體在需要長久的轉(zhuǎn)基因表達的應(yīng)用中的使用，受到其致細胞病變特性的阻礙。不同的實驗室已經(jīng)研究了使a病毒載體適應(yīng)長期表達的可能性，這導致SIN、SFV、VEE和EEE非致細胞病變變體的分離(7,20-23)。在大多數(shù)情況下，利用攜帶異源基因的載體，已經(jīng)分離了非致細胞病變突變，所述異源基因編碼賦予抗生素如噤呤霉素或G418抗性的蛋白。當將用這種類型的載體轉(zhuǎn)染的細胞在存在抗生素的情況下孵育時，僅選擇含有表達抗性基因的非致細胞病變突變體復制子的那些細胞。盡管已經(jīng)描述的大多數(shù)a病毒突變體在nsp2中攜帶突變，但這些突變在不同病毒中改變不同的蛋白殘基，雖然在不同的a病毒間存在高程度的序列同源性。以這種同源性序列作為基礎(chǔ)，在SFV環(huán)境中，研究了良好表征的SIN突變的作用，所述突變影響SIN中nsp2的殘基726。突變P726L和P726T已分別由Frolov等(7)和Perri等(22)描述為非致細胞病變。在第一項研究中，殘基726也可以突變?yōu)樗衅渌赡艿陌被?，其產(chǎn)生了具有不同致細胞病變性程度的SIN突變體的集合。Frolov等能在RNA復制水平和致細胞病變性之間建立相關(guān)性，由此可得出如下結(jié)論nsp2殘基726的變化將RNA水平減少為少于野生型載體中所觀察的水平的5°/。，該變化產(chǎn)生非致細胞病變表型(7)。選擇兩種不同的變化P726T和P726F，該變化已經(jīng)能將SIN中RNA的水平分別減少為野生型水平的5.1%和1.6%,并將對應(yīng)的突變引入SFVnsp2的718位，產(chǎn)生被本發(fā)明人分別鑒定為S2和S3的突變體。這些變化均不能在SFV中獨自產(chǎn)生非致細胞病變表型。用已并入LacZ報告基因的那些SFV突變體(S2和S3)轉(zhuǎn)染BHK細胞而進行的研究證明，僅小百分比的轉(zhuǎn)染的細胞能維持載體的復制。突變體S2(P718T)看起來比S3(P718F)更穩(wěn)定，并且在缺少選擇時產(chǎn)生大集落的表達(3-gal的細胞。因此可知這些集落含有具有其他適應(yīng)性突變的復制子。為了選擇這些集落并鑒定存在于復制子中的可能的次級突變(secondarymutation),將N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因(pac)克隆于SFV突變體S2中，并分離在嘌呤霉素存在的情況下培養(yǎng)的細胞集落。在所分析的一個集落中，在nsp2的位置649發(fā)現(xiàn)了另一突變(R649H),該突變聯(lián)合突變P718T,能基于該雙SFV突變體(P718T/R649H)為SFV載體提供非致細胞病變表型。本發(fā)明人將該雙SFV突變體(P718T/R649H)稱為突變體S2-9，其在本說明書中以突變體SFV-S2-9或簡單地以S2-9無區(qū)分地出現(xiàn)。突變R649H影響SFV核定位信號648RRR,648RRR負責nsp2向細胞核的部分轉(zhuǎn)運已有記載(27)。位置649的Arg變?yōu)镠ys構(gòu)成了非常保守的變化，這可解釋既沒在雙突變體S2-9(P718T/R649H)也未在簡單突變體(R469H)中觀察到對nsp2向細胞核的轉(zhuǎn)運的明顯作用。當與野生型SFV載體相比時，后者、突變體(R469H)未顯示致細胞病變性的任何降低，這表示，位置649和718突變這兩者對消除致細胞病變作用是必須的。Fazakerley等描述了位置649中的更激烈變化(R649D),該變化導致完整病毒基因組下SFV神經(jīng)毒力的衰減(6)。在此情況下，盡管突變R649D不抑制病毒對BHK細胞的致細胞病變作用，但卻完全打斷了nsp2向細胞核的運輸。所有這些數(shù)據(jù)表明，nsp2的序列648肌可能與SFV的致細胞病變性有關(guān)。突變體S2-9含有雙突變P718T/R649H,它能以比野生型SFV載體所觀察到的水平低約60倍的水平復制，這可解釋所述突變體S2-9致細胞病變性的缺失。突變體S2-9中亞基因組RNA的水平僅比野生型SFV載體的低30倍，這表明，在非致細胞病變突變體S2-9中，亞基因組RNA/基因組RNA的比增加了約2倍。轉(zhuǎn)染后短時間內(nèi)，這個比甚至更大，這表明，非致細胞病變載體中基因組RNA的合成與亞基因組RNA的合成相比，受到延遲。所觀察的突變體S2-9RNA量的減少和亞基因組RNA/基因組RNA比值的增加兩者，均與對SIN載體描述的那些相似，所述SIN載體在nsp2位置726中含有非致細胞病變突變(7，22)。然而，這些結(jié)果與Perri等所述的非致細胞病變SFV突變體的結(jié)果矛盾，其中突變體RNA的量大于野生型病毒RNA的量，并且其中亞基因組RNA/基因組RNA的比也降低了(22),這表明建立該組分離的SFV突變體的長久復制可能與不同的機制有關(guān)。突變體S2-9中較低的RNA復制水平不是由于RNA序列中存在的突變的順式作用，因為野生型SFV載體反式提供的野生型復制酶允許將突變體S2-9的基因組RNA和亞基因組RNA水平恢復至接近野生型SFV載體的值。用a病毒突變體進行的幾項研究已證明，nsp2中的非致細胞病變突變能改變這種蛋白的蛋白水解活性，這導致復制酶的超加工(7)或?qū)е逻@種多蛋白的較慢加工(22)。在本發(fā)明中，無論通過體外翻譯方式還是通過免疫印跡分析方式，均未觀察到突變體S2-9和野生型SFV載體之間在復制酶加工上有明顯差異。盡管突變體S2-9復制水平低，但轉(zhuǎn)染24小時后，載體SFV-S2-9-LacZ(基于SFV突變體S2-9的病毒載體)產(chǎn)生的(3-半乳糖苷酶((3-gal)的量與用表達相同轉(zhuǎn)基因的野生型SFV載體獲得的量非常相似。在轉(zhuǎn)染后的稍后時間，載體S2-9的表達水平增加了約2倍，這與觀察到的RNA水平的增加有關(guān)。其他描述的非致細胞病變載體中，重組蛋白表達水平顯示了很大的變化性，范圍為從SIN突變體P726L情況下，野生型表達的僅4%(1)到在Lundstr6m等(21)研發(fā)的雙突變體SFV-PD情況下的1.000%。然而，當同樣的作者表示，在用攜帶LacZ或GFP作為標志物基因的SFV-PD栽體感染的BHK細胞中，p-gal或GFP的表達在48小時后達到最大，稍后在隨后的3-4天內(nèi)顯著降低(20)時，這種載體的非致細胞病變特性值得懷疑。對此，加上本說明書的實施例8是值得的，實施例8克服現(xiàn)有技術(shù)的偏見，因為其證明，Lundstr6m等(21)研發(fā)的SFV-PD載體是致細胞病變的。這個小組描述的含有熱敏感突變的一些其他突變體也能表達高水平的重組蛋白，但僅在允許的溫度下(20，21)。突變體S2-9可能比具有低的多的RNA水平的野生型SFV載體表達更大量的重組蛋白的原因，可能與后一載體誘導的強蛋白合成抑制有關(guān)。兩篇最近的出版物表明，elF2a磷酸化是a病毒在感染中的稍后時間在宿主細胞內(nèi)誘導翻譯抑制的機制(15,31)。同時，這些作者證明，存在于衣殼基因5'末端的翻譯增強子元件能在磷酸化的elF2a存在的情況下，有效翻i,病毒結(jié)構(gòu)多蛋白。已經(jīng)證明，當衣殼翻譯增強子協(xié)調(diào)地融合于SFV或SIN載體中重組蛋白的氨基末端時，其使重組蛋白表達水平增加了8倍(IO,28)。在SFV突變體S2-9衍生的病毒載體背景下，未觀察到這種作用，這可能是因為經(jīng)由elF2a磷酸化的翻譯在轉(zhuǎn)染了該載體的細胞中未被抑制。在用衍生于SFV突變體S2-9的病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞中，蛋白合成抑制的缺失可能是用比以野生型SFV載體所達到水平4氐的RNA水平產(chǎn)生高表達水平的原因。衍生于SFV突變體S2-9的病毒載體的包裝效率比攜帶相同轉(zhuǎn)基因的野生型SFV載體低約6個對數(shù)單位。這可能歸因于低RNA復制水平或者歸因于雙SFV突變體(S2-9)包裝的缺乏。借助與野生型SFV載體共轉(zhuǎn)染細胞的包裝實驗僅能使S2-9病毒顆粒效價增加15倍，在所述包裝實驗中，衍生于雙SFV突變體S2-9的所述病毒載體的RNA以幾乎正常的水平復制，這表明低RNA水平僅是這種載體低包裝效率的部分原因。僅含有突變R649H的SFV載體以與野生型SFV載體相似的水平進行包裝，而僅含有突變P718T的SFV載體(SFV-S2)不充分地進行包裝。盡管載體SFV-S2在大多數(shù)轉(zhuǎn)染的細胞中不能復制這一事實可能是形成這種低包裝效率的因素，但是一切均顯示這種突變單獨或者與突變R649H聯(lián)合，影響病毒顆粒中SFVRNA的衣殼化。在含有核苷酸2767-2824的基因組區(qū)域中，已經(jīng)繪制了SFV包裝信號的基因圖譜(32),并且其不與存在于突變體S2-9中、位于位置3643(R649H)和3849-51(P718T)的任何突變重疊。然而，不能拋棄的是，這些突變可影響基因組RNA的二級結(jié)構(gòu)，從而改變包裝信號的可接近性。為確定序列在SFV包裝中的確切功能，需要更多的突變形成研究。已經(jīng)證明，衍生于突變體S2-9的病毒載體能有效地用于產(chǎn)生組成型地表達重組蛋白的BHK細胞的穩(wěn)定細胞系，而無需分離克隆。為此，除了突變P718T和R649H夕卜，載體必須含有期望的轉(zhuǎn)基因和用于選擇已經(jīng)被有效轉(zhuǎn)導的細胞的選擇基因(如編碼賦予抗生素抗性的蛋白的基因等)。利用LacZ作為報道轉(zhuǎn)基因并利用pac基因作為選擇基因，產(chǎn)生表現(xiàn)出非常高的穩(wěn)定性和與野生型SFV載體相似的表達水平的細胞系，所述穩(wěn)定性為在培養(yǎng)10代后，約85%的細胞表達卩-gal。這與用非致細胞病變的SIN載體產(chǎn)生的類似細胞系中的觀察結(jié)果形成對比，所述非致細胞病變SIN載體攜帶在nsp2中的突變P726L和作為報道基因的LacZ基因，并以比野生SIN載體低約25倍的水平表達P-ga1(1)。在后一個情況中，盡管如果細胞系衍生于表達P-gal的細胞的克隆群，用這種系統(tǒng)可實現(xiàn)更高的穩(wěn)定性，但5次傳代后，45。/。的細胞喪失LacZ表達。衍生于突變體S2-9的病毒載體能產(chǎn)生組成型地表達大鼠心臟營養(yǎng)素-l(rCT)的穩(wěn)定細胞系。在此情況下，含有2個亞基因組啟動子的載體(SFV-S2-9-rCT-pac)中rCT和pac的表達引起細胞系的產(chǎn)生，在所述細胞系中，表達在最初5代中保持穩(wěn)定，從第5代起逐漸喪失(圖16)。然而，載體SFV-S2-9-pac2A-rCT導致非常穩(wěn)定的細胞系的產(chǎn)生，在所述載體SFV-S2-9-pac2A-rCT中，利用編碼FMDV自身蛋白酶2A的核普酸序列作為連接子，將pac基因和編碼rCT的基因協(xié)調(diào)地融合，所述非常穩(wěn)定的細胞系維持與用野生型SFV載體獲得的表達相似的高rCT表達，并且所述表達在培養(yǎng)中持續(xù)至少IO代(圖17)。同樣，衍生于突變體S2-9的病毒載體也能產(chǎn)生表達胰島素樣生長因子I(IGF-I)的穩(wěn)定細胞系。在此情況下，含有2個亞基因組啟動子的載體(SFV-S^9-IGF-pac)中IGF-I和pac的表達引起細胞系的產(chǎn)生，在該細胞系中，表達在最初的4-5代中保持穩(wěn)定，從第5代起逐漸喪失，并到第10代時降低80倍(圖20)。然而，載體SFV畫S2-9-pac2A-IGF引起較高穩(wěn)定性的細胞系產(chǎn)生，在所述載體中，利用編碼FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列作為連接子，將pac基因和編碼IGF-I的基因協(xié)調(diào)地融合，而所述細胞系維持了與用野生型SFV載體所獲得的表達相似的高IGF-I表達，以及在培養(yǎng)10代后降低僅約4倍(圖20)。后一個載體(SFV-S2-9-pac2A-IGF)還在早期傳代中表現(xiàn)出IGF-I表達水平，所述表達水平為用載體SFV-S2-9-IGF-pac所觀察到的表達水平的約2倍多。載體SFV-S2-9-pac可因此用于快速地產(chǎn)生可大量產(chǎn)生目的異源產(chǎn)物如重組蛋白的穩(wěn)定的哺乳動物細胞系。本發(fā)明的病毒載體本發(fā)明一方面涉及基于Semliki森林病毒(SFV)的病毒載體，在下文中稱為本發(fā)明的病毒載體，其含有Semliki森林病毒(SFV)的復制子，其中所述復制子含有(i)編碼在亞基nsp2中具有突變P718T和R649H的SFV復制酶的核苷S臾序列，(ii)含有選擇基因的多核苷酸，(iii)含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的病毒載體含有SFV復制子，所述復制子含有編碼SFV復制酶的核苷酸序列，所述SFV復制酶在亞基nsp2中含有突變P718T和R649H。這些突變中的每一個突變都影響核苷酸的三聯(lián)子，兩者都位于編碼病毒復制酶亞基或非結(jié)構(gòu)性蛋白nsp2的序列中。突變P718T表示，位于野生型SFV編碼的蛋白nsp2的氨基酸序列位置718處的脯氨酸(P),被突變的載體(本發(fā)明的病毒載體)編碼的蛋白nsp2的蘇氨酸(T)替換。同樣，突變R649H表示，位于野生型SFV編碼的亞基nsp2的氨基酸序列的位置649處的精氨酸(R),被突變的載體(本發(fā)明的病毒載體)編碼的亞基nsp2的組氨酸(H)替換。兩個位置718和649都涉及亞基nsp2的已經(jīng)經(jīng)切割和加工的序列中替換的氨基酸的位置。在本發(fā)明具體的實施方案中，存在于本發(fā)明病毒載體中的SFV復制子含有SEQIDNO:l和SEQIDNO:2:SEQIDNO:1包括SFV復制所需的5'末端、編碼在nsp2中具有突變P718T和R649H的SFV復制酶并與該復制酶重疊的序列、病毒SFV亞基因組啟動子；以及SEQIDNO:2包拾SFV復制所需的3'末端，所述3，末端含有聚腺嘌呤(PolyA)的末端序列。這兩條序列一起形成載體的骨架，并且含有選擇基因的多核苷酸和含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸置于所述兩條序列之間。含有選4奪基因的多核苷酸的表達以及含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸的表達可以受控于兩個獨立的SFV亞基因組啟動子或單個亞基因組啟動子，其控制融合蛋白形式的含有選擇基因的多核苷酸的表達以及含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苦酸序列的多核苷酸的表達。因此，在特定實施方案中，本發(fā)明的病毒載體含有a)含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核香酸，所述多核苷酸的表達受第一SFV亞基因組啟動子(SG1)的控制；以及b)含有選擇基因的多核苷酸，所述多核苷酸的表達受第二SFV亞基因組啟動子(SG2)的控制。所述第一和第二SFV亞基因組啟動子可以相同或不同。在具體的實施方案中，選擇基因的表達和目的異源產(chǎn)物的表達受兩個相同或不同的獨立SFV亞基因組啟動子的控制。如圖8所示，含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核香酸和含有選擇基因的多核苷酸位于SFV復制子內(nèi)，并介于復制酶中重疊的亞基因組啟動子與SFV復制所需的3'末端之間。在特定實施方案中，含有編碼目的異源產(chǎn)物(GOI,目的基因)的核苷酸序列的多核苷S吏位于在復制酶中重疊的亞基因組啟動子(SG1)的下游，并且其表達受控于所述啟動子SG1。另一個亞基因組啟動子SG2控制含有選擇基因的多核香酸的表達，所述含有選擇基因的多核苷酸位于SG2的下游，隨后并入，其表達受控于所述啟動子SG2(圖8A)。如上文所提到的，亞基因組啟動子SG1和SG2可以相同或不同。在另一個特定實施方案中，本發(fā)明的病毒載體也用相同的2個亞基因組啟動子(SG1和SG2)進行構(gòu)建，但交換了含有編碼目的異源產(chǎn)物(GOI)的核苷酸序列的多核苷酸和含有選擇基因的多核苷酸的位置，以便SG1控制含有選擇基因的多核苷酸的表達，SG2控制含有編碼目的異源產(chǎn)物(GOI)的核苷S踏列的多核苷酸的表達(圖8C)。如上文所提到的，亞基因組啟動子SG1和SG2可以相同或不同。在另一個可選的特定實施方案中，本發(fā)明的病毒載體含有，亞基因組啟動子(如SG1)下游的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含含有選擇基因的多核苷酸和含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸通過多核苷酸連接子協(xié)調(diào)地融合；有利的是，所述連接子是含有編碼翻譯后(自身)蛋白水解切割位點的核苷S交序列的多核苷酸。事實上，編碼翻i奪后(自身)蛋白水解切割位點的任何核苷酸序列，以及相應(yīng)地所述核苷酸序列編碼的(自身)蛋白酶或氨基酸或肽序列都可以用于本發(fā)明中。在特定實施方案中，所述連接子是含有編碼(自身)蛋白酶的核苷S臾序列的多核香酸，所述(自身)蛋白酶在由選擇基因翻譯產(chǎn)生的蛋白和編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列翻譯產(chǎn)生的蛋白間順式作用，即在特定實施方案中，所述連接子是含有核苷酸序列的多核苷酸，當其被翻譯時，提供切割位點，由此表達的融合蛋白或多蛋白在形成所述融合蛋白或多蛋白的蛋白中被翻譯后加工。因此，為了簡潔，本說明書偶爾使用措辭"編碼蛋白酶的核苷酸序列"，作為措辭"編碼翻譯后(自身)蛋白水解切割位點的核香酸序列"的同義詞。通過非限制性的說明，編碼在由選擇基因的翻譯和編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的翻譯產(chǎn)生的蛋白間順式作用的(自身)蛋白酶的核苷酸序列來自病毒，例如細小核糖核酸病毒、a病毒等。在特定實施方案中，所述連接子含有編碼口^^疫病毒(FMDV)多蛋白的區(qū)域2A或FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列。在另一個特定實施方案中，所述連接子含有編碼具有蛋白水解活性的SFV衣殼羧基末端結(jié)構(gòu)域的核苦酸序列。這種可選的特定實施方案的示意圖顯示于圖8B中，在該圖中，顯示了亞基因組啟動子(如SG1)控制所述構(gòu)建體的表達，所述構(gòu)建體包含含有選擇基因的多核苷酸和含有編碼目的異源產(chǎn)物(GOI)的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核普酸通過所述連接子協(xié)調(diào)地融合。兩個基因(選擇基因和GOI)的共翻譯(聯(lián)合翻譯)因此發(fā)生于單個多蛋白中，翻譯后，所述多蛋白通過在(自身)蛋白水解切割位點斷裂的方式迅速得以切割，產(chǎn)生選擇蛋白和目的異源產(chǎn)物。歐洲專利申請EP736099和Ryan和Drew(35)以前曾記載過這些翻譯后(自身)蛋白水解斷裂位點的用途，特別是編碼FMDV多蛋白的區(qū)域2A(FMDV自身蛋白酶2A)的序列的用途，23將其全部內(nèi)容通過引用并入?？蛇x地，在另一個特定實施方案中，所述連接子是含有編碼反式作用的蛋白酶的切割位點的核芬酸序列的多核苷酸；在此情況下，可以天然地或重組地用本發(fā)明病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞表達所述蛋白酶，或可選地可以外源地添加所述蛋白酶，以便釋放含有選擇蛋白和目的異源產(chǎn)物的融合蛋白的目的異源產(chǎn)物。事實上，編碼反式作用的蛋白酶的切割位點的任何核苷酸序列，以及相應(yīng)地所述序列編碼的氨基酸序列，都可以用于本發(fā)明。通過非限制性的說明，所述編碼反式作用的蛋白酶的切割位點的核苷酸序列，可以是編碼可被肽鏈內(nèi)切酶切割的氨基酸序列的核苷酸序列等。通過非限制性的說明，編碼反式作用的蛋白酶的切割位點的所述核苷酸序列，是編碼病毒蛋白酶切割位點的核普酸序列，所述病毒如馬鈴薯Y病毒屬CPo，/ms)的病毒，如煙草蝕紋病毒(EtchTobaccoVirus:ETV)等，且所述蛋白酶可以被用本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞表達(或天然地，或因為其已經(jīng)進行了適宜的轉(zhuǎn)化)等。可選地，在另一個特定實施方案中，所述連接子是含有編碼切割位點的核芬酸序列的多核苦酸，所述切割位點可以被化學試劑識別，如在曱硫氨酸殘基中切割的溴化氰等。在包含含有選擇基因的多核苷酸的所述構(gòu)建體中，所述多核苷酸與含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苦g吏序列的多核苷酸協(xié)調(diào)地融合，含有選擇基因的多核香酸的3'末端可以通過所述連接子協(xié)調(diào)地融合于含有編碼目的異源產(chǎn)物(GOI)的核苷酸序列的多核苷酸的5'末端?？蛇x地，含有編碼目的異源產(chǎn)物(GOI)的核苷S吏序列的多核苷酸的3，末端，可以通過所述連接子協(xié)調(diào)地融合于含有選擇基因的多核苷酸的5'末端。當載體細胞(carriercells)表達選擇基因時，存在于本發(fā)明病毒載體中的選擇基因允許從還未被轉(zhuǎn)染的細胞或已經(jīng)喪失它的細胞中選擇攜帶本發(fā)明病毒載體的細胞。事實上，允許選擇攜帶本發(fā)明病毒載體的細胞的任何選擇基因均可用于實施本發(fā)明。通過非限制性說明，所述選擇基因可以是其表達賦予抗生素抗性的基因、允許合成培養(yǎng)基中遺漏的必須營養(yǎng)素的基因、提供轉(zhuǎn)染的細胞選擇優(yōu)勢的基因等。在特定實施方案中，所述選擇基因是其表達賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素例如哺乳動物細胞的毒性抗生素，所述基因如賦予潮霉素抗性(hph)的基因、賦予新霉素抗性(neoR)的基因、編碼噤呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶(pac)的基因等，所述編碼嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶(pac)的基因的表達賦予攜帶本發(fā)明病毒載體的細胞對噤呤霉素抗生素的抗性。pac基因的使用，允許從已經(jīng)被轉(zhuǎn)染或者已經(jīng)喪失本發(fā)明病毒載體的細胞中選擇攜帶本發(fā)明病毒載體的細胞，允許將噤呤霉素添加到培養(yǎng)基。目的異源產(chǎn)物事實上可以是任何目的蛋白或肽，如報道蛋白或肽((3-gal等)；或具有治療或診斷用途的肽、蛋白或抗體(或其功能片段)；或任何重組的目的蛋白或肽。如本文所用，術(shù)語"異源的"還包括"重組的"，即它看起來不是天然的。目的異源產(chǎn)物的說明性的非限制性實例包括，具有治療用途的肽和蛋白，如胰島素樣生長因子I(IGF-I)、心臟營養(yǎng)素-1(CT1)、制瘤素M(OSM)、a干擾素(如IFNa5)、雙調(diào)蛋白(AR)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、內(nèi)皮細胞蛋白C/激活的蛋白C受體(EPCR)、目的或治療或診斷用途的抗體(或其功能片段)等。因此，存在于本發(fā)明病毒載體中的含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸，包含編碼目的異源產(chǎn)物的序列。"突變的SFV復制酶基因-GOI-選擇基因"組件，或可選地，"突變的SFV復制酶基因-選擇基因-GOI"組件的側(cè)翼為復制所需的5，和3，序列，形成可以在細胞內(nèi)自我擴增的RNA復制子。本發(fā)明的病毒載體可以以RNA形式使用，也可以以DNA形式使用。當以RNA形式使用時，本發(fā)明的病毒載體通過在其5，末端加入帽子結(jié)構(gòu)而完成。當以DNA形式使用時，完整的載體可以包含真核細胞中的功能啟動子，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子，任何之前限定的實施方案中的SFV復制子序列，以及轉(zhuǎn)錄終止信號序列，例如衍生于SV40的信號序列。載體因此在轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄為RNA，在所述細胞內(nèi)，其將自我擴增。任選地，如果需要，本發(fā)明的病毒載體可以含有基因轉(zhuǎn)錄或翻譯增強子，即，可以與激活劑如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的核酸，以便增加基因轉(zhuǎn)錄或翻譯水平；正如所知道的，所述增強子可以鄰近或遠離其作用的基因。如本說明書所用，術(shù)語"增強子"包括基因轉(zhuǎn)錄增強子和基因翻譯增強子兩者，包括稱為IRES(核糖體內(nèi)部進入位點)的區(qū)域，該區(qū)域，正如所知道的，是促進翻譯起始的區(qū)域。如果需要，所述增強子，連同(之前限定的)含有編碼翻譯后(自身)蛋白水解切割位點的核苷酸序列的多核苷酸連接子，可以以盒形成。事實上，任何適宜的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯增強子都可以用于本發(fā)明。通過說明，所述增強子可以是SFV最小的翻譯增強子"bl",其含有編碼SFV衣殼的最初34個氨基酸的核苷酸序列。在特定實施方案中，本發(fā)明的病毒載體包含含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苦酸，所述多核苷酸在其5'末端融合于增強子，或可選地，融合于含有所述增強子和多核苷酸連接子的盒，所述多核苷酸連接子含有編碼(之前限定的)翻譯后(自身)蛋白水解切割位點的核苷酸序列。在具體的實施方案中，本發(fā)明的病毒載體含有人IGF-I前體序歹'](IFG-IB)，所述人IGF-I前體序列在其5，末端與盒融合，所述盒含有SFV衣殼的最小翻譯增強子("bl"),其后接編碼FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列(pSFVM2A-IGF-IB，實施例10)。用于制備本發(fā)明病毒載體的RNA或DNA構(gòu)建體，可通過包括于普通實驗室手冊內(nèi)的常規(guī)分子生物學方法獲得，如包括于"Molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆實-瞼室手冊)"(JosephSambrook,DavidW.RusselEds.2001，3aed.ColdSpringHarbor,NewYork)或"Currentprotocolsinmolecularbiology(最新分子生物學實驗方法匯編)"(F.M.Ausubel，R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore，J.A.Smith,J.G.SeidmanandK.StruhlEds,vol.2.GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,NewYork,N.Y.，更新至2006年9月)的常規(guī)分子生物學方法。本發(fā)明的病毒載體，衍生于SFVS2-9(P718T/R649H)中分離的非致細胞病變雙突變體，表現(xiàn)出與野生型SFV載體非常相似的表達水平。穩(wěn)定細胞系。所述本發(fā)明的病毒載體體外產(chǎn)生可組成型地表達目的異源產(chǎn)物的用途，構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。本發(fā)明的穩(wěn)定細胞系穩(wěn)定細胞系。因此，本發(fā)明的另一方面涉及可組成型地表達目的異源產(chǎn)物的穩(wěn)定細胞系，即下文的本發(fā)明的穩(wěn)定細胞系，其中所述細胞系是用含有SFV復制子的本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞系，其中所述復制子含有(i)編碼在亞基nsp2中具有突變P718T和R649H的SFV復制酶的核苷酸序列，(ii)含有選擇基因的多核苷酸，以及(iii)含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核芬酸。如上文所述，根據(jù)本發(fā)明，當?shù)贗O代中表達目的異源產(chǎn)物的細胞的百分比大于85%時，細胞系是"穩(wěn)定的"，所述百分比在連續(xù)或隨后的傳代中可以得以維持或被超過。同樣，當上文提到的穩(wěn)定的細胞系可以在數(shù)量上高水平(與當細胞用野生型載體轉(zhuǎn)導時，轉(zhuǎn)導后24小時獲得的水平相比，大于50%)地進一步表達異源產(chǎn)物時，表達是"組成型的"。在特定實施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定細胞系是用本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細胞系，所述本發(fā)明的病毒載體的SFV復制子含有序列SEQIDNO:l和SEQIDNO:2。在另一個特定實施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定的細胞系是用本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定的細胞系，所述本發(fā)明的病毒載體含有a)含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸，其表達受第一SFV亞基因組啟動子(SG1)的控制；以及b)含有選擇基因的多核苷酸，其表達受第二SFV亞基因組啟動子(SG2)的4空制。所述第一和第二SFV亞基因組啟動子可以相同或不同。在另一個特定實施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定的細胞系是用本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定的細胞系，在所述本發(fā)明的病毒載體中，含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸位于在復制酶中重疊的第一亞基因組啟動子(SG1)的下游，并且其表達受所述啟動子SG1的控制，以及，含有選擇基因的多核香酸位于控制所述含有選擇基因的多核苷酸的表達的第二亞基因組啟動子(SG2)的下游。所述亞基因組啟動子SG1和SG2可以相同或不同。#4居有關(guān)本發(fā)明病毒載體的上文所述，兩個多核苷酸間的相對位置可以變化。在另一個特定實施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定的細胞系是用本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定的細胞系，所述本發(fā)明的病毒載體含有亞基因組啟動子(如SG1)下游的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含含有選擇基因的多核苷酸和含有編碼目的異源產(chǎn)物的核香酸序列的多核苷酸，所述多核香酸通過多核香酸連接子協(xié)調(diào)地融合；所述連接子有利地是含有編碼翻譯后(自身)蛋白水解切割位點的核苷酸序列的多核苷酸。關(guān)于本發(fā)明的病毒載體，上文已經(jīng)提到所述連接子的特征。在特定實施方案中，所述連接子含有編碼在由選擇基因的翻譯和編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的翻譯產(chǎn)生的蛋白間順式作用的(自身)蛋白酶的核苦S交序列，如編碼口蹄疫病毒(FMDV)多蛋白的區(qū)域2A或FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列，或編碼SFV衣殼的羧基末端結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列等。在另一個特定實施方案中，所述連接子是含有編碼反式作用蛋白酶切割位點的核苷酸序列的多核苷酸，如編碼病毒蛋白酶如ETV蛋白酶切割位點的核苷酸序列等，在此情況下，本發(fā)明的細胞系可以表達所述的蛋白酶，或可選地，所述蛋白酶可以以外源的方式加入。在另一個特定實施方案中，如上文所述，所述連接子是含有編碼切割位點的核苷酸序列的多核苷酸，所述切割位點可以被化學試劑識別，如上述于曱硫氨酸殘基切割的溴化氰等。在本發(fā)明穩(wěn)定的細胞系的本特定實施方案中，使用本發(fā)明的病毒載體，其含有亞基因組啟動子下游的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含含有選擇基因的多核苷酸和含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核普酸通過多核普酸連接子協(xié)調(diào)地融合，亞基因組啟動子(如SG1)控制所述構(gòu)建體的表達，所述構(gòu)建體包含含有選擇基因的多核苷酸和含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核香酸通過多核苷酸.連接子協(xié)調(diào)地融合，兩個基因(選擇基因和目的基因)的共翻譯發(fā)生于單個多蛋白中，所述單個多蛋白，在翻譯后，通過(自身)蛋白水解切割位點斷裂的方式迅速地得以切割，從而產(chǎn)生選擇蛋白和目的異源產(chǎn)物。根據(jù)有關(guān)本發(fā)明病毒載體的上文所述，在上述構(gòu)建體中兩個多核香酸間的相對位置可以變化，即在所述構(gòu)建體中，含有選擇基因的多核苷酸的3'末端，可以通過所述連4妄子協(xié)調(diào)地融合于含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苦酸序列的多核苷酸的5'末端，或反之亦然，含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核芬酸的3，末端，可以通過所述連接子協(xié)調(diào)地融合于含有選擇基因的多核苷酸的5，末端。本發(fā)明人進行的數(shù)個分析已經(jīng)表明，本發(fā)明的這種類型的病毒載體，產(chǎn)生維持與用野生型SFV載體獲得的表達相似的目的異源產(chǎn)物高表達的非常穩(wěn)定的細胞系，所述病毒載體含有亞基因組啟動子下游的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含含有選擇基因的多核苷酸和含有編碼目的異源產(chǎn)物的核普酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸通過包含DNA序列的連接子協(xié)調(diào)地融合。對于本發(fā)明病毒載體，上文已經(jīng)提到選擇基因的特征和含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸的特征兩者。在特定實施方案中，存在于用于產(chǎn)生本發(fā)明穩(wěn)定細胞系的本發(fā)明病毒載體中的選擇基因，是其表達賦予抗生素抗性的基因、允許合成培養(yǎng)基中遺漏的必須營養(yǎng)素的基因、賦予轉(zhuǎn)染的細胞選擇優(yōu)勢的基因，例如，賦予潮霉素抗性(hph)的基因，賦予新霉素抗性(neoR)的基因，編碼嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶(pac)的基因等，所述編碼嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因的表達，賦予攜帶本發(fā)明病毒載體的細胞對。票呤霉素抗生素的抗性。同樣，在特定實施方案中，本發(fā)明穩(wěn)定的細胞系表達的目的異源產(chǎn)物，是報道蛋白(P-gal等)；或具有治療或診斷用途的蛋白、肽或抗體(或其片段)；或任何的另外的目的重組蛋白或肽；所述目的異源產(chǎn)物的示例性非限制性實例包括，具有治療用途的肽和蛋白，如IGF-I、CT1、OSM、IFN、AR、GDNF、EPCR、目的或具有治療或診斷用途的抗體等。在特定實施方案中，本發(fā)明的穩(wěn)定的細胞系是組成型地表達大鼠心臟營養(yǎng)素-l(rCT)的穩(wěn)定的細胞系。通過利用本發(fā)明兩種不同的病毒載體，產(chǎn)生兩種類型的細胞系。一種情況是，含有2個亞基因組啟動子的本發(fā)明病毒載體(SFV-S2-9-rCT-pac)中rCT和pac的表達，使這樣的細胞系產(chǎn)生，即在該細胞系中，表達保持穩(wěn)定至少頭5代，從第5代起逐漸喪失(圖16)。然而，另一種情況是，當使用鑒定為SFV-S2-9-pac2A-rCT的本發(fā)明的病毒載體時，其中，利用編碼FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列作為連接子，將pac基因和編碼rCT的基因協(xié)調(diào)地融合，獲得非常穩(wěn)定的細胞系，在培養(yǎng)中，所述細胞系維持高rCT表達達至少10代，所述高rCT表達與用野生型SFV載體獲得的相似(圖17)。在另一個特定實施方案中，本發(fā)明穩(wěn)定的細胞系是表達胰島素樣生長因子I(IGF-I)的穩(wěn)定的細胞系。通過本發(fā)明的兩種不同的病毒載體，產(chǎn)生兩種類型的細胞系。一種情況是，含有2個亞基因組啟動子的本發(fā)明的病毒載體(SFV-S^9-IGF-pac)中IGF-I和pac的表達，使這樣的細胞系產(chǎn)生，即在該細胞系中，表達保持穩(wěn)定至少最初4-5代，從第5代起逐漸喪失，并且到達10代時降低80倍(圖20)。然而，當使用鑒定為SFV-S2-9-pac2A-IGF的本發(fā)明的病毒載體時，其中，利用編碼FMDV自身蛋白酶2A的核苦酸序列作為連接子，將pac基因和編碼IGF-I的基因協(xié)調(diào)地融合，產(chǎn)生具有更高穩(wěn)定性的細胞系，所述細胞系維持與用野生型SFV載體獲得的表達相似的高IGF-I表達，在培養(yǎng)10代后，僅有約4倍的降低(圖20)。后一個載體(SFV-S2-9-pac2A-IGF)還在早期傳代中表現(xiàn)出IGF-I表達水平，所述表達水平高于用載體SFV-S2-9-IGF-pac所觀察到的約2倍。本發(fā)明的穩(wěn)定細胞系，可通過包括于普通實驗室手冊中的常規(guī)分子生物學方法獲得，如通過用本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)染適宜的細胞或細胞系獲4尋，所述普通實'險室手冊，如"Molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆實驗室手冊)"(JosephSambrook，DavidW.RusselEds.2001，3rded.ColdSpringHarbor,NewYork)或"Currentprotocolsinmolecularbiology(最新分子生物學實驗方法匯編)"(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.SeidmanandK.StruhlEds,vol.2.GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，NewYork,N.Y.，更新至2006年9月)。事實上，待轉(zhuǎn)染的細胞可以是允許本發(fā)明的病毒載體復制的任何真核細胞或細胞系。所述細胞或細胞系可以是來自哺乳動物的系。在特定實施方案中，待轉(zhuǎn)染的所述細胞或細胞系是衍生于倉鼠腎成纖維細胞的細胞系,如BHK-21細胞系。通過允許將本發(fā)明的病毒載體導入細胞的常規(guī)的物理或化學方法，進行細胞的轉(zhuǎn)染，如通過電穿孔或通過遺傳材料與陽離子脂質(zhì)的結(jié)合。這些方法將用于將本發(fā)明的病毒載體作為或者RNA或者DNA進行轉(zhuǎn)染。在特定實施方案中，轉(zhuǎn)染通過電穿孑L進行("Currentprotocolsinmolecular30biology(最新分子生物學實-驗方法匯編)"；AusubelFMetal.;同上)。體外產(chǎn)生本發(fā)明穩(wěn)定細胞系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明另一個其他的方法涉及體外產(chǎn)生能組成型地表達目的異源產(chǎn)物的本發(fā)明的穩(wěn)定細胞系的方法，在下文中，產(chǎn)生本發(fā)明穩(wěn)定細胞系的方法包括I.用含有SFV復制子的本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)染細胞，其中所述復制子含有(i)編碼在亞基nSp2中具有突變P718T和R649H的SFV復制酶的核苷酸序列，(ii)含有選擇基因的多核苷酸，以及(iii)含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸；II.選擇步驟I中產(chǎn)生的穩(wěn)定的細胞；以及III.培養(yǎng)并維持穩(wěn)定的細胞。如上文所提到的，待轉(zhuǎn)染的細胞事實上可以是允許本發(fā)明的病毒載體復制的任何真核細胞或細胞系。通過非限制性的說明，所述待轉(zhuǎn)染的細胞或細胞系是來自哺乳動物的系。在特定實施方案中，所述待轉(zhuǎn)染的細胞或細胞系是衍生于倉鼠腎成纖維細胞的細胞系，如BHK-21細胞系。之前已經(jīng)提到本發(fā)明病毒載體的特征。本發(fā)明的病毒載體可以以RNA形式或可選地以DNA形式使用。當以RNA的形式使用時，本發(fā)明的病毒載體通過在其5'末端加入帽結(jié)構(gòu)而完成。當以DNA的形式使用時，完整的載體包括真核細胞中的功能啟動子、之前限定有關(guān)本發(fā)明病毒載體的任何實施方案中的SFV復制子序列和轉(zhuǎn)錄終止信號序列，所述啟動子如巨細胞病毒(CMV)啟動子，所述轉(zhuǎn)錄終止信號序列如衍生自SV40的信號序列。細胞可以通過允許將本發(fā)明的病毒載體導入細胞的任何常規(guī)物理或化學方法轉(zhuǎn)染，例如通過電穿孔或通過遺傳材料與陽離子脂質(zhì)的結(jié)合。這些方法將用于將本發(fā)明的病毒載體作為RNA或作為DNA進行轉(zhuǎn)染。在特定實施方案中，通過電穿孔進行轉(zhuǎn)染("Currentprotocolsinmolecularbiology(最新分子生物學實驗方法匯編)"；AusubelFMetal.;如上文所述)。根據(jù)并入由此細胞得以轉(zhuǎn)染的本發(fā)明病毒載體的選擇基因，以不同的方式選擇穩(wěn)定的細胞。如上文所解釋的，選擇基因的表達賦予轉(zhuǎn)染的細胞允許它們被選擇的優(yōu)勢。使細胞經(jīng)歷對轉(zhuǎn)染細胞的選擇條件便足夠了。當用pac基因作為選擇基因時，其在轉(zhuǎn)染的細胞中的表達使轉(zhuǎn)染的細胞是嘌呤霉素抗性的。在此情況下，向培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素便足以除去非轉(zhuǎn)染的細胞或已經(jīng)喪失本發(fā)明病毒載體的細胞。根據(jù)轉(zhuǎn)染的細胞的類型，將穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)于和維持于常規(guī)的培養(yǎng)基和條件中，并將它們維持于轉(zhuǎn)染的細胞的選擇性刺激物下(例如存在嘌呤霉素)。當細胞是BHK-21時，將它們培養(yǎng)于已描述的條件下("Currentprotocolsinmolecularbiology(最新分子生物學實驗方法匯編)"；AusubelFMetal.;如前述)。體外產(chǎn)生目的異源產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的穩(wěn)定的細胞系可用于體外產(chǎn)生目的異源產(chǎn)物。結(jié)果，所述本發(fā)明的穩(wěn)定的細胞系體外產(chǎn)生目的異源產(chǎn)物的用途，形成了本發(fā)明的其^也方法。因此，本發(fā)明另一方面涉及體外產(chǎn)生目的異源產(chǎn)物的方法，其包括將本發(fā)明的穩(wěn)定的細胞系在允許包含于本發(fā)明的病毒載體中的目的異源產(chǎn)物表達的條件下培養(yǎng)，本發(fā)明的病毒載體用于產(chǎn)生本發(fā)明的穩(wěn)定的細胞系。更具體來說，體外產(chǎn)生目的異源產(chǎn)物的方法包括I.用含有SFV復制子的本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)染細胞，其中所述復制子含有(i)編碼在亞基nsp2中具有突變P718T和R649H的SFV復制酶的核苷S交序列，(ii)含有選擇基因的多核苷酸，以及(iii)含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸；II.選擇步驟I中產(chǎn)生的穩(wěn)定的細胞(本發(fā)明的穩(wěn)定的細胞系)；III.培養(yǎng)并維持所述穩(wěn)定的細胞(本發(fā)明的細胞系)；以及如果需要，IV.提取目的異源產(chǎn)物。步驟I、II和III實際上對應(yīng)于產(chǎn)生組成型地表達目的異源產(chǎn)物的本發(fā)明的穩(wěn)定的細胞系。在此情況下，細胞將用本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)染，所述本發(fā)明的病毒載體包含含有編碼待產(chǎn)生的目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸。如上文所述，將所述含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸插入本發(fā)明病毒載體的一位置，以致其表達受SFV亞基因組啟動子的控制。如上文提到的，目的異源產(chǎn)物可以是任何目的蛋白或肽，如報道蛋白(p-gal等)；或具有治療或診斷用途的蛋白、肽或抗體(或其片段)；或任何的另外的目的重組蛋白或肽。目的異源產(chǎn)物的示例性、非限制性的實例包括具有治療用途的肽和蛋白，如胰島素樣生長因子I(IGF-I)、心臟營養(yǎng)素-1(CT1)、制瘤素M(OSM)、a干擾素(如IFNa5)、雙調(diào)蛋白(AR)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、內(nèi)皮細胞蛋白C/激活的蛋白C受體(EPCR)、目的或治療或診斷用途的抗體(或其功能片l殳)等。如之前產(chǎn)生本發(fā)明穩(wěn)定細胞系的方法中所述的，實施產(chǎn)生本發(fā)明的穩(wěn)定細胞系的步驟。有時候可以使用處于培養(yǎng)基中即未被分離或純化的目的異源產(chǎn)物；然而，有時候提取(分離)并任選地純化目的異源產(chǎn)物可以是有利的。在此情況下，當目的異源產(chǎn)物是細胞內(nèi)的(其不能被分泌至培養(yǎng)基中)時，目的異源產(chǎn)物的提取可以對細胞的裂解物進行，或者當目的異源產(chǎn)物可以分泌至周圍的培養(yǎng)基中時，目的異源產(chǎn)物的提取可以對穩(wěn)定細胞的上清液進行。取決于產(chǎn)物的特性，適合待產(chǎn)生的具體目的異源產(chǎn)物的、用于提取和純化肽和蛋白的任何常規(guī)方法，都可以用于提取。此類方法的示例性、非限制性實例包括，基于通過大小和/或電荷的分離(硫酸銨沉淀、凝膠過濾、超離心、電泳、電聚焦等)、通過免疫純化的分離(親和柱、免疫沉淀等)和通過與特異配體結(jié)合的分離的方法等。下列實施例的目的是說明本發(fā)明，而非意圖限制本發(fā)明。本發(fā)明的實施例材料和方法質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒pSFV-l和pSFV3-LacZ由Liljestr6m博士(KarolinskaInstitute,Stockholm)(18)惠贈，之前已有描述。為了構(gòu)建質(zhì)粒pSFV-S2和pSFV-S3，用Sacl/Xhol從pSFV-l中提取待誘變處理的、含有nsp2區(qū)域的3.5kb片段，并亞克隆至用相同的酶消化的質(zhì)粒pBluescriptSK(Stratagene,LaJolla,USA)中，產(chǎn)生質(zhì)粒Blu-nsp2。通過交換PCR(crossoverPCR),將突變P718T和P718F導入該質(zhì)粒的nsp2。將外部引物SF3669-VS(SEQIDNO:3)和SF4096-RS(SEQIDNO:4)順序地與經(jīng)設(shè)計引入各自突變的寡核苷酸對組合。對于S2，所用的內(nèi)部寡核苷酸對是mutS2-VS(SEQIDNO:5)和mutS2-RS(SEQIDNO:6)，其重疊25個核苷酸，并且其中編碼nsp2中的Pro718的密碼子CCC已經(jīng)突變?yōu)榫幋aThr的ACG(加有下劃線)。對于S3,所用的內(nèi)部寡核苷酸是mutS3-RS(SEQIDNO:7)和mutS3-RS(SEQIDNO:8)，其重疊25個核苷酸，且其中編碼nsp2的Pro718的密碼子CCC已經(jīng)突變?yōu)榫幋aPhe的TTT(加有下劃線)。用Pfu進行交換PCR,產(chǎn)生430bp的DNA片段，將該片段用Eagl/Narl消化，并在用Eagl部分消化和用Narl完全消化后克隆于Blu-nsp2中，分別產(chǎn)生質(zhì)粒Blu-nsp2-S2或Blu-nsp2-S3。通過測序，證實突變S2或S3在這些質(zhì)粒中存在。最后，從Blu-nsp2-S2或Blu-nsp2-S3中提取含有突變的nsp2的Sacl/Xhol3.5kb片段，并亞克隆于用相同的酶消化的pSFV-l中，分別產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-S2和pSFV-S3。為了將LacZ克隆至這些質(zhì)粒中，用pSFV3-LacZ的Xbal/Xmal提取含有該基因的3,86kb的DNA片段，并將其克隆于用相同的酶消化的pSFV-S2或pSFV-S3中，分別產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-S2-LacZ和pSFV國S3-LacZ。為了產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-pac，通過用Notl和Hpal消化，從質(zhì)粒pBSpac(5)(J.Ortin博士惠贈，CNB，Madrid,Spain)中提取含有嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶(pac)基因的0.95kb的DNA片段。在用Klenow使Notl末端變平后，將該片段克隆于用SmaI消化的pSFV-l中，產(chǎn)生pSFV-pac。通過將pSFV-pac中含有大部分nsp2的3.5kb的Sacl/Xhol片段替換為從含有突變S2的Blu-nsp2-S2中獲得的相同片段，產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-S2-pac。通過將pSFV3-LacZ中3.2kb的Rsrll/Xhol片,殳替換成從涵蓋含有nsp2的突變P718T和R649H的復制酶區(qū)域的pSFV-S2-9-pac中獲得的相同片段，產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-S2-9-LacZ。為了產(chǎn)生雙載體pSFV-S2-9-LacZ-pac,用Mscl/Spel從pSFV-pac中提取含有后接pac基因的SFV亞基因組啟動子的1.9kb的盒，將其克隆至用Smal/Spel消化的pSFV-S2-9-LacZ中。為了產(chǎn)生pSFV-RHR-pac,首先，通過PCR,將nsp2的第一突變R649H引入Blu-npsZ中。簡而言之，利用pSFV-l作為模板，用Pfli和寡核苷酸SF1947-VS(SEQIDNO:9)和SF3623-S29-RS(SEQIDNO:IO)獲得1.67kb的PCR片段。在后一個寡核苦酸中，密碼子CGC已被CAC取代，這導致nsp2中的突變R649H(加有下劃線；觀察到引物含有反向序列)。這種寡核苷酸的序列含有鄰近突變R649H的nsp2的Narl位點(以斜體表示)。用BsffilI/Narl消化PCR片段，產(chǎn)生1.36kb的DNA片段，將該片段克隆至用相同的酶消化的Blu-nsp2中，由此產(chǎn)生Blu-nsp2-RHR。最后，從Blu-nsp2-RHR中提取含有突變的nsp2的3.5kb的Sacl/Xhol片段，并亞克隆至用相同的酶消化的pSFV-pac，產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-RHR-pac。RNA轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染通過用Spel消化，將純化的質(zhì)粒DNA制備成線性的，并利用SP6聚合酶(Amersham匪Pharmacia)，在存在巾冒類4以物(NewEnglandBiolabs，USA)的情況下，進行轉(zhuǎn)錄。通過以前所述的電穿孔(17),在BHK-21細胞中轉(zhuǎn)染體外合成的RNA。復制子的包裝如所述(29),通過用重組RNA和用輔助SFV助體-S2和助體-C-S219ARNA共電穿孔BHK-21細胞，進行病毒顆粒(vp)中SFV重組RNA的包裝。通過X-gal染色用病毒的系列稀釋物感染的BHK-21細胞，滴定攜帶LacZ作為指示基因的SFV顆粒。對于攜帶pac基因的SFV顆粒而言，通過對用一抗SFVnsp2特異性多克隆兔抗血清感染的BHK-21細胞的間接免疫熒光，進^f亍滴定(E.Casales,結(jié)果還未/>布)。噪呤霉素抗性細胞系的選擇和傳代制備溶解于MEM的1mg/ml噤呤霉素(Sigma,St.Louis，USA)溶液，過濾、等分試樣并貯藏于-20。C。在用攜帶pac基因的SFV重組RNAs轉(zhuǎn)染BHK細胞后，使細胞恢復24小時，然后加入5昭/ml的嘌呤霉素。為了選擇嘌呤霉素抗性細胞，每2-3天，用含有嘌呤霉素的新培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基。選擇后，細胞的傳代總是在存在所示濃度的嘌呤霉素的情況下進行。如果細胞用SFV-S2-pac轉(zhuǎn)染，克隆單個座位，擴增并冷凍貯藏于液氮中。用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基是補充了5%胎牛血清、10%磷酸胰蛋白培養(yǎng)基(Invitrogene,USA)、2mM谷酰胺、20mMHEPES、100嗎/ml35鏈霉素和100IU/ml青霉素的BHK-21GlasgowMEM(Invitrogene,USA)(完全BHK培養(yǎng)基)。適應(yīng)性突變的作圖用RNeasy試劑盒(Qiagen,Germany),分離用SFV-S2-pacRNA轉(zhuǎn)染后獲得的嘌呤霉素抗性細胞的總細胞RNA。利用與SFV核苷酸4977-5010互補的反義寡核香酸(SEQIDNO:ll)作為引物，用每個克隆的5嗎RNA和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega,Madison,USA)合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄后，通過用TaqPlusLong(Stratagene，LaJolla,USA)，用相同的反義引物和與SFV核苷酸1040-1074互補的正義寡核苷酸(SEQIDNO:12),進行30個循環(huán)的PCR，擴增cDNAs。用Bell(U06)和Bsu36I(4916)消化所得的3971bp的片段，并克隆于相應(yīng)的pSFV-pac位點中。使來自每個單個克隆的質(zhì)粒DNA線性化，并用作模板體外合成RNA,隨后將合成的RNA轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞，以便測定其賦予嘌呤霉素抗性的能力。當包含于位置1106-4916之間的亞區(qū)(subregion)能允許細胞在噤呤霉素存在的情況下存活和分裂，如克隆S2-9的情況一樣，對來自兩個獨立質(zhì)?？寺〉膩唴^(qū)進行完全測序。RNA分析用RNeasy、量試劑盒(Qiagen，Germany)，從轉(zhuǎn)染的細胞或從某些細胞系中提取總RNA，并通過Northern印跡分析。將3嗎總RNA在具有曱醛的1.2%瓊脂糖凝膠上進行大小分級，將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Hybond-N+,Amersham)上，并與32P標記的SFV亞基因組啟動子特異性寡核苷酸(SEQIDNO:13)雜交。利用Phosphorlmager(Cyclone,Packard,USA)和Optiquant軟件(4.0版，Packard),測定基因組SFVRNA和亞基因組SFVRNA的相對量。表達和復制酶加工分析對于體外翻譯實驗，首先如以前所述體外轉(zhuǎn)錄SFVRNAs,根據(jù)制造商的說明書，用RNeasy試劑盒(Qiagen，Germany)純化，在存在["S]-曱硫氨酸和["S]-半胱氨酸(Amersham，USA)混合物的情況下，與用核酸酶(Promega)處理的兔網(wǎng)織紅細胞裂解物混合，并在30°C下孵育90分鐘。每個翻譯反應(yīng)含有2.3純化的轉(zhuǎn)錄RNA。加入Laemmli加樣緩沖液終自顯影來分析。從用SFV載體轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞獲得裂解物，用于免疫印跡分析實驗，所述實驗借助在緩沖液中的孵育，所述緩沖液含有1%Igepal(Sigma，USA)、50mMTrisHC1、pH7.6的150mMNaCl、2mMEDTA和1pg/mlPMSF(Sigma,St.Louis，USA),通過在冷凍微離心機中以6000rmp離心6分鐘使其澄清，并通過Bradford分析進行定量。在8%的聚丙烯酰胺凝膠上通過SDS-PAGE分析裂解物，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并與作為一抗的、分別對SFVnsp3和nsp2(E.Casales，結(jié)果未公布)或肌動蛋白(Sigma,St.Louis,USA)具有特異性的多克隆兔抗血清一起孵育。用HRP偶聯(lián)的兔疫球蛋白特異性綿羊抗血清作為二抗。根據(jù)制造商的說明書，利用蛋白印跡增強型化學發(fā)光試劑(PerkinElmerLifeSciences,USA)觀察蛋白。對于細胞核定位研究，利用對細胞質(zhì)SFVnsp2具有特異性的Acm(由W.Bodemer惠贈)或?qū)毎薙FVnsp2具特異性的Acm(由L.Kaariainen博士惠贈)(16)作為一抗，進行轉(zhuǎn)染細胞的間接免疫熒光(16)。P-gal表達分析如上文所述，裂解轉(zhuǎn)染的細胞，如所述(17),測量裂解物中P-gal的總活性，或在指示的時間用X-gal將它們?nèi)旧?。以每個平板中轉(zhuǎn)染的細胞的平均量除每個平板檢測到的(3-gal的平均量，獲得每個細胞產(chǎn)生的蛋白的量。實施例1攜帶衍生于SIN的非致細胞病變突變的SFV載體的構(gòu)建和^^征產(chǎn)生新的非致細胞病變a病毒載體的可能方法是，利用該屬不同病毒共有的序列同源性，將前述突變導入其他的a病毒中。根據(jù)這種方法，評估了在SIN病毒載體中所述的非致細胞病變突變在衍生于SFV的表達載體中的作用。之前已經(jīng)證明，影響SINRep亞基nsp2的殘基726的突變，相當大地減少了這種病毒的致細胞病變性，這一事實與突變體中較低的RNA復制水平相關(guān)(7,22)。影響這種殘基的兩種突變，即P726T和P726F，之前描述為對SIN分別是部分致細胞病變的和非致細胞病變的，將它們引入載體pSFV-l中的nsp2的同源殘基中，產(chǎn)生分別攜帶nsp2中的突變P718T或P718F的突變體pSFV-S2和pSFV-S3。為了評估這些新載體的致細胞病變性，隨后從病毒亞基因組啟動子中克隆LacZ報道基因，產(chǎn)生載體pSFV-S2-LacZ和pSFV-S3-LacZ。體外合成這些質(zhì)粒中每個質(zhì)粒的RNA,并在BHK-21細胞中進行電穿孔，培養(yǎng)所述細胞，且在該細胞中，通過轉(zhuǎn)染后在不同時間進行X-gal染色，分析(3-gal的表達(圖1)。與用對照SFV-LacZRNA電穿孔的細胞不同(在該細胞中轉(zhuǎn)染后24小時，多于95%的細胞表達(3-gal并表現(xiàn)出致細胞病變表型)，用SFV-S2-LacZRNAs或SFV-S3-LacZRNAs轉(zhuǎn)染的細胞，在轉(zhuǎn)染后24小時，僅有小百分比的細胞表達P-gal,且未顯示致細胞病變形態(tài)。在SFV-S2-LacZ的情況中，陽性細胞的數(shù)量隨著時間而增加，在電穿孔后5天，能形成表達(3-gal細胞的大集落。這種作用在SFV-S3-LacZ中相當?shù)厣?，用所述SFV-S3-LacZ，在X-gal染色的第5天，觀察不到藍色集落。該數(shù)據(jù)表明，突變P718T和P718F可以阻斷病毒復制或轉(zhuǎn)基因表達，但它們引起具有相對高頻率的非致細胞病變變體，這可能是SFV體外轉(zhuǎn)錄或復制過程中次級適應(yīng)性突變的結(jié)果。實施例2衍生于含有新適應(yīng)性突變的SFV-S2的復制子的選擇和作圖為了選擇含有非致細胞病變SFV復制子的細胞群，用編碼賦予嘌呤霉素抗性的。票呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶(pac)顯性選擇標志物的基因替換質(zhì)粒pSFV-S2-LacZ中的LacZ才艮道基因，產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-S2-pac。利用這種質(zhì)粒作為模板，體外合成RNA,并在BHK-21細胞中進行電穿孔。電穿孔后24小時，加入5pg/ml的噪呤霉素，選擇對嘌呤霉素具有抗性的集落，隨后擴增所述集落。為了鑒定所選擇的細胞的復制子中可能的適應(yīng)性突變，從單個克隆中提取總RNA,用特異性引物通過RT-PCR,擴增含有完全nsp2序列的SFV復制酶的3.9kb片段。之所以擴增復制酶的nsp2區(qū)域，是因為在a病毒中描述的大多數(shù)非致細胞病變突變已經(jīng)在該區(qū)域進行了作圖。將從每個克隆拯救的cDNA片段亞克隆至原始的質(zhì)粒pSFV-pac中，替換野生型nsp2序列。為了檢測非致細胞病變突變是否已經(jīng)被拯救，體外合成每個新質(zhì)粒的RNA，并用于對BHK-21細胞進行電穿孔。轉(zhuǎn)染后24小時，加入5ng/ml的噪呤霉素，并用曱基紫在不同的時間染色細胞，以便將它們的生長與在用最初的突變體SFV-S2-pac或用原始的SFV-pac轉(zhuǎn)染的細胞中所觀察到的進行比較。克隆之一，SFV-S2-9-pac，表現(xiàn)出明顯的非致細胞病變表型，因為其賦予大多數(shù)轉(zhuǎn)染的細胞嘌呤霉素抗性(圖2)。其他檢測的克隆表現(xiàn)出與SFV-S2相似的模式，在這項研究中并未進一步分析。用原始的SFV-pac轉(zhuǎn)染的細胞表現(xiàn)出明顯的致細月包病變作用，并且它們中的大多凄t在4天前死亡。pSFV-S2-9-pac的nsp2片段的測序結(jié)果表明，除了原始的突變P718T夕卜，在nsp2的位置649存在另一適應(yīng)性突變，在該位置，Arg已被Hys替換。這種新突變作用SFVnsp2的細胞核定位信號^RRR(27),所述定位信號在SFV-S2-9中變?yōu)?48RHR。實施例3突變R649H對致細胞病變性和對nsp的細胞核定位的作用為了4企查突變R649H單獨對SFV致細胞病變性的作用，將這種突變引入質(zhì)粒pSFV-pac中，因而產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-RHR-pac。轉(zhuǎn)錄這種質(zhì)粒的RNA,并在BHK-21中進行電穿孔，使所述細胞恢復24小時。隨后加入5pg/ml的噤呤霉素，如上文所述，通過用曱基紫染色細胞，在不同的時間分析細胞的生長(圖2，右欄)。SFV-RHR-pac表現(xiàn)出與原始的載體SFV-pac中所觀察到的模式非常相似模式，其誘發(fā)導致大多數(shù)細胞在第4天前死亡的強烈而早期的致細胞病變作用。這些結(jié)果表明，載體SFV-S2-9致細胞病變性的缺失，歸因于突變P718T和R649H的組合。為了4企查突變R649H對nsp2的細胞核定位的作用，用含有這種突變的載體(SFV-S2-9-pac和SFV-RHR-pac)的RNA或用不含有它們的載體(SFV-pac和SFV-S2-pac)轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，并用分別對細胞核形式或細胞質(zhì)形式的SFVnsp2具特異性的單克隆抗體，通過免疫焚光，進行分析(圖3)。在所有的情況下，在轉(zhuǎn)染的細胞的細胞核和細胞質(zhì)中，都;f企測到了nsp2，這表明，突變RHR未影響這種蛋白向細胞核的轉(zhuǎn)運。實施例4用SFV-S2-9-pac轉(zhuǎn)染的細胞中的RNA復制為了測定非致細月包病變SFV雙突變體的RNA復制水平，用SFV-S2-9-pacRNA對BHK-21細胞進行電穿孔，轉(zhuǎn)染后24小時、48小時以及72小時，提取總RNA,并用對SFV亞基因組啟動子的序列具特異性的32P標記的寡核苷酸通過Northern印跡進行分析，其既存在于基因組RNA又存在于亞基因組RNA中(圖4，泳道2-4)。將基因組和亞基因組SFV-S2-9-pacRNAs的量，以及兩者間的比例，與用SFV-pacRNA轉(zhuǎn)染的細胞在電穿孔后24小時所獲得的進行比較(圖4，泳道5)。基因組和亞基因組SFV-S2-9-pacRNAs隨著時間而增加，并且看起來在轉(zhuǎn)染后48小時達到高峰。在用載體SFV-S2-9-pac獲得的嘌呤霉素抗性BHK細胞中觀察到相似RNA水平(圖4，泳道1)。在所有的情況下，產(chǎn)生的SFV-S2-9RNAs比在用原始的SFV-pacRNA轉(zhuǎn)染的細胞中獲得的量低得多(注意泳道5所受暴露比泳道1-4多72倍)。在用SFV-S2-9-pac轉(zhuǎn)染并用嘌呤霉素選擇的細胞中所觀察到的亞基因組RNA/基因組RNA的比，比在用SFV-pac轉(zhuǎn)染的細胞中所觀察到的大約L5倍(圖4,下方數(shù)字)。然而，在用SFV-S2-9-pac轉(zhuǎn)染但未被選擇的細胞中，這種比值較大得相當可觀，特別是轉(zhuǎn)染后24小時，但隨著時間而降低，這表明，與亞基因組RNA相比，雙突變體中基因組RNA的合成可以被延遲。在用SFV-S2-9-pac轉(zhuǎn)染的細胞中，也檢測到在基因組和亞基因組RNA之間具有中間大小的兩條另外的RNA條帶(圖4，泳道l-4)。未表征這些條帶，但它們可能對應(yīng)于可以在雙SFV突變體復制過程中出現(xiàn)的缺損干擾RNA(defective-interferingRNAs)。最后，為了測定SFV-S2-9-pacRNA的低復制水平是否可以用反式供應(yīng)的野生型復制酶恢復，將BHK-21細胞用SFV-S2-9-pac和SFV-LacZRNAs(野生載體)同時電穿孔。24小時后，從共電穿孔的細胞中提取總RNA，并通過Northern印跡分析(圖4，泳道7)。在相同的凝膠中，分析用原始SFV-pac電穿孔的細胞的RNA(圖4,泳道5)和用SFV-LacZ電穿孔的細胞的RNA(圖4,泳道6)，并用作每個基因組和亞基因組RNAs的分子大小標志物。在將凝膠暴露l小時后，在電穿孔的細胞中，很容易地檢測到基因組和亞基因組SFV-LacZ和SFV-S2-9-pacRNAs，這表明野生型復制酶也能至少部分地恢復雙突變體的復制。然而，盡管兩種亞基因組RNA的量非常相似，但產(chǎn)生的基因組SFV-LacZRNA的水平比突變體SV2-S2-9-pac所產(chǎn)生的多約2-3倍。實施例5突變體SFV-S2-9中復制酶的加工在用SFV-S2-9-pac復制子轉(zhuǎn)染的細胞中檢測到較小量RNA，可能是由于復制酶加工過程中的變化。以多蛋白nspl234合成SFV復制酶，其隨后通過存在于nsp2羧基末端結(jié)構(gòu)域中的蛋白酶活性，切割成成熟的單體組分(30),其中已經(jīng)對突變P718T和R649H進行了作圖。為了^r查這些突變對復制酶加工的作用，在存在["S]-甲硫氨酸和["S]-半胱氨酸的情況下，通過與兔網(wǎng)織紅細胞裂解物一起孵育，翻譯體外合成的SFV-S2-9-pacRNAs、SFV-RHR畫pacRNAs和SFV-S2-pacRNAs。通過SDS-PAGE以及隨后進行的放射自顯影，將這些突變體中復制酶的加工模式與用原始SFV-pacRNA獲得的復制酶加工模式進行比較(圖5A)。在三種分析的突變體和野生型復制酶之間未在復制酶的加工上觀察到差異，這使nsp單體在所有的情況中相似地聚積。為了測定復制酶加工是否在體內(nèi)受到影響，用分別對nsp2(圖5B,上圖)或?qū)sp3(圖5B,中央圖)具特異性的兔抗血清作為一抗，通過免疫印跡，分析攜帶載體SFV-S2-9-pac的。票呤霉素抗性BHK-21細胞系的裂解物，或者分析用原始SFV-pacRNA或用SFV-RHR-pacRNA轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞在電穿孔后24小時獲得的裂解物。在兩種情況下，衍生自SFV-pac和衍生自SFV-RHR-pac的樣品都表現(xiàn)出非常相似的模式，因為它們表達可比量的nsp2和nsp3單體。嘌呤霉素抗性BHK-SFV-S2-9-pac細胞系中nsp2和nsp3的量低約1.5倍，這可能是由于這種載體較低的復制。即使在所分析的樣品中檢測到僅非顯著量的高分子量產(chǎn)物，也可以使用抗nsp2抗血清在SFV-S2-9和兩種其他載體間觀察到差異條帶，這可以說明S2-9復制酶的體內(nèi)加工發(fā)生了小的改變。實施例6轉(zhuǎn)基因的表達和SFV-S2-9復制子的包裝為了測定突變體SFV-S2-9中異源基因的表達水平，將SFV亞基因組啟動子之后的Lac-Z報道基因克隆至該載體，產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-S2-9-Lac-Z。由這種質(zhì)粒體外合成RNA,并用于對BHK-21細胞進行電穿孔，電穿孔后，在不同的時間分析該細胞卩-gal的表達。也用原始載體SFV-LacZ的RNA轉(zhuǎn)染細胞，但由于這種載體誘發(fā)的致細胞病變作用，僅在電穿孔后24小時分析它們。轉(zhuǎn)染24小時后，在用SFV-S2-9-LacZ和SFV-LacZ轉(zhuǎn)染的細胞中觀察到相似的(3-gal表達水平，其為約15pg/細胞(圖6)。這種表達水平在用SFV-S2-9-LacZ轉(zhuǎn)染的細胞中隨著時間而增加，轉(zhuǎn)染后48小時，穩(wěn)定在約30pg(3-gal/細胞。為了測定雙突變體SFV-S2-9的包裝效率，如所述(29)，用SFV-S2-9-LacZRNA以及輔助SFV-助體-S2和SFV助體-C-S219ARNAs，對BHK-21細胞進行共電穿孔。電穿孔后24小時，收集細胞的上清液，并通過X-gal染色，對BHK-21細胞的單細胞層進行滴定。SFV-S2-9-LacZRNA被相當?shù)托У匕b，其提供了7xl03pv/ml的效價，這比原始SFV-LacZ所獲得的效價(5x109pv/ml)低得多。為了比較野生型復制酶的存在是否可增加雙突變體S2-9的包裝效率，用SFV-S2-9-LacZ的RNA、SFV-pac和兩種SFV輔助RNAs,對BHK-21細胞進行共電穿孔。在此情況下，觀察到原始載體SFV能適度增加SFV-S2-9-LacZ顆粒的產(chǎn)生，電穿孔后24小時，其達到lx105pv/ml的效價，所述效價是通過X-gal染色感染的BHK細胞而測定的。與SFV-pac被單獨包裝時獲得效價(1.2xl09pv/ml)相比(所述效價是利用對SFVnsp2具特異性的多克隆兔抗血清作為一抗，通過感染的細胞的間接免疫熒光測定的)，原始SFV-pacRNA的包裝在用SFV-S2-9-LacZ和這種載體進行共電穿孔的細胞中降低了約5倍(2.6xl08pv/ml)。為了測定存在于SFV-S2-9中的兩個單獨突變中的每一個突變具有的對包裝的影響，用輔助SFVRNAs和用SFV-RHR-pacRNAs或SFV-S2-pacRNAs兩者，對BHK-21細胞進行共電穿孔，如上文所述，滴定SFV-pac病毒顆粒。SFV-RHR-pac被高效價(6.5xl08pv/ml)包裝，而SFV-S2-pac表現(xiàn)出非常低的包裝效率(2xl04pv/ml)。實施例7利用載體SFV-S2-9產(chǎn)生表達LacZ的穩(wěn)定細胞系正如本研究所指出的，載體SFV-S2-9-pac可用于選擇在嘌呤霉素存在的情況下可以保持復制子的細胞。為了研究是否有可能利用這種類型的載體產(chǎn)生表達其他轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定細胞系，將LacZ報道基因引入pSFV-S2-9-pac，產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-S2-9-LacZ-pac,在該質(zhì)粒中，pac和LacZ基因位于獨立的亞基因組啟動子的下游。體外合成這種質(zhì)粒的RNA,并在BHK-21細胞中進行電穿孔。電穿孔后24小時，加入5嗎/ml。票呤霉素，且當所選擇的細胞達到匯合時，在抗生素存在的情況下，進行10次傳代，達30天的時期。表達卩-gal的細胞的百分比，通過X-gal染色在每一代中測定，其依據(jù)傳代，在70%至90%變動，但在第10代中高于85%,這表示在選擇存在的情況下轉(zhuǎn)基因表達的高穩(wěn)定性(圖7)。在無嘌呤霉素的情況下對所選擇的細胞進行傳代時，表達(3-gal的細胞的百分比降低的很快，在第3代后低于5%。第6代和8代后，測定用噪呤霉素選擇的細胞中卩-gal的表達水平，其分別達到13pg/細胞和18pg/細胞。這些數(shù)值與在用原始載體SFV-LacZ轉(zhuǎn)染的細胞在轉(zhuǎn)染后24小時所獲得的非常相似，這表示用載體SFV-S2-9產(chǎn)生的細胞系可用于大量表達重組蛋白。實施例8其他之前限定的非致細胞病變SFV突變體的評估將之前限定為非致細胞病變的SFV突變引入含有載體序列的質(zhì)粒pSFV-l中SFV復制酶亞基nsp2的基因。這些突變包括-LIOT(TTG變?yōu)锳CC):突變體SF2A(22)，丄713(01八變?yōu)镃CT):突變體SF2C(22)。此外，含有在nsp2中具有突變S259P和R650D的SFV載體序列的質(zhì)粒pSFV-PD是由K.Lundstr6m博士惠贈(21)。因此產(chǎn)生(或獲得)質(zhì)粒pSFV-SF2A、pSFV-SF2C和pSFV-PD,在病毒亞基因組啟動子的控制下，將LacZ基因克隆于所述質(zhì)粒中，分別獲得質(zhì)粒pSFV-SF2A-LacZ、pSFV-SF2C-LacZ和pSFV-PD-LacZ。用這些質(zhì)粒體外合成RNA，將所述RNA在BHK-21細胞中進行電穿孔。電穿孔后，將細胞分配于不同的平板上，在轉(zhuǎn)染后的不同時間固定并用X-gal染色。X-gal染色在由LacZ基因表達卩-gal的細胞中產(chǎn)生藍色，這允許檢測攜帶載體和已在不同的時間存活的細胞的數(shù)量，以及分析其形態(tài)，其為致細胞病變性指示劑。在這個實驗中，將對BHK細胞致細胞病變的用SFV-LacZRNA電穿孔的細胞，作為陰性對照使用。同樣，將SFV-S2-LacZRNA用作陽性對照，其在nsp2中攜帶突變P718T并在一定百分比的細胞中引起非致細胞病變表型。在圖10和圖12中可以看出，突變體SFV-SF2A和SFV-PD表現(xiàn)出的表型與野生型SFV載體的非常相似，在轉(zhuǎn)染的細胞中誘發(fā)強烈的致細胞病變作用，這表現(xiàn)為從第三天開始出現(xiàn)大量凋亡小體以及長時間(7天)后表達幾乎全部缺失。與SFV-PD載體的致細胞病變特性有關(guān)的數(shù)據(jù)，還得到由K.Lundstr6m自己公布的結(jié)果的支持，該結(jié)果表明，在感染了攜帶LacZ或GFP作為報道基因的SFV-PD載體的BHK細胞中，(3-gal或GFP的表達在48小時后如何達到最大，以及在接下來的3-4天顯著降低(20，參閱該參考文獻的圖2)。突變體SFV-SF2C多少表現(xiàn)出較少的致細胞病變表型，但在第3天，出現(xiàn)許多凋亡小體，以及，盡管顯然在第4天，存在高表達水平，但是，這在第7天幾乎完全消失，表明這種突變體比野生型載體可能多少允許更加延長的表達，但并未終止致細胞病變。載體SFV-S2是不引起凋亡小體出現(xiàn)以及允許維持表達至少7天以致出現(xiàn)集落的唯一載體。從用SFV-S2獲得的集落中的一個集落中選擇攜帶突變P718T和R649H的載體SFV-S2-9，這是在所述載體中的LacZ基因被pac基因替換的情況下進行。圖14包括用載體SFV-S2-9-LacZRNA轉(zhuǎn)染并用X-gal在不同時間染色的細胞的照片。載體S2-9未在轉(zhuǎn)染的細胞中產(chǎn)生致細胞病變作用，所述細胞能分裂。實施例9利用載體SFV-S2-9獲得產(chǎn)生心臟營養(yǎng)素1的穩(wěn)定細胞系在兩種不同的環(huán)境下，將大鼠心臟營養(yǎng)素(rCT)基因引入pSFV-S2-9-pac中，產(chǎn)生質(zhì)粒，用該質(zhì)粒產(chǎn)生表達rCT的細胞系。出于鑒定表達rCT的穩(wěn)定細胞系的目的，隨后分析rCT的表達以及rCT表達的穩(wěn)定性兩者。9.1質(zhì)粒構(gòu)建為了產(chǎn)生表達心臟營養(yǎng)素的細胞系，根據(jù)兩種不同的實施方案，引入大鼠心臟營養(yǎng)素(rCT)基因，產(chǎn)生基于pSFV-S2-9-pac的質(zhì)粒畫質(zhì)粒pSFV-S2-9-rCT-pac，在該質(zhì)粒中，pac和rCT基因被置于獨立的亞基因組啟動子的下游(圖15A);以及-質(zhì)粒pSFV-S2-9-pac2A-rCT,根據(jù)圖8B所述的大體結(jié)構(gòu)構(gòu)建，含有在單個亞基因組啟動子下游融合的pac基因和rCT基因(圖15A);在該實施方案中，將FMDV自身蛋白酶2A序列(SEQIDNO:14)(35)引入這兩個基因間，以便允許心臟營養(yǎng)素從融合蛋白中釋放(圖15A)。為了構(gòu)建質(zhì)粒pSFV-S2-9-rCT-pac，事先產(chǎn)生克隆載體pSFV-S2-9-mcs-pac,其包含SFV-S2-9復制酶、后接多克隆位點的第一亞基因組啟動子以及后接pac基因的第二亞基因組啟動子。簡而言之，使寡核苷酸SEQIDNO:15和SEQIDNO:16雜交，產(chǎn)生合成的DNA片段，其具有BamHI相容的、突出的5'末端，并且該DNA片段的序列含有具有酶AvrII、Apal、Nrul和BstBI的耙標的多克隆位點，在三個可能的閱讀階段中的三個翻譯終止密碼子，以及SFV亞基因組啟動子序列。將這個片段克隆至pSFV-S2-9-pac的BamHI位點，產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-S2陽9隱mcs-pac。在第二步中，利用分別與rCT基因的起始端和末端雜交且為使克隆更容易而在末端含有BamHI位點的寡核苦酸SEQIDNO:17和SEQIDNO:18,由質(zhì)粒pRSET-rCT(36)合成含有大鼠心臟營養(yǎng)素基因的645bp的PCR片段。用BamHI消化PCR片段，并克隆至pSFV-S2-9-mcs-pac的BamHI位點，獲得質(zhì)粒pSFV-S2-9-rCT-pac。以相似的方式將相同的PCR片段克隆至用BamHI消化的pSFV-l中，產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-rCT。為了構(gòu)建pSFV-S2-9-pac2A-rCT質(zhì)粒，事先產(chǎn)生克隆載體pSFV-S2-9-pac2A，該克隆載體含有載體SFV-S2-9-pac的序列并且在該序列末端含有克隆位點Smal/Xmal,在SFV-S2-9-pac的序列中，pac基因在其3'末端與編碼FMDV自身蛋白酶2A的核香酸序列協(xié)調(diào)地融合(35)。簡而言之，利用質(zhì)粒pSFV-S2-9-pac作為沖莫板，用外部寡核苷酸SEQIDNO:19和SEQIDNO:20以及內(nèi)部寡核苷酸SEQIDNO:21和SEQIDNO:22,進行交換PCR,產(chǎn)生842bp的DNA片段，用BamHI和XmaI消化該DNA片段，并克隆至用相同的酶消化的pSFV-S2-9-pac中，由此獲得質(zhì)粒pSFV-S2-9-pac2A。出于在pac基因的3，末端引入序列2A-Xmal以及同時除去存在于該基因內(nèi)的Xmal位點的雙重目的，進行交換PCR。最后，為了產(chǎn)生質(zhì)粒pSFV-S2-9-pac2A-rCT，利用分別與rCT基因的起始端和末端雜交且為使克隆更容易而在末端含有XmaI位點的寡核苷酸SEQIDNO:23和SEQIDNO:24，由質(zhì)粒pRSET-rCT(36)產(chǎn)生含有大鼠心臟營養(yǎng)素基因的645bp的PCR片段。用XmaI消化PCR片段，并克隆至pSFV-S2-9-pac2A的XmaI位點，獲得質(zhì)粒pSFV-S2-9-pac2A-rCT。9.2獲得產(chǎn)生心臟營養(yǎng)素的穩(wěn)定的細胞系以及心臟營養(yǎng)素的表達分析45將體外合成的每種質(zhì)粒的RNA(9.1節(jié))在BHK-21細胞中進行電穿孔。電穿孔24小時后，加入5昭/ml的。票呤霉素，且當所選擇的細胞達到匯合時，用對心臟營養(yǎng)素具特異性的抗體，通過免疫印跡，分析細胞裂解物中心臟營養(yǎng)素的表達(圖15B)。對于通過免疫印跡進行的分析實驗，通過與含有1%Igepal(Sigma,USA)、50mMTrisHC1,pH7.6、150mMNaCl、2mMEDTA和1pg/mlPMSF(Sigma,St.Louis,USA)的緩沖液一起孵育，獲得用SFV的SFV載體轉(zhuǎn)染的BHK-21細胞的裂解物，通過在冷凍微離心機中以6000rmp離心6分鐘，使所述裂解物澄清，并通過Bradford分析對其定量。通過在12。/。聚丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE，分析裂解物，將它們轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，并與作為一抗的、分別抗鼠心臟營養(yǎng)素CT-1(R&DSystems)或肌動蛋白(Sigma,St.Louis,USA)的多克隆抗血清一起溫育。將分別對大鼠或兔免疫球蛋白具特異性的山羊或綿羊抗血清與HRP偶聯(lián)，作為二抗使用。根據(jù)制造商的說明書，利用蛋白印跡增強型化學發(fā)光試劑(PerkinElmerLifeSciences,USA),觀察蛋白。為了對rCT的水平進行定量，為此目的，利用ImagequantTL程序(Amersham)，通過免疫印跡分析表達rCT的細胞的不同量的裂解物，并與已知量的重組心臟營養(yǎng)素進行比較。在用每一種載體產(chǎn)生的細胞系中，心臟營養(yǎng)素表達水平與用具有野生型復制酶SFV-rCT的載體RNA電穿孔的細胞獲得的表達水平相似(圖15B)。在所選擇的細胞系中rCT的表達為約4.3pg/細胞。在用載體SFV-S2-9-pac2A-rCT產(chǎn)生的細胞系中，雖然存在也被免疫印跡檢測到的未消化的組分，但是觀察到大多數(shù)rCT已經(jīng)從融合蛋白中釋放。為了分析這些載體在轉(zhuǎn)染的細胞中的穩(wěn)定性，在。票呤霉素存在的情況下，將含有它們的細胞連續(xù)傳代10次，達約20天，并通過免疫印跡，測定細胞裂解物中每代的rCT表達。如果細胞系是用載體8^82-9-1€丁-pac產(chǎn)生的，觀察到表達維持到第5代，從第5代開始，表達逐漸顯著減低，在第ll代實質(zhì)上消失(圖16)。然而，這種穩(wěn)定性的喪失未發(fā)生于含有載體SFV-S2-9-pac2A-rCT的細胞系中，在該細胞系中，表達維持恒定達至少IO代(圖17)，這表明轉(zhuǎn)基因(rCT基因)與pac基因利用編碼FMDV自身蛋白酶2A協(xié)調(diào)地融合相當程度地增加了由載體SFV-S2-9產(chǎn)生的細胞系中異源蛋白表達的穩(wěn)定性。實施例10利用載體SFV-S2-9獲得產(chǎn)生人胰島素樣生長因子aGF-I)的穩(wěn)定細胞系通過在兩種不同的環(huán)境中將人胰島素樣生長因子(IGF-I)基因引入pSFV-S2-9-pac中，產(chǎn)生質(zhì)粒，并用該質(zhì)粒產(chǎn)生表達IGF-I的細胞系。隨后出于鑒定表達IGF-I的穩(wěn)定細胞系的目的，分析IGF-I的表達和IGF-I表達的穩(wěn)定性兩者。10.1質(zhì)粒構(gòu)建為了產(chǎn)生表達IGF-I的細胞系，根據(jù)兩種不同的實施方案，通過引入IGF-I基因，產(chǎn)生基于SFV-S2-9-pac的質(zhì)粒誦質(zhì)粒SFV-S2-9-pac，在該質(zhì)粒中，將pac和IGF-I基因置于獨立的亞基因組啟動子的下游(圖18);在這種質(zhì)粒中，利用編碼FMDV自身蛋白酶2A的核香^列作為連接子，將IGF-I基因與SFV衣殼翻譯增強子融合，因為這種策略已經(jīng)在相當程度上增加了野生型SFV載體中的異源蛋白的表達(37);以及畫質(zhì)粒pSFV畫S2-9-pac2A陽IGF,根據(jù)圖8B所述的大體結(jié)構(gòu)構(gòu)建，含有在單個亞基因組啟動子下游融合的pac基因和IGF-I基因(圖18);在這種實施方案中，將編碼FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列(SEQIDNO:l4)(35)引入兩個基因間，以便允許從融合蛋白釋放心臟營養(yǎng)素(圖18)。為了構(gòu)建質(zhì)粒pSFV-S2-9-IGF-pac，用BglII+Klenow和Spel消化質(zhì)粒pSFVbl2A-IGF-IB(38),獲得2.3kb的片段，將該片段與從用Bsml十T4po1和Spel消化的pSFV-S2-9-pac中獲得的11.1kb的片段連接。質(zhì)粒pSFVbl2A-IGF-IB含有在其5，末端與盒融合的人IGF-I前體序列(IGF-IB),所述盒含有后接編碼FMDV自身蛋白酶2A的核苷酸序列的、編碼SFV衣殼最初34個氨基酸的序列(最小的翻譯增強子或"bl")。前體IGF-IB編碼195個氨基酸的前蛋白(preprotein),其包含IGF-I基因的結(jié)構(gòu)域II、B、C、A、D、D、E、Ea、Eb和6。這種蛋白加工成分泌的成熟形式的IGF-I,喪失氨基末端II結(jié)構(gòu)域和羧基末端結(jié)構(gòu)域E、Ea、Eb和6(39)。為了構(gòu)建質(zhì)粒pSFV-S2-9-pac2A-IGF，用Xmal消化質(zhì)粒pSFVbl2A-IGF-I(38)，獲得含有IGF-IB序列的0.59kb片段，將該片段與事先用Xmal消化的pSFV-S2-9-pac2A(有關(guān)質(zhì)粒pSFV-S2-9-pac2A-rCT的構(gòu)建，其特征以及獲得方式在實施例9.1中做了描述)連接。隨后選擇已經(jīng)以正確的方向引入0.59kb片段的克隆。10.2獲得產(chǎn)生IGF-I的穩(wěn)定的細胞系并分析IGF-I的表達將體外合成的每種質(zhì)粒的RNA(lO.l節(jié))在BHK-21細胞中進行電穿孔。電穿孔后24小時，加入5嗎/ml的。票呤霉素，當所選擇的細胞達到匯合時，通過對人IGF-I具特異性的ELISA，分析不同時間收集的細胞上清液中IGF-I的表達(圖19)。利用特異測量游離的人IGF-I(游離的IGF-I,貨號DSL-10-9400，DiagnosticSystemslaboratories,Webster,Texas,USA)的ELISA^式劑盒，分片斤細胞上清液中IGF-I的表達。對于每個所分析的傳代，每孔接種5xl()S個細胞，等待4個小時，以便細胞附著，并通過加入1ml具有5%胎牛血清(37)和5嗎/ml。票呤霉素的Glasgow-MEM培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基發(fā)生改變。24、48或72小時后，收集上清液，將其在冷凍微離心機中以6,000rpm離心5分鐘，以便除去細胞殘余物，并貯存于-80。C,直到分析，出于控制存在于每個樣品中的細胞的量的目的，從已經(jīng)收集了上清液的相同孔中收集BHK細胞，通過在含有l(wèi)%Igepal(Sigma,USA)、50mMTrisHC1，pH7.6、150mMNaCl、2mMEDTA以及1嗎/mlPMSF(Sigma,St.Louis，USA)的緩沖液中孵育，將其裂解，通過在冷凍微離心機中以6000rmp離心，使其澄清，并通過Bradford分析，對它們進行定量。通過Bradford獲得的蛋白量的值與所有分析的樣品中的值非常相似。獲得的有關(guān)收集到的細胞上清液中IGF-I表達的結(jié)果表明，數(shù)小時后，在用每種非致細胞病變載體產(chǎn)生的細胞系的上清液中IGF-I的表達水平，僅比用野生型載體SFV-IGF-I的RNA電穿孔的細胞中獲得的表達水平低約1.5-2倍(圖19)。相比在用SFV-S2-9-IGF-pac選擇的細胞系中的表達(21.3pg/細胞)，在用載體SFV-S2-9-pac2A-IGF獲得的細胞系中的表達(34.5pg/細胞)多少較大。對更長的時間取得的上清液中IGF-I的表達分析證明，IGF-I可以聚積，在載體SFV-S2-9-pac2A-IGF和SFV-S2-9-IGF-pac中分別多達67pg/細胞和34pg/細胞的最大值。這些結(jié)果表明，IGF-I被分泌至細胞外培養(yǎng)基中，這表示正確的多蛋白加工。為了分析這些載體在轉(zhuǎn)染的細胞中的穩(wěn)定性，在存在嘌呤霉素的情況下使含有它們的細胞進行10次連續(xù)傳代，達約20天的時期，通過對人IGF-I具特異性的ELISA,測定每次傳代24小時后收集的細胞上清液中IGF-I的表達。當細胞系是用載體SFV-S2-9-IGF-pac產(chǎn)生時，觀察到表達維持到第4代，從第4代開始，表達開始顯著降低，達到在第10代低80倍的水平(圖20)。這種穩(wěn)定性的喪失不是如此顯著地發(fā)生在含有載體SFV-S2-9-pac2A-IGF的細胞系中，在該細胞系內(nèi)，表達幾乎保持恒定，第l代至第10代降低4倍(圖20)。該結(jié)果證實，轉(zhuǎn)基因與pac基因利用編碼FMDV自身蛋白酶2A的核苷S齡列協(xié)調(diào)地融合，相當?shù)卦黾恿擞幂d體SFV-S2-9產(chǎn)生的細胞系中異源蛋白表達的穩(wěn)定性。參考文獻1.Agapov，E.V.，I.Frolov，B.D.Lindenbach,B.M.Pragai,S.SchlesingerandC.M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nesforSindbisvirusandSemlikiForestvirus-derivedvectors(用于辛德畢斯病毒和Semliki森林病毒的衍生的載體的穩(wěn)定的a病毒包裝細胞系).Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:4598-603.25.Pushko,R，M.Parker,G.V.Ludwig,N.L.Davis,R.E.JohnstonandJ.F.Smith.1997.Replicon-helpersystemsfromattenuatedVenezuelanequineencephalitisvirus:expressionofheterologousgenesvzYroanimmunizationagainstheterologouspathogensinvivo沐自衰減的委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒的復制子輔助系統(tǒng)異源基因的體外表達，針對體內(nèi)異源病原體的免疫).Virology239:398-401.26.Rayner，J.O,,S.A.DrygaandK.I.Kammd.2002.Alphavirusvectorsandvaccination(a病毒載體和4矣種).Rev.Med.Virol.12:279-96.27.Rikkonen,M.1996.Functionalsignificanceofthenuclear-targetingandNTP-bindingmotifsofSemlikiForestvirusnonstructuralproteinnsP2(Semliki森4木病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2的細月包核尋耙和NTP結(jié)合基元的功能意義).Virology218:352-61.28.Sjoberg，E.M.，M.SuomalainenandH.Garoff.1994.AsignificantlyimprovedSemlikiForestvirusexpressionsystembasedontranslationenhancersegmentsfromtheviralcapsidgene(基于來自病毒衣殼基因的翻譯增強子節(jié)段的顯著改善的Semliki森林病毒表達系統(tǒng)).Biotechnology(NY)12:1127-31.29.Smerdou,C.,andP.Liljestr6m.1999.Two-helperRNAsystemforproductionofrecombinantSemlikiForestvimsparticles(用于產(chǎn)生重組Semliki森4木病毒顆粒的兩個輔助RNA系統(tǒng)).J.Virol.73:1092-8.30.Strauss,J.HandE.G.Strauss.1994.Thealphaviruses:geneexpression,replicationandevolution(a病毒基因表達、復制和進J匕).Microbiol.Rev.58:491-562.31.Ventoso，I.，M.A.Sanz，S.Molina,J.J.Berlanga，LCarrascoandM.Esteban.2006.TranslationalresistanceoflatealphavirusmRNAtoelF2alphaphosphorylation:astrategytoovercometheantiviraleffectofproteinkinasePKR(末期a病毒mRNA對elF2a石岸酸化的翻譯4氐抗).GenesDev.20:87-100.32.White,C.L.,M.ThomsonandN.J.Dimmock.1998.DeletionanalysisofadefectiveinterferingSemlikiForestvimsRNAgenomedefinesaregioninthensP2sequencethatisrequiredforefficientpackagingofthegenomeintovirusparticles(缺陷型感染Semliki森林病毒RNA基因組的缺失分析明確了nsp2序列中將基因組有效包裝成病毒顆粒所需的區(qū)域).J.Virol.72:4320-6.33.F.，andA.Bernard.1999.Large-scaletransientexpressioninmammaliancellsforrecombinantproteinproduction(用于重組蛋白產(chǎn)生的哺乳動物細胞中大規(guī)模的瞬時表達).Curr.Opin.Biotechnol.10:156-9.34.Xiong，C，R.Levis,P.Shen,S.Schlesinger，C.M.RiceandH.V.Huang.1989.Sindbisvirus:anefficient,broadhostrangevectorforgeneexpressioninanimalcells(辛德畢斯病毒基因在動物細胞中表達的廣泛宿主范圍載體).Science243:1188-91.35.RyanMDandJDrew.Foot-and-mouthdiseasevims2Aoligopeptidemediatedcleavageofanartificialpolyprotein(口蹄疫病毒2A寡肽介導人工多蛋白的切割).EMBOJ.1994.13:928-33.36.IfiiguezM，CBerasain,EMartinez-Anso,MBustos，PFortes,DPennica,MAAvila,andJPrieto.2006Cardiotrophin-1defendstheliveragainstischemia-reperfiisioninjuryandmediatestheprotectiveeffectofischemicpreconditioning(心臟營養(yǎng)素防御肝免遭缺血再灌注損傷并介導缺血預處理的保護作用).JExpMed.203:2809-15.37.Rodriguez-MadozJ.R.，PrietoJ.andSmerdouC.2005.SemlikiForestvirusvectorsengineeredtoexpresshigherIL-12levelsinduceefficienteliminationofmurinecolonadenocarcinomas(經(jīng)工程改造表達更高水平IL-12的Semliki森林病毒載體誘發(fā)鼠結(jié)腸腺癌的有效清除).MolecularTherapy.12,153-163.38.Palencia，B.2005(June)."Bioproducci6ndeIGF-I(IGF-I的生物產(chǎn)生)，，.Ph.D.Thesis.UniversityofNavarre.39.LundPK.1994.Insulin-likegrowthfactorI:molecularbiologyandrelevancetotissue-specificexpressionandaction(月夷島素才羊生長因子I:纟且織特異性表達和作用的分子生物學和相關(guān)性).RecentProgHormRes.49:125-48.權(quán)利要求1.含有Semliki森林病毒(SFV)復制子的病毒載體，其中所述復制子含有(i)編碼在亞基nsp2中具有突變P718T和R649H的SFV復制酶的核苷酸序列，(ii)含有選擇基因的多核苷酸，以及(iii)含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸。2.如權(quán)利要求1所述的病毒載體，含有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。3.如權(quán)利要求1所述的病毒載體，含有a)含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸，其表達受第一SFV亞基因組啟動子(SG1)的控制；以及b)含有選擇基因的多核苷酸，其表達受第二SFV亞基因組啟動子(SG2)的控制。4.如權(quán)利要求3所述的病毒載體，其中所述第一和第二SFV亞基因組啟動子是相同的。5.如權(quán)利要求3所述的病毒載體，其中所述第一和第二SFV亞基因組啟動子是不同的。6.如權(quán)利要求1所述的病毒載體，含有處于亞基因組啟動子下游的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含所述含有選擇基因的多核苷酸和所述含有編碼目的異源產(chǎn)物的核普酸序列的多核苷酸，上述多核香酸協(xié)調(diào)地融合。7.如權(quán)利要求6所述的病毒載體，其中所述含有選擇基因的多核香酸通過多核苷酸連接子與所述含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸協(xié)調(diào)地融合。8.如權(quán)利要求7所述的病毒載體，其中所述連接子是含有編碼翻譯后(自身)蛋白水解切割位點的核苷酸序列的多核苷酸。9.如權(quán)利要求8所述的病毒載體，其中所述連接子是含有編碼(自身)蛋白酶的核苷酸序列的多核苷酸，所述蛋白酶在由所述選擇基因的翻譯和所述編碼目的異源產(chǎn)物的核香酸序列的翻譯產(chǎn)生的蛋白間發(fā)揮順式作用。10.如權(quán)利要求9所述的病毒載體，其中所述(自身)蛋白酶是口蹄疫病毒(FMDV)自身蛋白酶2A。11.如權(quán)利要求8所述的病毒載體，其中所述連接子是含有編碼反式作用蛋白酶的切割位點的核苷酸序列的多核苷酸。12.如權(quán)利要求11所述的病毒載體，其中所述反式作用蛋白酶是煙草蝕紋病毒(ETV)蛋白酶。13.如權(quán)利要求8所述的病毒載體，其中所述連接子是含有編碼能被化學試劑識別的切割位點的核苷酸序列的多核苦酸。14.如權(quán)利要求6所述的病毒載體，其中所述含有選擇基因的多核苦酸的3'末端，與所述含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核香酸的5'末端協(xié)調(diào)地融合。15.如權(quán)利要求6所述的病毒載體，其中所述含有編碼目的異源產(chǎn)物的核苷酸序列的多核苷酸的3'末端，與所述含有選擇基因的多核苷酸的5'末端協(xié)調(diào)地融合。16.如權(quán)利要求1所述的病毒載體，其中所述選擇基因是其表達賦予抗生素抗性的基因、允許合成培養(yǎng)基中遺漏的必需營養(yǎng)素的基因或賦予用所述病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞選擇優(yōu)勢的基因。17.如權(quán)利要求16所述的病毒載體，其中所述選擇基因是其表達賦予潮霉素抗性(hph)的基因、其表達賦予新霉素抗性(neoR)的基因或編碼噪呤霉素N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(pac)的基因，所述編碼嘌呤霉素N-乙?；D(zhuǎn)移酶(pac)的基因的表達賦予噪呤霉素抗性。18.如權(quán)利要求1所述的病毒載體，其中所述目的異源產(chǎn)物是報道蛋白或肽；具有治療或診斷用途的肽、蛋白或抗體或所述抗體的片段；或重組蛋白或肽。19.如權(quán)利要求18所述的病毒載體，其中所述目的異源產(chǎn)物選自胰島素樣生長因子I(IGF-I)、心臟營養(yǎng)素-1、制瘤素M(OSM)、a干擾素、雙調(diào)蛋白(AR)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、內(nèi)皮細胞蛋白C/激活的蛋白C受體(EPCR)和目的或者治療或診斷用途的抗體或其功能片段。20.如權(quán)利要求1-19中任一項所述的病毒載體在體外產(chǎn)生可組成型地表達目的異源產(chǎn)物的穩(wěn)定細胞系中的用途。21.可組成型地表達目的異源產(chǎn)物的穩(wěn)定細胞系，其中它是用如權(quán)利要求1-19中任一項所述的病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞系。22.體外產(chǎn)生權(quán)利要求21所述的可組成型地表達目的異源產(chǎn)物的穩(wěn)定細胞系的方法，包括I.用權(quán)利要求1-19中任一項所述的病毒載體轉(zhuǎn)染細胞；II.選擇步驟I中產(chǎn)生的穩(wěn)定細胞；以及III.培養(yǎng)并維持所述穩(wěn)定細胞。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中待轉(zhuǎn)染的所述細胞是真核細胞或真核細胞系，其優(yōu)選來自哺乳動物。24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中待轉(zhuǎn)染的所述細胞通過電穿孔或通過所述遺傳材料與陽離子脂質(zhì)的結(jié)合而轉(zhuǎn)染。25.如權(quán)利要求21所述的穩(wěn)定細胞系在體外產(chǎn)生目的異源產(chǎn)物中的用途。26.體外產(chǎn)生目的異源產(chǎn)物的方法，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求21所述的穩(wěn)定細胞系，所述培養(yǎng)在允許目的異源產(chǎn)物表達的條件下進行，所述目的異源產(chǎn)物為用來產(chǎn)生所述穩(wěn)定細胞系的病毒載體所含有。27.如權(quán)利要求26所述的方法，包括I.用權(quán)利要求1-19中任一項所述的病毒載體轉(zhuǎn)染細胞；II.選擇步驟I中產(chǎn)生的穩(wěn)定細胞；III.培養(yǎng)并維持所述穩(wěn)定細胞；以及，如果需要，IV.提取所述目的異源產(chǎn)物。全文摘要本發(fā)明涉及在編碼Semliki森林病毒(SFV)復制酶的亞基nsp2的核苷酸序列中含有SFV突變的復制子的病毒載體。所述病毒載體可用于產(chǎn)生能夠組成型地表達目的異源產(chǎn)物的穩(wěn)定細胞系。文檔編號C12N15/86GK101589150SQ200780044354公開日2009年11月25日申請日期2007年11月28日優(yōu)先權(quán)日2006年11月28日發(fā)明者亞蘭達·奎瓦斯拉布拉多爾,克里斯蒂安·斯梅爾多畢加索,埃爾古德恩·卡薩萊斯左庫,尼瑞·拉茲庫尹埃羅,胡安·羅伯托·拉洛古茲馬多茲,赫蘇斯·普列托巴爾圖埃納,馬爾塔·魯伊斯奎勒恩申請人:西瑪生物醫(yī)學信息公司