專利名稱：：重組的豬腺病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于在易于被疾病大量殺死的商品豬中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原產(chǎn)生基因(異源基因序列或其片段)的傳遞載體。該載體對(duì)制備易于大范圍給藥以保護(hù)豬抵抗疾病的疫苗特別有用。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生適當(dāng)?shù)膫鬟f載體的方法，制備基于該載體的疫苗的方法，給藥策略及保護(hù)豬免生疾病的方法。背景集約豬工業(yè)的生產(chǎn)率依賴于對(duì)傳染病的控制。雖然疾病由較好的衛(wèi)生和檢疫措施而部分得到控制，該工業(yè)仍依賴于免疫來保護(hù)畜群。在商業(yè)角度，每個(gè)動(dòng)物在飼料和流行病控制花費(fèi)中的費(fèi)用很高并且因此，通過任何新提出的疫苗對(duì)疾病的預(yù)防和控制必須是便宜、有效并易于提供的。傳統(tǒng)上，由活病毒顆粒組成的疫苗是通過病毒傳代及選擇減毒形式來制備的。此外，死疫苗是從毒性病毒制備。關(guān)于在豬中控制疾病而使用病毒載體的最新描述是用于控制假狂犬病的假狂犬病病毒的缺失突變。用皰疹病毒作為載體具有能刺激體液和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的優(yōu)點(diǎn)，因此可能提供終生保護(hù)。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在此載體中插入其它異源序列的能力，該序列可從適當(dāng)?shù)膯?dòng)子表達(dá)，產(chǎn)生的抗原暴露于動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，從而可保護(hù)動(dòng)物抵抗兩種疾病。此系統(tǒng)也有缺點(diǎn)。首先，存在潛伏期的問題。皰疹病毒具有在動(dòng)物的存活期中整合入神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元的能力。它僅需在動(dòng)物身上施加適當(dāng)?shù)膽?yīng)激就能引起病毒的再活化并最終導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。然而，現(xiàn)在已知特定基因-糖蛋白E-的缺失可使該病毒減毒并可防止病毒從潛伏期再活化。因此，此缺失載體目前廣泛用作假狂犬病的消滅載體，隨后不能用作為傳遞其它抗原的適當(dāng)載體。因此本發(fā)明的目的是提供特別適于大范圍給藥的遺傳物質(zhì)異源序列的傳遞載體。具體地說，本發(fā)明的目的是提供或改善產(chǎn)生和/或優(yōu)化抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的措施，從而保護(hù)動(dòng)物抵抗常見豬疾病的感染。另一個(gè)目的是提供制備用于產(chǎn)生和/或優(yōu)化抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的適當(dāng)工具的方法，從而可保護(hù)豬抵抗常見豬疾病的感染。進(jìn)一步的目的是提供保護(hù)策略。發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能表達(dá)目的DNA的重組豬腺病毒，該目的DNA穩(wěn)定整合到上述重組豬腺病毒基因組的適當(dāng)位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括重組豬腺病毒的重組載體，該腺病毒穩(wěn)定整合了至少一種異源核苷酸序列。優(yōu)選地，異源核苷酸序列能表達(dá)抗原多肽。由至少一種核苷酸序列編碼的抗原多肽對(duì)宿主載體來說優(yōu)選是外源的。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，異源核苷酸序列能表達(dá)免疫增強(qiáng)分子。也可以理解異源核苷酸序列可編碼和/或表達(dá)抗原多肽及免疫增強(qiáng)分子。重組載體可包含活的重組豬腺病毒，其中病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白與產(chǎn)生重組豬腺病毒的天然豬腺病毒中的蛋白相比沒有改變。本發(fā)明是部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)在豬腺病毒基因組中有非必要區(qū)，其與以前在其它腺病毒中鑒定的那些并不相關(guān)，因此使該病毒特別適于傳遞異源序列。本發(fā)明還基于如下發(fā)現(xiàn)豬腺病毒在豬中產(chǎn)生長期應(yīng)答，因而其很適合作為疫苗的載體。并且，對(duì)呼吸道或胃腸道特異性的大量血清型的存在可使我們選出適合靶器官和所需的免疫應(yīng)答類型的疫苗載體。本發(fā)明還基于發(fā)現(xiàn)豬腺病毒可包裝大于中等大小基因組哺乳動(dòng)物腺病毒中105％的基因組DNA，并且最終包裝出的病毒粒子在體外和體內(nèi)均是穩(wěn)定的。腺病毒是較大的并且多變化的家族，已從許多活的物種包括人和其它哺乳動(dòng)物及多種鳥類中分離出來。結(jié)果將腺病毒分成至少2個(gè)屬，乳腺病毒屬(Mastoadenoviridea)和禽腺病毒屬(Aviadenoviridae)，并且最近已提出了第三個(gè)屬，Atadenovirdae，包括一些牛和鳥類的腺病毒(eggdrop綜合癥)(Benk和Harrach，ArchivesofVirology143，829-837，1998)。豬腺病毒是豬的廣泛傳染性致病體，目前已識(shí)別出4種不同的血清型(Adair和McFerran，1976)并有存在至少另一種血清型的證據(jù)(Derbyshire等，1975)。在發(fā)現(xiàn)的4種血清型中，有3種(血清型1到3)是從胃腸道中分離出來的而第四種是從呼吸系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的。認(rèn)為豬腺病毒是較低致病性的廣泛感染劑，盡管一般都是從生病的動(dòng)物中分離到該病毒，但該病毒還是很可能僅作為繼發(fā)感染存在。已從患有腹瀉和呼吸系統(tǒng)感染的豬中分離出它們，但認(rèn)為至少胃腸系統(tǒng)的腺病毒感染經(jīng)常是無癥狀的(Sanford和Hoover，1983)。豬腺病毒通過消化或吸入進(jìn)行傳播并且經(jīng)口、鼻內(nèi)和氣管內(nèi)接種的實(shí)驗(yàn)性感染可導(dǎo)致病毒的攝入。實(shí)驗(yàn)致病性研究已表明感染的初級(jí)位點(diǎn)是下部小腸，還可能有扁桃體(Sharpe和Jessett，1967；Shadduch等，1968)。對(duì)于血清型4的感染，似乎在實(shí)驗(yàn)感染中可發(fā)展出病毒血癥。然而，這可能是胃腸系統(tǒng)血清型感染豬腺病毒的不太常見的表現(xiàn)(Shadduck等，1968)。糞便排泄是豬腺病毒(PAV)傳播最常見的原因，在感染后持續(xù)數(shù)周。在實(shí)驗(yàn)條件下還會(huì)發(fā)生從鼻釋放。已表明PAV在肺炎中的作用是誘病因素或者是增強(qiáng)劑(Kasza等，1969；Schiefer等，1974)，但實(shí)驗(yàn)中的血清型4肺炎并不需要第二種致病劑來產(chǎn)生疾病(Smith等，1973)。豬腺病毒有待進(jìn)行大量的詳細(xì)檢查，對(duì)于它們?cè)诩膊≈械淖饔没蛩鼈兊某Ｒ姵潭戎跎佟＿@是因?yàn)樗鼈冊(cè)谛笕褐胁⒉划a(chǎn)生任何重大的疾病并且不會(huì)由于產(chǎn)量的降低引起工業(yè)界的興趣?？赡茇i腺病毒的血清型數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于4種并且它可能作為正常的共生體存在于大多數(shù)豬畜群中。對(duì)于豬腺病毒在形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方面的研究已顯示它與所檢測的其它乳腺病毒的一些相似性。它的形態(tài)學(xué)特征是所檢測的其它腺病毒都具有的含有雙鏈DNA基因組核心的二十面體衣殼。極少針對(duì)PAV基因組特性的工作的報(bào)道(Benk等，1990，Kleiboeker等，1993，Reddy等，1993，Kleiboeker，1994)。PAV基因組的大小(約為34.8kb)略小于人腺病毒的基因組(約為35.9kb)。用來自2型人腺病毒全基因組的DNA探針通過雜交進(jìn)行的一項(xiàng)研究表明在豬和人的腺病毒之間具有相當(dāng)?shù)腄NA同源性(Benk等，1990)。近期關(guān)于血清型4PAV的報(bào)道證明它的基因組分布在L4和E3區(qū)(包括33K和pVIII基因)也與人腺病毒相似，盡管它們的序列同源性不象預(yù)期的那樣強(qiáng)(Kleiboeker，1994)。當(dāng)選擇適當(dāng)?shù)腜AV作為活的載體將疫苗傳遞給豬時(shí)，考慮血清型的天然豐富程度是重要的。那些在本領(lǐng)域中不太常見的血清型比那些經(jīng)常暴露給豬以及豬已對(duì)其發(fā)展出免疫性的血清型相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)。進(jìn)一步的考慮是載體在超越初乳中的母體抗體保護(hù)剛出生的小豬這一階段之后在豬中保持活性的能力。在選擇可能的PAV載體中的其它重要的考慮是致病性和免疫原性。優(yōu)選地，活載體病毒應(yīng)該是高感染性但非致病性的(或至少是減毒的)，從而它們自身不會(huì)對(duì)靶物種造成不利影響。疫苗載體的優(yōu)選候選者是血清型4(呼吸的)和血清型3(胃腸的)的非致病性分離株。選擇血清型3是因?yàn)樗谶B續(xù)豬腎細(xì)胞系中出色的生長能力。其它血清型的分離，可能會(huì)大大改變此選擇。值得注意的是毒性更強(qiáng)的毒株會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的抗體應(yīng)答?？烧系讲《净蚪M非必需區(qū)并可編碼感染性生物體的抗原決定簇(需要產(chǎn)生抵抗它的抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)的異源核苷酸序列可以是表達(dá)由胃腸病毒例如輪狀病毒或細(xì)小病毒，或呼吸病毒例如副流感病毒，或日本腦炎病毒引起的腸道感染的抗原決定簇的異源核苷酸序列?？烧系漠愒春塑账嵝蛄邪ㄏ铝胁≡w的抗原決定簇豬細(xì)小病毒肺炎支原體豬副流感病毒傳染性胃腸炎(豬冠狀病毒)豬輪狀病毒豬瘟病毒(經(jīng)典豬霍亂病毒)豬痢疾非洲豬瘟病毒假狂犬病病毒(Aujesky’s病病毒)，特別是假狂犬病病毒的糖蛋白D豬呼吸和生殖綜合癥病毒(PRRSV)整合于本發(fā)明載體中的更優(yōu)選的異源核苷酸序列是那些表達(dá)豬細(xì)小病毒、豬輪狀病毒、豬冠狀病毒和經(jīng)典豬霍亂病毒的抗原決定簇的異源核苷酸序列。還可以設(shè)想整合的異源核苷酸序列可以是免疫增強(qiáng)分子如細(xì)胞因子或生長促進(jìn)劑，例如豬白介素4(IL4)、γ干擾素(γIFN)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、FLT-3配體和白介素3(IL-3)。由候選載體的刺激引起的免疫應(yīng)答類型可影響對(duì)插入其中的異源核苷酸序列的選擇。天然經(jīng)腸道感染的PAV血清型1、2和3可誘導(dǎo)局部黏膜免疫并因此更適合于腸道感染(例如經(jīng)典豬霍亂病毒)。天然經(jīng)呼吸系統(tǒng)感染的PAV血清型4更適合于呼吸道感染(例如豬副流感病毒)，也可誘導(dǎo)較好的局部免疫。包含編碼抗原決定簇或免疫增強(qiáng)分子的異源基因的目的DNA可位于病毒基因組的至少一個(gè)非必需區(qū)中。可能適于替換或插入異源核苷酸序列的病毒基因組的非必需區(qū)可以是位于基因組右末端圖距單位97到99.5的非編碼區(qū)。優(yōu)選的非編碼區(qū)包括PAV基因組圖距單位81-84的早期區(qū)(E3)。異源基因序列可與啟動(dòng)子及先導(dǎo)序列相連從而核苷酸序列可在原位盡可能有效地表達(dá)。優(yōu)選地，異源基因序列與豬腺病毒的主要晚期啟動(dòng)子和剪接先導(dǎo)序列相連。哺乳動(dòng)物腺病毒的主要晚期啟動(dòng)子位于腺病毒遺傳學(xué)距單位16-17附近并含有經(jīng)典的TATA序列基元(Johnson，D.C.，Ghosh-Chondhury，G.，Smiley，J.R.，F(xiàn)allis，L.和Graham，F(xiàn).L.(1988)，用腺病毒載體實(shí)現(xiàn)的單純皰疹病毒糖蛋白gB的高豐度表達(dá)，病毒學(xué)164，1-14)。所考慮的豬腺病毒血清型的剪接先導(dǎo)序列是剪接到所有晚期基因mRNA5’末端的三聯(lián)體序列。異源基因序列還可能與多聚腺苷酸化序列相連。除了豬腺病毒主要晚期啟動(dòng)子，還可使用其它適當(dāng)?shù)恼婧藛?dòng)子。例如，可使用SV40病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV)或人腺病毒的啟動(dòng)子。還可考慮豬腺病毒以外的加工和多聚腺苷酸化信號(hào)，例如SV40的。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面中，提供重組疫苗以產(chǎn)生和/或優(yōu)化抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，從而提供或增強(qiáng)豬抗感染性生物體感染的保護(hù)能力，該疫苗包括與適當(dāng)?shù)妮d體和賦形劑配制的至少一種穩(wěn)定整合了至少一種異源核苷酸序列的重組豬腺病毒載體。優(yōu)選地，該核苷酸序列能表達(dá)抗原多肽或免疫增強(qiáng)分子。更優(yōu)選地，該異源核苷酸序列可編碼和/或表達(dá)抗原多肽和免疫增強(qiáng)分子。優(yōu)選地，由至少一種核苷酸序列編碼的抗原多肽對(duì)宿主載體來說是異源的。至少一種核苷酸序列可與啟動(dòng)子/先導(dǎo)序列和polyA序列相連。重組疫苗可包含活的重組豬腺病毒載體，其中病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白與產(chǎn)生重組豬腺病毒的天然豬腺病毒中的病毒粒子結(jié)構(gòu)蛋白相比并未改變。用于重組疫苗的優(yōu)選載體候選者是血清型3和4的PAV分離株。根據(jù)牲畜中存在的免疫及其環(huán)境也可使用其它血清型。該疫苗可以是針對(duì)由多種病原體引起的呼吸及腸道感染的。為使疫苗針對(duì)特定的感染性生物體，可將編碼感染性生物體的抗原決定簇的異源基因序列整合入含有載體的豬腺病毒基因組的非必需區(qū)。如果要使疫苗用于優(yōu)化抵抗疾病的保護(hù)，適當(dāng)?shù)漠愒春塑账嵝蛄锌梢允悄切┚幋a免疫增強(qiáng)劑如細(xì)胞因子或生長促進(jìn)劑的序列。疫苗可包含其它組分，例如穩(wěn)定劑、賦形劑、其它藥學(xué)上可接受的化合物或任何其它抗原或其部分。疫苗可以是凍干制劑或懸浮制劑的形式，所有這些形式在疫苗生產(chǎn)的領(lǐng)域中都是常見的。用于例如疫苗的適當(dāng)載體可以是等滲的緩沖鹽溶液。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面中，提供制備疫苗的方法，該疫苗用于產(chǎn)生和/或優(yōu)化抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫從而誘導(dǎo)或增強(qiáng)豬抗感染性生物體的保護(hù)，該方法包括構(gòu)建穩(wěn)定整合了至少一種異源核苷酸序列的重組豬腺病毒載體，并將上述重組的豬腺病毒載體置于適合進(jìn)行給藥的形式中。優(yōu)選地，核苷酸序列能表達(dá)抗原多肽，盡管它也可表達(dá)免疫增強(qiáng)分子。更優(yōu)選地，核苷酸序列可編碼和/或表達(dá)抗原多肽和免疫增強(qiáng)分子。核苷酸序列對(duì)于宿主載體是異源的為宜。進(jìn)一步更優(yōu)選地，核苷酸序列與啟動(dòng)子/先導(dǎo)序列和polyA序列相連。給藥形式可以是腸衣劑量單位，用于腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下給藥的接種物，噴霧劑，通過口服或鼻內(nèi)使用的劑型。還可以在飲用水或飼料塊中進(jìn)行給藥。在本發(fā)明的另一方面中，提供產(chǎn)生豬腺病毒疫苗載體的方法，該方法包括在豬腺病毒中插入至少一種異源核苷酸序列。優(yōu)選地，上述異源核苷酸序列能表達(dá)抗原多肽，盡管它還可表達(dá)免疫增強(qiáng)分子。更優(yōu)選地，核苷酸序列可編碼和/或表達(dá)抗原多肽和免疫增強(qiáng)分子。優(yōu)選地，由至少一種核苷酸序列編碼的抗原多肽對(duì)于宿主載體是異源的。更優(yōu)選地，異源核苷酸序列與啟動(dòng)子/先導(dǎo)序列和polyA序列相連。在構(gòu)建適當(dāng)載體的一個(gè)方法中，要進(jìn)行改變以整合外源DNA的非必需區(qū)可通過同源重組來進(jìn)行構(gòu)建。通過此方法，非必需區(qū)得到克隆并且外源DNA與啟動(dòng)子、先導(dǎo)序列和多聚腺苷酸化序列優(yōu)選地通過同源重組插入到側(cè)翼序列之間。通過此方法還可使非必需區(qū)部分缺失創(chuàng)造出適于超出了病毒的一般包裝限制的更大DNA插入體的額外空間。通過此方法，含有適當(dāng)?shù)腜AV啟動(dòng)子及外源基因序列及先導(dǎo)序列和多聚腺苷酸化識(shí)別序列的DNA表達(dá)盒可通過盒側(cè)翼的使之易于插入PAV基因組的單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)來進(jìn)行構(gòu)建。在本發(fā)明的另一方面中，提供將本發(fā)明的疫苗進(jìn)行給藥的策略。在一個(gè)策略中，異源抗原和免疫調(diào)節(jié)分子如細(xì)胞因子可在同一重組體中表達(dá)并作為單一的疫苗進(jìn)行傳遞。在根據(jù)本發(fā)明所述的一個(gè)策略中，基于PAV載體的疫苗可以以“雞尾酒”的形式進(jìn)行給藥，其中包含2種或多種帶有不同外源基因或免疫增強(qiáng)劑的病毒載體。在本發(fā)明優(yōu)選的接種策略中，“雞尾酒”或同時(shí)策略，使用基于PAV血清型3和血清型4的疫苗。在另一個(gè)優(yōu)選的策略中，構(gòu)建基本的重組血清型3豬腺病毒，并用血清型4的纖維基因代替血清型3中的纖維基因或?qū)⒀逍?的纖維也克隆入疫苗中從而擴(kuò)大了本發(fā)明的靶向傳遞范圍，可同時(shí)傳遞到腸及呼吸系統(tǒng)。在根據(jù)本發(fā)明所述的另一個(gè)策略中，基于PAV載體的疫苗可進(jìn)行連續(xù)給藥，在進(jìn)行首次PAV接種之后的某個(gè)階段接種加強(qiáng)疫苗或新的疫苗。優(yōu)選地，所用的疫苗基于異源PAV分離株。在“連續(xù)”策略的優(yōu)選形式中，選擇那些基于不相關(guān)的血清型分離株的疫苗從而獲得抵抗感染的最大保護(hù)效應(yīng)。在這一策略的一個(gè)例子中，使基于PAV血清型3的疫苗在接種基于PAV血清型4的疫苗之前或之后進(jìn)行給藥。根據(jù)本發(fā)明便于對(duì)豬在任何年齡進(jìn)行載體疫苗的接種?？稍谛∝i一天大的時(shí)候進(jìn)行接種，對(duì)繁殖的豬可在晚至生育及生育以后有規(guī)律地進(jìn)行接種。優(yōu)選地，不論根據(jù)連續(xù)給藥策略還是雞尾酒策略，豬都是在仍不具有充分的免疫活性時(shí)進(jìn)行接種的。更方便地，一天大的豬可在首次接種的4周以后再進(jìn)行接種以保護(hù)豬來抵抗重復(fù)感染。在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供在豬中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括將有效量的本發(fā)明的重組疫苗對(duì)豬進(jìn)行給藥。有效量是足以引起免疫應(yīng)答的量，優(yōu)選地為每劑至少104TCID50。本發(fā)明的疫苗當(dāng)然還可在給藥時(shí)與抗其它病毒或生物體如細(xì)小病毒或假狂犬病的疫苗相結(jié)合。在本發(fā)明此實(shí)施方案的優(yōu)選方面中，給藥是通過口服或鼻內(nèi)使用來進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建或檢測重組載體和疫苗的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。內(nèi)切酶消化、連接和電泳的常規(guī)方法按照制造商或供應(yīng)商的說明來進(jìn)行。對(duì)常規(guī)技術(shù)不再進(jìn)行詳述，它們?yōu)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。附圖簡述圖1表示PAV血清型3整個(gè)基因組的DNA限制性內(nèi)切酶圖譜。圖2表示PAV血清型3的序列特性和主要晚期啟動(dòng)子及剪接先導(dǎo)序列的克隆。圖3表示主要晚期啟動(dòng)子的序列、上游增強(qiáng)子序列和剪接先導(dǎo)序列1、2和3。圖4表示基因組右手端末端720個(gè)堿基。圖5表示E3的啟動(dòng)子區(qū)和重疊的L4區(qū)。圖6表示構(gòu)建PAV載體的優(yōu)選方法。圖7表示用基于PAV的疫苗接種的豬在用CSFV抗原攻擊后的體溫值。圖8圖示通過ELISA檢測的在用基于PAV的疫苗接種之前和之后的豬中的抗PAV的抗體水平。圖9圖示用基于PAV的疫苗接種的豬在用CSFV抗原攻擊之前和之后的中和抗體的發(fā)展。圖10圖示用表達(dá)豬G-CSF的重組PAV疫苗接種的豬中的平均白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)。圖11圖示用表達(dá)豬G-CSF的重組PAV疫苗接種后的白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)的變化百分率。圖12圖示用重組PAV-G-CSF接種后的單核細(xì)胞群的變化百分率。圖13圖示用重組PAV-G-CSF接種后的淋巴細(xì)胞群的變化百分率。圖14圖示用重組PAV-G-CSF接種后的T細(xì)胞刺激的變化。優(yōu)選的實(shí)施方案現(xiàn)在討論本發(fā)明基于PAV血清型3和血清型4分離株的優(yōu)選實(shí)施方案。盡管由于在豬中發(fā)生感染的位點(diǎn)而選出這兩個(gè)分離株，應(yīng)當(dāng)理解如果符合上述選擇標(biāo)準(zhǔn)，其它豬腺病毒的分離株可能會(huì)更適合疫苗載體的構(gòu)建。一般地，認(rèn)為PAV的致病性較低在本領(lǐng)域中不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。PAV的致病性程度在Derbyshire，1989中進(jìn)行了綜述。對(duì)PAV分離的首次報(bào)道是來自患有腹瀉的12天齡的豬(Haig等，1964)。兩年以后，4型PAV被首次報(bào)道，它是從患有由未知原因引起的腦炎的豬的腦中分離的(Kasza，1966)。更晚一些的報(bào)道將PAV主要與本領(lǐng)域中的腹瀉關(guān)聯(lián)起來，盡管這一般是低水平的。PAV也可規(guī)律地從健康沒有疾病體征的動(dòng)物中分離出來，它從患病動(dòng)物中的分離很可能是與其流行性的巧合而不是作為致病性的指示物。然而，已有報(bào)道稱在血清型4和呼吸疾病之間有關(guān)聯(lián)(Watt，1978)，并且還有實(shí)驗(yàn)感染支持此結(jié)論(Edington等，1972)。用病毒的胃腸血清型(例如血清型3)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)感染產(chǎn)生了腹瀉，但所產(chǎn)生的病理改變?cè)谂R床上并不顯著。通過傳統(tǒng)方法可確定所選的PAV血清型3基因組的特性。完整基因組的DNA限制性內(nèi)切酶圖譜如圖1所示。基因組的方向是從左向右。按約定腺病毒基因組一般如此定向，不合成晚期mRNA轉(zhuǎn)錄物的末端區(qū)域位于左端。用于產(chǎn)生圖譜的酶在每張圖的邊緣列出。PAV血清型3的主要晚期啟動(dòng)子(MLP)和剪接先導(dǎo)序列(LS)的鑒定PAVMLP的鑒定和克隆通過使用限制性酶和PAV血清型3基因組的遺傳學(xué)圖，得以定位含有MLP和先導(dǎo)序列的區(qū)域(圖1)。將在此區(qū)域中鑒定的片段克隆入質(zhì)粒載體中并測序。MLP啟動(dòng)子序列被鑒定為含有經(jīng)典的在測序的區(qū)域中是唯一的TATA序列及上游因子，然后通過先導(dǎo)序列和轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的定位得到確證。圖2和圖3說明了PAV血清型3的主要晚期啟動(dòng)子和剪接先導(dǎo)序列的序列特性。為測定剪接到晚期mRNA的先導(dǎo)序列的結(jié)構(gòu)和序列，用PAV感染豬腎細(xì)胞并使感染進(jìn)行到感染周期的晚期(經(jīng)常為20-24小時(shí)p.i.)。此時(shí)用RNAgents總RNA純化試劑盒(Promega)從感染細(xì)胞中純化總RNA。將分離的RNA用異丙醇沉淀并于-70℃貯存于200μl等分試樣中直至使用時(shí)。通過使用PolyAT序列系統(tǒng)(Promega，美國)從總RNA中分離PolyA(mRNA)。分離的mRNA用于產(chǎn)生cDNA。為產(chǎn)生cDNA，制備了六鄰體基因和五鄰體堿基基因互補(bǔ)鏈的寡核苷酸，上述兩個(gè)基因都是MLP的轉(zhuǎn)錄本。進(jìn)一步制備了覆蓋所提出的主要晚期轉(zhuǎn)錄本的加帽位點(diǎn)、TATA盒下游的24個(gè)堿基的寡核苷酸。該寡核苷酸用于與在Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中用來產(chǎn)生cDNA的寡核苷酸聯(lián)合使用。用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶瘡年栃钥寺‘a(chǎn)生的DNA從而測定插入片段的大小。用改良的鏈終止測序法對(duì)這些插入片段進(jìn)行DNA測序(Sanger，F(xiàn).，Nichlen，S和Gulson，A.R.，1977，用鏈終止抑制劑進(jìn)行DNA測序美國國家科學(xué)院院報(bào)745463-5467)，從而進(jìn)行TaqDNA聚合酶延伸(Promega，美國)。為確認(rèn)先導(dǎo)序列的加帽位點(diǎn)，制備新鮮的cDNA并在此時(shí)將dGTP殘基尾巴加入其中。簡言之，使cDNA與1mMdGTP和大約15單位的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Promega)在2mMCaCl2緩沖液中于37℃溫育60分鐘。通過加熱到70℃持續(xù)10分鐘來終止反應(yīng)。然后用乙醇沉淀DNA并將其重懸于適合用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的體積中。用在5’端具有XbaI位點(diǎn)的poly(dC)寡核苷酸按照前面所描述的過程進(jìn)行PCR。在過量的核苷酸存在下通過T4DNA聚合酶于37℃作用30分鐘使得到的片段變?yōu)槠蕉瞬⑵淇寺∪雙UC18載體的SmaI位點(diǎn)。如上所述在通過雜交顯示為陽性的克隆上進(jìn)行DNA制備和測序。圖3表示從cDNA研究中確定的包括主要晚期啟動(dòng)子、上游增強(qiáng)子序列和剪接先導(dǎo)序列1、2和3的各個(gè)序列。圖2表示完整的啟動(dòng)子盒及與之相連接的組分的DNA序列。病毒基因組非必需區(qū)的鑒定通過對(duì)約1.8Kbp的PAV血清型3的ApaI片段進(jìn)行克隆和完全測序來鑒定右端。通過比較RHE序列和左手端的序列測定了反向末端重復(fù)序列(ITR)。ITR有144個(gè)堿基長并且代表起點(diǎn)，在其中可進(jìn)行插入。圖4表示末端720堿基的序列。用來插入外源DNA的目的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)在末端序列中已標(biāo)明。鑒定了E4啟動(dòng)子的推定的TATA位點(diǎn)，這是用來插入的可能位點(diǎn)的最左端。起始的插入可在SmaI或EcoRI位點(diǎn)進(jìn)行。已將該基因組的E3區(qū)(也是非必需區(qū)域)定位并克隆。已鑒定出E3區(qū)的啟動(dòng)子，重疊的L4區(qū)已被測序(圖5)。L4多腺苷酸化信號(hào)后的E3區(qū)也是可能的插入位點(diǎn)，也可用于缺失來為更大的盒插入創(chuàng)造更大的空間。PAV載體的構(gòu)建圖6說明了構(gòu)建PAV載體的一種優(yōu)選方法。克隆PAV血清型3的右手端ApaI片段J并將唯一的距離反向重復(fù)序列230bp的SmaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)用作插入位點(diǎn)。將經(jīng)典豬霍亂病毒(豬瘟病毒)的含有E2(gp55)基因的主要晚期啟動(dòng)子表達(dá)盒克隆入RHE片段的SmaI位點(diǎn)。同源重組的優(yōu)選方法是用HpaI(基因組中單一位點(diǎn))切割PAV3的基因組DNA，并用以ApaI切割的含有g(shù)p55的表達(dá)盒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染此DNA。通過常規(guī)的氯化鈣沉淀技術(shù)將DNA混合物優(yōu)選地轉(zhuǎn)染入初級(jí)豬腎細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染的優(yōu)選方法是通過在基因組PAV3和質(zhì)粒之間的同源重組產(chǎn)生重組病毒(圖6)。發(fā)明詳述PAV載體的構(gòu)建下列實(shí)施例表示本發(fā)明中具代表性的重組豬腺病毒的構(gòu)建。重組病毒在初級(jí)豬腎細(xì)胞上繁殖并測定滴度。1.PAV-gp55的構(gòu)建將含有豬腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、經(jīng)典豬霍亂病毒(CSFV)基因(gp55)和SV40polyA的表達(dá)盒插入豬腺病毒血清型3的右手端(MU97-99.5)的SmaI位點(diǎn)并用于在豬初級(jí)腎細(xì)胞中產(chǎn)生重組的PAV3。表達(dá)盒的大小是2.38kb。在PAV3的基因組中未產(chǎn)生缺失。具有中等基因組(～36kb)的哺乳動(dòng)物腺病毒已表現(xiàn)出最多能容納野生型基因組長度的105％，大于此大小的基因組不能包裝或極為不穩(wěn)定，常常會(huì)發(fā)生DNA重排(Betts，Prevec和Graham，病毒學(xué)雜志67，5911-5921，(1993)，人腺病毒5型載體的包裝能力和穩(wěn)定性Parks和Graham，病毒學(xué)雜志，71，3293-3298，(1997)，產(chǎn)生腺病毒載體的輔助病毒依賴系統(tǒng)有助于確定有效DNA包裝的下限)。在本發(fā)明中，PAV基因組的長度為34.8kb，其中插入了2.38kb的表達(dá)盒而沒有任何其它缺失。得到的本發(fā)明的重組豬腺病毒的基因組DNA長度為106.8％，從而超過了所推定的構(gòu)建穩(wěn)定重組體的最大限度。重組病毒經(jīng)噬斑純化3次并在初級(jí)豬腎細(xì)胞中穩(wěn)定傳代。通過Southern印跡雜交顯示出重組體含有g(shù)p55。通過用重組豬腺病毒感染在蓋玻片上生長的初級(jí)PK細(xì)胞系證明了gp55的表達(dá)。24小時(shí)后，免疫熒光染色(IF)顯示出表達(dá)gp55的感染細(xì)胞。2.重組PAV-G-CSF的構(gòu)建將含有豬腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、編碼豬粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的基因和SV40polyA的表達(dá)盒插入豬腺病毒血清型3的右手端(MU97-99.5)的SmaI位點(diǎn)并用于在豬初級(jí)腎細(xì)胞中產(chǎn)生重組的PAV3。表達(dá)盒的大小是1.28kb。在PAV3的基因組中未制造缺失。將重組病毒進(jìn)行噬斑純化2次并在初級(jí)豬腎細(xì)胞中穩(wěn)定傳代。通過Southern印跡雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)表明重組體含有G-CSF。通過用重組的PAV-G-CSF感染初級(jí)腎細(xì)胞證明了G-CSF的表達(dá)。然后將來自感染的初級(jí)腎細(xì)胞的組織培養(yǎng)上清液在SDS-PAGE中進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移到膜上。在Western印跡中用抗純化重組大腸桿菌表達(dá)的豬G-CSF的兔多克隆抗血清來檢測表達(dá)G-CSF的感染細(xì)胞。3.重組PAV-gp55T/GM-CSF的構(gòu)建將含有豬腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、與編碼豬粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)全長或其成熟形式的基因同閱讀框融合的經(jīng)典豬霍亂病毒基因gp55的截短形式和SV40polyA的表達(dá)盒插入豬腺病毒血清型3的右手端(MU97-99.5)的SmaI位點(diǎn)并用于在豬初級(jí)腎細(xì)胞中產(chǎn)生重組的PAV3。表達(dá)盒的大小是2.1kb。在PAV3的基因組中未制造缺失。將重組病毒進(jìn)行噬斑純化2次并且通過PCR表明含有g(shù)p55和GM-CSF。4.重組PAV-gp55/E3的構(gòu)建將含有豬腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、經(jīng)典豬霍亂病毒基因gp55和SV40polyA的表達(dá)盒插入豬腺病毒血清型3的E3區(qū)(MU81-84)的BsrgI/SnaBI位點(diǎn)之間并用于在豬初級(jí)腎細(xì)胞中產(chǎn)生重組的PAV3。表達(dá)盒的大小是2.38kb。在PAV3的基因組中制造620個(gè)堿基對(duì)的缺失。將重組病毒進(jìn)行噬斑純化2次并且通過PCR表明含有g(shù)p55。接種策略1.接種PAV-gp55在此實(shí)驗(yàn)中用5-6周齡的小豬來代表具免疫力正常的豬。對(duì)一組小豬(#2，6和7)接種重組的PAV-gp55，以每只小豬1×107pfu的劑量進(jìn)行皮下給藥。對(duì)照組的小豬(#3，8，11，12，13和14)不進(jìn)行接種。在接種組的小豬中未觀察到臨床體征(體溫沒有升高)(表1)。表1接種rPAV∷gp55的豬的體溫用重組的PAV-gp55接種5周后以致命劑量(1×103.5TCID50)的毒性豬瘟病毒(經(jīng)典豬霍亂病毒)以皮下給藥的方式攻擊這兩組豬。監(jiān)測豬的體溫，結(jié)果在表2中列出并在圖7中以圖形的方式顯示。表2用CSFV攻擊后的體溫(℃)結(jié)果表明到第5天對(duì)照組體溫升高(高于40.5℃)并表現(xiàn)出疾病的臨床體征。接種組未表現(xiàn)出疾病的臨床體征。到第9天對(duì)照組的豬死亡或被進(jìn)行安樂死。接種組的豬到第16天進(jìn)行安樂死。在后期所有對(duì)照組的豬表現(xiàn)出嚴(yán)重的臨床疾病，而接種組的豬未表現(xiàn)出疾病的臨床體征。結(jié)果表明皮下接種重組PAV-gp55的豬能在致死劑量的經(jīng)典豬霍亂病毒攻擊下存活。收集兩組豬的血清并用ELISA檢測抗PAV抗體的存在。這些檢測表明在接種之前就預(yù)先存在抗PAV的抗體。這些抗體的水平在接種重組PAV-gp55后28到36天后上升到頂峰。這些結(jié)果在圖8中列出。在用CSFV攻擊之前和之后收集接種組的血清并檢測CSFV的中和性抗體的存在。在接種重組PAV-gp55后的第0天和第28天(攻擊前)檢測血清，然后再在攻擊后的第16天(接種后第52天)檢測血清。圖9中的結(jié)果表明在第0天未檢測到中和性抗體，在第28天檢測到低水平的中和性抗體，在第52天檢測到高水平的抗體。這些結(jié)果表明重組PAV-gp55能在抗PAV的抗體預(yù)先存在時(shí)保護(hù)豬抵抗致命攻擊。2.接種PAV-G-CSF在此實(shí)驗(yàn)中用5-6周齡的小豬來代表具免疫力正常的豬。對(duì)一組小豬(n＝4)接種重組的PAV-G-CSF，以每只小豬1×107pfu的劑量進(jìn)行皮下給藥。對(duì)第二組小豬(n＝4)接種野生型(wt)PAV，以每只小豬1×107pfu的劑量進(jìn)行皮下給藥。對(duì)照組小豬(n＝4)不進(jìn)行接種。在接種后的104小時(shí)內(nèi)每間隔8小時(shí)給豬放一次血。測定全血計(jì)數(shù)并監(jiān)測每組的平均白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)。這些結(jié)果在圖10中表示，平均WBC計(jì)數(shù)的變化百分率在圖11中表示。接種PAVwt或PAV-G-CSF的小豬在接種后24-72小時(shí)表現(xiàn)出輕微腹瀉的疾病臨床體征。兩組小豬在接種后80-96小時(shí)都完全恢復(fù)。對(duì)照組的豬未表現(xiàn)出疾病的臨床體征。全血篩選結(jié)果表明對(duì)照組豬的平均WBC計(jì)數(shù)在實(shí)驗(yàn)過程中有所升高。接種PAVwt的豬也顯示白細(xì)胞記數(shù)增加在接種后48-80小時(shí)白細(xì)胞降低，在80-96小時(shí)開始恢復(fù)。接種重組PAV-G-CSF的豬的WBC計(jì)數(shù)在實(shí)驗(yàn)過程中有顯著下降。這些結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析在表3中列出。分析表明平均WBC計(jì)數(shù)之間的差異(對(duì)照與PAV-G-CSF；PAVwt與PAV-G-CSF)是顯著的，這說明重組PAV-G-CSF改變了與免疫相關(guān)細(xì)胞的比例。表3接種野生型(wt)PAV、重組表達(dá)G-CSF的PAV(PAV-G-CSF)或未接種的對(duì)照豬小組的平均WBC計(jì)數(shù)之間的t-檢驗(yàn)結(jié)果a零假設(shè)；在平均WBC計(jì)數(shù)之間無差異。bp＞0.05，在95％的置信水平不足以反對(duì)零假設(shè)，得出結(jié)論在平均白細(xì)胞水平之間無差異。cp＜0.05，在95％的置信水平反對(duì)零假設(shè)，得出結(jié)論在平均白細(xì)胞水平之間有差異。d每組中的4只小豬每隔8小時(shí)進(jìn)行采血。還監(jiān)測了每個(gè)組測定了白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。平均單核細(xì)胞群的變化百分率在圖12中表示，平均淋巴細(xì)胞群的變化百分率在圖13中表示。圖12顯示出豬中的單核細(xì)胞群在接種PAVwt后快速增加，但在接種重組體的PAV-G-CSF之后減少。此效應(yīng)是因?yàn)橛芍亟M體產(chǎn)生的G-CSF的表達(dá)。這些結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析在表4中列出。分析表明在接種后32到96小時(shí)在PAVwt與PAV-G-CSF之間有顯著差異。圖13顯示出接種重組PAV-G-CSF之后淋巴細(xì)胞群數(shù)目有變化。未接種的對(duì)照在實(shí)驗(yàn)過程中表現(xiàn)出穩(wěn)定的淋巴細(xì)胞數(shù)目，而接種PAVwt的豬由于感染表現(xiàn)出淋巴細(xì)胞群的顯著增加。接種重組PAV-G-CSF的豬表現(xiàn)出淋巴細(xì)胞群體的減少。這些結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析在表5中列出。分析表明在接種后8到96小時(shí)在PAVwt和重組PAV-G-CSF之間有顯著差異。接種重組PAV-G-CSF和PAVwt后在淋巴細(xì)胞增殖中的不同應(yīng)答是因?yàn)橛芍亟M體產(chǎn)生的G-CSF的表達(dá)。這些結(jié)果表明接種重組PAV-G-CSF導(dǎo)致與免疫相關(guān)的細(xì)胞亞群發(fā)生變化。表4在接種重組PAV-G-CSF、野生型PAV(PAVwt)的豬或未接種的對(duì)照豬的平均單核細(xì)胞群間的t-檢驗(yàn)結(jié)果a零假設(shè)；在平均單核細(xì)胞計(jì)數(shù)之間無差異。bp＞0.1，在90％的置信水平不足以反對(duì)零假設(shè)，得出結(jié)論在平均單核細(xì)胞水平之間無差異。cp＜0.05，在95％的置信水平反對(duì)零假設(shè)，得出結(jié)論在平均單核細(xì)胞水平之間有差異。d每組中的4只小豬每隔8小時(shí)進(jìn)行采血。表5在接種重組PAV-G-CSF、野生型PAV(PAVwt)的豬或未接種的對(duì)照豬的平均淋巴細(xì)胞群間的t-檢驗(yàn)結(jié)果</tables>a零假設(shè)；在平均WBC計(jì)數(shù)之間無差異。bp＞0.05，在95％的置信水平不足以反對(duì)零假設(shè)，得出結(jié)論在平均白細(xì)胞水平之間無差異。cp＜0.05，在95％的置信水平反對(duì)零假設(shè)，得出結(jié)論在平均白細(xì)胞水平之間有差異。d每組中的4只小豬每隔8小時(shí)進(jìn)行采血。圖14是圖示在用伴刀豆凝集素A(ConA)刺激后每組T細(xì)胞增殖的變化。這些結(jié)果確證在接種PAVwt后2天出現(xiàn)T細(xì)胞的顯著增殖，而接種重組PAV-G-CSF則在第3天導(dǎo)致T細(xì)胞增殖的下降。接種表達(dá)豬G-CSF的重組PAV的結(jié)果表明G-CSF對(duì)細(xì)胞的免疫應(yīng)答有顯著效應(yīng)?？梢岳斫怆m然本說明書確定了本發(fā)明的界限和范圍，所有在此范圍內(nèi)的實(shí)施方案例如異源基因、插入位點(diǎn)、啟動(dòng)子類型和血清型不必要都在這里特別舉出，盡管按照本發(fā)明它們應(yīng)在保護(hù)范圍之內(nèi)。圖2包括加入的USF5’(上游)核苷酸的PAV主要晚期啟動(dòng)子盒的全序列。核苷酸堿基記數(shù)76A，143C，187G，96T，總共502bp。1GGTGCCGCGGTCCTCGGCGTAGAGGATCAGGGCCCAGTCGGAGATGAAGGCACGCGCCCA61GGCGAGGACGAAGCTGGCGACCTGCGAGGGGTAGCGGTCGTTGGGCACTAATGGCGAGGC121CTGCTCGAGCGTGTGGAGACAGAGGTCCTCGTCGTCCGCGTCCAGGAAGTGGATTGGTCG181CCAGTGGTAGTCCACGTGACCGGCTTGCGGGTCGGGGGGTATAAAAGGCGCGGGCCGGGG241TGCGTGGCCGTCGTTGCTTCGCAGGCCTCCTCACCGGAGTCCGCGTCTCCGGCGTCTCG3O1CGCTGCGGCTGCATCTGTGGTCCCGGAGTCTTCAGGTCCTTGTTGAGGAGGTACTCCTGA361TCGCTGTCCCAGTACTTGGCGTGTGGGAAGCCGTCCTGATCGCGATCCTCCTGCTGTTGC421AGCGCTTCGGCAAACACGCGCACCTGCTCTTCGGACCCGGCGAAGCGTTCGACGAAGGCG481TCTAGCCAGCAACAGTCGCAAG上游刺激因子(USF)和TATA基元用黑體表示。完整的先導(dǎo)序列用斜體表示，各個(gè)先導(dǎo)序列之間的加帽位點(diǎn)和剪接位點(diǎn)分別用雙下劃線或單下劃線標(biāo)出。圖3啟動(dòng)子盒成分的各個(gè)序列I.包含在長盒中的5’(上游)序列1GGTGCCGCGGTCGTCGGCGTAGAGGATGAGGGCCCAGTCGGAGATGAAGGCACGCGCCCA61GGCGAGGACGAAGCTGGCGACCTGCGAGGGGTAGCGGTCGTTGGGCACTAATGGCGAGGC121CTGCTCGAGCGTGTGGAGACAGAGGTCCTCGTCGTCCGCGTCCAGGAAGTGGATTGGTCG181CCAGTGGTAGII.包括USF、TATA基元和加帽位點(diǎn)序列的序列1CCACGTGACCGGCTTGCGGGTCGGGGGGTATAAAAGGCGCGGGCCGGGGTGCGTGGCCGT61CIII.第一先導(dǎo)序列1AGTTGCTTCGCAGGCCTCGTCACCGGAGTCCGCGTCTCCGGCGTCTCGCGCTGCGGCTGC61ATCTGTGGTCCCGGAGTCTTCAGIV.第二先導(dǎo)序列1GTCCTTGTTGAGGAGGTACTCCTGATCGCTGTCCCAGTACTTGGCGTGTGGGAAGCCGTC61CTGATCGV.第三先導(dǎo)序列1CGATCCTCCTGCTGTTGCAGCGCTTCGGCAAACACGCGCACCTGCTCTTCGGACCCGCCG61AAGCGTTCGACGAAGGCGTCTAGCCAGCAACAGTCGCAAG圖4PAV基因組的右手端序列，此區(qū)域是計(jì)劃插入表達(dá)盒的位點(diǎn)。核苷酸堿基記數(shù)183A，255C，306G，204T，總共948bp。反向末端重復(fù)序列(ITR)用黑體顯示。相關(guān)酶位點(diǎn)用下劃線注明，酶的名稱標(biāo)在下方。圖中還顯示了E4區(qū)推定的TATA。權(quán)利要求1.一種能表達(dá)目的DNA的重組豬腺病毒，該目的DNA穩(wěn)定整合到所述重組豬腺病毒基因組的適當(dāng)位點(diǎn)。2.一種重組載體，包括穩(wěn)定整合并能表達(dá)目的DNA的重組豬腺病毒。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其中所述重組豬腺病毒能表達(dá)至少一種異源核苷酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組載體，其中所述重組豬腺病毒包括與所述重組豬腺病毒來源的天然豬腺病毒的病毒粒子相比結(jié)構(gòu)蛋白未改變的活的豬腺病毒。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組載體，其中所述至少一種異源核苷酸序列能表達(dá)成抗原多肽。6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組載體，其中所述至少一種異源核苷酸序列能表達(dá)成免疫增強(qiáng)分子。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼在豬中引發(fā)腸道疾病的感染體的抗原決定簇。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼在豬中引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病的感染體的抗原決定簇。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼假狂犬病病毒(Aujeszky’s病病毒)的抗原決定簇。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組載體，其中異源序列編碼假狂犬病病毒的糖蛋白D的抗原決定簇。11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼豬呼吸和生殖綜合癥病毒(PRRSV)的抗原決定簇。12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼豬瘟病毒的抗原決定簇。13.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼豬細(xì)小病毒的抗原決定簇。14.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼豬冠狀病毒的抗原決定簇。15.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼豬輪狀病毒的抗原決定簇。16.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼豬副流感病毒的抗原決定簇。17.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼肺炎支原體的抗原決定簇。18.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼FLT-3配體。19.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼白介素3(IL-3)。20.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼豬白介素4(IL4)。21.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼γ干擾素(γIFN)。22.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼豬粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。23.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼豬粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)24.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組載體，其中所述異源核苷酸序列編碼抗原多肽和免疫增強(qiáng)分子。25.根據(jù)權(quán)利要求2到24中任一項(xiàng)所述的重組載體，其中所述重組豬腺病毒選自血清型3和4。26.根據(jù)權(quán)利要求2到25中任一項(xiàng)所述的重組載體，其中目的DNA穩(wěn)定整合到豬腺病毒基因組的非必要區(qū)。27.根據(jù)權(quán)利要求2到26中任一項(xiàng)所述的重組載體，其中目的DNA穩(wěn)定整合到基因組的右手端。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的重組載體，其中目的DNA在圖距單位97到99.5穩(wěn)定整合到基因組右手端。29.根據(jù)權(quán)利要求2到26中任一項(xiàng)所述的重組載體，其中目的DNA穩(wěn)定整合到基因組的E3區(qū)。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的重組載體，其中目的DNA在圖距單位81-84穩(wěn)定整合到E3區(qū)。31.一種產(chǎn)生用作疫苗的重組豬腺病毒載體的方法，包括在豬腺病毒基因組的非必要區(qū)插入至少一種與有效啟動(dòng)子序列相連的異源核苷酸序列。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中在插入所述異源核苷酸序列之前，將限制性酶切位點(diǎn)插入到所述豬腺病毒基因組的所述非必要區(qū)。33.一種重組載體，用于產(chǎn)生和/或優(yōu)化抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，從而在豬中提供或增強(qiáng)抵抗感染體感染的保護(hù)，所述疫苗包括至少一種穩(wěn)定整合并能表達(dá)至少一種異源核苷酸序列的重組豬腺病毒載體，及適當(dāng)?shù)妮d體和/或賦形劑。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的重組疫苗，其中所述至少一種異源核苷酸序列能表達(dá)成抗原多肽。35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的重組疫苗，其中所述至少一種異源核苷酸序列能表達(dá)成免疫增強(qiáng)分子。36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的重組疫苗，其中所述異源核苷酸序列編碼抗原多肽和免疫增強(qiáng)因子。37.根據(jù)權(quán)利要求33到36中任一項(xiàng)所述的重組疫苗，其中選擇上述載體和/或賦形劑使所述疫苗以噴霧劑、腸衣劑量單位或接種體的形式來傳遞。38.根據(jù)權(quán)利要求33到36中任一項(xiàng)所述的產(chǎn)生重組疫苗的方法，包括將至少一種穩(wěn)定整合并能表達(dá)至少一種異源核苷酸序列的重組豬腺病毒載體與適當(dāng)?shù)妮d體和/或賦形劑混合。39.一種抗豬疾病的接種方法，包括給予所述豬第一種穩(wěn)定整合并能表達(dá)至少一種異源核苷酸序列的重組豬腺病毒載體，該序列編碼需免疫來抵抗的所述疾病的抗原決定簇。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，包括給予所述豬第二種豬腺病毒載體，該載體包括與整合到所述第一種重組豬腺病毒載體的所述至少一種異源核苷酸序列不同的至少一種異源核苷酸序列。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述第二種豬腺病毒載體包含與所述第一種豬腺病毒載體不同的血清型。42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述第二種豬腺病毒載體整合并能表達(dá)編碼免疫增強(qiáng)分子的至少一種異源核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及包括穩(wěn)定整合并能表達(dá)至少一種異源核苷酸序列的重組豬腺病毒的重組載體。核苷酸序列優(yōu)選地是編碼豬霍亂病毒或假狂犬病病毒的抗原決定簇的序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生重組載體的方法、制備基于載體的疫苗的方法、給藥策略及保護(hù)豬抵抗疾病的方法。文檔編號(hào)A61K39/00GK1275084SQ98809116公開日2000年11月29日申請(qǐng)日期1998年8月14日優(yōu)先權(quán)日1997年8月14日發(fā)明者M(jìn)·A·約翰遜,J·M·哈蒙德申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)和工業(yè)研究組織,豬研究開發(fā)公司