專利名稱：處理白細胞的方法、白細胞組合物及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及不能增殖但保留功能的細胞組合物，以及這些組合物的制備方法和應(yīng)用。更特別地，本發(fā)明涉及制備用于轉(zhuǎn)輸?shù)脑鲋骋种瓢准毎姆椒ā?br> 背景技術(shù)：
施行骨髓移植(BMT)治療多種惡性及非惡性血液病，包括白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、貧血和免疫缺陷病，如重度聯(lián)合免疫缺陷(SCTD)、維-奧二氏綜合征和再生障礙性貧血。
白血病是造血組織的惡性腫瘤。這些腫瘤可分為兩種主要的類型慢性和急性。急性白血病的特征在于未分化的細胞群體(例如，急性淋巴細胞性白血病(或“ALL”)和急性骨髓性白血病(或“AML”))，而慢性白血病通常顯示更成熟的形態(tài)學(xué)(例如，慢性髓細胞性白血病(或“CML”)和慢性淋巴細胞性白血病(或“CLL”))。美國1995年有大約25700例新的白血病病例，其中約4500例是CML。1996年美國診斷出大約7000例新的CML病例，其中約30％最終接受異體BMT(白血病協(xié)會白血病協(xié)會站點，1997)。預(yù)計約50％的BMT患者遭受白血病的復(fù)發(fā)。
白血病治療的一般目的在于抑制異常形態(tài)的增殖，并恢復(fù)骨髓中的“正常”血細胞生成。治療方案可包括化學(xué)治療、放射治療和骨髓移植的組合。在“屬”同種異體骨髓移植(異體BMT)方案中，首先給予白血病患者重度骨髓抑制劑量的化學(xué)放射治療。該治療階段用來根除所有白血病細胞及其先祖。抑制病理性造血生理學(xué)后，將功能上無作用的骨髓替換為同種異體無病的干細胞。在最佳條件下，移植的骨髓利于正常多克隆造血增殖的恢復(fù)。疾病控制的改善也依賴于移植物對白血病細胞的免疫介導(dǎo)的反應(yīng)，稱為移植物抗白血病(GVL)效應(yīng)。
骨髓不是造血祖細胞的唯一來源。外周血和臍血也可作為干細胞的來源。參見McCullough，新一代血液成分，輸血(Transfusion)35374(1995)?？上到y(tǒng)施用營養(yǎng)因子(如粒細胞-集落刺激因子)，來提高外周血干細胞的增殖，從而產(chǎn)生骨髓的替代品，用于收獲造血祖細胞。
遺憾地，成功BMT的主要障礙是移植物抗宿主疾病(GVHD)、感染和原發(fā)疾病的復(fù)發(fā)。GVHD和感染引起移植后前100天中10-30％的發(fā)病率和死亡率(《基礎(chǔ)與臨床免疫學(xué)》(Basic and ClinicalImmunology)，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(編)，Appleton & Lange，Norwalk CT，1994)。如果BMT失敗，殘余腫瘤細胞的無限制增殖可導(dǎo)致“復(fù)發(fā)”。參見Slavin等人，“用免疫活性淋巴細胞及其活化細胞因子對最小殘余疾病的免疫治療”，癌癥研究(Cancer Investigation)，10221(1992)。過去在這種情況下的醫(yī)學(xué)治療選擇非常有限。例如，第二次骨髓移植和/或細胞毒性藥物的廣泛應(yīng)用與極低的存活率相關(guān)。
然而，由對移植生物學(xué)的更充分的理解得出一種治療策略。對有或無T細胞排除下的BMT的研究顯示，對于能用于CML患者最小殘余疾病或“全面”復(fù)發(fā)的治療的抗白血病治療而言，T細胞是重要的?；谶@種理解，骨髓移植后用供體白細胞輸入(DLI)對白血病患者的治療成為一種公認的治療。參見Kolb等人，血液(Blood)762462(1990)；Lim，S H.等人，美國血液學(xué)雜志(Am.J.Hem.)5461-67，1997；Giralt，S.A.等人，腫瘤學(xué)現(xiàn)代觀點(Cur.Op.Onc.)889-95，1996。白細胞的轉(zhuǎn)輸也已被用作骨髓移植失敗后的過繼免疫治療，來誘導(dǎo)永久的緩解。參見，J.Mccullough，新一代血液成分，輸血，35374(1995)。DLI對于CML的治療特別有效，但也可用于AML、ALL和CLL的治療。DLI也已用于脊髓發(fā)育不良(MDS)、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病和多發(fā)性骨髓瘤的治療。輸入的細胞似乎引起對受體惡性細胞的免疫應(yīng)答。根據(jù)對bcr-abl重排(費城染色體)的PCR分析，大約70％的復(fù)發(fā)為慢性期的CML患者在DLI后達到持久的細胞遺傳免除，并成為殘余疾病陰性的(Drobyski，W.R.等人，血液822310-2318，1993)。
然而，該方法具有危險，因為患者中的80％發(fā)生GVHD，56％發(fā)生骨髓發(fā)育不良。這是治療失敗的兩個主要原因，導(dǎo)致可達20％的反應(yīng)患者的死亡(Champlin，R.等人，血液學(xué)學(xué)報(Act.Haemat.)95157-163，1996)。GVHD由轉(zhuǎn)輸?shù)腂MT或DLI中存在的供體T淋巴細胞引起，增殖并定居于宿主組織。一旦增殖，供體T細胞即攻擊宿主組織，引起病理癥狀。
DLI后疾病的根除被認為是由于移植物對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)，即GVL效應(yīng)(Barrett，J.等人，腫瘤學(xué)現(xiàn)代觀點，889-95，1996)。GVL效應(yīng)的機理尚未完全搞清。它是由來源于供體的T細胞實現(xiàn)的，因為T細胞排除的BMT導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)的更高發(fā)病率。免疫應(yīng)答是發(fā)生該效應(yīng)所必需的，與同種異體BMT相比，同源BMT后更高的復(fù)發(fā)率在實驗中證明了這一點(Duell，T.，國際醫(yī)學(xué)年報(Ann.Int.Med.)126184-192，1997)。在日本，人群的高均一性導(dǎo)致無效的DLI治療，因為隨機供體和宿主不是充分同種異體的(Takahashi，K.等人，柳葉刀(Lancet)343700-702，1994)。
臨床結(jié)果表明，GVL效應(yīng)可與致病性GVHD區(qū)分。用T細胞排除的同種異體BMT治療的患者比用BMT和標準GVHD預(yù)防治療的患者顯示更高的復(fù)發(fā)率，甚至當(dāng)控制GVHD發(fā)病率數(shù)時仍如此(Horowitz，M.M.等人，血液75555-562，1990)。也有許多報道的病例，觀察到CML的免除而沒有GVHD的發(fā)病(Duell，T.，國際醫(yī)學(xué)年報126184-192，1997)。在動物模型中，GVHD與GVL的區(qū)分是可實現(xiàn)的(參見，例如，Johnson，B.D.等人，骨髓移植(Bone Marrow Transplant.)11329-336，1993；Glass，B.等人，英國血液學(xué)雜志(Br.J.Hem.)93412-420，1996；Johnson，B.D.等人，血液853302-3312，1995)。
為了避免急性GVHD，用幾種技術(shù)清除在BMT中存在的供體T淋巴細胞或成熟淋巴細胞。然而，當(dāng)前沒有有效的骨髓處理來完全避免GVHD，因為在大多數(shù)情況下GVL效應(yīng)被減弱，導(dǎo)致更高的復(fù)發(fā)率(Kantarjian，H.M.等人，血液873069-3081，1996)。人及動物模型的某些實驗方法包括，T細胞亞群的排除，UVB照射(Greenfeld，J.I.等人，外科研究雜志(J.Sur.Res.)60137-141，1996)，或T細胞排除隨后再加入一定量的T細胞，滴定一定量T細胞的GVHD的缺乏(Drobyski，W.R.等人，血液，822310-2318，1993)。一種策略中，用一種“自殺基因”轉(zhuǎn)染供體T細胞，該基因是提供對藥物丙氧鳥苷的敏感性的皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因。如果觀察到GVHD癥狀，則給予患者丙氧鳥苷以在體內(nèi)消除T細胞，直到癥狀消退(Bordignon，C.等人，人類基因治療(Hum.Gen.Ther.)6813-819，1995；Bonini C.等人，科學(xué)(Science)2761719-1724，1997)。另一種“自殺基因”法應(yīng)用編碼凋亡信號傳遞蛋白(Ariad Pharmaceuticals)的FAS基因。在FAS系統(tǒng)中，用一種二聚劑如FK1012誘導(dǎo)FAS產(chǎn)生，殺傷表達該基因的供體細胞。
“自殺基因”法盡管從治療殘余癌癥后消除不需要的T細胞的觀點來看也許是有吸引力的，但也有許多明顯的缺點。首先，用GVHD癥狀作為開始藥物治療的信號。因此，GVHD應(yīng)能開始并必須可關(guān)閉。其次，用來消除T細胞的藥物必須全身施用，從而使整個身體與藥物接觸達到使GVHD受控所必需的一定時間。丙氧鳥苷具有毒性副作用，HSV-tk蛋白是免疫原性的。此外，因為需要保護患者免于GVHD的嚴重形式，所以免疫抑制預(yù)防仍是絕對必要的。同樣，在某些慢性GVHD例子中，證明丙氧鳥苷的施用不是完全有效的(Bonini C.等人，科學(xué)2761719-1724，1997)。這或許是由于該方法的防止誤解的說明，即只有增殖的細胞是丙氧鳥苷敏感的。此外，甚至增殖的細胞也能通過鄰近HSV-tk細胞附近存在的正常細胞提供的酶輔助而逃脫丙氧鳥苷的作用(Good Samaritan效應(yīng))。
對于FAS系統(tǒng)，缺點包括合成的困難以及誘導(dǎo)FAS產(chǎn)生的二聚劑的不溶性。二聚劑與宿主中FKBP蛋白的結(jié)合可限制可用的藥物。
此外，與基因治療有關(guān)的技術(shù)及實踐考慮使得難以實行和控制技術(shù)的應(yīng)用。轉(zhuǎn)染細胞的產(chǎn)生被低效率所困擾，這使當(dāng)出現(xiàn)GVHD跡象時，被處理細胞群體的均一性以及完全殺傷細胞的能力成為問題。細胞必須能增殖數(shù)周時間，這意味著在收獲細胞與轉(zhuǎn)染細胞可用于輸注的時間之間有一個延遲。最后，并且也是最重要地，輸入人體中的細胞可能含有修飾的遺傳物質(zhì)，它有可能對宿主長期具有有害作用。
電離輻射(γ-輻射或X-輻射)或UV線(UVCλ＝200-280nm；UVBλ＝280-320nm；UVAλ＝320-400nm)已被用來處理血液制品來誘導(dǎo)細胞中的DNA損傷。當(dāng)前公認的用于輸血相關(guān)的GVHD預(yù)防的方法是γ-輻射處理(2500 cGy)。用于防止TA-GVHD的γ-輻射的臨床劑量導(dǎo)致活T細胞減少105-106倍。然而，γ-輻射和電離輻射對于核酸通常不是特異的。由于其高能量，γ-輻射和UVC也攻擊蛋白質(zhì)和其它細胞成分，引起明顯的非特異性損傷(Deeg，H.J.等人，血細胞(Blood Cells)18151-162，1992)。為了防止GVHD，用UVB消除大鼠淋巴細胞的增殖而保留BM祖細胞和原始造血干細胞的生存力用于植入。在4000J/cm2的UVB處理劑量時，CTL活性降低但仍存在(Gowing，H.等人，血液871635-1643，1996)。然而，UVB輻射也導(dǎo)致明顯的細胞損傷，特別是當(dāng)使用寬發(fā)射光譜的燈時(Gowing，H.等人，血液871635-1643，1996；Pamphilon，A.A.等人，血液772072-2078，1991)。已經(jīng)報道了導(dǎo)致較低細胞生存力和免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的表面分子化學(xué)修飾和膜破裂，這或許是由于UVB誘導(dǎo)蛋白質(zhì)和脂類尤其不飽和鍵的化學(xué)改變的能力。這些限制是由于UVB不是只對核酸有選擇性，而是修飾吸收280-320nm的任何化學(xué)基團這一事實。
用于人白細胞處理、在光敏劑8-甲氧基補骨脂素(8-MOP)存在下的UVA輻射顯示，在體外混合淋巴細胞培養(yǎng)反應(yīng)中抑制外周血白細胞的刺激能力和增殖(Kraemer，K.H.等人，皮膚病學(xué)研究雜志(J.Inv.Derm.)77235-239，1981；Kraemer，K.H.等人，皮膚病學(xué)研究雜志7680-87，1981)。然而，如這些報道中所述，UVA加補骨脂素處理導(dǎo)致表面抗原表達、細胞因子合成(IL-1、IL-6、IL-8和INF)和細胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄的抑制(Gruner，S.等人，組織抗原(Tiss.Ant.)27147-154，1986；Neuner，P.等人，光化學(xué)與光生物學(xué)(Photochem.Photobiol.)59182-188，1994)。因此，以前的研究中所述的光化學(xué)處理(PCT)條件，盡管抑制增殖并減少非特異的細胞損傷，但也滅活T細胞的免疫功能；這些處理條件不可能為了轉(zhuǎn)輸目的，產(chǎn)生有效提供任何免疫保護或誘導(dǎo)GVL效應(yīng)的細胞。最后，對脾和髓細胞的UVA加8-MOP處理已成功地用于鼠模型中GVHD的降低(Ullrich，S.E.，皮膚病學(xué)研究雜志96303-308，1991)。如同以前所有報道一樣，該研究只針對供體白細胞的GVHD方面，而不為白細胞提供免疫保護或GVL功能。
顯然，存在對新方法的需要，來抑制同種異體組織相容性障礙間的GVHD誘導(dǎo)，而不需要與藥物的系統(tǒng)接觸。這種方法可對無免疫應(yīng)答的個體提供某種免疫保護，和/或允許對殘余癌的殺傷，但應(yīng)能防止輸入細胞在宿主中的增殖。
在此描述并要求專利保護的本發(fā)明，通過提供制備不誘導(dǎo)GVHD但保留白細胞功能的白細胞的方法，針對并克服了與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的這些和其它問題。通過以下的詳細描述，本發(fā)明的方法所具有的這種及其它優(yōu)點將是顯然的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種有效方法，用于處理同種異體供體的白細胞，從而產(chǎn)生不能增殖但保留生存力和有效促進疾病細胞或病原體破壞的免疫功能的白細胞。由于經(jīng)處理的白細胞不能增殖，所以當(dāng)引入同種異體宿主時它們不能誘導(dǎo)GVHD(在同源或自體輸血時，GVHD不是問題)，因此，它們能理想地用于對于多種臨床適應(yīng)癥尤其癌癥的治療的DLI中，以及為無免疫應(yīng)答的哺乳動物提供免疫功能。
本發(fā)明的多個方面包括下列方面一種分離的細胞群體，其含有一種白細胞群體，其中該白細胞群體的一部分是不增殖的，使得該細胞群體不能在同種異體宿主中引發(fā)移植物抗宿主疾病(GVHD)；并且該白細胞群體的一部分保留免疫學(xué)活性，包括促進疾病細胞或病原體破壞的能力。優(yōu)選地，該群體中至少90％的白細胞是不增殖的。
前述實施方案的白細胞群體的特征進一步在于1)優(yōu)選地包含T細胞、NK細胞和抗原呈遞細胞；2)經(jīng)適當(dāng)刺激后能合成和/或分泌細胞因子，如IL-2、IFN-γ、IL-10和GM-CSF；3)能表達特征為T細胞激活和免疫功能的表面標記，諸如尤其是CD4、CD8、CD16和CD56；以及4)與未處理的白細胞群體相比，顯示提高的殺傷功能與增殖功能的比值。
本發(fā)明的白細胞群體總體上不能增殖，但保留免疫學(xué)活性。該白細胞群體尤其將有下列活性1.促進疾病細胞、受感染細胞或病原體的破壞。
2.有利于第二種細胞群體的植入。第二個細胞群體可以是一種細胞懸液或有組織的細胞集合，如一塊組織或器官。這些細胞可包括例如造血細胞、髓細胞、白細胞、骨髓細胞、胰島細胞、肝細胞、神經(jīng)元細胞、心肌細胞、間充質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞。
3.促進免疫重建。
4.免疫治療。
5.混合嵌合狀態(tài)(mixed chimerism)的治療。
6.促進移植物抗白血病(GVL)效應(yīng)。
在一種實施方案中，該白細胞群體對于促進癌細胞的破壞是有效的。優(yōu)選地，癌細胞選自慢性骨髓性白血病(CML)細胞、慢性髓單核細胞性白血病(CmML)細胞、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)細胞、急性骨髓性白血病(AML)細胞、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)細胞、多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞、何杰金氏淋巴瘤細胞和非何杰氏淋巴瘤細胞。在優(yōu)選實施方案中，癌細胞為慢性骨髓性白血病(CML)細胞或多發(fā)性骨髓瘤細胞。
在另一種實施方案中，該白細胞群體能有效地促進疾病細胞的破壞，其中疾病細胞是一種受感染的細胞。受感染細胞包括被病毒感染的細胞。優(yōu)選地，感染細胞的病毒選自巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒(Ad)和卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒。
在第三種實施方案中，該白細胞群體對于促進病原體的破壞是有效的。病原體包括細菌、真菌和寄生蟲。
在另一種實施方案中，該白細胞群體對于促進第二種細胞群體的植入是有效的。用于植入的細胞可以是，例如，造血細胞、髓細胞、白細胞、骨髓細胞、胰島細胞、肝細胞、神經(jīng)元細胞、心肌細胞、間充質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞。另外，植入的第二種細胞群體可包括實體器官或其一部分。
本發(fā)明也提供用多種方法篩選的上述白細胞群體的亞群。該亞群包括淋巴細胞和T淋巴細胞；并能通過基于例如表面標記表達的陽性和陰性選擇而獲得這些亞群。優(yōu)選的表面標記包括CD8、CD4、CD16和CD56。從全血中篩選白細胞群體亞群的方法包括白細胞電泳(leukophresis)和紅細胞去除。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了應(yīng)用上述細胞群體的多種治療方法，包括供體白細胞輸注、白細胞回加、免疫重建、過繼免疫治療、混合嵌合狀態(tài)的治療以及增強第二種移植細胞群體植入的方法。對于增強第二種移植細胞群體植入的方法，能在第二種細胞群體移植之前、移植同時或之后將本發(fā)明的細胞群體引入宿主中。
本發(fā)明也提供了制備經(jīng)處理的白細胞群體的方法，其中該白細胞群體總體上是不增殖的，并且不能在同種異體宿主中引起移植物抗宿主疾病(GVHD)，該方法包括下列步驟i)提供一種含有白細胞群體的樣品；和ii)使該樣品與能與核酸形式共價鍵的化合物以一定量結(jié)合，使得該化合物能在每108個白細胞基因組DNA堿基對中形成約1-104個加合物，從而抑制增殖但保留免疫學(xué)活性，包括白細胞群體促進疾病細胞或病原體破壞的能力。
在一種優(yōu)選實施方案中，該化合物以足以在每108個白細胞基因組DNA堿基對中形成約5-103個加合物的量存在。優(yōu)選地，該方法導(dǎo)致經(jīng)處理的白細胞群體內(nèi)至少90％的T細胞增殖被抑制。
優(yōu)選地，能與核酸形成共價鍵的化合物進一步包含一種能與核酸非共價結(jié)合的核酸結(jié)合部分。
在一種實施方案中，該化合物包含核酸結(jié)合部分；能與核酸反應(yīng)形成共價鍵的部分；以及共價連接核酸結(jié)合部分與效應(yīng)物部分的一種脆性連接體。優(yōu)選地，核酸結(jié)合部分是一種芳族嵌入物而效應(yīng)物部分是一種芥子基(mustard)。
在制備經(jīng)處理的白細胞群體的方法的一種優(yōu)選實施方案中，能與核酸形成共價鍵的化合物含有一種可光活化部分，其在電磁刺激后能與核酸形成共價鍵。當(dāng)使用具有可光活化部分的化合物即可光活化化合物時，該方法進一步包括下列步驟使與該化合物混合的白細胞樣品暴露于光線下，以光活化可光活化部分，從而導(dǎo)致可光活化部分與白細胞基因組DNA形成共價鍵。
在前述方法的一種實施方案中，具有可光活化部分的化合物選自呋喃香豆素、放線菌素、蒽環(huán)酮、氨茴霉素、苯并二吡喃酮、芴、芴酮、單星脂肪藍、norphillin A、有機染料；菲啶、吩噻嗪硫鎓鹽、吩嗪、吩噻嗪、疊氮基苯、喹啉和噻噸酮、吖啶和橢圓玫瑰樹堿。優(yōu)選的呋喃香豆素是補骨脂素。優(yōu)選的補骨脂素包括PAP、8-甲氧基補骨脂素(8-MOP)、4’-氨甲基4，5’，8-三甲基補骨脂素(AMT)、5-甲氧基補骨脂素和三氧雜啉(trioxalene)4，5’，8-三甲基補骨脂素。
當(dāng)用來處理白細胞的化合物是補骨脂素時，該補骨脂素優(yōu)選地以10-4-150μM的濃度存在，并使白細胞樣品暴露于波長為200-450nm、優(yōu)選地320-400nm的紫外線下。優(yōu)選地，以10-3-100J/cm2的劑量提供紫外線。白細胞樣品將暴露于紫外線下1秒到60分鐘的一段時間。
在一種優(yōu)選實施方案中，根據(jù)以上實施方案制備經(jīng)處理的白細胞群體的方法，使用通式
的補骨脂素(此處被稱為S-59)及其鹽。S-59將以10-4-150μM、更優(yōu)選地10-3-150μM的濃度使用。使與S-59混合的白細胞樣品暴露于波長為200-450nm、優(yōu)選地320-400nm的紫外線下。優(yōu)選地將與S-59混合的白細胞樣品暴露于劑量為10-3-100J/cm2、更優(yōu)選地3J/cm2的紫外線下。為了光活化S-59，優(yōu)選地將白細胞樣品暴露于紫外線下1秒到60分鐘、優(yōu)選地1分鐘的一段時間。優(yōu)選地以每毫升10-109個細胞、更優(yōu)選地每毫升102-108個細胞、最優(yōu)選地每毫升2×106個細胞的細胞密度提供白細胞樣品。
提供根據(jù)前述方法產(chǎn)生的白細胞群體，包括特別用S-59處理的白細胞群體。
本發(fā)明的再另一方面為促進疾病細胞或病原體破壞的方法，包括將用上述方法產(chǎn)生的白細胞群體與含有疾病細胞或病原體的同種異體細胞群體相混合。該方法能在體外或體內(nèi)進行。在一種優(yōu)選實施方案中，通過供體白細胞向宿主中的輸入使白細胞群體與哺乳動物宿主的同種異體細胞群體在體內(nèi)混合。優(yōu)選地，對患有BMT后白血病或多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)的哺乳動物宿主實施供體白細胞輸注。
在促進疾病細胞或病原體破壞的方法的一種優(yōu)選實施方案中，疾病細胞是癌細胞。包括來源于下列癌癥的癌細胞慢性骨髓性白血病(CML)細胞、慢性骨髓單核細胞性白血病(CmML)細胞、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)細胞、急性骨髓性白血病(AML)細胞、急性淋巴母細胞性白血病(AML)細胞、多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞，何杰金氏淋巴瘤細胞和非何杰金氏淋巴瘤細胞。在一種最優(yōu)選的實施方案中，癌細胞是慢性骨髓性白血病細胞或多發(fā)性骨髓瘤細胞。
另一類優(yōu)選癌細胞是選自乳腺癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、睪丸癌細胞、前列腺癌細胞、結(jié)腸癌細胞、黑素瘤細胞、腎癌細胞、成神經(jīng)細胞瘤細胞、頭癌細胞和頸癌細胞的癌細胞。
在促進疾病細胞或病原體破壞的方法的另一種優(yōu)選實施方案中，疾病細胞是一種受感染細胞。優(yōu)選的受感染細胞包括被一種病毒如巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒(Ad)或卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染的細胞。
在促進疾病細胞或病原體破壞的上述方法的又另一種實施方案中，用對疾病細胞或病原體特異的一種或多種抗原表位刺激白細胞群體，來擴大對抗原特異的細胞毒性T細胞的數(shù)量。刺激或抗原特異的T細胞擴增能在體內(nèi)、離體或在體外進行。進行體內(nèi)刺激的方法是在從供體中分離白細胞群體之前，用對疾病細胞或病原體特異的抗原接種白細胞供體。在疾病為CML的情況中，優(yōu)選地用CML細胞的bcr-abl抗原刺激白細胞群體。在多發(fā)性骨髓瘤的情況中，能用患者骨髓瘤細胞的獨特型抗原接種白細胞供體。
在促進疾病細胞或病原體破壞的前述方法的又另一種實施方案中，用一種促分裂原刺激白細胞群體。優(yōu)選地用一種促有絲分裂組合物如豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)加離子霉素或植物凝集素在體外進行刺激。
附圖簡述

圖1顯示用不同濃度的S-59(正方形)、AMT(三角形)和8-MOP(圓形)光化學(xué)處理(PCT)后(UVA＝1J/cm2)增殖T細胞的減少(參見實施例1)。
圖2顯示在MLR試驗中用不同藥物劑量的S-59處理的效應(yīng)細胞的3H-胸苷摻入(參見實施例2)。
圖3顯示用不同藥物劑量的S-59光化學(xué)處理的效應(yīng)細胞在MLR中的IL-2產(chǎn)生水平(參見實施例2)。
圖4顯示用不同藥物劑量的S-59光化學(xué)處理的效應(yīng)細胞在MLR中的IFN-γ產(chǎn)生水平(參見實施例2)。
圖5顯示用不同濃度的S-59和0.5J/cm2UVA對PC中的白細胞PCT后，隨PCT后時間而變的產(chǎn)生的IL-8水平(參見實施例2)。
圖6顯示用不同劑量的AMT和1J/cm2UVA PCT后，隨處理后時間而變化的CD69標記表達的水平(參見實施例3)。
圖7顯示在PC中用多種補骨脂素光化學(xué)處理后補骨脂素-DNA加合物的形成。S-59(正方形)；AMT(三角形)；8-MOP(圓形)；1.9J/cm2UVA(參見實施例3)。
圖8顯示S-59+UVA處理對被處理細胞增殖的影響，在MLR試驗中根據(jù)3H胸苷摻入測定。NR表示未處理的細胞；UV表示無S-59時用UVA照射的細胞。也顯示了在三種不同濃度的S-59存在下用3J/cm2UVA照射細胞時獲得的結(jié)果。詳見實施例14。
圖9顯示用抗-CD3抗體使被處理細胞激活后測定的，S-59+UVA處理對被處理細胞增殖的影響。詳見實施例14。
圖10A顯示用S-59+UVA光化學(xué)處理并在MLR中刺激的人PBMC的IL-2產(chǎn)生。通過夾心ELISA測定。詳見實施例14。
圖10B顯示用S-59+UVA光化學(xué)處理并在MLR中刺激的人PBMC的IFN-γ產(chǎn)生。通過夾心ELISA測定。
圖11A顯示用抗-CD3激活后于不同時間(小時)測定的經(jīng)處理的及對照細胞中的CD69表達。
圖11B顯示用抗-CD3激活后于不同時間(小時)測定的經(jīng)處理的及對照細胞中的CD25表達。
圖12顯示用抗-CD3激活后于不同時間(小時)測定的經(jīng)處理的及對照未處理細胞中的CD40L表達。
圖13顯示光化學(xué)處理、激活的白細胞的細胞毒性T細胞活性，根據(jù)與經(jīng)處理的白細胞共溫育的靶細胞的51Cr釋放來測定。
圖14顯示接受MHC-錯配骨髓移植與S-59+UVA處理的脾細胞、然后在移植三天后用白血病細胞攻擊的受照射鼠中，平均體重的測定。如圖所示，在0.01μM S-59存在下使脾細胞暴露于UVA下不同時間長度。
圖15顯示在有或無經(jīng)處理的白細胞輸注時接受骨髓移植的白血病攻擊的小鼠中GVL活性的分析。GVL活性用無白血病存活百分率證明(括號中給出了存活比)。
圖16顯示S-303處理的效應(yīng)細胞增殖能力的分析，在MLR中與γ-滅活的同種異體刺激細胞共培養(yǎng)后6-7天，根據(jù)3H-胸苷摻入測定。
圖17顯示MLR上清液中的IFN-γ水平，其中在共培養(yǎng)之前用不同濃度的S-303處理效應(yīng)細胞。
發(fā)明詳述縮寫使用下列縮寫B(tài)MT骨髓移植DLI供體白細胞輸注LDA有限稀釋分析MLR混合淋巴細胞反應(yīng)PA光化學(xué)抑制的；PCT光化學(xué)處理；PI-DLI光化學(xué)滅活的供體白細胞輸注；PUVA補骨脂素及紫外線A照射。
PAP4’-和5’-伯氨基取代的補骨脂素S-59一種具有下式的伯氨基取代的補骨脂素
PBSC外周血干細胞PC血小板濃縮物TA-GVHD轉(zhuǎn)輸相關(guān)的移植物抗宿主疾病
PHA植物凝集素定義“同種異體”是指相同種的遺傳上不同的成員之間存在的關(guān)系，即這些成員不是同源的。
“宿主”可與“受體”交換作用，是指同種異體供體白細胞的哺乳動物受體。通常，宿主是人，但也包括其它哺乳動物，如小鼠、狗、貓、猴、馬等。
“白細胞”是指任何白細胞，包括譜系祖細胞?！翱乖蔬f細胞”包括巨噬細胞，和在外周血中少量存在的樹突細胞，以及它們各自的前身細胞。白細胞存在于循環(huán)血液中和骨髓中，以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的髓細胞形成、淋巴和網(wǎng)狀部位。
在此使用的“白細胞群體”是指含有超過一種白細胞細胞型的白細胞群體，并且至少包括T細胞、抗原呈遞細胞和NK細胞。
“供體白細胞”指對于宿主動物不是內(nèi)源的而來源于一種同種異體供體的白細胞。對于體外和非人類應(yīng)用，白細胞群體和供體白細胞可來源于哺乳動物，包括嚙齒類動物、兔、狗等等。
“純化的”意思是，白細胞群體已從身體中分離，并被處理使得基本上不含非白細胞的細胞型，并且優(yōu)選地不含其它污染物，如白細胞來源中存在的細胞殘片，該來源一般為外周血、骨髓甚至脾細胞。優(yōu)選地，純化白細胞群體，使其含有少于13％的紅細胞(RBC)，更優(yōu)選地少于5％，甚至更優(yōu)選地少于1％。在一種最優(yōu)選的實施方案中，血細胞比容水平低于0.5％。以下描述了白細胞純化方法。
“經(jīng)處理的白細胞”指已暴露于或接觸一種能與核酸形成一個或更多共價鍵的化合物的白細胞。白細胞能通過PCT或用烷化劑化合物“處理”?！肮饣瘜W(xué)滅活的”或“光化學(xué)抑制的”(PA)或“PCT抑制的”白細胞指甚至在刺激后仍不能增殖的PCT白細胞，并不意味著白細胞在蛋白質(zhì)表達和免疫功能方面被滅活。
本發(fā)明的白細胞群體含有但不限于“不增殖的”細胞。如果在DNA復(fù)制中細胞被抑制，從而甚至在用試劑如促分裂原、細胞因子、抗原、抗體或其它增殖刺激物刺激后仍不能分裂產(chǎn)生新細胞，則這種細胞是“不增殖的”。本發(fā)明的方法導(dǎo)致制劑中每種白細胞的復(fù)制均抑制不是必需的。對于本發(fā)明，只要能增殖的少部分白細胞不足以在同種異體宿主中引起GVHD，則在純化的群體內(nèi)至少90％、更優(yōu)選地至少95％的白細胞中，白細胞群體增殖受到抑制就足夠了。在一種最優(yōu)選的實施方案中，群體內(nèi)99％或更多的白細胞是不增殖的。例如，通過有限稀釋試驗(LDA)或單獨通過3H-胸苷摻入法，或如以下實施例所述作為MLR試驗的一部分，能測定增殖活性。在一種最優(yōu)選的實施方案中，群體中的T細胞被增殖抑制到LDA檢測的下限。已表明這些試驗結(jié)果預(yù)示經(jīng)處理的白細胞在體內(nèi)增殖的能力。
“移植物抗宿主疾病”或“GVHD”起因于存在于轉(zhuǎn)輸BMT或DLI中的供體T細胞的克隆擴展、增殖和定居于宿主組織。已證實GVHD的發(fā)生與嚴重程度與可克隆T細胞的存在有關(guān)(參見Kernan，N.A.等人，血液68770-773，1986)。在與供體HLA-匹配的患者中，GVHD的發(fā)生起因于次要組織相容性抗原。GVHD的發(fā)病是由于免疫抑制的患者中免疫功能的缺乏，這是BMT成功所必需的條件。供體T細胞能在該環(huán)境中不受攻擊地增殖，并攻擊宿主組織，引起病理癥狀。在細胞水平上，宿主的抗原呈遞細胞與供體T細胞在主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I和II的范圍內(nèi)相互作用，并誘導(dǎo)其對攜有宿主特異性(次要)抗原的細胞的激活。這導(dǎo)致激活T細胞的克隆增殖，其攻擊宿主組織并釋放細胞因子。T細胞分泌的細胞因子也激活宿主的多種其它效應(yīng)細胞，這通過細胞因子的另外產(chǎn)生(細胞因子潮)加重組織損傷。參見，例如Burakoff，S.J.等人，移植物抗宿主疾病免疫學(xué)、病理生理學(xué)與治療。于Brinkhous KMS，S.A.(編)《血液學(xué)》(Hematology)第12卷(第一版)，紐約，Marcell Dekker，Inc.，1990，725頁。
當(dāng)診斷有GVHD時，通常給予患者高劑量的免疫抑制藥物來抑制GVHD。然而，這些藥物也使移植的白細胞在GVL方面無效，并且患者可復(fù)發(fā)為白血病。
白細胞群體引起GVHD的能力可如以下實施例4所述在體內(nèi)測定，或者通過有限稀釋試驗(LDA)在體外測定，或者如以下實施例5所述通過MLR測定。根據(jù)LDA測定，如果群體中的可克隆T細胞數(shù)量為未處理白細胞對照群體(GVHD和增殖的陽性對照)中存在的10-3-10-4，則判斷該白細胞群體不能引起GVHD。在體內(nèi)，白細胞群體的同種異體受體中GVHD臨床癥狀(實施例4所述癥狀)的缺乏表明該群體不能引起GVHD。
如果一種白細胞群體包括這樣的白細胞，其能直接或間接參與能有效地從身體中殺傷或清除目標疾病細胞(或病原體)、或限制疾病細胞(或病原體)增殖的免疫應(yīng)答，則認為該群體“對于促進疾病細胞或病原體的破壞是有效的”。不是白細胞群體中存在的每種白細胞都能促進破壞，但總體上該群體應(yīng)在此方面有效。
應(yīng)當(dāng)認識到，疾病細胞或病原體能通過任何機制被破壞。通過經(jīng)處理的白細胞能介導(dǎo)破壞的特定機制限制處理白細胞的方法不是本發(fā)明的目的。疾病細胞可被T細胞或NK細胞通過細胞溶解而破壞，而且也能被其它機制殺傷，如被誘導(dǎo)經(jīng)歷凋亡。疾病細胞或病原體也能被依賴抗體的細胞介導(dǎo)細胞毒性(ADCC)、巨噬細胞的吞噬作用所破壞，或通過哺乳動物中天然存在的任一免疫機制被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所清除。通過殺傷其存活所依賴的宿主細胞，能間接破壞駐留于宿主細胞內(nèi)的病原體。在標準免疫學(xué)教科書如《基礎(chǔ)與臨床免疫學(xué)》第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(編)，Appelton & Lange，Norwalk CT，1994中，討論了免疫系統(tǒng)使機體擺脫惡性細胞、受感染細胞或病原體的機制?！坝行А碧幚淼墓w白細胞可以是一種效應(yīng)細胞，如細胞毒性T細胞(CTL)、NK細胞或一種巨噬細胞，其直接殺傷靶疾病細胞或病原體，或誘導(dǎo)疾病細胞經(jīng)歷凋亡。此外，通過刺激其它白細胞，例如來自于移植的骨髓、以前DLI的白細胞，或宿主自身的白細胞，經(jīng)處理的供體白細胞能介導(dǎo)破壞，從而進行殺傷或清除。通過表面抗原表達、細胞因子分泌或任何適當(dāng)?shù)臋C制能對其它白細胞進行刺激。經(jīng)MHC-限制和/或非MHC限制(如NK細胞)的機制能發(fā)生細胞溶解。
白細胞群體促進疾病細胞或病原體破壞的效能可通過多種試驗測定，如以下實施例所述的MLR或51Cr釋放試驗。例如，根據(jù)在51Cr釋放試驗中介導(dǎo)白血病細胞殺傷的能力證明了細胞溶解的效能。對于本發(fā)明，如果在適當(dāng)試驗中(例如51Cr釋放試驗)，白細胞群體顯示比陰性對照群體至少高約20％的水平的溶細胞能力，則認為該群體對促進疾病細胞的破壞是有效的。以下提供了用于殺傷的疾病細胞和病原體類型。
通常，促進破壞的效能需要白細胞群體保持一定的蛋白質(zhì)合成水平，以使得包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(如細胞因子)的蛋白質(zhì)能產(chǎn)生并分泌。優(yōu)選地，在質(zhì)膜上也有表面抗原包括受體，粘附分子和協(xié)同刺激分子的表達。細胞生存力和膜完整性對于介導(dǎo)GVL效應(yīng)是重要的?！凹毎媪Α痹诖硕x為循環(huán)中即血流和其它組織中的存活率。
盡管某些細胞因子的產(chǎn)生可被抑制，但優(yōu)選地細胞因子產(chǎn)生保持在用上述化合物處理之前的至少70％、更優(yōu)選地80％、甚至更優(yōu)選地高于90％，最優(yōu)選地高于95％的水平。優(yōu)選地，白細胞群體包括在刺激下能至少分泌白細胞介素-2(IL-2)和干擾素-γ(IFN-γ)的白細胞。由于這些細胞因子在T細胞激活和GVHD/GVL中的明確作用，它們是相關(guān)的。其它相關(guān)細胞因子包括粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細胞介素-10(IL-10)。例如，用本實施例以下部分所述的細胞因子測定試劑盒(例如，R & D Systems的試劑盒)能容易地測定細胞因子的分泌。
在純化白細胞群體中的白細胞上表達的表面抗原(也被稱為表面標記)取決于特定的細胞型。優(yōu)選地，該群體包括表達下列表面抗原的白細胞CD2、CD28、CTLA4、CD40配體(gp39)、CD18、CD25、CD69(淋巴細胞激活標記)和CD16/CD56、抗原，已知它們參與T細胞與NK細胞激活有關(guān)的相互作用和免疫功能。優(yōu)選地，白細胞也表達其它表面標記，包括MHC I類和II類、CD8、CD4、CD3/TcR(T細胞受體)、粘附分子如CD54(ICAM-1)、LFA-1和VLA-4，及其它共同刺激分子。可用多種測定法能檢測及測定表面抗原的表達，例如通過標準FACS-SCAN分析用對特定抗原特異的抗體染色細胞并檢測已被直接或間接標記的抗體。本領(lǐng)域所知的其它方法包括表面抗原的免疫沉淀和免疫印跡。
在此使用的“疾病細胞”是指癌細胞、受感染細胞或任何類型病變的細胞，它們可能存在于體內(nèi)或體外。癌細胞或惡性細胞可能來源于任何類型的癌癥、是任何組織或細胞型來源的。這些惡性或癌細胞包括但不限于下列惡性腫瘤的細胞白血病，包括慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴母細胞性白血病(ALL)；多發(fā)性骨髓瘤(MM)；非何杰金氏淋巴瘤和何杰金氏病(淋巴瘤)；實體瘤，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、腎細胞癌、成神經(jīng)細胞瘤和頭頸腫瘤。受感染細胞包括被下列任何微生物感染的細胞細菌、真菌、寄生蟲或其它任何病原微生物。
“病原體”被定義為含有核酸并且能引起人類、其它哺乳動物或脊椎動物疾病的任何媒介。病原體的實例包括引起人類、其它哺乳動物或脊椎動物疾病的細菌、病毒、原生動物、真菌、酵母、霉菌和支原體。病原體的遺傳物質(zhì)可以是DNA或RNA，遺傳物質(zhì)可以作為單鏈或雙鏈核酸存在。病原體可能位于細胞之外，或駐留于細胞內(nèi)，如巨噬細胞中的HIV所例證的。
術(shù)語供體白細胞“輸注”和“轉(zhuǎn)輸”在此可交換地使用，是指相同的方法。
“光劑量”或“PCT劑量”，以J/cm2的單位確定，是指PCT過程中白細胞樣品接受的每單位區(qū)域的總光能。通過改變光線強度和細胞樣品暴露于光線的時間能改變光劑量。
以mW/cm2單位測定的光線“強度”是指每秒每單位樣品接受的光能。
“可光活化部分”在此被定義為一種隨電磁輻射經(jīng)受化學(xué)改變的部分。當(dāng)含有可光活化部分的化合物被電磁輻射光活化時，光活化部分與核酸形成共價鍵，形成一種化合物核酸復(fù)合體，在此稱作“加合物”。
“芳族嵌入物”是指一種具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)、能插入核酸中的化合物或其部分。芳族嵌入物包括但不限于蒽、吖啶、萘、萘甲酸，等等。
在此使用的“分離的細胞群體”包括在細胞正常駐留的生物之外存在的細胞群體。
在此使用的“免疫學(xué)活性”是指免疫系統(tǒng)的細胞如T細胞、B細胞、NK細胞、抗原呈遞細胞(APC)及其它細胞所表達的功能，這些功能包括但不限于細胞因子的合成與分泌、細胞介導(dǎo)的細胞毒性、抗體的合成與分泌、抗原及抗原片段的加工和呈遞、表示免疫細胞特征的表面標記的表達。引入作為參考本申請中引用的參考文獻，包括專利、公布的專利申請及其它出版物，在此引入作為參考。優(yōu)選實施方案描述以下總結(jié)了本發(fā)明的多個優(yōu)選方面，并在隨后的詳細描述及實施例中進一步描述并說明。
本發(fā)明提供一種方法，用于處理分離的白細胞群體，以使該群體的一部分不能增殖到該群體可引起最小GVHD的程度，但仍保留能有效促進疾病細胞或病原體破壞的足夠的免疫功能?！白钚VHD”意思是，GVHD的程度不足以引起哺乳動物的死亡，或消除白細胞群體促進疾病細胞或病原體破壞和/或介導(dǎo)GVL效應(yīng)的能力。
GVHD明確地與供體T細胞的克隆擴展有關(guān)，原則上，去除、滅活或殺傷白細胞的任何處理對其都是有效的。另一方面，GVL與供體白細胞的免疫應(yīng)答有關(guān)，并且可能是細胞溶解作用、抗原呈遞、特異性細胞因子合成或以上組合的結(jié)果。對于觀察到GVL效應(yīng)需要供體白細胞的某些功能是完整的。在避免GVHD的嘗試中對供體白細胞功能的滅活也使供體BM或白細胞不能有效地為無免疫應(yīng)答者或BMT宿主提供必要的免疫功能。
為了使處理能在同種異體宿主中消除GVHD而仍提供免疫保護和/或誘導(dǎo)GVL效應(yīng)，必須選擇性地去除白細胞的增殖能力，而保留一定水平的白細胞功能。本發(fā)明提供了具有這些特征的白細胞群體。
本發(fā)明的分離的白細胞群體提供了優(yōu)于以前所述及使用的群體的許多優(yōu)點。一個明顯的優(yōu)點是，消除GVHD的發(fā)病將允許供體白細胞向患者中的安全輸入。因此，缺乏免疫系統(tǒng)或具有嵌合免疫系統(tǒng)的宿主能接受大劑量的經(jīng)處理的供體白細胞和/或多次DLI，從而提高了疾病治療的效能。以前，GVHD的威脅限制了輸入的白細胞的量。
非增殖性白細胞群體能有效地為宿主提供對抗癌癥和感染的充分免疫防御。這些白細胞可用于治療復(fù)發(fā)的血液惡性腫瘤，如慢性骨髓性、急性骨髓性、急性淋巴細胞性、多發(fā)性骨髓瘤及其它形式的白血病和骨髓瘤，作為BMT后治療的一部分或作為BMT的一種備擇方法。DLI引起的GVL效應(yīng)不僅可用于去除最小殘余疾病，而且也能用于較高惡性細胞荷載的治療，尤其是因為白細胞擴展的缺乏允許更大量細胞的安全輸入。本發(fā)明的經(jīng)處理的白細胞群體也可用于對免疫調(diào)節(jié)治療敏感的某些實體瘤(例如乳腺癌和腎細胞癌)的治療，并且可用于防止匹配及錯配異體BMT過程中的移植排斥。以下詳述了在治療中該經(jīng)處理的白細胞適用的其它多種臨床適應(yīng)癥。
本發(fā)明的處理白細胞的方法包括下列步驟?？蓮墓撬琛⒛氀蛉蝎@得白細胞。最方便的白細胞來源是外周血。科學(xué)文獻中描述了從其它來源分離白細胞的方法。例如，通過紅細胞去除或白細胞電泳處理全血來純化并富集白細胞。得到的純化白細胞群體大約99％不含紅細胞，與白細胞相比紅細胞有不同的大小和密度，易于通過這些方法去除。
然后將白細胞群體與化合物混合，并在能有效抑制白細胞增殖而不損害細胞生存力和完整性的條件下處理。去除未反應(yīng)的化合物，或者隨時間延長該化合物可變?yōu)闊o活性的，而不必要去除。在一種優(yōu)選實施方案中，“化合物”是指能與一種核酸形成共價鍵的化合物。共價鍵的形成在每108個白細胞基因組DNA堿基對中可形成大約1-104個加合物，優(yōu)選地5-103個加合物，最優(yōu)選地103個加合物。重要的是，處理條件使得對蛋白質(zhì)及其它細胞成分的非特異性損傷減至最小并避免膜損傷。大多數(shù)經(jīng)處理的白細胞的膜完整性對于發(fā)生GVL效應(yīng)是必要的。這些處理條件也能有效地使經(jīng)處理的白細胞在引入同種異體宿主中后不能引起GVHD，或者使之在體外MLR試驗中無反應(yīng)性。另外，經(jīng)處理的白細胞應(yīng)保持對于完成免疫功能、尤其對于促進疾病細胞或病原體在體內(nèi)(或體外)的破壞有效的蛋白質(zhì)表達。
以下公開了能與核酸、優(yōu)選地雙鏈DNA形成共價鍵的適當(dāng)化合物的性質(zhì)。這些化合物可含有一種能與核酸形成共價鍵的部分，該部分是可光活化的或化學(xué)反應(yīng)性的。該化合物通過與基因組DNA形成共價鍵、進而干擾DNA聚合酶的功能并使白細胞不能增殖，來抑制細胞的增殖能調(diào)節(jié)化合物與白細胞核酸形成的共價加合物的數(shù)量，使得該化合物能抑制增殖，但保留對促進疾病細胞或病原體的破壞有效的免疫功能。應(yīng)用烷化劑化合物，通過調(diào)節(jié)化合物濃度以及在去除未結(jié)合的化合物之前白細胞與化合物接觸的時間長度，能調(diào)節(jié)這一作用。所需的濃度取決于特定化合物的性質(zhì)，如在水溶液中的溶解度和DNA結(jié)合常數(shù)。一般以每108個白細胞基因組DNA堿基對中能有效產(chǎn)生大約1-104個共價結(jié)合化合物的加合物、優(yōu)選地約5-103個加合物、更優(yōu)選地約102-103個加合物的濃度使用該化合物。理想地，處理白細胞群體的條件在每108個基因組DNA堿基對中將產(chǎn)生大約103個加合物。能有效獲得本發(fā)明的白細胞組合物的最低化合物濃度是優(yōu)選的濃度。
應(yīng)用可光活化化合物，通過調(diào)節(jié)化合物濃度、光線波長和暴露于光線的時間長度能調(diào)節(jié)PCT作用。以下詳述了使用補骨脂素及其它可光活化化合物進行PCT的條件。
處理條件的目的是在每108個白細胞基因組DNA堿基對中產(chǎn)生大約1-104個共價結(jié)合化合物的加合物、優(yōu)選地約5-104個加合物、更優(yōu)選地約102-103個加合物。理想地，該處理條件在每108個基因組DNA堿基對中將產(chǎn)生大約103個加合物。例如，通過使用如以下實施例所述的放射性標記的DNA結(jié)合化合物，能測量由處理產(chǎn)生的化合物-DNA加合物的數(shù)量。
能在白細胞處理中使用的另一種類型的化合物是一種作為DNA復(fù)制抑制劑的小分子。如上所述，這種小分子復(fù)制抑制劑可任選地含有一種連接體(脆性的或相反)和一種效應(yīng)物部分。DNA復(fù)制的任何步驟都能作為抑制的目標，包括起點識別復(fù)合體(ORC)的形成、ORC對起點的補充、復(fù)制的起始、延伸等。另外，有利于復(fù)制過程的酶的抑制劑，如解旋酶和拓撲異構(gòu)酶，也是有用的。拓撲異構(gòu)酶抑制劑的實例包括，例如喜樹堿和道諾霉素。
為了使白細胞樣品與化合物混合，可將本發(fā)明的化合物以幾種形式引入白細胞懸液(白細胞樣品)中?？梢宰鳛樗?、鹽水中的水溶液、合成培養(yǎng)基(如“SterilyteTM3.0”)或懸浮白細胞的溶液引入化合物。以下提供了適于重懸浮白細胞的溶液(輸血級和非輸血級)?！昂铣膳囵B(yǎng)基”在此被定義為水性合成血液或血液制品貯存培養(yǎng)基。另外能以含或不含佐劑的干燥制劑提供化合物。然后攪拌細胞懸液混合該化合物。
將待用化合物處理的白細胞重懸浮于生理平衡溶液中，如血漿、合成培養(yǎng)基或其組合物。能以200mL-1L的體積提供白細胞。用于處理的白細胞優(yōu)選地包含于一種反應(yīng)容器如血袋中。血袋為本領(lǐng)域所知。
通過體外及體內(nèi)試驗?zāi)鼙O(jiān)測用化合物處理對白細胞群體生存力及功能的影響，從而確定使增殖和GVHD活性減至最小而使細胞毒性功能和/或GVL效應(yīng)達到最大的最佳處理條件。最佳條件將隨所用化合物的性質(zhì)而不同，并由疾病或病原體所證實。對于可光活化化合物，最優(yōu)選的PCT條件包括最低化合物濃度和最低光劑量，其足以提供增殖被抑制但能有效促進疾病細胞或病原體破壞的白細胞群體。將如下表征經(jīng)處理的白細胞群體。
將評價經(jīng)處理的白細胞群體的細胞生存力。如本實施例以下部分所述，例如，通過PCR分析檢測對供體白細胞特異的序列，能在體內(nèi)測定細胞的生存力。優(yōu)選地，該白細胞群體具有至少3周的細胞生存力。處理后白細胞的快速清除可影響其誘導(dǎo)抗白血病反應(yīng)的能力。被處理白細胞的膜完整性對于發(fā)生GVL效應(yīng)也是必要的。通過臺盼藍或碘化丙錠染料排除法能測定膜完整性。如果使用，在使具有完整細胞膜的白細胞數(shù)達到最大的光劑量和/或化合物濃度方面，優(yōu)化PCT方法。
如以下本實施例所述，例如，通過有限稀釋試驗(LDA)或混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)試驗?zāi)軠y定增殖活性?；旌狭馨图毎磻?yīng)(MLR)試驗中的白細胞活性預(yù)示被處理的白細胞在體內(nèi)介導(dǎo)GVHD的能力。此外，通過監(jiān)測已輸入經(jīng)處理的白細胞的MHC匹配動物中的GVHD癥狀和/或GVHD誘導(dǎo)的發(fā)病率和死亡率能確定GVHD。
通過監(jiān)測細胞因子合成、表面抗原性標記的表達和溶解靶細胞的能力，能確定白細胞活性。利用合適的抗原特異性抗體和標準FACS-SCAN分析測定表面抗原性標記的表達。作為共價結(jié)合化合物濃度和(若使用時)PCT光劑量的函數(shù)測定抗原性標記CD2、CD28、CTLA4、CD40配體(gp39)、CD18、CD25、CD69(淋巴細胞激活標記)和CD16/CD56的存在，已知它們參與與T細胞和NK細胞激活相關(guān)的相互作用及免疫功能。假如PCT對蛋白質(zhì)作用溫和，PCT條件下表面分子的穩(wěn)定性預(yù)計不受影響。選擇處理條件例如PCT，使得它們不能相反地影響表面分子的表達或使細胞因子的產(chǎn)生降低至希望水平(以上公開的優(yōu)選水平)之下。
例如，在51Cr釋放試驗中通過人或小鼠白血病細胞系的溶解，能測定預(yù)示GVL活性的溶細胞活性。如Choudhury等人，血液891133-1142，1997所述能在體外測定抗白血病效應(yīng)，或者如Johnson等人，血液853302-3312，1995所述在體內(nèi)測定。對實體瘤的活性能用例如實體瘤的鼠模型來檢測。介導(dǎo)受感染細胞或病原體溶解的能力能在動物模型中用受感染動物來測定。GVHD和GVL能力也能如以下實施例4及5所述在體內(nèi)測定。
以下實施例中描述了所有上述試驗。由于鼠與人之間免疫應(yīng)答的相似性，使用鼠模型進行的實驗預(yù)示人的應(yīng)答。例如，GVL效應(yīng)在鼠和人系統(tǒng)中都得到很好證明。這些試驗的結(jié)果預(yù)示DLI處理的宿主中的體內(nèi)生物學(xué)反應(yīng)。
根據(jù)動物模型的試驗結(jié)果，對有代表性數(shù)量的患者測試確定有效的化合物濃度，并使用導(dǎo)致患者疾病緩解的最有效化合物濃度。對大多數(shù)患者使用的條件是最優(yōu)選的。這些患者一般是BM移植后的患者。
根據(jù)這些試驗和檢測的結(jié)果，確定最佳處理條件是可能的，該條件將產(chǎn)生不能增殖和引發(fā)GVHD，但能有效地促進疾病細胞或病原體破壞的白細胞群體。被處理的白細胞群體應(yīng)當(dāng)具有GVL活性。白細胞供體的選擇對于DLI，供體與白細胞輸注的宿主(受體)必須是同種異體的。HLA-A及-B是HLA I基因，而HLA-DR是HLA II基因。這些基因的每一種都以多種不同的等位基因形式存在。由于每一個體固有兩個拷貝的染色體6(含有HLA基因)，所以個體能表達最高可達6個的不同HLA-A、-B和-DR蛋白質(zhì)(每一基因座兩個不同等位基因的產(chǎn)物)。優(yōu)選地，同種異體供體在HLA-A、B和DR的6個HLA基因座的3個或更多上是基因型相同的。在“單倍體相同的”移植中，供體和宿主在6個HLA基因座的3個上匹配。理想地，供體和受體在HLA-A、B和DRB1上相同。通過美國國家骨髓供體程序(NMPD)能搜索到HLA-匹配的無關(guān)供體。
當(dāng)前，對于接受未修飾的非T細胞排除移植的已達55歲的患者，患者與供體的HLA-A、B和DRB1基因必須相同。36歲或更年輕的患者能從HLA-A、-B或-DR相差不超過1個次要抗原匹配的供體移植。HLA-A或B次要匹配被定義為屬于相同交叉反應(yīng)組的兩種抗原。HLA-DR次要匹配被定義為表達相同DR特異性但DRB1等位基因不同的兩種單元型。對于合適的同種異體供體的方案，參見O’Reilly，R.等人，異體骨髓移植用于缺少供體的患者的方法，于《血液學(xué)》-1996，美國血液學(xué)協(xié)會教育計劃，第132-146頁。白細胞的制備本發(fā)明的白細胞群體的起始材料能由例如地區(qū)性血液處理中心提供，其類似于現(xiàn)有的處理外周血干細胞以及造血干細胞的其它來源(如骨髓)的中心。能在用于進行處理的任何合適的設(shè)施輸入(能在多種設(shè)施包括當(dāng)?shù)匮褐行幕蜥t(yī)院血庫進行輸入)并處理供體的白細胞。此外，輸入的白細胞能連夜運往優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)的細胞處理設(shè)施進行處理和質(zhì)量保證試驗。然后將用于DLI的經(jīng)處理的白細胞通過當(dāng)日快遞送往患者所在醫(yī)院，用于對患者施用。此外，能使用本領(lǐng)域所知的方法冷藏處理的白細胞，如控制在10％DMSO中的冷凍速度，并貯存于液氮中(參見Russel等人，骨髓移植19861-866，1997)。當(dāng)需要移植時，融化冷凍的白細胞，洗滌去除DMSO。
一種用于純化白細胞制劑的常規(guī)方法包括通過密度梯度離心從全血中分離。這一般包括通過Ficoll梯度離心分離富含T細胞的白細胞。參見，例如，Longley和Stewart，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)12133-38，1989。該方法如下進行(1)仔細地在Ficoll上層加新抽取的血樣(例如50-200毫升)，使得界面不受干擾；(2)通過吸出位于梯度界面的不透明細胞帶(離心后)收集白細胞；和(3)洗滌收集的細胞，使之不含F(xiàn)icoll。在該系統(tǒng)中沉淀紅細胞和粒細胞。為了去除Ficoll，一般通過離心并棄上清液，洗滌細胞一次或多次。該方法產(chǎn)生純化的白細胞制劑，即基本上不含紅細胞的制劑。
存在制備大量白細胞制劑的自動化方法。例如，本發(fā)明構(gòu)思了根據(jù)使用說明書用白細胞電泳儀(例如，COBE Spectra Apheresis System，COBE BCT，Inc.Lakewood，CO)處理血液。優(yōu)選地，使用產(chǎn)生具有最低百分血細胞比容的白細胞制劑的輸入(apheresis)儀。白細胞電泳后，用適當(dāng)溶液(如上所述的血漿、輸血級溶液等)洗滌并稀釋白細胞制劑，使之達到低于0.5％的最終血細胞比容。如果以上步驟不能充分降低血細胞比容水平，則用Percoll分離作為進一步的純化步驟。作為白細胞電泳的一種備擇方法，紅細胞去除法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的。
如果基本上只含有T細胞和NK細胞或其它白細胞混合物的白細胞群體是所希望的，則能利用例如用鑒定特異性細胞表面標記的適當(dāng)抗體的陽性和/或陰性選擇，通過熒光激活細胞分選法(FACS)，從白細胞制劑中分離所選的細胞亞群。能用于篩選的表面標記的實例包括但不限于CD4、CD8、CD16和CD56。這些細胞分離法在本領(lǐng)域中眾所周知，參見，例如，Ed Harlow和David Lane，《抗體實驗室手冊》(Antibody，A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1988。
將純化的白細胞群體懸浮于如上公開的適當(dāng)溶液中。能立即處理純化的白細胞群體，或冷藏用于以后的處理。在對于增殖滅活的制劑中，將純化、混合的白細胞制劑重懸浮于等滲溶液如血漿、合成培養(yǎng)基或此兩者的組合物中。一般以每毫升10-109個細胞、優(yōu)選地104-107細胞/ml、理想地2×106細胞/ml的細胞密度制備純化的白細胞群體。
本發(fā)明構(gòu)思了經(jīng)處理的白細胞的制備和施用或應(yīng)用的多種方案。可收集外周血(或另外的白細胞來源包括骨髓或臍血)，并冷凍直到用于增殖滅活處理，處理時融化細胞并洗滌使之不含冷藏劑，任選地加工以獲得純化的白細胞制劑，并進行處理。隨后能將經(jīng)處理的白細胞群體輸入患者。下列備擇方案也是可能的i)外周血的收集、加工、白細胞處理和輸注；ii)收集、加工、白細胞處理、經(jīng)處理的細胞的冷凍、洗掉冷藏劑和輸注；iii)用靶抗原接種供體以擴展抗原特異性T細胞、從接種的供體收集外周血、加工、處理并輸注；iv)用靶抗原對供體白細胞體外致敏以擴展抗原特異性T細胞、白細胞處理和輸注?；衔镌诒景l(fā)明的一種實施方案中，能與核酸形成共價鍵的化合物適于獲得本發(fā)明的白細胞群體的目的。這些化合物優(yōu)選地包含一種與核酸非共價結(jié)合的部分，以及能與核酸反應(yīng)形成共價鍵的相同或不同的部分。該化合物優(yōu)選地具有下列性質(zhì)i)對核酸的高結(jié)合親和力；ii)在水溶液中的可溶性；和iii)穿透白細胞膜的能力。能與核酸形成共價鍵的部分包括化學(xué)反應(yīng)性部分，其不需要外部刺激來激活并可與核酸反應(yīng)，和可光活化的部分，其只在以電磁輻射形式刺激后才與核酸反應(yīng)。
在此使用時，術(shù)語“烷化劑化合物”是指一種化合物，其包含至少一種化學(xué)反應(yīng)性部分，該部分在沒有外部刺激如光刺激時能與核酸反應(yīng)形成共價鍵。
能與核酸形成共價鍵的化合物還可能是可光活化的。在此定義的“可光活化化合物”包括一種在被某種波長的光線刺激光活化后能與核酸形成共價鍵的部分。
優(yōu)選地，該化合物包含能與核酸反應(yīng)形成共價鍵的部分，和能與核酸非共價結(jié)合的部分。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，能與核酸結(jié)合的部分也可以作為能與核酸共價反應(yīng)的部分，并且可以是例如可光活化的。
在一種實施方案中，烷化劑化合物包含核酸結(jié)合部分；能與核酸反應(yīng)形成共價鍵的部分(“在此被稱為效應(yīng)物部分”)；和共價連接核酸部分與效應(yīng)物部分的脆性連接體。在一種優(yōu)選實施方案中，在水溶液中，適當(dāng)pH值時，這些化合物具有一段時間的活性，其間它們能與核酸結(jié)合并反應(yīng)。該階段后，化合物分解為不再能與核酸很好地結(jié)合也不能與之反應(yīng)的產(chǎn)物。
這些烷化劑化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)可被大致地描述為一種能與脆性連接體共價鍵合的錨，共價連接于一種效應(yīng)物上?！板^”，也被稱為“核酸結(jié)合部分”被定義為能與核酸生物聚合體(DNA、RNA或其合成類似物)非共價結(jié)合的部分?！靶?yīng)物”或“效應(yīng)物部分”被定義為一種能通過與核酸形成共價鍵的機制與該核酸反應(yīng)的部分。“脆性連接體”被定義為一種用來共價連接錨與效應(yīng)物的部分，其在某些條件下降解，使錨與效應(yīng)物不再共價連接。錨-脆性連接體-效應(yīng)物的排列使化合物能與核酸特異結(jié)合(由于錨的結(jié)合能力)。這使效應(yīng)物進入附近與核酸反應(yīng)。
優(yōu)選地，核酸結(jié)合部分選自芳族嵌入物、吖啶、吖啶衍生物、橢圓玫瑰樹堿、2-多胺、溝結(jié)合劑和疏水或擇形結(jié)合劑。在優(yōu)選實施方案中，脆性連接體含有一種功能性單位，其選自正向酯、反向酯、正向硫代酯、反向硫代酯、正向及反向硫羰酸酯、正向及反向二硫代羧酸、硫酸酯、正向及反向磺酸酯、磷酸酯和正向及反向膦酸酯基。效應(yīng)物部分優(yōu)選地含有一種官能團，選自芥子基、芥子基相當(dāng)物、環(huán)氧化物、醛和甲醛合成體。
當(dāng)烷化劑化合物與白細胞組合物在生理pH下結(jié)合形成一種反應(yīng)混合物時，該化合物的效應(yīng)物部分與所接觸的核酸反應(yīng)。不能與核酸反應(yīng)的效應(yīng)物部分逐漸被溶劑水解。脆性連接體的水解與效應(yīng)物-核酸反應(yīng)和效應(yīng)物水解同時發(fā)生。理想的是脆性連接體以低得足以使白細胞增殖失活的速率分解；即，脆性連接體的分解速率低于該化合物與白細胞核酸反應(yīng)的速率。經(jīng)過足夠長的時間后，該化合物分解為錨(其也可帶有脆性連接體片段)和效應(yīng)物-核酸分解產(chǎn)物(脆性連接體片段也可能仍與效應(yīng)物連接)，或者分解為錨(其也可帶有脆性連接體片段)和水解的效應(yīng)物分解產(chǎn)物(脆性連接體片段也可能仍與效應(yīng)物連接)。不與錨或效應(yīng)物保持連接的化合物降解后，也能產(chǎn)生脆性連接體的其它片段。本發(fā)明的烷化劑化合物的確切實施方案確定錨分解產(chǎn)物或效應(yīng)物分解產(chǎn)物是否帶有脆性連接體片段，或者是否產(chǎn)生脆性連接體的其它片段，這些片段不與錨或效應(yīng)物分解產(chǎn)物結(jié)合。
優(yōu)選的烷化劑化合物是在脆性連接體分裂后產(chǎn)生低誘變性分解產(chǎn)物的化合物。效應(yīng)物水解后化合物的誘變性主要歸因于錨部分，因為該錨與核酸相互作用，并且可能具有干擾核酸復(fù)制的能力，即使效應(yīng)物部分水解后仍如此。脆性連接體分裂后，錨片段具有大大降低的誘變性。
在本發(fā)明的其它實施方案中，在一段時間后從反應(yīng)混合物中去除能與核酸形成共價鍵的化合物。最佳反應(yīng)時間可以經(jīng)驗地確定，如下文實施例中所述。在共同擁有的美國專利申請系列號08/779,830、08/779,885和09/003,113中以及在1998年7月8日申請的共同擁有的美國專利申請代理人目錄號28217-20004.21和28217-20004.22中，提供了用于從反應(yīng)混合物中去除化合物的方法和組合物。上一句所提及的所有專利申請的公開內(nèi)容在此都完全引入作為參考。此外，也向反應(yīng)混合物中加入能與化合物反應(yīng)并使之失活的猝滅劑。在1998年1月6日申請的共同擁有的美國臨時專利申請系列號60/070,597和1998年7月6日申請的美國專利申請代理人目錄號28217-20006.00中，公開了典型的猝滅劑和方法；其公開內(nèi)容在此都完全引入作為參考。
多種類型適用于作為錨、連接體和效應(yīng)物。能在烷化劑化合物中使用的錨基團的實例包括但不限于嵌入物(包括芳族嵌入物)、小溝結(jié)合劑、大溝結(jié)合劑、通過靜電相互作用或疏水相互作用結(jié)合的分子以及通過序列特異性相互作用結(jié)合的分子。以下是可能的錨基團的非限制性列表吖啶(及吖啶衍生物，例如硫酸原黃素、吖啶黃素、二吖啶、吖啶酮、苯并吖啶、喹吖因)、放線菌素、蒽環(huán)酮、紫紅菌素、道諾霉素、噻噸酮(及噻噸酮衍生物，例如竹桃霉素D)、氨茴霉素、絲裂霉素、棘霉素(醌霉素A)、三骨菌素、橢圓玫瑰樹堿(及二聚體、三聚體及其類似物)、norphilin A、芴(及衍生物，如芴酮、芴二胺)、吩嗪、菲啶、吩噻嗪(例如氯丙嗪)、吩噁嗪、苯并噻唑、呫噸和噻噸、蒽醌、蒽吡唑、苯并噻喃吲哚、3，4-苯并芘、1-芘基環(huán)氧乙烷、苯并蒽、苯并二吡喃酮、喹啉(例如氯奎、奎寧、苯基喹啉、氨甲酰)、呋喃香豆素(例如補骨脂素和異補骨脂素)、乙錠、丙錠、coralyne和多環(huán)芳香烴及其環(huán)氧乙烷衍生物；偏端霉素、紡錘霉素、其它lexitropsin、Hoechst 33258及其它Hoechst染料、DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)、berenil和三芳基甲烷染料；黃曲霉毒素；精胺、亞精胺及其它多胺；和核酸或類似物，它們通過序列特異性相互作用如三股螺旋形成、D-環(huán)形成和與單鏈標靶的直接堿基配對來結(jié)合。這些化合物的衍生物也是錨基的非限制性實例，其中化合物衍生物包括但不限于，在任何位置帶有一種或多種任何種類的取代基的化合物，該化合物氧化或還原產(chǎn)物，等等。
能在本發(fā)明中使用的連接體的實例包括但不限于含有如下官能團的化合物，如酯(其中該酯的羰基碳位于錨與酯的sp3氧之間；該排列也叫做“正向酯”)、“反向酯”(其中該酯的sp3氧位于錨與該酯的羰基碳之間)、硫代酯(其中該硫代酯的羰基碳位于錨與該硫代酯的硫之間，也叫做“正向硫代酯”)、反向硫代酯(其中該硫代酯的硫位于錨與該硫代酯的羰基碳之間，也叫做“反向硫代酯”)、正向及反向硫羰酸酯、正向及反向二硫代羧酸、硫酸酯、正向及反向磺酸酯、磷酸酯、正向及反向膦酸酯基。“硫代酯”表示-C(＝O)-S-基；“硫羰酸酯”表示-C(＝S)-O-基，“二硫代羧酸”表示-C(＝S)-S-基。對于被稱為“正向”和“反向”的基團，正向是這樣的官能團方向，其中在官能團水解后，產(chǎn)生的酸性官能團可與錨部分共價連接，而產(chǎn)生的醇或硫醇官能團可與效應(yīng)物部分共價連接。反向是這樣的官能團方向，其中在官能團水解后，產(chǎn)生的酸性官能團可與效應(yīng)物部分共價連接，而產(chǎn)生的醇或硫醇官能團可與錨部分共價連接。
能在本發(fā)明中使用的效應(yīng)物的實例包括但不限于芥子基、芥子基相當(dāng)物、環(huán)氧化物、醛、甲醛合成體和其它烷化及交聯(lián)劑。芥子基被定義為含有單或雙鹵乙胺基和單鹵乙硫醚基。芥子基相當(dāng)物被定義為通過類似于芥子基的機制(即，通過形成一種吖丙啶鎓中間物，或者通過含有或形成一種氮丙啶環(huán)，它能與親核物質(zhì)反應(yīng))反應(yīng)的基團，如單或雙甲磺酰基乙胺基、單甲磺?；伊蛎鸦位螂p甲苯磺?；野坊蛦渭妆交酋；伊蛎鸦?。甲醛合成體被定義為能在水溶液中分解為甲醛的任何化合物，包括羥甲胺如羥甲基甘氨酸。美國專利號4,337,269和國際專利申請WO 97/02028中給出了甲醛合成體的實例。
用下列通式I、II和III描述能用來制備本發(fā)明的白細胞的烷化劑化合物。
通式I為
其中至少R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9之一是如下所述的-V-W-X-E，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9的剩余者獨立地選自-H、-R10、-O-R10、-NO2、-NH2、-NH-R10、-N(R10)2、-F、-Cl、-Br、-I、-C(＝O)R10、-C(＝O)-O-R10和-O-C(＝O)-R10，其中-R10獨立地為H、-C1-8烷基、-C1-8雜烷基、-芳基、-雜芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3雜烷基-芳基、-C1-3烷基-雜芳基、-C1-3雜烷基-雜芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3雜烷基、-雜芳基-C1-3烷基、-雜芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基；V獨立地為-R11-、-NH-R11-或-N(CH3)-R11-，其中-R11-獨立地為-C1-8烷基-、-C1-8雜烷基-、-芳基-、-雜芳基-、-C1-3烷基-芳基-、-C1-3雜烷基-芳基-、-C1-3烷基-雜芳基-、-C1-3雜烷基-雜芳基-、-芳基-C1-3烷基-、-芳基-C1-3雜烷基-、-雜芳基-C1-3烷基-、-雜芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基-、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基-或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基-；W獨立地為-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-O-S(＝O)2-O-、-S(＝O)2-O-、-O-S(＝O)2-、-O-P(＝O)(-OR10)-O-、-P(＝O)(-OR10)-O-、-O-P(＝O)(-OR10)-；X獨立地為-R11-；并且E獨立地選自-N(R12)2、-N(R12)(R13)、-S-R12和
其中-R12為-CH2CH2-G，其中每個G獨立地為-Cl、-Br、-I、-O-S(＝O)2-CH3、-O-S(＝O)2-CH2-C6H5或-O-S(＝O)2-C6H4-CH3；其中R13獨立地為-C1-8烷基、-C1-8雜烷基、-芳基、-雜芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3雜烷基-芳基、-C1-3烷基-雜芳基、-C1-3雜烷基-雜芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3雜烷基、-雜芳基-C1-3烷基、-雜芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基；及其所有的鹽和立體異構(gòu)體(包括對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體)。
根據(jù)通式I的一種優(yōu)選組合物是化合物S-303，其中V為-NHR11-，R11為-CH2CH2-，W為-C(＝O)-O-，X為-CH2CH2-，E為-N(R12)2，R12為-CH2CH2G，G為-Cl。參見共同擁有的PCT申請US98/00531。通式II為
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8獨立地選自-H、-R10、-O-R10、-NO2、-NH2、-NH-R10、-N(R10)2、-F、-Cl、-Br、-I、-C(＝O)R10、-C(＝O)-O-R10和-O-C(＝O)-R10，其中-R10獨立地為H、-C1-8烷基、-C1-8雜烷基、-芳基、-雜芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3雜烷基-芳基、-C1-3烷基-雜芳基、-C1-3雜烷基-雜芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3雜烷基、-雜芳基-C1-3烷基、-雜芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基；R20為-H或-CH3；并且R21為-R11-W-X-E，其中-R11-獨立地為-C1-8烷基-、-C1-8雜烷基-、-芳基-、-雜芳基-、-C1-3烷基-芳基-、-C1-3雜烷基-芳基-、-C1-3烷基-雜芳基-、-C1-3雜烷基-雜芳基-、-芳基-C1-3烷基-、-芳基-C1-3雜烷基-、-雜芳基-C1-3烷基-、-雜芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基-、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基-或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基-；W獨立地為-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-O-S(＝O)2-O-、-S(＝O)2-O-、-O-S(＝O)2-、-O-P(＝O)(-OR10)-O-、-P(＝O)(-OR10)-O-、-O-P(＝O)(-OR10)-；X獨立地為-R11-；并且E獨立地選自-N(R12)2、-N(R12)(R13)、-S-R12和
其中-R12為-CH2CH2-G，其中每個G獨立地為-Cl、-Br、-I、-O-S(＝O)2-CH3、-O-S(＝O)2-CH2-C6H5或-O-S(＝O)2-C6H4-CH3；其中R13獨立地為-C1-8烷基、-C1-8雜烷基、-芳基、-雜芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3雜烷基-芳基、-C1-3烷基-雜芳基、-C1-3雜烷基-雜芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3雜烷基、-雜芳基-C1-3烷基、-雜芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基；及其所有的鹽和立體異構(gòu)體(包括對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體)。
通式III為
其中至少R44、R55、R3、R4、R5和R8之一是-V-W-X-E，而R44、R55、R3、R4、R5和R8的剩余者獨立地選自-H、-R10、-O-R10、-NO2、-NH2、-NH-R10、-N(R10)2、-F、-Cl、-Br、-I、-C(＝O)R10、-C(＝O)-O-R10和-O-C(＝O)-R10，其中-R10獨立地為H、-C1-8烷基、-C1-8雜烷基、-芳基、-雜芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3雜烷基-芳基、-C1-3烷基-雜芳基、-C1-3雜烷基-雜芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3雜烷基、-雜芳基-C1-3烷基、-雜芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基；V獨立地為-R11-、-NH-R11-或-N(CH3)-R11-，其中-R11-獨立地為-C1-8烷基-、-C1-8雜烷基-、-芳基-、-雜芳基-、-C1-3烷基-芳基-、-C1-3雜烷基-芳基-、-C1-3烷基-雜芳基-、-C1-3雜烷基-雜芳基-、-芳基-C1-3烷基-、-芳基-C1-3雜烷基-、-雜芳基-C1-3烷基-、-雜芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基-、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基-、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基-或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基-；W獨立地為-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-O-S(＝O)2-O-、-S(＝O)2-O-、-O-S(＝O)2-、-O-P(＝O)(-OR10)-O-、-P(＝O)(-OR10)-O-、-O-P(＝O)(-OR10)-；X獨立地為-R11-；并且E獨立地選自-N(R12)2、-N(R12)(R13)、-S-R12和
其中-R12為-CH2CH2-G，其中每個G獨立地為-Cl、-Br、-I、-O-S(＝O)2-CH3、-O-S(＝O)2-CH2-C6H5或-O-S(＝O)2-C6H4-CH3；其中R13獨立地為-C1-8烷基、-C1-8雜烷基、-芳基、-雜芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3雜烷基-芳基、-C1-3烷基-雜芳基、-C1-3雜烷基-雜芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3雜烷基、-雜芳基-C1-3烷基、-雜芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3烷基、-C1-3雜烷基-芳基-C1-3雜烷基、-C1-3烷基-雜芳基-C1-3雜烷基或-C1-3雜烷基-雜芳基-C1-3雜烷基；及其所有的鹽和立體異構(gòu)體(包括對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體)。
應(yīng)當(dāng)理解，在上述通式I中，吖啶核是錨部分，-V-W-X-基團包括脆性連接體、E基團為效應(yīng)物基團。同樣，在上述通式III中，補骨脂素核是錨部分，-V-W-X-基團包括脆性連接體、E基團為效應(yīng)物基團。通式II是通式I的子集。
實施例7-12說明這些化合物的合成，用于產(chǎn)生本發(fā)明的白細胞。
在本發(fā)明的一種實施方案中，以前在共同擁有的美國專利號5,399,719(其公開內(nèi)容在此完全引入作為參考)中公開的4’-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5’，8-三甲基補骨脂素(“S-59”)也可用于對白細胞群體的光化學(xué)處理。
適用于本發(fā)明方法的可光活化化合物包括呋喃香豆素、放線菌素、蒽環(huán)酮、氨茴霉素、苯并二吡喃酮、芴和芴酮、單星脂肪藍、norphillinA、有機染料、菲啶、吩噻嗪硫鎓鹽、吩嗪、吩噻嗪、疊氮基苯、喹啉和噻噸酮。在此所述的可光活化化合物的優(yōu)選種通常是指呋喃香豆素。補骨脂素及衍生物補骨脂素是屬于呋喃香豆素組的平面芳香族有機化合物。補骨脂素存在于自然中，主要在植物中，包括椴樹、丁香、芹菜、歐防風(fēng)和無花果。至于人類，補骨脂素已經(jīng)用于對白癲風(fēng)、牛皮癬和蕈樣肉芽腫治療的光化學(xué)療法。關(guān)于補骨脂素光化學(xué)的綜述，參見Parsons，B.J.，光化學(xué)與光生物學(xué)32813-821，1980。以下顯示了補骨脂素的基本結(jié)構(gòu)。
特別地，本發(fā)明考慮補骨脂素，[7H-呋喃(3，2-g)-(1)-苯并吡喃-7-酮，或6-羥基-5-苯并呋喃丙烯酸的b-內(nèi)酯]，它是線性的
其中附加于中心芳香部分的兩個氧殘基具有1，3方向，另外其中的呋喃環(huán)部分連接于兩個環(huán)的香豆精系統(tǒng)的位置6上。補骨脂素衍生物由線性呋喃香豆素在位置3、4、5、8、4’或5’的取代所產(chǎn)生。
關(guān)于安全問題，補骨脂素已存在于我們的飲食中。無長波長UVA照射時，補骨脂素是相對無活性的。測得UVA激活的補骨脂素的有效半衰期為幾毫秒。照射后剩余的所有藥物都回復(fù)為無活性狀態(tài)，從而限制其副作用。
以前用于病原體滅活的方案需要在暴露于光線之前及光照期間從反應(yīng)中去除分子氧，來防止照射過程中產(chǎn)生的氧自由基對血液制品的損傷。參見L.Lin等人，血液74517(1989)；Wiesehahn的美國專利號4,727,027。本發(fā)明的方法能用來在氧存在下抑制白細胞的增殖。此外，應(yīng)用本發(fā)明的方法使用的新型補骨脂素，不需要降低分子氧的濃度。優(yōu)選的補骨脂素具有低誘變性和高核酸結(jié)合親和力。
8-甲氧基補骨脂素(在文獻中有不同的名稱，例如，花椒毒素、甲氧補骨脂素、8-MOP)是一種天然存在的補骨脂素，在埃姆斯試驗中具有低誘變性。
4’-氨甲基-4，5’，8-三甲基補骨脂素(AMT)是最有反應(yīng)性的核酸結(jié)合補骨脂素衍生物之一，可在每3.5個DNA堿基對中產(chǎn)生可達1個的AMT加合物(S.T.Issacs，G.Wiesehahn和L.M.Hallick，NCI專論(NCI Monograph)6621，1984)。
“4’-伯氨基取代的補骨脂素”或“4-PAP”被定義為這樣的補骨脂素化合物，其具有通過總長為2-20個碳的烴鏈與補骨脂素4’位置連接的NH2基，其中這些碳的0-6個獨立地被NH或O所取代，取代的每一點與取代的其它點至少隔開兩個碳，與補骨脂素至少隔開一個碳。4’-伯氨基取代的補骨脂素可以在補骨脂素的4、5’和8位置上具有其它的取代，這些取代包括但不限于下列基團H和(CH2)nCH3，其中n＝0-6。
“5’-伯氨基取代的補骨脂素”，在此也用縮寫“5-PAP”表示，被定義為這樣的補骨脂素化合物，其具有通過總長為1-20個碳的烴鏈與補骨脂素5’位置連接的NH2基，其中這些碳的0-6個獨立地被NH或O取代，取代的每一點與取代的其它點至少隔開兩個碳，與補骨脂素至少隔開一個碳。5’-伯氨基取代的補骨脂素可以在補骨脂素4、4’和8位置上具有其它的取代，這些取代包括但不限于下列基團H和(CH2)nCH3，其中n＝0-6。美國專利號5,585,503、5,578,736、5,556,993和5,399,719中公開了4-PAP和5-PAP的實例(包括S-59)以及它們的合成方法。
優(yōu)選的補骨脂素包括5’-伯氨基取代的補骨脂素和4’-伯氨基取代的補骨脂素(在此通稱為PAP)、8-甲氧基補骨脂素(8-MOP)、4’-氨甲基-4，5’，8-三甲基補骨脂素(AMT)、5-甲氧基補骨脂素(5-MOP)和三氧雜啉4，5’，8-三甲基補骨脂素。AMT、5-MOP、8-MOP和三氧雜啉是可商業(yè)獲得的。
最優(yōu)選的補骨脂素是具有以上所示結(jié)構(gòu)式的S-59(見縮寫S-59)。S-59是一種能通過嵌入與核酸可逆結(jié)合的合成補骨脂素。一旦用UVA照射，嵌入的S-59即形成單加合物并與RNA和DNA鏈間交聯(lián)。S-59光化學(xué)處理是核酸特異的，S-59易于穿過細胞膜和核膜。S-59兼具高水溶性和核酸結(jié)合親和力的特點，對于核酸加合物的形成具有高的量子產(chǎn)量。這使較低補骨脂素濃度能用于PCT，在無非特異性細胞損傷的情況下抑制增殖。對S-59的誘變性和基因毒性研究證明了對于用來凈化血液制品中的病原體的濃度而言40000-67000倍的安全限度。最后，用于PCT的S-59劑量大大低于呋喃香豆素(包括補骨脂素的化學(xué)基團)的平均每日飲食攝入量(Wagstaff.D.J.Reg.Tox.Pharm.14261-272，1991)。
在一種實施方案中，用一種可光活化化合物處理含有一種白細胞群體的細胞群體，該化合物含有一種在光活化后能與核酸形成共價鍵的部分。因此，為了與核酸形成共價鍵，可光活化化合物必須用光線活化。光線包括紫外線(UVA、UVB、UVC)和可見光。在一種實施方案中，用于PCT的波長范圍為200-450nm。在一種優(yōu)選實施方案中，用于PCT的光線波長為320-400nm。
優(yōu)選地，用波長為320-400nm的UV線光化學(xué)處理該細胞群體。單純的UVA照射對細胞引起最小的損傷。
在一種實施方案中，可光活化化合物包括一種補骨脂素分子。應(yīng)用適當(dāng)濃度補骨脂素和UVA線劑量的PCT將引起增殖抑制，而保持白細胞的免疫原性功能，例如，該功能可有效地促進疾病細胞、受感染細胞或病原體的破壞，誘導(dǎo)抗白血病反應(yīng)，便于第二種細胞群體的植入，促進免疫重建，利于免疫治療及治療混合嵌合狀態(tài)。補骨脂素反應(yīng)性不僅特別針對細胞中的核酸之于蛋白質(zhì)，而且對于DAN之于RNA分子也有不同的補骨脂素結(jié)合親和力，這是由于使得能更好嵌入DNA中的核酸結(jié)構(gòu)的不同(Cimino，G.D.等人，生物化學(xué)年述(Ann.Rev.Biochem.)541151-1193，1985)。另外，利用該技術(shù)，能區(qū)別性地修飾轉(zhuǎn)錄活性(相比無活性)基因，這是由于可影響補骨脂素結(jié)合的不同構(gòu)象和組蛋白結(jié)合狀態(tài)。因此，如PCT的處理具有主要在DNA合成(復(fù)制)水平上干擾細胞功能的能力，對轉(zhuǎn)錄有較小的影響，對蛋白質(zhì)合成有最小的影響或無影響。例如，在PCT的情況中，根據(jù)所用的補骨脂素濃度和UVA線劑量確定干擾的水平。
與可光活化化合物混合的白細胞樣品用一種光活化裝置光化學(xué)處理。通常，適用于本PCT方法的光活化裝置包括下列部分(a)一種裝置，用于提供適當(dāng)波長的電磁輻射，以引起可光活化化合物的活化；(b)在光活化期間支持多種樣品的裝置，它與提供輻射的裝置有固定的關(guān)系；和(c)在光活化期間使樣品溫度保持于希望的溫度范圍內(nèi)的裝置。
在一種實施方案中，該光活化裝置能夠發(fā)射出特定強度的電磁輻射光譜，包括200-450nm、優(yōu)選地320-400nm的波長。使用光活化裝置內(nèi)的適當(dāng)濾波器能選擇特定的波長。在Hearst等人的美國專利號5,184,020和5,503,721及WO 96/39820中公開了一種合適的光活化裝置以及利用該裝置光活化可光活化化合物的方法?？梢允褂玫钠渌饣罨b置包括General Electric F20TI2-BLB型熒光UVA燈泡(Alter，H.J.等人，柳葉刀241446(1988))和倫敦P.W.Allen Co.制造的A405-TLGW/05型長波長紫外線燈。用補骨脂素對白細胞的光化學(xué)處理在水中或在如以下實施例所述的適當(dāng)溶劑中制備補骨脂素貯存液。
將補骨脂素貯存液加入純化的供體白細胞群體懸液中至希望的終濃度。以上述制備方法，用8-MOP飽和的PAS制備用8-MOP處理的單位。在光活化裝置中用UVA線照射純化的供體白細胞，至10-3-100J/cm2的終劑量。照射期間攪拌樣品。在照射之前采取白細胞樣品作為對照。
一般而言，向純化的白細胞制劑中加入濃度為10-4-150μM、優(yōu)選地10-3-150μM的PAP。白細胞的細胞密度一般為約10-109細胞/ml，優(yōu)選地約103-108細胞/ml，更優(yōu)選地約104-107細胞/ml，最優(yōu)選地約2×106細胞/ml，在一種優(yōu)選實施方案中，利用波長為320-400nm的紫外線對與S-59混合的白細胞進行PCT。將光活化方法限于大于320nm的波長使直接核酸損傷減到最小，因為高于313nm時核酸的吸收很小。細胞優(yōu)選地將接受約10-3-100J/cm2、更優(yōu)選地1-3J/cm2的光劑量。在一種最優(yōu)選的實施方案中，光劑量為3J/cm2。照射一般為1-50mW/cm2的光強度。白細胞樣品暴露于UV線的時間為約1秒到60分鐘，優(yōu)選地約3分鐘，更優(yōu)選地約1分鐘。
PCT后，如上及實施例所述測定白細胞樣品增殖及參與白細胞活性的效能。主要是測定下列參數(shù)細胞生存力、增殖能力、細胞因子分泌和表面抗原表達。治療應(yīng)用本發(fā)明的經(jīng)處理的白細胞群體是不增殖的但保留免疫學(xué)活性，如下所述具有多種預(yù)防及治療用途。一般地，接受含有經(jīng)處理的白細胞群體的DLI的個體包括但不限于移植患者，如BM后移植患者或預(yù)期進行實體器官移植的患者。經(jīng)處理的白細胞不能引起GVHD這一事實使得在DLI中能施用更大量的白細胞(即更大的細胞劑量)，從而使治療的效能達到最大。
經(jīng)處理的白細胞可用于供體白細胞輸注(DLI)，尤其是對異體BMT患者或無免疫應(yīng)答患者(如患有CLL的老年患者)提供免疫活性。使用經(jīng)處理的白細胞的DLI可用于緩解包括下列的多種病癥白血病，包括慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓單核細胞性白血病(CmML)、急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴母細胞性白血病(ALL)；多發(fā)性骨髓瘤(MM)；非何杰金氏淋巴瘤和何杰金氏淋巴瘤；大細胞淋巴瘤(LCL)；和EB病毒誘導(dǎo)的B淋巴增生性疾病(EBV-BLPD或EBV-誘導(dǎo)的淋巴瘤)；
實體瘤，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌和結(jié)腸癌、黑素瘤、腎細胞癌、成神經(jīng)細胞瘤、頭頸腫瘤；再生障礙性貧血；脊髓發(fā)育不良；免疫缺陷，例如常見多種免疫缺陷、SCID、維-奧二氏綜合癥；粒性白細胞缺乏癥；混合嵌合狀態(tài)；和遺傳病。
DLI可以用于預(yù)防或治療目的的多種形式(a)對所有同種異體移植的過繼免疫治療；(b)對于免疫抑制或免疫缺陷患者的免疫重建；(c)對不適于移植的老年白血病患者的治療(d)BMT少量或小型移植。
BMT少量方案是兩個步驟的方法，包括i)使用最小條件方案和供體干細胞對移植耐受性的誘導(dǎo)；和ii)重復(fù)用DLI的治療。該方案避免了化學(xué)治療方案的毒性。BMT少量方案適用于下列適應(yīng)癥不能正常地適于移植的患者，尤其是老年患者(＞65歲)；CLL患者，其中大多數(shù)嚴重?zé)o免疫應(yīng)答。BMT少量方案降低了毒性、GVHD和感染。以下實施例13中描述了一種典型的BMT少量方案。
(e)CD34選擇的/T細胞排除的同種異體移植加同時的DLI。
與CD34+選擇的細胞(為了富集干細胞及祖細胞的選擇)同時提供的DLI可用于提供對感染的過繼免疫治療，如CMV、EB病毒(EBV)、腺病毒(Ad)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒引起的感染，和真菌感染，并可用于治療白血病，例如CML。
(f)混合嵌合狀態(tài)的治療。
(g)補救化學(xué)治療或化學(xué)抗性白血病。
在本發(fā)明的一種實施方案中，在單倍體相同的(單倍)移植中施以PA-DLI。一般地，單移植需要幾乎完全的T細胞排除，導(dǎo)致嚴重的、持續(xù)的免疫抑制。PA-DLI可用于保持宿主的免疫活性；另外，可為癌癥的治療提供GVL效應(yīng)。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的無GVHD能力但保留某些免疫功能的白細胞，在DLI中用于復(fù)發(fā)性癌癥的緩解或同種異體BMT后最小殘余疾病的去除，尤其是CML和急性白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。對CML的bcr-abl蛋白質(zhì)特異的大量供體CTL有助于復(fù)發(fā)CML中DLI的效能。如果通過醫(yī)生常規(guī)用來監(jiān)測癌細胞存在的方法能檢測到惡性細胞，則確定癌癥患者患有“復(fù)發(fā)”。
在另一種實施方案中，在誘導(dǎo)化學(xué)治療(化學(xué)治療的最初一輪)期間白血病患者的治療中使用含有非增殖性白細胞的DLI，來避免重度骨髓抑制方案并消除最小殘余疾病。在該安排中使用DLI，能降低誘導(dǎo)期間所用化療藥物的有毒劑量。
在本發(fā)明的一種實施方案中，PA-DLI也能用于實體器官的移植(例如腎臟、心臟、皮膚)，作為一種提高異體移植物壽命和供體器官接受的機會的方法。由于供體器官中過客白細胞的存在，在異體移植中大多發(fā)生器官排斥。由于不能增殖且不能介導(dǎo)GVHD，DLI(使用器官供體的白細胞)可作為移植前耐受方案，用于將以其它方式誘導(dǎo)器官排斥的免疫應(yīng)答的抑制。對于實體器官移植的宿主的耐受包括下列步驟在器官移植過程之前或期間，用相當(dāng)水平的重度骨髓抑制方案進行含或不含供體干細胞的PA-DLI輸入，使供體細胞能在循環(huán)中存活。DLI可便于該方案中供體干細胞的植入，允許宿主中的混合嵌合狀態(tài)。
在所有類型的移植和植入情況中，能在移植之前、同時或之后對宿主施用經(jīng)處理的白細胞。能在這些時間中的任何時間進行多次經(jīng)處理的細胞群體的輸注。
不增殖的、免疫功能性的白細胞對于由于高齡或comorbid病而禁忌傳統(tǒng)異體BMT的患者的DLI特別重要?；加邪┌Y的老年患者(＞65歲)不是異體BMT的主要候選者，部分地是由于移植不能很好地重建老化的免疫系統(tǒng)，并由于該方法的嚴格性。當(dāng)前，對控制老年患者中的癌癥有效的唯一選擇是化學(xué)治療，其副作用對于這些患者是無法忍受的。本發(fā)明的經(jīng)處理的白細胞提供一種十分需要的備擇方法，用于治療老齡患者癌癥并提供對機會感染的免疫防御。DLI對于破壞癌細胞而不引起伴隨的GVHD是有用的。
有些治療情況中，在用上述化合物處理供體白細胞群體之前，擴展供體白細胞亞群尤其是抗原特異性T細胞和前身細胞是所希望的。能用對疾病細胞(例如，腫瘤相關(guān)抗原)或病原體特異的抗原刺激白細胞群體，來擴展/富集對該抗原特異的細胞毒性及輔助T細胞的數(shù)量。通過在從被刺激的供體中分離白細胞之前用適當(dāng)抗原接種供體，能在體內(nèi)進行刺激；此外，在用化合物處理白細胞群體之前能在體外進行對分離白細胞的刺激。
例如，用多發(fā)性骨髓瘤患者的IgG接種的供體含有高水平的骨髓瘤特異的前身CTL。因此，對于治療多發(fā)性骨髓瘤(MM)中的應(yīng)用，從這些接種的供體中制備白細胞是優(yōu)選的。Hsu，F(xiàn)J等人，國家醫(yī)學(xué)(Nat.Med.)252-58，1996中描述了為了用非何杰金氏淋巴瘤免疫患者而用腫瘤相關(guān)肽對樹突細胞脈沖。在Stingl，G.等人，今日免疫(Immunol.Today)16330-333，1995中綜述了用肽/抗原對樹突細胞脈沖的技術(shù)。Pardoll，D.等人，免疫(Immunity)3165-169，1995中描述了cDNA免疫(用合適的cDNA轉(zhuǎn)染樹突細胞)。在用于CML治療的過繼免疫治療中，在分離供體白細胞之前，能用bcr-abl肽接種供體，用于通過本發(fā)明的方法治療及隨后的輸注。例如，ten Bosch，G.等人，血液883522-3527，1996描述了用于接種的有效的及免疫原性的肽。在另一種實施例中，在根據(jù)本發(fā)明的方法治療之前，用前列腺特異性抗原(PSA)在體內(nèi)或體外預(yù)刺激用于前列腺癌治療的供體白細胞。這樣的接種能用于增加前身T細胞群體和/或?qū)ζ渌[瘤特異性抗原、病毒抗原及其它病原體抗原特異的T細胞群體。
用合適的抗原接種的供體的白細胞可用于為無免疫應(yīng)答的患者提供對機會感染的免疫防御的預(yù)防或治療，這些機會感染如巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒或腺病毒(Ad)感染。一種實例中，能對CMV抗原接種供體，分離其白細胞，并根據(jù)本發(fā)明的方法處理，以在DLI中用來治療由于免疫抑制而患CMV感染的患者。無免疫應(yīng)答的患者包括處于免疫抑制藥物治療中的患者，如器官移植患者(BM及其它器官)、HIV或EBV感染的人體、癌癥患者和具有免疫缺陷病的個體。
也能在體外刺激供體白細胞(也被稱為離體的擴展)來擴大前身細胞集合。例如，在多發(fā)性骨髓瘤情況中，在治療阻斷GVHD活性之前，通過與由樹突細胞呈遞的患者特異的MM抗原在體外一起培養(yǎng)，能刺激供體白細胞。
也能利用離體的或體外刺激擴展抗白血病T細胞群體用于CML的治療。在CML中，染色體9上的c-abl癌基因向染色體22上的斷點簇區(qū)(bcr)的經(jīng)典易位(t(9；22)(q34；q11))產(chǎn)生bcr-abl融合基因及bcr-abl210kD融合癌蛋白質(zhì)的表達。bcr-abl融合蛋白質(zhì)是CML特異的，bcr-abl蛋白質(zhì)的兩種主要變體是良好表征的抗原。能進行體外刺激來擴展bcr-abl蛋白質(zhì)特異的T細胞，例如，如Choudhury，A.等人，血液891133-1142，1997；ten Bosch，G.等人，血液883522-3527，1996及Mannering等人，血液90290-297，1997所述。代表斷點區(qū)或接點(新的接點氨基酸序列)的肽能作為免疫原，用于對來源于健康供體的人T細胞的體外免疫(參見，ten Bosch，G.等人，1996，如上文；Mannering等人，1997，如上文)。產(chǎn)生的CD4+T細胞識別來源于同種異體CML患者的bcr-abl表達細胞。在另一種方法中，能從CML患者的外周血細胞中體外產(chǎn)生樹突細胞(DC)，并作為抗原呈遞細胞用于抗白血病T細胞的離體擴展(Choudhury等人，1997，如上文)。一般來說，供體抗原呈遞細胞(APC)能用表現(xiàn)疾病細胞特征的抗原脈沖，或者能與疾病細胞(例如，滅活的腫瘤細胞)協(xié)同培養(yǎng)；然后可在向受體中輸入供體白細胞之前使這些APC接觸供體白細胞。此外，供體白細胞與疾病細胞(或疾病細胞抗原)的直接接觸能用來擴展供體淋巴細胞中的T細胞群體。
用來擴展T細胞的“抗原”可以是多肽、脂類或碳水化合物部分(或任何組合，如糖蛋白)，并能從疾病細胞或病原體中分離或重組產(chǎn)生。含有多肽的抗原不需要組成全長的蛋白質(zhì)，只要它包括至少一種表位即可。該抗原能作為全長蛋白質(zhì)或其片段或作為重組產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)包含于疫苗組合物中，可與或者不與一種佐劑結(jié)合或以其它方式呈遞。疫苗能采用多種形式表達抗原的疾病細胞，或其細胞膜制劑；或者病原體，優(yōu)選地為滅活形式。制備疫苗的方法在文獻中有講授，參見，例如，Harlow，如上文。免疫和體外(離體)刺激和前身細胞群體擴展的方法在本領(lǐng)域中已知，參見，例如，Choudhury，A.等人，血液891133-1142，1997；ten Bosch，G.等人，血液883522-3527，1996；Mannering等人，血液90290-297，1997。
對于體內(nèi)應(yīng)用，白細胞一般在血漿、合成培養(yǎng)基或其它生理緩沖溶液中施用，劑量為每次輸注每kg大約105-1011個白細胞，體積大約為50-500ml或更多。這些參數(shù)隨治療和疾病而不同，并由治療患者的醫(yī)生來決定。標準DLI實踐是以每kg體重107-108個細胞的劑量施用白細胞。能與化學(xué)治療結(jié)合施行DLI。
對于體內(nèi)應(yīng)用，本發(fā)明的白細胞一般是靜脈內(nèi)施用的。
在BMT后90天內(nèi)GVHD通常是明顯。為了緩解癌癥復(fù)發(fā)患者中的疾病，優(yōu)選地在復(fù)發(fā)診斷后1周-3月內(nèi)進行DLI。對于異體BMT后的過繼免疫治療，能從BMT之前到幾年后進行DLI作為維持治療。對于接受DLI代替BMT的癌癥患者，優(yōu)選地在癌癥診斷不久后即施以DLI。在不進行BMT時，能在化學(xué)及放射方案或其它治療方案之前、期間或之后進行DLI。在所有指標中，DLI的適當(dāng)時間安排將由在疾病治療方面熟練的醫(yī)生來確定。
治療成功的評價DLI后，就常規(guī)方法后的GVHD監(jiān)測宿主或患者。在輸注后90天內(nèi)GVHD通常是明顯的。臨床GVHD癥狀包括皮疹、腫脹和肝、腸、肺及關(guān)節(jié)損傷、嚴重的腹瀉和黃疸。能測定患者膽紅素和肝功能酶的水平，并且也能進行肝臟的活組織檢查。能定期對接受DLI的患者監(jiān)測詳細病史、身體檢查、綜合實驗室評價，包括完全血細胞計數(shù)和差別血細胞計數(shù)、尿分析、血液尿素氮肌酸酐、膽紅素、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶、Na+、K+、Cl-、清蛋白、總蛋白質(zhì)、葡萄糖和放射顯影檢查。癌癥狀況能通過例如骨髓抽取檢查和活組織檢查、細胞遺傳檢查(包括免疫組化分析)和分子分析來評價。
對于本發(fā)明，如果有可見的或可測量的疾病癥狀或疾病引起的癥狀的好轉(zhuǎn)，則本發(fā)明經(jīng)處理的白細胞的受體病情緩解(病情指惡性腫瘤或感染)。癥狀及評價其好轉(zhuǎn)的方法隨病情而不同，但為臨床醫(yī)生所熟悉。用來評價治療成功的一種有用的終點是100天的死亡率。
本發(fā)明的方法和組合物也可用于非DLI情況中GVHD的預(yù)防。這些包括但不限于血小板轉(zhuǎn)輸及血小板貯存過程中細胞因子積累引起的發(fā)熱、非溶血性輸血反應(yīng)。
本方法及本發(fā)明的經(jīng)處理的、不增殖的白細胞也具有體外用途。例如，PCT方法是在原代培養(yǎng)物或具有分化能力的細胞系(如祖細胞和干細胞)中抑制DNA合成而不影響細胞生物合成的最低侵入性方法。因此，能在試驗中用處理條件來制備分離的干細胞、白細胞或其它細胞系，從而檢測細胞分化或發(fā)育步驟是否取決于增殖/DNA合成。這些研究可以鑒定沿分化或發(fā)育途徑的靶分子，并且有利于抑制或促進分化的藥物的發(fā)展。例如，也能用經(jīng)處理的白細胞作為單向MLR試驗中的刺激細胞，來刺激有增殖能力的同種異體細胞的免疫應(yīng)答，而刺激細胞本身不同時增殖。使用能與DNA形成共價鍵的化合物的PCT及有關(guān)處理，將代替當(dāng)前輻射或絲裂霉素C的應(yīng)用，來實現(xiàn)刺激細胞的細胞抑制(cytostatis)。對于體外應(yīng)用，能單獨或作為測定試劑盒的一部分來提供經(jīng)處理的白細胞或其它細胞的組合物。該測定試劑盒能用于MLR或用于分化測定。為此目的，經(jīng)處理的細胞一般以冷凍形式提供。此外，試劑盒可提供用于制備白細胞或具有上述特征的其它細胞的試劑和說明書。這些試劑包括一種或多種能與DNA形成共價鍵的化合物。例如，一種用于PCT的試劑盒將包括一種或多種可光活化化合物，優(yōu)選地為PAP或吖啶，更優(yōu)選地為S-59。
下列實施例是為了說明在此所述的本發(fā)明而不是限制其范圍。對該方法的有些修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是易于明白的，并且包含于權(quán)利要求書中。
實施例多種試驗根據(jù)3H胸苷摻入的增殖測定法在一種典型測定中，在測試化合物(例如DNA復(fù)制抑制劑或促分裂原)的存在或不存在下，在96孔板中將細胞培養(yǎng)預(yù)期的一段時間。使用大約20Ci/mmol比活的3H胸苷制備一般含有1μCi/50μl/孔的介質(zhì)。將該介質(zhì)/標記物加入細胞中，并將細胞于37℃溫育約4-6小時或更長。為方便起見，用一種多通道細胞收集器將細胞轉(zhuǎn)移到濾紙片上，并洗掉游離的(未摻入的)標記物。然后干燥該濾片，轉(zhuǎn)移至小瓶，并浸于閃爍液中。然后可將小瓶置于自動計數(shù)器中，計數(shù)氚全范圍，確定一式三份樣品的每分鐘平均計數(shù)(cpm)?；衔?DNA加合物的測定用3H標記的PAP測定DNA修飾的程度。向純化的白細胞樣品中加入PAP至希望的終濃度。以適當(dāng)?shù)腢V線劑量照射小型-PL2410塑料容器中的20mL等份。對照樣品在無UVA時只用PAP處理。照射后，純化白細胞DNA。通過測定260nm的吸光度測定每一樣品的DNA含量。由DNA樣品的放射性計算每1000個堿基對(bp)的補骨脂素加合物的數(shù)量。標準曲線使3H計數(shù)的量與加合物的數(shù)量相關(guān)。PCR抑制試驗聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法在本領(lǐng)域中眾所周知。參見K.B.Mullis等人，美國專利號4,683,195和4,683,202，在此引入作為參考。可用該試驗來估計PAP-DNA加合物對特定核酸序列的模板功能的作用。
為了獲得HLA-DQα基因座中的242bp序列或?qū)Ζ?珠蛋白基因座中的439bp序列，PCR擴增由光化學(xué)處理的或γ照射的血小板濃縮物獲得的DNA樣品(1μg)。連續(xù)稀釋(1∶10)然后擴增對照(未處理的)DNA。不稀釋地擴增處理的DNA。PCR擴增進行35個循環(huán)。該試驗提供了一種方法，用于將細胞增殖試驗所測定的功能性T細胞增殖抑制與核酸的直接修飾相關(guān)聯(lián)。
下列實施例1-4表明，PCT對被處理白細胞性質(zhì)的影響與白細胞DNA的修飾及聚合酶活性的抑制相關(guān)。其次，對血小板濃縮物中白細胞的PCT處理能防止鼠轉(zhuǎn)輸模型中轉(zhuǎn)輸激活的GVHD。
實施例1T細胞的光化學(xué)滅活實施例1證明，PCT能以依賴劑量的方式滅活白細胞。作為例子，補骨脂素，可使用S-59、AMT和8-MOP。PCT的劑量依賴性隨所用補骨脂素的性質(zhì)而不同，S-59是所試最有效的。
表征了應(yīng)用S-59(正方形)、4’-氨甲基4，5’，8-三甲基補骨脂素[AMT](三角形)和8-甲氧基補骨脂素[8-MOP](圓形)的光化學(xué)處理對血小板濃縮物(PC)中白細胞的劑量相關(guān)的作用，結(jié)果顯示于圖1中。血小板濃縮物如美國專利號5,593,823所述制備并處理，該專利在此引入作為參考。在LDA試驗中將來自于光化學(xué)處理的及未處理的合并隨機供體PC的白細胞加于板上。在1焦耳/cm2UVA的恒定光劑量下使用不同濃度的三種補骨脂素。用0.05μM S-59、1.0μM AMT和10.0μM 8-MOP滅活T細胞至LDA的檢測下限(用箭頭標出)。這些數(shù)據(jù)清楚地表明，在抑制T細胞增殖方面，與AMT和8-MOP相比，S-59是更好的光試劑。
實施例2混合白細胞反應(yīng)從4個個體中抽取外周血置于抗凝劑檸檬酸葡萄糖(ACD)試管中。通過在Ficoll上的密度梯度離心分離外周血單核細胞(PBMC)。合并三名供體的PBMC，用作異體刺激物。剩余個體的PBMC用作效應(yīng)物。刺激物和效應(yīng)物PBMC用補加有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI洗兩次，重懸浮于補加培養(yǎng)基中。
使刺激物PBMC暴露于血庫137銫輻射體的2500cGyγ輻射下。然后將刺激物細胞以含有1.0×105個細胞的100μL等份加于96孔圓底平板中。
效應(yīng)物細胞如下經(jīng)受應(yīng)用S-59的PCT。將效應(yīng)物細胞重懸浮于30mL上述細胞培養(yǎng)基中，并向細胞懸液中加入水性S-59貯存液(溶解于水中)至圖2、圖3或圖4中所說明的終濃度。S-59貯存液的濃度和使用體積依希望的S-59終濃度而不同。然后將含有S-59的30mL細胞溶液轉(zhuǎn)移到小PL2410袋中，用3J/cm2劑量的UVA線照射。對于圖3，光劑量為3.0J/cm2。然后離心細胞，重懸浮于細胞培養(yǎng)基中，以含有1.0×105個細胞的100μL等份加板，并與刺激物細胞混合為每孔200μL的終體積。
然后在37℃、5％CO2下溫育培養(yǎng)板。溫育1、2及7天后取出MLR的上清液樣品，貯存于-80℃，用于隨后的細胞因子分析。用來測定細胞增殖的孔溫育6天。6天溫育后，用來測定細胞增殖的所有孔接受1μCi3H胸苷。在3H胸苷存在下溫育24小時后，將細胞收獲于玻璃纖維紙上。然后通過液體閃爍計數(shù)定量摻入的3H胸苷的量。圖2顯示了用不同濃度S-59光化學(xué)處理的效應(yīng)細胞的3H胸苷摻入的結(jié)果。
用R&D Systems提供的ELISA測定試劑盒按照使用說明書進行被處理細胞的細胞因子IL-2和IFN-γ合成的分析。圖3和圖4分別顯示IL-2和干擾素-γ產(chǎn)生的結(jié)果。圖4中，對第7天采取的細胞培養(yǎng)基進行IFN-γ分析。
實施例3PCT的白細胞功能調(diào)節(jié)實施例3表明，用于PCT的補骨脂素濃度和光劑量能調(diào)節(jié)根據(jù)細胞因子合成和表面標記表達(例如CD69淋巴細胞活化標記表達)確定的白細胞活性。該數(shù)據(jù)提供了證據(jù)表明，能滴定UVA光劑量和可光活化化合物的濃度，來獲得對于阻斷白細胞群體中的T細胞增殖及保持白細胞活性都有效的適當(dāng)范圍，正如細胞因子合成和表面標記表達所證明的。a.PCT對細胞因子合成的調(diào)節(jié)以0.5J/cm2UVA的恒定光劑量用不同濃度S-59的PCT后也測定了IL-8的合成(見圖5)。發(fā)現(xiàn)用隨S-59濃度逐漸增加的PCT能調(diào)節(jié)IL-8合成。在S-59濃度范圍內(nèi)以1.0J/cm2UVA時也獲得相似的行為(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明，細胞因子的合成能被用于PCT的補骨脂素濃度和光劑量所調(diào)節(jié)。b.PCT處理后白細胞上CD69表達的調(diào)節(jié)借助于CD69的熒光抗體和FACS掃描分析，測定被PMA和鈣離子載體激活后白細胞對CD69表達的誘導(dǎo)(見圖6)。用不同濃度AMT和1J/cm2UVA光化學(xué)處理后隨時間的變化測定CD69的表達。也發(fā)現(xiàn)PCT對CD69表達誘導(dǎo)的影響是依賴補骨脂素劑量的，在AMT濃度越來越高時，CD69的表達顯示更大的抑制。在本研究中為S-59的低劑量時，誘導(dǎo)保持不變。
實施例4PCT引起的DNA修飾實施例4表明，PCT對所處理白細胞性質(zhì)的影響與白細胞DNA修飾和聚合酶活性的抑制相關(guān)。
利用3H放射性標記的S-59、AMT和8-MOP加1.9J/cm2UVA以及對經(jīng)處理的白細胞的分離DNA的閃爍計數(shù)，在合并的隨機供體PC的光化學(xué)處理后測定白細胞基因組DNA上的補骨脂素加合物(圖7)。用150μM S-59、AMT和8-MOP的光化學(xué)處理分別誘導(dǎo)12.0、6.0和0.7個加合物/1000bp DNA。PCT后被處理白細胞基因組DNA上加合物的相對數(shù)量與PCT對白細胞功能的影響相關(guān)，并且證明該影響是DNA修飾的直接后果。PCR抑制試驗中對DNA聚合酶DNA擴增的抑制(數(shù)據(jù)未顯示)顯示對PCT過程中所用補骨脂素濃度的相同依賴性。
由在此用于研究PCT對白細胞體外影響的所有生物學(xué)及分子參數(shù)得出的結(jié)果是一致的。通過有限稀釋分析對白細胞功能的估計、細胞因子產(chǎn)生的測定及補骨脂素誘導(dǎo)的DNA損傷的定量顯示，PCT以劑量依賴的方式滅活白細胞。使用適當(dāng)?shù)膭┝?，能控制白細胞的功能如細胞因子的產(chǎn)生或抗原性標記的表達。另外，在所試的三種補骨脂素中，S-59在滅活白細胞方面是最有效的。S-59抑制T細胞增殖的劑量范圍大約為3.5log單位。因此，能抑制白細胞增殖和伴隨的GVHD但保留免疫功能的劑量窗口大于其它滅活方法所提供的。
實施例5鼠轉(zhuǎn)輸模型中TA-GVHD的預(yù)防下列鼠轉(zhuǎn)輸模型是很好表征的模擬人TA-GVHD臨床綜合征的模型(Fast，LD等人，血液82292，1993)。根據(jù)預(yù)期的體外結(jié)果，使用該體內(nèi)模型，通過將純合親本(A株，H-2a)的脾細胞轉(zhuǎn)輸?shù)矫庖呋钚噪s合F1雜交受體(B6AF1株，H-2a/b)中，來估計S-59光化學(xué)處理對TA-GVHD抑制的影響。
經(jīng)外側(cè)尾靜脈將大約108個的供體(A或F1)脾細胞輸入每一受體(F1)中。由密度梯度離心獲得的脾細胞用作活T細胞的來源。使用三個轉(zhuǎn)輸組(1)處理對照組(F1→F1)將B6AF1脾細胞輸入B6AF1受體中；(2)陽性TA-GVHD對照組(A→F1)將供體A脾細胞輸入B6AF1受體中；(3)S-59光化學(xué)處理組(PCT A→F1)用150μM S-59和3焦耳/cm2UVA處理供體A的脾細胞，然后輸入B6AF1受體中。
轉(zhuǎn)輸后2周內(nèi)監(jiān)測受體的TA-GVHD的生物學(xué)證據(jù)。用雙色熒光激活流式細胞儀分析受體脾細胞的供體T細胞移植。該試驗中，用pan-T細胞、抗-CD3抗體也用抗H-2b抗體染色脾T細胞。根據(jù)與抗H-2b抗體反應(yīng)的缺乏檢測供體A的T細胞。在對照實驗中，F(xiàn)1→F1受體的超過99％的CD3陽性脾細胞都用抗H-2b抗體標記。平行地，用51Cr裂解試驗測定受體脾臟中細胞毒性淋巴細胞(CTL)的存在。將脾細胞與51Cr標記的EL-4細胞(H-2b)以150∶1的效應(yīng)物靶比值在37℃下溫育4-6小時。根據(jù)靶細胞的裂解和51Cr向培養(yǎng)基中的釋放來測定CTL的細胞毒性。
結(jié)果表明，盡管在本研究期間對照F1→F1組中的受體仍然健康，但A→F1組中的受體在供體脾細胞輸入2-3周后發(fā)展TA-GVHD的生物學(xué)癥狀。TA-GVHD的特征在于脾大、供體T細胞(H-2a)的移入(28.6±11.3％)和受體脾臟中CTL的存在(35±18.7％51Cr裂解)(表1)。
轉(zhuǎn)輸兩周后通過測定脾臟∶體重比值來估計脾大。轉(zhuǎn)輸三周后通過胸腺細胞結(jié)構(gòu)的評價來檢測免疫缺陷的發(fā)展。胸腺發(fā)育不全是與TA-GVHD相關(guān)的獲得性免疫缺陷的可靠指標。
也監(jiān)測受體的GVHD臨床癥狀，包括體重、姿勢、活動、皮膚完整性、毛皮質(zhì)地、白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)和血小板計數(shù)。F1→F1組中健康動物的每周體重隨時間增加，而A→F1組中動物的平均體重不隨時間增加。
A→F1組中動物的平均臨床得分(0-2級，健康動物為0級)隨時間增加，表明TA-GVHD表面上是明顯的并逐漸地加重。PCT A→F1組中的動物類似于對照F1→F1組中的動物，仍然健康并且沒有可見的TA-GVHD臨床表現(xiàn)。當(dāng)轉(zhuǎn)輸后超過10周時在A→F1組中觀察到25％的死亡率，而對照F1→F1和PCT A→F1組中的所有動物都保持健康。
表1
1.S.D.＝標準差2.轉(zhuǎn)輸兩周后測定3.轉(zhuǎn)輸三周后測定在盲編后制備組織切片并檢查其組織學(xué)異常。對肝臟評價淋巴浸潤液的存在與膽管破壞及血管內(nèi)皮炎癥和浸潤。就淋巴小囊的保留或破壞評價脾的組織學(xué)。評價皮膚切片的皮下區(qū)和附器中的淋巴浸潤。評價骨髓切片每一主要譜系脊髓、細胞胞類和巨核細胞的細胞結(jié)構(gòu)和成熟。在盲試中，A→F1小鼠在肝、脾、骨髓和口腔粘膜中發(fā)展GVHD的組織學(xué)證據(jù)。相反，光化學(xué)處理的供體細胞(PCT-A)或同源細胞(F1)的受體不顯示組織學(xué)異常。
用濃度為50nM-150μM的S-59和3J/cm2UVA處理的輸入細胞的幾組小鼠的轉(zhuǎn)輸，在該范圍內(nèi)顯示完全的GVHD抑制。這表明GVHD能被PCT體內(nèi)抑制的劑量窗口類似于體外試驗所獲得的。
體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)的結(jié)論為，在3.5對數(shù)單位的S-59濃度中，對白細胞的PCT處理在體外能抑制其增殖并且在體內(nèi)抑制TA-GVHD。對于相同的濃度范圍，觀察到體外白細胞功能(細胞因子合成和表面分子表達)的依賴劑量的調(diào)節(jié)。
實施例6本實施例描述了一種方法，用來確定適于抑制GVHD而保留DLI的GVL效應(yīng)的PCT條件，例如用于在對同種異體BMT后復(fù)發(fā)白血病患者的治療。實驗?zāi)康目偨Y(jié)如下。
A.在PCT中使用的補骨脂素濃度范圍的確定，以防止體外淋巴細胞的增殖，從而抑制GVHD。
B.體外光化學(xué)處理的白細胞表型的表征，以確定細胞生存力和預(yù)示產(chǎn)生體內(nèi)GVL效應(yīng)的T細胞及NK細胞表面抗原的表達。
C.對體外經(jīng)處理的白細胞的細胞因子表達的定性及定量分析。
D.鼠白血病模型中體內(nèi)經(jīng)處理的白細胞-DLI對GVHD抑制的證明。用補骨脂素對白細胞的光化學(xué)處理如下所述制備補骨脂素的貯存液。通過在10mL蒸餾水中溶解50mgAMT粉末制備15mM的AMT貯存液。劇烈混合該溶液，并通過0.2μm針筒式濾膜過濾。使用Shimadzu UV160U分光光度計測定溶液在250nm的吸光度，來確定濾過液中AMT的濃度。用25000M-1cm-1的消光系數(shù)值計算AMT的濃度。
通過在蒸餾水中溶解S-59粉末制備S-59補骨脂素的貯存液。劇烈混合該溶液，并通過0.2μm針筒式濾膜過濾。使用Shimadzu UV160U分光光度計測定溶液在250nm的吸光度，來測定濾過溶液中S-59的濃度。用25400M-1cm-1的消光系數(shù)值計算S-59的濃度。
8-甲氧基補骨脂素(8-MOP)在水溶液中是溶解度較差。因此，使用以8-MOP飽和的PAS溶液(PAS，可從Baxter獲得，是一種人工血液代用品，由pH7.2、300mOsm的乙酸鈉、檸檬酸三鈉、氯化鈉磷酸緩沖液組成)制備用8-MOP和紫外線處理的白細胞制劑。通過在100mLPAS中懸浮100mg 8-MOP制備其飽和溶液。在黑暗容器中于室溫下將該溶液攪拌16小時。通過0.2μm濾膜過濾得到的溶液，以除去任何不溶的8-MOP。使用Shimadzu UV160U分光光度計測定248nm的吸光度，來測定8-MOP的終濃度。用22900M-1cm-1的消光系數(shù)值計算8-MOP的濃度。
向純化的供體白細胞群體懸液中加入補骨脂素貯存液至希望的終濃度。按上述制備方法，使用8-MOP飽和的PAS制備用8-MOP處理的單位。在光活化裝置中用UVA線照射純化的供體白細胞至10-3-100J/cm2的終劑量。在照射過程中以70轉(zhuǎn)/分鐘攪拌該單位。在照射之前采取白細胞樣品用作對照。
以10-4-150μM的濃度向純化的白細胞制劑中加入S-59。白細胞將具有10-108細胞/mL、優(yōu)選地107細胞/mL、更優(yōu)選地2×106細胞/mL的細胞密度。
使與S-59混合的白細胞群體樣品暴露于波長為200-450nm、優(yōu)選地320-400nm的紫外線下。細胞優(yōu)選地接受約10-3-100J/cm2的光劑量。在一種優(yōu)選實施方案中，光劑量為3J/cm2。UV線暴露的時限約為1秒到60分鐘，優(yōu)選地約1分鐘。
PCT后，如上及實施例中所述，測定白細胞樣品增殖及參與白細胞活性的能力。應(yīng)測定下列參數(shù)細胞生存力和完整性；增殖活性；表面抗原表達；細胞因子分泌；GVHD和GVL活性。
下列試驗?zāi)苡糜谕榛瘎┨幚淼幕蚬饣瘜W(xué)處理的白細胞。A.體外白細胞的劑量反應(yīng)動力學(xué)i)有限稀釋試驗(LDA)該試驗直接測定可克隆的T細胞數(shù)量，它在體內(nèi)直接與GVHD的發(fā)病率和嚴重程度相關(guān)(Keman，N.A.等人，血液68770-773，1986)。FDA使用LDA對血液制品的γ照射建立通用規(guī)程。該試驗按照Pelsynski，M.等人，血液831683-1689，1994的方法進行。簡言之，在用不同濃度藥物和恒定劑量光線PCT處理后測定人白細胞增殖細胞的數(shù)量。用合并的致死性γ-照射的異體刺激細胞來刺激生長。增殖對照包括未處理的白細胞(作為增殖的陽性對照)和接受致死性γ-照射的PCT前的白細胞(陰性對照)。根據(jù)分離的增殖集落的數(shù)量測定生長。對人白細胞測定所用劑量與被增殖抑制的細胞數(shù)之間的相關(guān)性。從該實驗獲得的劑量反應(yīng)預(yù)計類似于對于血小板濃縮物中的白細胞所獲得的。
如下進行LDA。通過白細胞電泳從外周血中分離白細胞。刺激活T細胞，使之在含有RPMI培養(yǎng)基的微量滴定板的孔中增殖，培養(yǎng)基中補加有胎牛血清(FBS)、植物凝集素(PHA)、重組白細胞介素-2(rIL-2)和T細胞生長因子(TCGF)。每一孔中也含有從10個個體的PBMC合并物制備并用5000cGyγ射線照射的105個異體刺激細胞。
將每一未處理的對照樣品的白細胞以兩個獨立的系列稀釋。在每孔中加入含有一個系列的105、104、103、102、101和100個細胞或第二系列的300、100、33、11和4個細胞的100μL等份。每一稀釋度以10個重復(fù)樣本加入板中。培養(yǎng)含有1.1×107個總白細胞的光化學(xué)處理的樣品的11mL等份，來檢測活T細胞。將該樣品的100μL等份不稀釋地加入110孔中。
將微量滴定板在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育3周。溫育0.5、1及2周后，對每孔飼以TCGF、FBS、rIL-2和PHA。在3周溫育期的最后，就T細胞克隆的存在對每孔評分。將含有一個或多個T細胞克隆的孔評分為陽性。不含T細胞克隆的孔被評分為陰性。用基于泊松分布的最小卡方分析計算每一樣品的T細胞頻率。用下列公式計算T細胞減少系數(shù)T細胞減少系數(shù)＝f對照/f處理，其中f對照和f處理分別為對照和經(jīng)處理的樣品的T細胞頻率。
對照等份或者不處理或者只用UVA或只用S-59處理。一個等份以2500cGy臨床劑量的γ射線照射。向其余等份中加入S-59至終濃度為10-4μM-150μM。然后以10-3-100焦耳/cm2的UV光劑量照射。ii)混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)試驗該試驗也被稱為MLC試驗，按照Kraemer，K.H.等人，皮膚病學(xué)研究雜志77235-239，1981和Kraemer，K.H.等人，皮膚病學(xué)研究雜志7680-87，1981的方法進行。至于該試驗的基本原理和控制，參見《基礎(chǔ)與臨床免疫學(xué)》，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(編)，Appleton & Lange，Norwalk，CT，1994，246-247頁。它間接測定異體刺激誘導(dǎo)的淋巴細胞中DNA合成。當(dāng)在組織培養(yǎng)中合并兩種HLA-不同的個體的淋巴細胞時，細胞膨大、合成DNA并增殖，而HLA-相同的細胞仍然靜止。根據(jù)3H-胸苷向增殖細胞內(nèi)核酸的摻入測定誘導(dǎo)的DNA合成。然后收獲細胞，洗去未結(jié)合的放射性，并在β計數(shù)器中計數(shù)內(nèi)化的放射性。
在單路MLR中測定白細胞的效應(yīng)物及刺激物功能。包括標準、適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫φ?。通過將效應(yīng)細胞與致死性γ-照射的合并人白細胞(刺激細胞)一起溫育來測定效應(yīng)功能。在致死性γ-照射以阻斷胸苷攝取后，通過與正常合并的人白細胞一起溫育來測定被處理白細胞(用PCT或其它烷化劑化合物處理)的刺激功能。將獲得的隨處理劑量而變的結(jié)果與雙道MLR相比較。
盡管MLR將提供LDA所提供的信息的一部分，但它能夠提供關(guān)于被處理白細胞刺激其它細胞的能力的信息。MLR中被處理白細胞的刺激能作為一種抗白血病免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的模型，其在BMT轉(zhuǎn)輸患者中被DLI激活。該情況中，抗白血病的免疫應(yīng)答(GVL效應(yīng))可被BMT中存在的宿主或供體細胞起動。B.受處理白細胞的表型特征i)表面抗原性標記表達利用合適的熒光標記抗體(Pharmingen)和標準FACS-SCAN分析測定PCT或烷化劑處理對表面抗原性標記表達的影響。如Coligan，J.E.等人，《免疫學(xué)通用方案通用方案》，紐約，John Wiley & Sons，Inc.，1991中所述，利用合適的熒光標記抗體(Pharmingen)和標準FACS-SCAN分析，作為處理劑量的函數(shù)測定抗原性標記CD2、CD28、CTLA4、CD40配體(gp39)、CD18、CD25、CD69和CD16/CD56的存在，已知這些標記參與與T細胞和NK細胞激活及免疫功能相關(guān)的相互作用。假如對蛋白質(zhì)的PCT及相關(guān)處理性質(zhì)溫和，則在處理條件下表面分子的穩(wěn)定性預(yù)計不受影響；然而，其表達的誘導(dǎo)預(yù)計是劑量依賴的。
關(guān)于被處理的人淋巴細胞在增殖、表面標記表達、細胞因子合成和細胞毒性方面的表征，見實施例14。ii)白血病細胞系裂解為了測定受處理細胞誘導(dǎo)的直接GVL效應(yīng)，研究對一系列人及小鼠白血病細胞系(可從ATCC獲得)的溶細胞能力。按照Jiang，Y.Z.等人，骨髓移植8233-238，1991的條件進行該實驗。如Coligan，J.E.等人，《免疫學(xué)通用方案通用方案》，紐約，John Wiley & Sons，Inc.，1991所述，在標準條件下用51Cr標記白血病細胞。根據(jù)上清液中51Cr放射性的釋放測定達到的所有裂解，并與作為背景和總裂解的對照相比較。監(jiān)測處理劑量對受處理T細胞的溶細胞能力的影響。通過加入漸增數(shù)量的經(jīng)處理的白細胞并觀察是否發(fā)生裂解來進行該實驗。能用T細胞亞群重復(fù)該實驗。盡管白血病系的直接裂解提供了GVL效應(yīng)的一種直接機制，但其缺乏可能意味著DLI誘導(dǎo)GVL效應(yīng)的一種間接機制。因此，另外，通過測定細胞因子產(chǎn)生如IFN-γ、IL-2或GM-CSF的產(chǎn)生能測定細胞毒性。iii)體內(nèi)細胞生存力為了估計體內(nèi)經(jīng)處理的細胞的生存力，在不同劑量的處理后，將雄性小鼠的白細胞輸入雌性同源或異源受體中。利用對脾細胞轉(zhuǎn)輸后希望的時點采取的血液樣品所進行的PCR方法(Goodarzi，M.O.等人，輸血35145-149，1995)，監(jiān)測循環(huán)中經(jīng)處理的細胞的存在。該方法檢測只存在于雄性(供體)細胞中的Y-染色體特異性基因序列的存在，具有每50μL宿主血液1-5個細胞的敏感度。該實驗將測定對活動物中輸入細胞的清除的影響，以及處理劑量與體內(nèi)細胞循環(huán)之間的關(guān)系。如Johnson等人，斯堪的納維亞免疫學(xué)雜志(Scand.J.Immunol.)45511-514，1997所述，通過在輸注之前對白細胞的PKH-26標記也能檢測體內(nèi)經(jīng)處理的白細胞的生存力。C.細胞因子合成的定量及定性表征利用可商業(yè)獲得的Elisa試劑盒(R&D Systems)，在效應(yīng)細胞與刺激細胞協(xié)同培養(yǎng)之后對培養(yǎng)上清液進行定量及定性細胞因子測定。按照Elisa廠商提供的說明書進行試驗。將對每一樣品的吸光度測定與每一測定試劑盒提供的細胞因子標準產(chǎn)生的標準曲線相比較，估計結(jié)果。作為化合物濃度的函數(shù)和—在PCT的情況下—光劑量及處理與測定之間的時間間隔的函數(shù)對處理的白細胞進行細胞因子測定。由于在T細胞激活和GVHD/GVL中的明確作用而測定IL-1、 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ細胞因子。
對待處理的白細胞細胞因子合成的確定在測定細胞通過細胞因子產(chǎn)生作為免疫應(yīng)答誘導(dǎo)物起作用的能力中是重要的；它也可用作對生化功能和蛋白質(zhì)合成的測定。
關(guān)于被處理的人淋巴細胞在增殖、表面標記表達、細胞因子合成和細胞毒性方面的表征，見實施例14。D.體內(nèi)鼠模型對于證明GVHD抑制和GVL效應(yīng)誘導(dǎo)的應(yīng)用對于研究移植物抗宿主疾病和移植物抗白血病效應(yīng)，小鼠是非常完善的模型。為了分別估計經(jīng)處理的白細胞對GVHD和GVL的影響，使用在Johnson，B.D.等人，骨髓移植11329-336，1993和Johnson，B.D.等人，血液853302-3312，1995中所述的移植鼠模型。該模型中，亞致死地照射(9Gy)雌性AKR/J小鼠(H-2k)，然后給予MHC-匹配雌性B10.BR供體(H-2k)的107個BM細胞加3×107個脾細胞。這種處理顯示引起急性GVHD臨床癥狀并在50天內(nèi)死亡。輸入的脾細胞的消除導(dǎo)致混合嵌合體的完全存活，而未BMT導(dǎo)致50％的死亡率。本實施例中，在轉(zhuǎn)輸之前對鼠脾細胞進行處理，以根據(jù)死亡率測定檢測處理對GVHD的抑制，并且也提供抑制GVHD發(fā)病的最低劑量。脾細胞是小鼠血液白細胞的公認替代品，因為小鼠的血液容積對于這些實驗而言太小。
為了評估處理細胞的GVL反應(yīng)性，BMT 21天后，向受體輸入例如PA異體脾細胞，然后在7天后用AKR白血病細胞攻擊。據(jù)所知，BMT恢復(fù)后(28天)5×104AKR白血病細胞向小鼠的輸入引起白血病和白血病攻擊25天后95％的死亡率(Johnson，B.D.等人，移植54104-112，1992)。相反，BMT 21天后異體脾細胞的輸入顯示，在7天后用AKR細胞攻擊后可誘導(dǎo)GVL效應(yīng)。該作用過程導(dǎo)致70天后70％的存活率。如果證明有GVHD的預(yù)防，則轉(zhuǎn)輸前脾細胞的處理使得在無GVHD時能檢測到GVL的誘導(dǎo)。其測定是根據(jù)輸入經(jīng)處理的脾細胞的BMT受體的存活率，該受體用AKR細胞攻擊。
作為處理劑量的函數(shù)檢測使用待處理的白細胞的DLI對白血病攻擊存活率的影響，并與進行未處理脾細胞輸注的對照組相比較。利用如Johnson，B.D.等人，骨髓移植11329-336，1993所述的PCR測定法，檢測存活小鼠的嵌合狀態(tài)和白血病荷載。
該實驗?zāi)Ｐ椭?，通過死亡前對血液的白細胞計數(shù)或PCR分析能診斷白血病的死因，因為白血病可引起AKR白血病細胞的擴展。對AKR白血病細胞特異性標記特異的引物可用于PCR分析。根據(jù)低白細胞計數(shù)和脾萎縮以及通過特有的臨床癥狀(毛皮和姿勢的改變、粘性糞便等)診斷GVHD引起的死亡。通過注射更少或更大量的AKR白血病細胞檢測PA-DLI對最小殘余疾病或更高腫瘤荷載的效能。
根據(jù)本發(fā)明例如通過PCT法對白細胞的處理，如果在不引起GVHD的條件下，在施以白血病攻擊后能誘導(dǎo)用處理細胞DLI處理的小鼠存活率統(tǒng)計學(xué)顯著的提高，則認為這對誘導(dǎo)GVL效應(yīng)是有效的。存活動物的遺傳型應(yīng)該也是完全嵌合的，因為在人類中這與無病長期存活的更高發(fā)病率有關(guān)。在最初BMT后100天內(nèi)，存活率的提高易于證明。
將在上述對于供體白細胞的條件下處理脾細胞。
關(guān)于鼠模型系統(tǒng)中在無GVHD時引起的經(jīng)處理的白細胞GVL效應(yīng)的情況，見實施例15。
實施例7-12
下列具體實施例是為了說明在本發(fā)明方法中有用的代表性烷化劑化合物的制備方法，提供關(guān)于對專業(yè)人員有用的化合物的有關(guān)資料，并且說明測定化合物有效性的方法。除非另外提出，在CDCl3中Varian 200MHz儀器上記錄所有NMR譜；報告相對于四甲硅烷(TMS)的化學(xué)位移。用Perkin Elmer FTIR記錄IR譜。用5mM含水H3PO4作為A流動相A，用5mM CH3CN作為流動相B，用YMC C8柱以梯度模式進行HPLC。在DMSO或乙醇中制備樣品，并在注射前保持于≤15℃。
表2顯示用于不同化合物的化合物號的名稱。
表2
實施例7N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(化合物IV)的合成步驟A.N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯在N2下于-15℃，向干THF中的N-(叔丁氧羰基)-β-丙氨酸(20.3g，107mmol)和4-甲基嗎啉(13.0mL，12.0g，119mmol)的攪拌溶液(200mL)中加入氯甲酸異丁基酯(13.9mL，14.6g，107mmol)，導(dǎo)致白色沉淀(4-甲基嗎啉·HCl)的立即形成。在-15℃下攪拌反應(yīng)混合物5分鐘，隨后將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到燒瓶中，該燒瓶中含有-15℃下干THF中的三乙醇胺(48.3g，324mmol)的攪拌溶液(150mL)。將反應(yīng)混合物加溫到23℃，并攪拌另外1.5小時，隨后通過真空抽濾去除沉淀。然后在真空中從濾液中去除THF，在水(500mL)與EtOAc(5×150mL)之間分配剩余的粘性黃色油。在Na2SO4上干燥合并的有機層。真空中溶劑的去除產(chǎn)生25.8g(75％)的希望產(chǎn)物N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯，為一種暗黃色的油。1H NMRδ5.32(brs，1H)，4.18(t，J＝5.4Hz，2H)，3.58(t，J＝5.1Hz，4H)，3.37-3.23(m，2H)，2.80(t，J＝5.4Hz，2H)，2.69(t，J＝5.1Hz，4H)，2.51(t，J＝6.0Hz，2H)，1.41(s，9H)未發(fā)現(xiàn)羥基質(zhì)子。13CNMRδ173.0，156.4，79.8，63.3，60.2，57.3，54.1，36.7，35.3，28.8.步驟B.N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[雙(2-叔-丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯在N2下將由步驟A獲得的N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯(22.7g，70.9mmol)與咪唑(11.1g，163mmol)的乙腈攪拌溶液(70mL)冷卻至0℃。然后加入叔丁基二甲基氯硅烷(534mg，3.54mmol)，并在0℃下將反應(yīng)混合物攪拌另外5分鐘。將反應(yīng)混合物加溫到23℃，攪拌2小時，隨后通過真空抽濾除去產(chǎn)生的白色沉淀(咪唑·HCl)。在真空中從濾液中除去乙腈，在飽和鹽水(600mL)與EtOAc(3×200mL)之間分配剩余的物質(zhì)。在Na2SO4上干燥合并的有機層。真空中溶劑的去除產(chǎn)生35.2g(90％)的希望產(chǎn)物N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[雙(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯，為一種黃色的油。1HNMRδ5.29(brs，1H)，4.14(t，J＝6.0Hz，2H)，3.65(t，J＝6.3Hz，4H)，3.37(表觀q，2H)，2.85(t，J＝6.0Hz，2H)，2.71(t，J＝6.3Hz，4H)，2.49(t，J＝5.9Hz，2 H)，1.42(s，9H)，0.88(s，18H)，0.03(s，12H)；13C NMRδ172.7，156.3，79.7，63.3，62.4，57.7，54.3，36.7，35.3，28.9，26.4，18.7，-4.9.步驟C.β-丙氨酸2-[雙(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯向含有從步驟B獲得的N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[雙(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯(3.01g，5.48mmol)的燒瓶中，加入純?nèi)宜?5mL)，導(dǎo)致CO2氣體的放出。攪拌反應(yīng)混合物5分鐘，在真空中去除三氟乙酸。在飽和NaHCO3(100mL)與EtOAc(3×30mL)之間分配剩余的物質(zhì)。在Na2SO4上干燥合并的有機層。真空中溶劑的去除產(chǎn)生2.45g(100％)的希望產(chǎn)物β-丙氨酸2-[雙(2-叔-丁二甲基甲硅烷氧乙基)氨基]乙酯，為一種暗黃色的油。1H NMRδ4.12(t，J＝6.0Hz，2H)，3.63(t，J＝6.4Hz，4H)，2.96(t，J＝6.2Hz，2H)，2.84(t，J＝6.0Hz，2H)，2.69(t，J＝6.4Hz，4H)，2.44(t，J＝6.2Hz，2H)，0.86(s，18H)，0.03(s，12H)未發(fā)現(xiàn)胺質(zhì)子。13C NMR(CDCl3)δ173.0，63.4，62.6，57.9，54.4，38.4，38.1，26.4，18.7，-4.9.步驟D.N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯通過室溫下在10mL CHCl3中攪拌12.5小時，使β-丙氨酸2-[雙(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯(736mg，1.64mmol)與9-甲氧基吖啶-2-羧酸甲酯(669mg，2.50mmol)反應(yīng)。然后過濾掉沉淀(吖啶酮)，在飽和水性NaHCO3(100mL)與CHCl3(3×35mL)之間分配濾過液。在Na2SO4上干燥合并的有機層，并在真空中濃縮，產(chǎn)生1.61g粘性褐色的油。通過在N2下將粗中間物溶解于3.0mL THF中，并在冷卻至0℃后立即用HF/吡啶(1.0mL)處理，來進行對產(chǎn)生的二醇的脫保護。攪拌1小時使溶液升溫至室溫。在真空中去除揮發(fā)物，在飽和水性NaHCO3(100mL)與CHCl3(3×35mL)之間分配殘余物。干燥合并的有機層，濃縮產(chǎn)生649mg黃褐色的固體。制備型TLC(C-18，CH3CN)得到20％產(chǎn)率的希望的二醇，N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯(根據(jù)HPLC，純度＞80％)；1H NMRδ8.82(s，1H)，8.21-7.94(m，2H)，7.94-7.72(m，2H)，7.59(表觀t，1H)，7.23(表觀t，1H)，4.30-4.18(m，2H)，4.18-4.05(m，2H)，3.89(s，3H)，3.69-3.50(m，4H)，2.92-2.73(m，4H)，2.73-2.55(m，4H)步驟E.N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯向二氯化合物的轉(zhuǎn)化，是通過類似于Peck等人(美國化學(xué)協(xié)會雜志(J.Am.Chem.Soc.)1959，813984)的方法實現(xiàn)的。將溶于純SOCl2(6mL)中從步驟D獲得的產(chǎn)物(41mg，0.090mmol)的黃色溶液在室溫下攪拌20小時。然后在真空中除去SOCl2得到一種黃色固體(二鹽酸鹽)。然后在飽和NaHCO3(50mL)與CH2Cl2(3×20mL)之間分配該物質(zhì)。在Na2SO4上干燥合并的有機層。在真空中溶劑的去除產(chǎn)生35.4mg游離堿的二氯化合物，為一種橙色的膠。1H NMRδ8.82(s，1H)，8.20-7.83(m，4H)，7.5(表觀t，1H)，7.25(表觀t，1H)，4.36-4.15(m，4H)，3.93(s，3H)，3.48(t，J＝6.9Hz，4H)，3.06-2.77(m，4H)，2.86(t，J＝6.9Hz，4H)未發(fā)現(xiàn)胺質(zhì)子。13CNMRδ172.3，166.6，155.2，146.5，144.6，133.1，131.6，128.7，124.6，124.3，116.1，114.3，63.7，57.2，53.5，52.9，46.3，42.5，35.2.
未發(fā)現(xiàn)其它的碳。通過加入1M醚中的HCl從CH2Cl2中沉淀HCl鹽，得到N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(化合物IV)，為一種黃色的固體(根據(jù)HPLC純度為81％)。
以相似的方法制備N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(化合物V)。在步驟D中用9-甲氧基吖啶代替9-甲氧基吖啶-2-羧酸甲酯，獲得為一種黃色油的中間體二醇(7.1％)(根據(jù)HPLC純度為74％)。1H NMRδ8.14(d，J＝7.5Hz，2H)，7.93(d，J＝8.6Hz，2H)，7.52(表觀t，2H)，7.23(表觀t，2H)，4.36-4.08(m，4H)，3.76-3.5(m，4H)，3.08-2.60(m，8H)未發(fā)現(xiàn)胺及羥基質(zhì)子。
將中間體二醇(37.3mg，0.0793mmol)的亞硫酰氯溶液(4.0mL)在23℃下攪拌7.5小時。在真空中去除亞硫酰氯，得到一種黃色的油。將該物質(zhì)溶解于乙醇(～4mL)中，并在真空中除去溶劑。然后將該物質(zhì)溶解于CH2Cl2(4mL)中并在真空中除去溶劑；該步驟重復(fù)兩次。然后用己烷(3×4mL)研磨該物質(zhì)，得到40.0mg為黃色吸水性玻璃狀固體形式的產(chǎn)物(根據(jù)HPLC純度為42％)。通過在飽和NaHCO3與CH2Cl2之間分配，隨后在Na2SO4上干燥合并的有機層，并在真空中除去溶劑，將有些物質(zhì)轉(zhuǎn)化為游離胺用于分析目的。1H NMRδ8.21-8.00(m，4H)，7.66(表觀t，2H)，7.38(表觀t，2H)，4.26-4.12(m，2H)，4.12-3.98(m，2H)，3.43(t，J＝6.9Hz，4H)，2.96-2.68(m，8H)未發(fā)現(xiàn)胺質(zhì)子。
按上述方法，但用N-(叔丁氧羰基)-4-氨基丁酸代替N-(叔丁氧羰基)-β-丙氨酸，制備N-[(2-甲酯基吖啶-9-基)] 4-氨基丁酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(化合物VI)(根據(jù)HPLC純度為78％)。1H NMRδ8.89(s，1)，8.12(表觀t，2)，7.93-7.80(m，2)，7.59(表觀q，1)，7.36-7.20(m，1)，4.16(t，2，J＝5.7Hz)，4.07-3.92(m，2)，3.97(s，3)，3.46(t，4，J＝6.9Hz)，2.93-2.80(m，6)，2.60(t，2，J＝6.5Hz)，2.29-2.12(m，2)未發(fā)現(xiàn)胺質(zhì)子。
實施例8用3-[N，N-雙(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)]氨基丙醇代替實施例7步驟A中的三乙醇胺，然后從步驟C繼續(xù)，制備N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸3-[雙(2-氯乙基)氨基]丙酯二鹽酸鹽(化合物VIII)(根據(jù)HPLC純度為63％)。1H NMRδ8.91(s，1)，8.20-7.93(m，4)，7.18(表現(xiàn)t，1)，7.39(表觀t，1)，4.30(m，4)，3.96(s，3)，3.48(t，4，J＝6.9Hz)，2.88-2.60(m，2)，2.83(t，4，J＝6.9Hz)，2.62(t，2，J＝6.7Hz)，1.85-1.68(m，2)未發(fā)現(xiàn)胺質(zhì)子。
實施例9在實施例7中合成的化合物也能用下列方法制備N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(化合物V)的合成方法II步驟A.N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸甲酯二鹽酸鹽合并9-氯吖啶(11.7g，《有機合成》(Organic Synthesis)，Coll.第三卷，第57頁)、β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(9.9g)和甲醇鈉(3.26g)，加入60mL甲醇。用磁力攪拌器攪拌該混合物，并回流5.5小時。消除熱度，并在尚溫時(≤35℃)過濾懸液。用大約10mL另外的甲醇漂洗固體鹽，濃縮合并的深綠色濾液，產(chǎn)生21g潮濕的黃綠色固體。
將該固體溶解于350mL煮沸的2-丙醇中，使之在室溫下結(jié)晶。用大約15mL 2-丙醇和15mL己烷漂洗產(chǎn)生的結(jié)晶，然后風(fēng)干，產(chǎn)生15.5g亮黃色產(chǎn)物N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(產(chǎn)量為78.5％)。
1H NMRδ1.9(brs，2H)；3.24(t，J＝7.0Hz，2H)；3.76(s，3H)；4.45(brs，2H)；7.23(app.t，J＝8Hz，2H)；7.49(app.t，J＝8Hz，2H)；8.11(d，J＝8.4Hz，2H)；8.30(d，J＝8.4Hz，2H)；9.68(brs，0.5H).IR1574(s)，1691(s)，1726(s)，2336(m)，2361(m)，3227(m).步驟B.N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽在甲苯(750mL)、飽和水性Na2CO3(200mL)與H2O(50mL)之間分配由步驟A獲得的N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽。用甲苯(3×250mL)再次萃取水層，合并有機層并用飽和水性Na2CO3(50mL)洗滌。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使甲苯的體積降至大約100mL。然后加入三乙醇胺(30mL)形成一種部分不能混合的系統(tǒng)。然后加入NaOMe(50mg)的MeOH溶液(2mL)。通過室溫攪拌及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)從反應(yīng)混合液中快速除去溶劑。除去溶劑后，將反應(yīng)混合液真空下另外放置1-1.5小時，產(chǎn)生糖漿狀溶液。
在CH2Cl2(200mL)與鹽水(200mL)之間分配粗混合物，除去過量的三乙醇胺。用CH2Cl2(5×100mL)抽提鹽水層。合并有機層，用鹽水(50mL)洗滌，然后用0.5M HCl(2×100mL)抽提。合并酸性水層并用CH2Cl2(50mL)洗滌。在CH2Cl2(200mL)存在下用粉末K2CO3使酸溶液變?yōu)閴A性。分離有機層，用CH2Cl2(5×100mL)再次抽提水層。用鹽水(50mL)洗滌合并的有機層，用無水Na2SO4干燥，并解吸得到不含二醇的粗胺(5.02g)，一種黃色粘膠。根據(jù)NMR，該物質(zhì)與實施例1中用備擇方法制備的物質(zhì)相同。
將上述粗制品的一部分(0.400g)與異丙醇(100mL)劇烈攪拌，并用1MHCl乙醚溶液酸化。冷卻漿液，棄去首批沉淀。除去一半溶劑后，第二組結(jié)晶產(chǎn)生N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽，為一種明黃色的晶態(tài)固體(0.200g)，根據(jù)HPLC純度＞95％。
1H NMRδ8.11(表觀t，4H)，7.69(表觀t，2H)，7.41(表觀t，2H)，4.23(t，J＝5.4Hz，2H)，4.03(t，J＝5.9Hz，2H)，3.58(t，J＝5.2Hz，4H)，2.73(t，J＝5.4Hz，2H)，2.70(t，J＝5.9Hz，2H)2.68(t，J＝5.2Hz，4H).未發(fā)現(xiàn)胺及羥基質(zhì)子。
13C NMRδ173.3，151.7，149.4，130.5，129.5，124.0，123.4，118.4，63.5，60.1，57.3，54.0，46.6，35.8.步驟C.N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽向步驟B獲得的N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-羥乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(113mg，0.24mmol)的CH3CN溶液(0.5ml)中(攪拌懸液)加入SOCl2(0.5mL)。在23℃下攪拌得到的黃色溶液16小時，隨后在真空中去除揮發(fā)物。剩余的橙色油溶解于EtOH(～2mL)中，在真空中除去EtOH，得到一種黃色固體。然后用己烷(2×3mL)研磨該物質(zhì)。在真空中去除殘余溶劑，得到123mg希望的物質(zhì)N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽(根據(jù)HPLC，純度為93％)，為一種黃色固體。1H NMRδ8.09(表觀t，J＝8.8Hz，4H)，7.66(表觀t，J＝7.6Hz，2H)，7.38(表觀t，J＝7.7Hz，2H)，4.14(t，J＝5.9Hz，2H)，4.00(t，J＝5.8Hz，2H)，3.43(t，J＝6.9Hz，4H)，2.87(t，J＝6.9Hz，4H)，2.77(t，J＝5.9Hz，2H)，2.69(t，J＝5.8Hz，2H).未發(fā)現(xiàn)胺質(zhì)子。13C NMRδ173.0，151.5，149.4，130.5，129.6，124.1，123.4，118.6，63.5，57.3，53.5，46.7，42.5，35.7.IR(HCl鹽的KBr沉淀)3423，3236，2939，2879，1736，1634，1586，1572，1540，1473，1272，1173cm-1.
實施例10N-(4-甲氧基-吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽，化合物IX。
N-(4-甲氧基-吖啶-9-基)β-丙氨酸甲酯的制備方法是將1.4g(5.84mmol)4，9-二甲氧基吖啶、0.89g(6.42mmol)β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和20mL甲醇混合，然后加熱，在N2下回流12小時。然后在真空中濃縮該反應(yīng)物，溶解于CHCl3-異丙醇中(50mL，4∶1v/v)，并用50％NH4OH(2×25mL)和鹽水(1×25mL)洗滌。用Na2SO4干燥有機層，在真空中濃縮產(chǎn)生1.24g(68％)甲酯(根據(jù)HPLC，純度＞74％)，為黃色的油；Rf(SiO2，乙酸乙酯)＝0.25；IR(薄膜)3363，2947，1730，1611，1573，1518，1484，1463，1423，1420，1246，1170，1081cm-1；1H NMRδ2.70(t，2H，J＝5.7Hz)，3.74(s，3H)，4.00(t，2H，J＝6.3Hz)，4.11(s，3H)，6.98(d，1H，J＝7.4Hz)，7.36(m，2H)，7.65(m，2H)，8.12(d，2H，J＝8.5Hz)；13C NMR)δ35.7，46.9，52.3，56.5，107.2，115.3，119.8，123.5，124.1，130.0，151.4，173.6.
在實施例3步驟B所述條件下將其轉(zhuǎn)化為二醇，產(chǎn)生647g黃色油。對粗混合物的HPLC分析顯示85％的產(chǎn)率(λ＝278nm)；Rf(SiO2，20％甲醇-乙酸乙酯)＝0.17；IR(薄膜)3337，2947，2828，1726，1616，1569，1522，1484，1463，1420，1348，1250，1174，1127，1081，1043cm-1；1H NMRδ2.7(m，8H)，3.55(m，4H)，3.97-4.08(m，2H)，4.08(s，3H)，4.19(t，2H，J＝5.5 Hz)，6.96(d，1H，J＝7.4Hz)，7.29(m，2H)，7.61(m，2H)，8.10(m，2H)；13C NMRδ36.0，46.9，53.7，56.4，57.1，60.1，63.3，107.4，115.7，119.1，119.6，123.2，123.5，123.9，128.5，130.0，140.8，147.4，151.6，151.7，154.3，173.3.
如實施例3步驟C所述，將其轉(zhuǎn)化為N-(4-甲氧基-吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽與亞硫酰氯。使用乙酸乙酯隨后用10％甲醇-乙酸乙酯對粗產(chǎn)物急速過濾(SiO2)，在有些產(chǎn)物的明顯柱上降解后得到58mg黃色油；Rf(SiOux，乙酸乙酯)＝0.26；IR(薄膜)3405，2955，2828，1726，1616，1577，1518，1463，1416，1348，1246，1174，1123，1081，1013cm-1；1H NMRδ2.69-2.99(m，8H)，3.45(t，4H，J＝6.7 Hz)，4.03(m，2H)，4.09(s，3H)，4.16(t，2H，J＝5.9Hz)，6.97(d，1H，J＝7.7Hz)，7.32(m，2H)，7.65(m，2H)，8.12(d，2H，J＝8.7Hz).
通過在真空中濃縮反應(yīng)液與共沸去除過量亞硫酰氯(2×5mL甲苯)，能以粗品形式分離二鹽酸鹽。HPLC分析表明原材料完全消耗而4-甲氧基吖啶(RT＝22.3分鐘)是主要的雜質(zhì)。1H NMR(CD3OD)δ3.18(t，2H，J＝6.4Hz)，3.71(m，6H)，4.04(m，4H)，4.18(s，3H)，4.51(m，2H)，7.17(m，2H)，7.56(m，2H)，7.91-8.15(m，2H)，8.55(d，1H，J＝8.8Hz).
同樣地從3-氯-9-甲氧基-4-甲基吖啶制備N-(3-氯-4-甲基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽，化合物X。游離堿的1HNMRδ7.96-8.17(m，3H)，7.29-7.52(m，3H)，4.19(t，J＝5.8Hz，2H)，4.00(s，3H)，3.89(t，J＝5.1Hz，2H)，3.47(t，J＝6.8Hz，4H)，2.91(t，J＝6.8Hz，4H)，2.83(t，J＝5.8Hz，2H)，2.67(t，J＝5.5Hz，2H).
同樣地從6-氯-2，9-二甲氧基吖啶制備N-(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯二鹽酸鹽，化合物XIII。游離堿的1HNMRδ7.96-8.17(m，3H)，7.29-7.52(m，3H)，4.19(t，J＝5.8Hz，2H)，4.00(s，3H)，3.89(t，J＝5.1Hz，2H)，3.47(t，J＝6.8Hz，4H)，2.91(t，J＝6.8Hz，4H)，2.83(t，J＝5.8Hz，2H)，2.67(t，J＝5.5Hz，2H).
實施例11[N，N-雙(2-氯乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯二鹽酸鹽，化合物XI。步驟A.β-丙氨酸[N，N-雙(2-三異丙基甲硅烷基氧基)乙基]乙酯將β-丙氨酸乙酯鹽酸鹽(1.99g，12.9mmol)、K2CO3(6.0g，43.4mmol)和碘乙基三異丙甲硅烷基酯(9.47g，28.9mmol)的乙腈溶液(175mL)的漿液回流5-7天。溶劑真空蒸發(fā)后，用CH2Cl2研磨固體。用稀釋的Na2CO3(含水)然后用鹽水洗滌有機層，在無水Na2SO4上干燥。通過硅膠層析(1∶4 EtOAc/己烷)純化粗產(chǎn)物，得到5.60g油狀[N，N-雙(2-三異丙基甲硅烷氧基)乙基]β-丙氨酸乙酯(83.1％)。1H NMRδ4.12(q，J＝7.1Hz，2H)，3.73(t，J＝6.8Hz，4H)，2.92(t，J＝7.3Hz，2H)，2.70(t，J＝6.6Hz，4H)，2.46(t，J＝7.4Hz，2H)，1.4-0.9(m，45H，包括1.25(3H)時的三聯(lián)體和1.06及1.05時的單體)步驟B.[N，N-雙(2-三異丙基甲硅烷基氧基)乙基]-β-丙氨酸在乙醇中攪拌由上述步驟A獲得的β-丙氨酸[N，N-雙(2-三異丙基甲硅烷氧基)-乙基]乙酯(5.60g，10.8mmol)和氫氧化鋰(0.59g，14.1mmol)，并回流3小時。除去溶劑，在CH2Cl2與稀釋的NaHCO3(含水)之間分配粗產(chǎn)物。用鹽水洗滌有機層，在無水Na2SO4上干燥，解吸后得到[N，N-雙(2-三異丙基甲硅烷基氧基)乙基]-β-丙氨酸，為一種淡黃色的油(5.03g，95.1％產(chǎn)量)。1H NMRδ3.90(t，J＝5.5Hz，4H)，3.04(t，J＝6.2Hz，2H)，2.92(t，J＝5.5Hz，4H)，2.50(t，J＝6.1Hz，2H)，1.06(s，42H).步驟C.[N，N-雙(2-羥乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯于N2下在CH2Cl2(1mL)中攪拌由以上步驟B獲得的[N，N-雙(2-三異丙基甲硅烷氧基)乙基]-β-丙氨酸(51.0mg，0.104mmol)。在冰浴上冷卻時，逐滴加入SOCl2(0.5mL)，并攪拌反應(yīng)液2.25小時。解吸反應(yīng)混合液除去過量SOCl2后，加入干燥的CH2Cl2(0.5mL)，并于N2下在冰浴中冷卻該溶液。加入預(yù)冷的9-(3-羥基)丙胺基-6-氯-2-甲氧基-吖啶(29.0mg，91.5mmol)CH2Cl2漿液(1mL)。0.5小時后，在CH2Cl2與含水NaHCO3之間分配該混合物。用鹽水洗滌有機層，以無水Na2SO4上干燥并解吸。用己烷研磨獲得的膠，解吸己烷提取物，獲得一種極粗的三異丙基甲硅烷基保護的原材料與產(chǎn)物的混合物(53.5mg)。
為了去除三異丙甲硅烷基，在冰冷的THF(1mL)中攪拌一部分保護的粗二醇(33.1mg)。加入HF/吡啶(0.5ml)后，在充滿N2的氣囊中在環(huán)境溫度下攪拌混合物2.5小時。在CH2Cl2與NaHCO3(含水)之間分配反應(yīng)混合物，用稀釋的NaHCO3(含水)洗滌有機層數(shù)次，除去過量的HF/吡啶。用鹽水初步干燥后用無水Na2SO4干燥，除去溶劑得到粗二醇(13.1mg)。
將其與另外的粗二醇(5.0mg)合并，通過以95CH2Cl2/5iPA/1 TFA作為洗脫液的C-18制備型TLC純化，獲得二醇TFA鹽。將鹽在CH2Cl2與NaHCO3(含水)之間分配后，用鹽水干燥有機層，然后用無水Na2SO4干燥，并解吸獲得二醇的游離堿，[N，N-雙(2-羥乙基)]β-丙氨酸、3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯(5.0mg)。1H NMRδ7.92-8.25(m，3H)，7.23-7.47(m，3H)，430(t，J＝5.7Hz，2H))，3.98(s，3H)，3.81(t，J＝6.2Hz，2H)，3.64(t，J＝4.9Hz，4H)，2.86(t，J＝6.1Hz，2H)，2.67(t，J＝4.9Hz，4H)，2.51(t，J＝5.9Hz，2H)，2.04(明顯的五聯(lián)體，2H)步驟D.[N，N-雙(2-氯乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯二鹽酸鹽，化合物質(zhì)XI將以上獲得的[N，N-雙(2-羥乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯(4.0mg，0.0073mmol)溶解于CH2Cl2(1mL)中，在冰/水浴中冷卻。加入冰冷的SOCl2(0.1mL)，將反應(yīng)液在室溫下攪拌4小時。解吸反應(yīng)混合液除去溶劑，用己烷研磨，并在CH2Cl2與NaHCO3(含水)之間分配。用鹽水干燥有機層，然后用無水Na2SO4干燥并解吸，獲得為一種黃色膠的二氯化合物。1H NMRδ7.8-8.2(m，3H)，7.2-7.5(m，3H)，4.35(t，J＝5.9Hz，2H)，3.85-4.10(3.99，s，OMe和3.9-4.0，m，NHCH2，總5H)，3.48(t，J＝6.9Hz，4H)，2.9-3.0(m，6H)，2.49(t，J＝6.6Hz，2H)，2.1-2.3(m，2H).
在預(yù)冷的CH2Cl2中攪拌游離胺，用1M HCl乙醚溶液酸化，并用少數(shù)幾滴甲醇解吸，獲得希望的化合物，[N，N-雙(2-氯乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯二鹽酸鹽(2.5mg)，(3.5mg，81％)，為一種黃色固體。
以與前述步驟C相同的方法，但使用6-氯-9-(2-羥基)乙胺基-2-甲氧基-吖啶代替6-氯-9-(3-羥基)丙胺基-2-甲氧基-吖啶，制備類似的二醇。1H NMRδ7.96-8.13(m，3H)，7.20-7.47(m，3H)，4.76(t，J＝4.9Hz，2H)，3.99(s，3H)，3.92-4.14(m，2H)，3.60(t，J＝5.1Hz，4H)，2.78(t，J＝6.1Hz，2H)，2.63(t，J＝5.1Hz，4H)，2.45(t，J＝6.0Hz，2H).
通過類似于步驟D的步驟，其轉(zhuǎn)化為[N，N-雙(2-氯乙基)]β-丙氨酸2-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]乙酯二鹽酸鹽，化合物XII。1H NMRδ7.94-8.20(m)，7.20-7.50(m)，4.42(CH2OC＝O)，3.90-4.10(OCH3，NHCH2)，3.46(CH2Cl)，2.82(N(CH2)3)，2.39-2.56(CH2C＝O).
實施例124，5’，8-三甲基-4’-補骨脂素乙酸酯鹽酸鹽，化合物XIV步驟A.4，5’，8-三甲基-4’-補骨脂素乙酸[N，N-雙(2-羥乙基)]-2-氨乙基酯在100℃下攪拌4，5’，8-三甲基-4’-補骨脂素乙酸甲酯(250mg，0.832mmol)、三乙醇胺(12mL)和1M乙醚中的HCl(2mL)2小時。使得到的澄清褐色溶液冷卻至室溫，并在CH2Cl2與飽和NaHCO3(含水)之間分配。用飽和NaHCO3(含水)漂洗有機層數(shù)次。用無水Na2SO4干燥后，在真空中去除溶劑，在CH2Cl2與1M含水HCl之間分配殘余物。用CH2Cl2漂洗水層數(shù)次，然后在有機溶劑存在下用K2CO3使之變?yōu)閴A性。用水漂洗含有中性產(chǎn)物的有機層數(shù)次，然后干燥并濃縮。酸堿抽提過程的重復(fù)可產(chǎn)生一種米黃色固體的希望產(chǎn)物(84.3mg，24.3％)1HNMRδ7.53(s，1H)，6.24(s，1H)，4.23(t，J＝5.4Hz，2H)，3.69(s，2H)，3.56(t，J＝5.3Hz，4H)，2.82(t，J＝5.4Hz，2H)，2.69(t，J＝5.3Hz，4H)，2.57(s，3H)，2.51(d，J＝1.1Hz，3H)，2.47(s，3H).步驟B.4，5’，8-三甲基-4’-補骨脂素乙酸[N，N-雙(2-氯乙基)]-2-氨乙基酯鹽酸鹽向冰冷的上述二醇(9.8mg，0.023mmol)CH2Cl2混合液(1mL)中加入亞硫酰氯(0.2mL)，并在氮下于室溫攪拌過液。濃縮得到的漿液，然后用己烷研磨，得到為一種灰白色固體的希望產(chǎn)物(6.2mg，53.9％)1H NMR(CD3OD)δ7.71(s，1H)，6.28(s，1H)，4.56(t，J＝4.8Hz，2H)，3.95(t，J＝6.1Hz，4H)，3.89(s，2H)，3.60-3.83(m，6H)，2.54(s，3H)，2.53(s，3H)，2.50(s，3H).
實施例13典型BMT小量或微移植方案在用異體外周血干細胞移植之前給顯示CLL的患者施行一種非分離的預(yù)備方案。移植之后用DLI支持，這是達到最大移植物抗惡性腫瘤反應(yīng)所必需的。輕度毒性的預(yù)備方案是基于氟達拉濱(FAMP)的，并根據(jù)惡性腫瘤類型加以改進。對于晚期的和以前處理的CLL，對患者施用300mg/m2/dx3的FAMP和30mg/m2/dx3的環(huán)磷酰胺。用由30mg/m2/dx3的FAMP、25mg/m2/d/CIx4的順鉑和0.5gm mg/m2/dx2的Ara-c組成的方案處理Richter和大細胞淋巴瘤(LCL)。除了對LCL處理外，不進行GVHD預(yù)防。該方案是為了產(chǎn)生嵌合狀態(tài)，并使植入成為可能，而降低常規(guī)誘導(dǎo)治療的毒性。能在移植1個月后施以DLI來加強移植。成功的移植為以后施用的DLI作了準備，對于增強移植物抗白血病反應(yīng)和加速免疫恢復(fù)是必要的。
實施例14應(yīng)用人外周血淋巴細胞的體外研究為了表征特定類型的被處理細胞群體，檢查了經(jīng)受PCT并在體外培養(yǎng)的人外周血淋巴細胞(PBL)的幾個特征。這些包括生存力、T細胞增殖、細胞因子合成及分泌、表面抗原表達、體外細胞毒性和Fas配體表達。生存力用臺盼藍排除法測定在3J/cm2UVA下接受10nM S-59的PBL的生存力。2天后存活率為75％，3天后為50％，4天后為25％。在有關(guān)實驗中，觀察到被處理淋巴細胞的依賴劑量的存活率。增殖根據(jù)3H-胸苷向異體刺激的T細胞DNA中的摻入來測定淋巴細胞的增殖。從三名供體中分離外周血單核細胞(PBMC)，合并，γ-照射(2500cGy)，以防止自身刺激，并在MLR中用作刺激細胞。從第4名供體中分離的PBMC作為效應(yīng)細胞。效應(yīng)細胞在3J/cm2UVA下用0.05、0.5或5nM 4’-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5’，8-三甲基補骨脂素(“S-59”)處理，并與刺激細胞協(xié)同培養(yǎng)。對照、未處理的效應(yīng)細胞也與刺激細胞協(xié)同培養(yǎng)。培養(yǎng)6天后，向培養(yǎng)液中加入3H-胸苷，一天后收獲細胞，通過閃爍計數(shù)分析細胞樣品測定3H-胸苷的攝入。圖8顯示，根據(jù)MLR中的3H-胸苷攝入所測定的被處理白細胞的增殖，在0.1nM-10nMS-59之間以劑量依賴的方式被消除，10nM S-59時增殖被完全抑制。
也可用一種備擇方法分析被處理白細胞的增殖能力，該方法中用表面結(jié)合的抗-CD3抗體激活被處理細胞。在該試驗中，PBMC或未被處理、或在3J/cm2UVA劑量下用0.0001、0.001或0.01μM S-59處理、或在無S-59時照射。然后在附著抗-CD3抗體的培養(yǎng)板中在5％CO2、37℃下溫育細胞，來誘導(dǎo)T細胞的多克隆激活，并在培養(yǎng)1、2及3天后測定3H-胸苷的摻入。結(jié)果(圖9)顯示在所有處理條件下增殖能力依賴劑量的降低，和10nM S-59時增殖的完全抑制。細胞因子產(chǎn)生如前對于增殖分析的部分中所述，在MLR中培養(yǎng)人淋巴細胞。在3.0J/cm2UVA下用不同濃度的S-59(0.05、0.5或5nM)處理效應(yīng)細胞。培養(yǎng)2、4、6及7天后采取MLR細胞培養(yǎng)基樣品。用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗測定這些樣品的IL-2和IFN-γ水平，并用分光光度法定量結(jié)果。標準溶液用于建立將濃度(pg/ml)與吸光度相關(guān)聯(lián)的標準曲線，由它來確定試驗樣品中的細胞因子濃度。
圖10A顯示對IL-2產(chǎn)生的分析。未處理的淋巴細胞及用較低濃度S-59(即，0.005和0.5nM)處理的淋巴細胞的IL-2分泌在培養(yǎng)2天時達到最高，然后由于IL-2被群體中增殖淋巴細胞消耗而下降。相反，在用5nM S-59處理的淋巴細胞中，IL-2不被非增殖的淋巴細胞消耗，而在第4、6及7天時仍以相當(dāng)高的水平存在于培養(yǎng)基中。
刺激PBMC的IFN-γ產(chǎn)生不受S-59+UVA處理的影響或被略微提高。見圖10B。IL-2和IFN-γ的綜合結(jié)果顯示，在增殖被抑制的條件下，被處理細胞仍然能合成并分泌與T細胞激活有關(guān)的細胞因子。表面抗原表達分析了被處理淋巴細胞上表面標記表達的分析。經(jīng)Ficoll梯度離心獲得淋巴細胞，并通過用表面結(jié)合的抗-CD3抗體體外刺激來激活。應(yīng)用CD69、CD25(IL-2受體)或CD40L的熒光抗體，通過熒光激活細胞分類(FACS)分析測定被激活、處理的淋巴細胞的表面抗原表達。作為激活后時間的函數(shù)測定表達，并與未處理細胞的表達相對比。
CD69是淋巴細胞激活的一種早期標記。圖11A顯示，用1nM或10nM S-59+3J/cm2UVA處理的細胞在處理后高達48小時的時間內(nèi)具有類似于或略高于未處理細胞的表面CD69水平。因此，盡管被處理的細胞不能增殖，但與激活有關(guān)的信號傳遞途徑仍具功能性。
CD25是IL-2受體，略晚(激活后)于CD69檢測到其表達。圖11B顯示，與未處理的細胞相比，在用1nM或10nM S-59+3J/cm2UVA處理的細胞中，表面CD25基本上不受影響。
T細胞上的CD40配體(CD40L)識別B細胞表面上表達的CD40分子，作為T細胞激活過程的一部分。T細胞上CD40L表達的抑制能誘導(dǎo)細胞無應(yīng)答性或無反應(yīng)性。因此，處理后CD40L在T細胞上未受干擾的表達是正常T細胞激活的指征。用抗-CD3抗體使經(jīng)處理的細胞激活后檢查PCT對CD40L表達的影響(圖12)。該分析的結(jié)果表明，對于隨后增殖能力被消除的處理條件，被處理細胞的CD40L表達與在未處理細胞中觀察到的緊密平行。
總之，在增殖嚴重降低或完全抑制的條件下(見圖8及9，本實施例)，早期T細胞激活標記CD69和IL-2受體CD25的表達仍基本上不受影響；而CD40L水平與未處理的細胞平行。應(yīng)當(dāng)指出，一旦經(jīng)抗原或促有絲分裂刺激，CD69即在淋巴細胞上短暫表達，CD69的繼續(xù)表達需要新的轉(zhuǎn)錄。因此，在經(jīng)處理的非增殖細胞中觀察到高CD69水平，這進一步支持了處理不能不可逆地抑制基因表達這一見解。細胞毒性T細胞功能通過在MLR中產(chǎn)生對γ照射滅活的同種異體“刺激”細胞的細胞毒性T細胞，來估計S-59+UVA處理對T細胞裂解功能的影響。然后測定這些細胞毒性T細胞裂解51Cr-標記的靶細胞的能力，這些靶細胞從用來提供滅活的刺激細胞的相同供體中獲得。
細胞毒性T細胞的產(chǎn)生從兩種供體中取出外周血(100mL)，一種被稱為“刺激物”，另一種被稱為“效應(yīng)物”。經(jīng)Ficoll梯度離心從兩種群體中分離PBMC。通過將效應(yīng)PBMC以5×106細胞/ml的細胞密度置于組織培養(yǎng)瓶中1小時，來耗貧效應(yīng)PBMC中的單核細胞。γ-照射(2500cGy)刺激PBMC阻斷細胞分裂。將單核細胞耗貧的效應(yīng)物與照射的刺激物分開重懸浮于RPMI完全培養(yǎng)基中至1×106細胞/ml的濃度。然后合并等體積的效應(yīng)物與刺激細胞懸液用于MLR，并在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃溫育7天。
靶細胞的制備從為MLR提供刺激細胞的相同供體中抽取外周血(50ml)。如上分離PBMC，以1×106細胞/ml的濃度重懸浮于RPMI培養(yǎng)基中，然后用2μg/ml PHA-M(植物凝集素-M)和10單位/ml的重組IL-2在37℃下刺激7天。
用51Cr對靶細胞的標記在200μCi Na251CrO4存在下37℃溫育靶細胞2小時，然后洗滌三次除去未摻入的標記物。
對效應(yīng)細胞的光化學(xué)處理(PCT)將效應(yīng)細胞(如上所述單核細胞耗貧的)分為四個等份，將每一份重懸浮于30ml含1％牛血清白蛋白的PBS中。向三份中加入S-59至0.1、0.01或0.001μM的終濃度；其余等份用作未處理的對照。將含有S-59的樣品轉(zhuǎn)移至30ml 2410血袋中，在Baxter/Fenwall UVA照射裝置中用3J/cm2UVA照射每一樣品。
CTL測定如下測定被處理的效應(yīng)細胞群體的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性。重懸浮被處理的細胞(或?qū)φ瘴刺幚砑毎?至1ml終體積中5×106細胞/ml的終濃度，進行連續(xù)兩倍稀釋獲得2.5×106、1.25×106和0.625×106細胞/ml的終濃度。向圓底96孔微量滴定板的三孔的每孔中加入重懸浮的經(jīng)處理的效應(yīng)細胞和每一經(jīng)處理的效應(yīng)細胞稀釋度(“效應(yīng)細胞”)的100μl樣品。然后向每孔效應(yīng)細胞中加入含有5×103個細胞的100μl標記靶細胞樣品(如上所述制備)，產(chǎn)生100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1的效應(yīng)細胞靶細胞比值，在37℃下溫育混合物4小時。溫育后，以250×g離心培養(yǎng)板5分鐘，從每孔中取出100μl上清液。在γ計數(shù)器上定量上清液中51Cr的量。對每組三個孔計算平均51Cr cpm和標準差。
對照稀釋未標記的靶細胞，并以與效應(yīng)細胞相同的比例用標記的靶細胞加板，來測定51Cr的自發(fā)釋放。標記的靶細胞也與RPMI和1％Triton X-1000(每個3孔)一起溫育，來測定51Cr的最大釋放。對每組三個孔計算平均51Cr cpm和標準差。
結(jié)果圖13顯示對于經(jīng)處理的和未經(jīng)處理的白細胞，在不同效應(yīng)物靶(或未標記的靶標記的靶)比值時的51Cr釋放。這些結(jié)果表明，用能阻斷增殖的S-59劑量和UVA處理的白細胞保留了溶細胞功能。因此，不能增殖的被處理白細胞不僅具有與未處理細胞相同的表型(如表面標記和細胞因子表達所示)，而且具有相似的功能性質(zhì)。
總之，對被處理白細胞群體的增殖、表面標記表達、細胞因子合成及CTL活性的分析顯示了被處理細胞的下列特性1.一旦經(jīng)處理，即可觀察到增殖能力的劑量依賴的抑制。
2.被處理細胞保留細胞因子合成、細胞表面抗原表達和體外細胞毒性。
因此，如此所述處理的白細胞群體及相當(dāng)?shù)募毎后w能有利于供體細胞(如造血細胞和造血干細胞)向非重度骨髓抑制的宿主中的植入?？蓪崿F(xiàn)這一點的一種機制是通過經(jīng)處理的白細胞群體對供體特異耐受性的誘導(dǎo)。
實施例15鼠模型系統(tǒng)中被處理白細胞在無GVHD時GVL效應(yīng)的準備進行實驗研究S-59+UVA處理對MHC-錯配的B6/AKR鼠模型系統(tǒng)中供體淋巴細胞GVL活性的影響。使供體脾細胞通過細孔濾網(wǎng)，獲得未分離的脾細胞的單細胞懸液，然后用0.01μM S-59和不同劑量的UVA處理(0.5分鐘、1分鐘、2分鐘及8分鐘)。將1×107個處理的供體脾細胞與5×106個排除T細胞的骨髓細胞一起(C57BL/6、H-2b、Thy1.2+)注射入經(jīng)受1100R全身輻射的AKR、H-2k、Thy1.1+宿主中。移植3天后用250個AKR-M2白血病細胞攻擊每組小鼠(每組6只動物)。觀察移植動物的GVHD臨床癥狀、白血病復(fù)發(fā)及死亡。另外，移植后每3-4天記錄一次移植動物的體重。
結(jié)果總結(jié)于表3和圖14及15中，表明能獲得UVA+S-59劑量的適當(dāng)范圍，其在MHC-錯配移植中能有效地保留GVL活性而降低GVHD。例如，向排除T細胞的骨髓中加入未處理的或溫和處理的(0.5分鐘UVA+0.01μM S-59；照射劑量＝1.8 J-nM/cm2)淋巴細胞在移植受體中導(dǎo)致輕度到重度GVHD(根據(jù)這些組動物中降低的體重而證明；圖14)。相反，用1分鐘UVA+0.01μM S-59(照射劑量＝3.7 J-nM/cm2)處理的淋巴細胞能有效地保留GVL活性(白血病攻擊70天后，3只中有3只存活者)而無GVHD癥狀。見表3及圖15。用1分鐘UVA+0.01μM S-59處理的動物的體重(圖14)也表明無GVHD。如果用相同的S-59濃度及更高的UVA劑量(2及8分鐘UVA，分別相當(dāng)于7.5和30 J-nM/cm2的照射劑量)處理細胞，則供體淋巴細胞的GVL活性消除。在這些情況下，移植后20天內(nèi)3只小鼠中有3只死亡，見圖15。
表3施用PCT白細胞的B6/AKR嵌合體中的GVL活性
注意-所有組都在第1天照射并接受MHC-錯配的骨髓移植，和第0天經(jīng)處理的脾細胞(如適用)。
-如果進行白血病攻擊，則在第3天。
-MST＝存活時間的中值，單位為天。
-范圍＝死亡天數(shù)(移植后)(X＝存活)
從這些結(jié)果能得出結(jié)論，向排除T細胞的骨髓中加入用適量S-59+UVA處理的白細胞能在主要MHC-錯配鼠模型系統(tǒng)中防止GVHD。此外，適當(dāng)處理的白細胞的加入有利于供體植入，并導(dǎo)致MHC-錯配移植宿主中的穩(wěn)定嵌合狀態(tài)。最后，被處理白細胞的GVL活性保留。因此，用S-59+UVA對白細胞的處理是一種調(diào)節(jié)供體淋巴細胞的免疫學(xué)活性以支持同種異體移植的新方法。
實施例16S-303對人淋巴細胞增殖及T細胞功能的影響在MLR試驗中對經(jīng)處理的異體刺激T細胞進行測定。從為了防止自身刺激而以2500cGy劑量γ輻射的供體中分離外周血單核細胞(PBMC)，用作刺激細胞。從不同供體分離的PBMC用作效應(yīng)細胞。用0.1、0.2、0.3、0.4或0.5μM的N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯(S-303)在室溫下處理濃度為2×106細胞/ml的效應(yīng)細胞大約15分鐘，用含有1％牛血清白蛋白的PBS洗兩次。將S-303處理的及未處理的效應(yīng)細胞與γ-輻射的刺激細胞以1∶1的比例協(xié)同培養(yǎng)。
淋巴細胞增殖的測定方法包括，協(xié)同培養(yǎng)開始6天后向協(xié)同培養(yǎng)物中加入3H-胸苷，于第7天收獲細胞，及測定細胞中3H cpm的摻入。對協(xié)同培養(yǎng)開始24及48小時后采取的培養(yǎng)上清液進行夾心ELISA，分析細胞因子的產(chǎn)生。
對S-303處理細胞的增殖能力的分析(圖16)顯示，S-303處理的異體刺激效應(yīng)細胞中3H-胸苷的摻入，在用0.1μM S-303處理的細胞中降低，而在用濃度為0.2μM或更高的S-303處理的細胞中完全被阻斷。因此，在S-303處理的白細胞中觀察到淋巴細胞增殖的劑量依賴的抑制。
作為對S-303處理白細胞的細胞因子產(chǎn)生的測定，估計γ干擾素(IFN-γ)的產(chǎn)生。圖17顯示，在用0.1μM及0.2μM S-303處理的細胞中，IFN-γ分泌不受影響，其中增殖分別嚴重降低及完全抑制(見圖16)。用0.3μM S-303處理的細胞，其中淋巴細胞的增殖完全被抑制(圖16)，產(chǎn)生對照水平大約的28％的IFN-γ(圖17)。
總之，S-303預(yù)處理以劑量依賴的方式抑制異體刺激的人淋巴細胞的增殖，如在MLR中測定的。此外，在增殖被完全抑制的條件下(例如，用0.2μM S-303對效應(yīng)細胞的處理)，IFN-γ的合成不受影響。因此，能獲得能產(chǎn)生在刺激后不能增殖但保留免疫學(xué)活性的淋巴細胞的S-303處理條件。
盡管為了理解的清晰性，以圖表和實施例的方式相當(dāng)詳細地描述了上述發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，在不背離本發(fā)明的精神的情況下可進行多種改變和修改。因此，不應(yīng)把上述描述和實施例看作限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種待用于向同種異體受體中引入的分離的細胞群體，該細胞群體中含有一種白細胞群體，其中該白細胞群體的一部分是不增殖的，使得該受體中移植物抗宿主疾病(GVHD)的誘導(dǎo)被抑制，并且其中該白細胞群體的一部分保留免疫學(xué)活性。
2.權(quán)利要求1的細胞群體，其中白細胞群體含有T細胞、NK細胞和抗原呈遞細胞。
3.權(quán)利要求1的細胞群體，其中在適當(dāng)刺激后該白細胞群體的一部分即產(chǎn)生細胞因子。
4.權(quán)利要求3的細胞群體，其中細胞因子選自IL-1、IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10和GM-CSF。
5.權(quán)利要求1的細胞群體，其中該白細胞群體的一部分表達一種表面標記，該表面標記選自CD2、CD28、CTLA4、CD40配體(gp39)、CD18、CD25、CD69(淋巴細胞激活標記)和CD16/CD56、MHC I類和II類、CD8、CD4、CD3/TcR(T細胞受體)、CD54(ICAM-1)、LFA-1和VLA-4。
6.權(quán)利要求1的細胞群體，其中該群體中超過90％的白細胞是不增殖的。
7.權(quán)利要求1的細胞群體，其中通過接觸抗原或促分裂原刺激白細胞。
8.權(quán)利要求1的細胞群體，其中白細胞在促進疾病細胞的破壞方面有效。
9.權(quán)利要求1的細胞群體，其中白細胞在促進受感染細胞的破壞方面有效。
10.權(quán)利要求1的細胞群體，其中白細胞有利于第二種細胞群體的植入。
11.權(quán)利要求10的細胞群體，其中第二種細胞群體選自造血細胞、髓細胞、白細胞、骨髓細胞、胰島細胞、肝細胞、神經(jīng)元細胞、心肌細胞、間充質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞。
12.權(quán)利要求10的細胞群體，其中第二種細胞群體是一種器官。
13.權(quán)利要求1的群體，其中該白細胞群體含有第一種淋巴細胞亞群。
14.權(quán)利要求13的群體，其中第一種淋巴細胞亞群含有第二種T淋巴細胞亞群。
15.權(quán)利要求14的群體，其中根據(jù)表面標記的表達獲得第二種亞群。
16.權(quán)利要求15的群體，其中表面標記選自CD8、CD4、CD16和CD56。
17.權(quán)利要求1的群體，其中通過選自白細胞電泳和紅細胞去除的方法從全血中獲得白細胞群體。
18.一種用于供體白細胞輸注的方法，其中該方法包括在骨髓移植之后向受試哺乳動物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細胞群體。
19.一種增強移植細胞群體的植入的方法，其中該方法包括在移植之前向受試哺乳動物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細胞群體。
20.一種增強移植細胞群體的植入的方法，其中該方法包括在移植時向受試哺乳動物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細胞群體。
21.一種增強移植細胞群體的植入的方法，其中該方法包括在移植之后向受試哺乳動物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細胞群體。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中移植的細胞群體含有造血干細胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中移植的細胞群體含有造血干細胞。
24.一種用于免疫重建的方法，其中該方法包括向受試哺乳動物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細胞群體。
25.一種用于過繼免疫治療的方法，其中該方法包括向受試哺乳動物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細胞群體。
26.一種用于混合嵌合狀態(tài)治療的方法，其中該方法包括向受試哺乳動物中引入根據(jù)權(quán)利要求1的細胞群體。
27.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1的細胞群體的方法，其中該方法包括(a)形成一種體外反應(yīng)混合物，其含有白細胞群體和一種能與核酸形成共價鍵的化合物；和(b)在能產(chǎn)生一種含有白細胞群體的細胞群體的條件下溫育該反應(yīng)混合物；其中一部分白細胞群體是不增殖的，使得受體中移植物抗宿主疾病(GVHD)的誘導(dǎo)被抑制，并且其中該白細胞群體的一部分保留免疫學(xué)活性。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中免疫學(xué)活性包括疾病細胞、受感染細胞和病原體的破壞。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中該化合物以一定量存在，使得該化合物在每108個白細胞基因組DNA堿基對中形成約1到約104個加合物。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中該化合物以一定量存在，使得該化合物在每108個白細胞基因組DNA堿基對中形成約5到約103個加合物。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中未反應(yīng)的化合物被去除。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中通過向反應(yīng)混合物中加入猝滅劑去除未反應(yīng)的化合物。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求27的方法制備的細胞群體。
34.一種細胞群體，其性質(zhì)相當(dāng)于根據(jù)權(quán)利要求33的群體。
35.一種細胞群體，其性質(zhì)相當(dāng)于根據(jù)權(quán)利要求1的群體。
36.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中被處理的白細胞群體內(nèi)至少90％的T細胞中增殖被抑制。
37.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中該化合物含有一種能與核酸非共價結(jié)合的核酸結(jié)合部分。
38.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中該化合物含有(a)一種核酸結(jié)合部分；(b)一種能與核酸形成共價鍵的效應(yīng)物部分；和(c)一種共價連接核酸結(jié)合部分與效應(yīng)物部分的脆性連接體。
39.權(quán)利要求38的方法，其中核酸結(jié)合部分是一種芳族嵌入物，而效應(yīng)物部分是一種芥子基。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中該化合物是具有通式
的N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[雙(2-氯乙基)氨基]乙酯(S-303)及其鹽。
41.權(quán)利要求27的方法，其中該化合物也是一種復(fù)制抑制劑。
42.權(quán)利要求27的方法，其中該化合物也是一種拓撲異構(gòu)酶抑制劑。
43.權(quán)利要求42的方法，其中該化合物選自喜樹堿和道諾霉素。
44.權(quán)利要求27的方法，其中該化合物含有一種可光活化部分，其在電磁刺激后與核酸形成共價鍵。
45.權(quán)利要求44的方法，其中該方法進一步包括使反應(yīng)混合物暴露于光下，光活化該可光活化部分，從而導(dǎo)致可光活化部分與白細胞基因組DNA間共價鍵的形成。
46.權(quán)利要求45的方法，其中該化合物選自呋喃香豆素、放線菌素、蒽環(huán)酮、氨茴霉素、苯并二吡喃酮、芴、芴酮、單星脂肪藍、norphillin A、有機染料；菲啶、吩噻嗪硫鎓鹽、吩嗪、吩噻嗪、疊氮基苯、喹啉和噻噸酮、吖啶和橢圓玫瑰樹堿。
47.權(quán)利要求46的方法，其中呋喃香豆素是一種補骨脂素。
48.權(quán)利要求47的方法，其中補骨脂素選自PAP、8-甲氧基補骨脂素(8-MOP)、4’-氨基甲基-4，5’，8-三甲基補骨脂素(AMT)、5-甲氧基補骨脂素(5-MOP)和三氧雜啉4，5’，8-三甲基補骨脂素。
49.權(quán)利要求47的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于波長為200-450nm的紫外線下。
50.權(quán)利要求49的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于波長為320-400nm的紫外線下。
51.權(quán)利要求50的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于劑量為10-3-100J/cm2的紫外線下。
52.權(quán)利要求51的方法，其中使該反應(yīng)混合物在紫外線下暴露1秒-60分鐘的一段時間。
53.權(quán)利要求52的方法，其中補骨脂素以10-4-150μM的濃度存在。
54.權(quán)利要求53的方法，其中該補骨脂素為具有通式
的4’-(4-氨基-2-氧雜)丁基-4，5’，8-三甲基補骨脂素(S-59)及其鹽。
55.權(quán)利要求54的方法，其中S-59的濃度為10-3-150μM。
56.權(quán)利要求55的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于波長為200-450nm的紫外線下。
57.權(quán)利要求56的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于波長為320-400nm的紫外線下。
58.權(quán)利要求57的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于劑量為10-3-100J/cm2的紫外線下。
59.權(quán)利要求58的方法，其中使該反應(yīng)混合物暴露于劑量為3J/cm2的紫外線下。
60.權(quán)利要求58的方法，其中使該反應(yīng)混合物在紫外線下暴露1秒-60分鐘的一段時間。
61.權(quán)利要求60的方法，其中使該反應(yīng)混合物在紫外線下暴露大約1分鐘的時間。
62.權(quán)利要求61的方法，其中白細胞群體的細胞密度為每毫升10-109個細胞。
63.權(quán)利要求62的方法，其中白細胞群體的細胞密度為每毫升2×106個細胞。
64.一種根據(jù)權(quán)利要求38的方法產(chǎn)生的細胞群體。
65.一種根據(jù)權(quán)利要求40的方法產(chǎn)生的細胞群體。
66.一種根據(jù)權(quán)利要求41的方法產(chǎn)生的細胞群體。
67.一種根據(jù)權(quán)利要求46的方法產(chǎn)生的細胞群體。
68.一種根據(jù)權(quán)利要求54的方法產(chǎn)生的細胞群體。
69.一種根據(jù)權(quán)利要求59的方法產(chǎn)生的細胞群體。
70.一種根據(jù)權(quán)利要求63的方法產(chǎn)生的細胞群體。
71.一種促進疾病細胞或病原體破壞的方法，包括將權(quán)利要求1的白細胞群體與含有疾病細胞或病原體的同種異體細胞群體相混合。
72.一種促進疾病細胞或病原體破壞的方法，包括將權(quán)利要求70的白細胞群體與含有疾病細胞或病原體的同種異體細胞群體相混合。
73.權(quán)利要求72的方法，其中該疾病細胞是一種癌細胞。
74.權(quán)利要求73的方法，其中該癌細胞選自慢性骨髓性白血病(CML)細胞、慢性骨髓單核細胞性白血病(CmML)細胞、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)細胞、急性骨髓性白血病(AML)細胞、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)細胞、多發(fā)性骨髓瘤(MM)細胞、何杰金氏淋巴瘤細胞和非何杰金氏淋巴瘤細胞。
75.權(quán)利要求74的方法，其中癌細胞為慢性骨髓性白血病細胞。
76.權(quán)利要求74的方法，其中癌細胞為多發(fā)性骨髓瘤細胞。
77.權(quán)利要求73的方法，其中癌細胞選自乳腺癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、睪丸癌細胞、前列腺癌細胞、結(jié)腸癌細胞、黑素瘤細胞、腎癌細胞、成神經(jīng)細胞瘤細胞、頭癌細胞和頸癌細胞。
78.權(quán)利要求71的方法，其中疾病細胞是受感染細胞。
79.權(quán)利要求78的方法，其中受感染細胞被病毒感染。
80.權(quán)利要求79的方法，其中該病毒選自巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒(Ad)和卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒。
81.權(quán)利要求71的方法，其中通過將供體白細胞輸入所述宿主中使白細胞群體與哺乳動物宿主的同種異體細胞群體于體內(nèi)相混合。
82.權(quán)利要求81的方法，其中該哺乳動物宿主患有骨髓移植后白血病或多發(fā)性骨髓瘤的復(fù)發(fā)。
83.權(quán)利要求71的方法，其中刺激白細胞群體以擴展對疾病細胞或病原體抗原特異的細胞毒性T細胞的數(shù)量。
84.權(quán)利要求83的方法，其中在從供體中分離白細胞群體之前在體內(nèi)進行刺激。
85.權(quán)利要求84的方法，其中通過用抗原對白細胞供體接種進行刺激。
86.權(quán)利要求85的方法，其中疾病細胞是CML細胞，并用CML細胞的bcr-abl抗原接種白細胞供體。
87.權(quán)利要求85的方法，其中疾病細胞是多發(fā)性骨髓瘤細胞，并用骨髓瘤細胞的獨特型抗原接種白細胞供體。
88.權(quán)利要求83的方法，其中離體地進行刺激。
89.權(quán)利要求83的方法，其中刺激起因于白細胞群體與疾病細胞間的接觸。
90.權(quán)利要求83的方法，其中刺激起因于白細胞群體與抗原呈遞細胞之間的接觸，其中該抗原呈遞細胞已經(jīng)接觸疾病細胞。
91.權(quán)利要求83的方法，其中刺激起因于白細胞群體與抗原呈遞細胞之間的接觸，其中該抗原呈遞細胞已經(jīng)接觸疾病細胞的一種抗原。
92.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1的細胞群體的方法，其中該方法包括(a)形成一種含有白細胞群體和復(fù)制抑制性化合物的體外反應(yīng)混合物；和(b)在一定條件下溫育該反應(yīng)混合物，該條件能產(chǎn)生一種含有白細胞群體的細胞群體，其中該白細胞群體的一部分是不增殖的，使得受體中移植物抗宿主疾病(GVHD)的誘導(dǎo)被抑制，并且該白細胞群體的一部分保留免疫學(xué)活性。
93.權(quán)利要求92的方法，其中該化合物是一種拓撲異構(gòu)酶抑制劑。
94.權(quán)利要求93的方法，其中該化合物選自喜樹堿和道諾霉素。
95.一種制備經(jīng)處理的白細胞群體的方法，其中該白細胞群體總體上是不增殖的，并且不能在同種異體宿主中引起移植物抗宿主疾病(GVHD)，其包括下列步驟i)提供純化的白細胞群體的樣品；和ii)使白細胞樣品與能與核酸形成共價鍵的化合物以一定的量結(jié)合，使得該化合物在每108個白細胞基因組DNA堿基對中形成約1-104個加合物，從而抑制增殖但保留白細胞群體促進疾病細胞或病原體破壞的有效性。
96.一種制備用于混合淋巴細胞反應(yīng)的刺激細胞的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求27的方法處理含有白細胞群體的細胞群體，并用經(jīng)處理的細胞群體作為刺激細胞。
97.一種確定增殖是否為細胞功能所必需的方法，包括下列步驟(a)形成一種體外反應(yīng)混合物，其含有一種細胞群體和一種能與核酸形成共價鍵的化合物；(b)在一定條件下溫育該反應(yīng)混合物，該條件能產(chǎn)生一種不能DNA合成但能夠RNA及蛋白質(zhì)生物合成的細胞群體；并觀察細胞群體，確定細胞功能是否行使。
98.權(quán)利要求97的方法，其中該細胞功能是分化。
全文摘要
本發(fā)明提供了處理白細胞的方法與組合物,用于抑制白細胞的增殖并使它們不能引發(fā)移植物抗宿主疾病(GVHD),但能有效地增強同種異體供體細胞的植入,促進疾病細胞或病原體的破壞。也提供了白細胞組合物及這些組合物在緩解疾病中的應(yīng)用方法,其有利于多種類型的免疫重建和免疫治療,并增強同種異體供體細胞的植入。
文檔編號A61K35/14GK1270630SQ98809097
公開日2000年10月18日 申請日期1998年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月21日
發(fā)明者W·M·格林曼, J·A·格拉斯, S·塔利布, A·斯塔西諾波勞斯, D·J·海, J·E·赫爾斯特 申請人:塞魯斯公司