專利名稱：哺乳動物端粒酶的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及人類端粒酶，即一種人類端粒DNA合成中涉及的核蛋白酶。本發(fā)明也提供了與分子生物學，化學，藥理學，以及醫(yī)學和診斷技術(shù)領(lǐng)域有關(guān)的方法和組合物。相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的描述真核生物染色體的末端或端粒DNA通常是由串聯(lián)重復的簡單序列組成。端粒酶是核蛋白酶，它用包含在酶RNA組分內(nèi)的序列為模板合成端粒DNA的一條鏈。參見Blackburn，1992，生物化學年度回顧61113-129，本文一并參考。
雖然已知人類端粒酶合成具有序列5’-TTAGGG-3’的端粒重復單位，但迄今為止的科學文獻還沒有報道人類端粒酶的RNA組分。參見Morin，1989，細胞59521-529和Morin，1991，自然353454 456，本文一并參考。這一知識還不足以使得能夠分離與鑒別人類端粒酶RNA組分核苷酸序列的其余部分。啤酒酵母，四膜蟲屬的某些種，以及其它纖毛蟲如游仆蟲屬和目錄口蟲屬的端粒酶RNA組分已被測序，并且在科學文獻中報道。參見Singer和Gottschling，1994年10月21日，科學266404 409；Lingner等，1994，基因和發(fā)展81984-1988；Greider和Blackburn，1989，自然337331-337；Romero和Blackburn，1991，細胞67343-353；和Shippen-Lentz和Blackburn，1990，科學247546-552，各文獻本文一并參考。這些纖毛蟲端粒酶合成不同于人類中的端粒重復單位。
目前非常需要有關(guān)人類端粒酶的更多的信息。盡管端粒DNA的重復單位具有看似簡單的性質(zhì)，但科學家們早已知道端粒在保持染色體結(jié)構(gòu)和功能中具有重要的生物學作用。最近科學家推測喪失端粒DNA可以觸發(fā)細胞衰老和老化，并且端粒酶的調(diào)節(jié)作用可以具有重要的生物學含義。參見Harley，1991，突變研究256271-282，本文一并參考。
用于檢測端粒酶活性和鑒別調(diào)節(jié)或影響端粒酶活性的化合物的方法，以及通過控制端粒長度和端粒酶活性治療和診斷細胞衰老和無限增殖化的方法已有描述。參見PCT專利公開出版物95/13381，1995年5月18日公開；95/13382，1995年5月18日公開；和93/23572，1993年11月25日公開；以及美國專利申請，尚未給予申請?zhí)柕纳暾?發(fā)明人C.Harley，N.Kim，S.Weinrich)，申請日1995年6月7日；08/315,214，申請日1994年9月28日；08/315,216，申請日1994年9月28日；08/288,501，申請日1994年8月10日；08/014,838，申請日1993年2月8日；08/153,051和08/151,477，申請日均為1993年11月12日；08/060,952，申請日1993年5月13日；08/038,766，申請日1993年3月24日；以及07/882,438，1992年5月13日，各文獻本文一并參考。
如果包含RNA組分和/或編碼端粒酶蛋白質(zhì)組分的核酸可以以純化的或可分離的形式獲得并且這些核酸的核苷酸序列是已知的，則可以實現(xiàn)和得到端粒酶介導的治療和端粒酶測定和篩選方法的明顯的改進和新的機會。本發(fā)明滿足了這些和其它需要，并提供這樣的改進和機會。
發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供了基本上純化形式的人類端粒酶RNA組分和RNA組分的基因，以及包含人類端粒酶RNA組分核苷酸序列的所有或至少有用部分的核酸。本發(fā)明也提供了其它物種的RNA組分核酸，這些核酸具有與人類端粒酶RNA組分基本上的同源性，這些核酸包括但不限于，哺乳動物(如靈長類)RNA組分。本發(fā)明的其它有用的核酸包括具有互補于所說RNA組分的序列的核酸；具有相關(guān)于但不同于所說RNA組分的核苷酸序列之序列并且以有用的方式與人類端粒酶RNA組分或者RNA組分或蛋白質(zhì)組分的基因相互作用的核酸；與RNA組分或RNA組分基因不具有明顯的序列同源性或互補性但以所需的有用的方式作用于RNA組分上的核酸。如以下詳細描述的，本發(fā)明的核酸包括DNA和RNA分子兩者和兩者的修飾類似物，并且用于各種有用的目的。
本發(fā)明的有用的核酸的一個類型是反義寡核苷酸，形成三股螺旋的寡核苷酸，或能用于體內(nèi)和體外抑制人類端粒酶活性的其它寡核苷酸或寡核苷酸模擬物例如反義戊糖核酸(PNA)-肽核酸/聚酰胺核酸，這些寡核苷酸能以許多方式阻斷端粒酶活性，包括阻止端粒酶基因的轉(zhuǎn)錄(例如經(jīng)形成三股螺旋)，或者以阻止功能性核糖核蛋白端粒酶裝配或阻止RNA組分(一旦裝配進端粒酶復合物中)作為端粒DNA合成的模板的方式結(jié)合端粒酶的RNA組分。典型地，依據(jù)作用模式，本發(fā)明的這些寡核苷酸包括從約10到約25至200或更多核苷酸的特異性序列，它們同源于或互補于端粒酶的RNA組分或端粒酶RNA組分的基因中的特異性核苷酸序列。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了互補于端粒酶RNA組分多核苷酸序列的反義多核苷酸，典型地是互補于基本上相同于(identical to)天然產(chǎn)生的哺乳動物端粒酶RNA組分基因序列之多核苷酸序列的多核苷酸。這樣的反義多核苷酸用于抑制各種端粒酶RNA組分的轉(zhuǎn)錄和/或穩(wěn)定性和/或功能，并且進而使細胞(例如患者中的致瘤性細胞)中的各自的端粒酶活性降低。通過抑制正確的端粒復制和細胞修復中所需的功能性(催化活性和高保真性)端粒酶全酶的形成，這樣的反義多核苷酸能作為端粒酶調(diào)節(jié)劑起作用。所說反義多核苷酸能與其它抗腫瘤治療方式結(jié)合，如電離輻射或化療(例如用DNA破壞劑如博萊霉素，順氯氨鉑，氮芥子氣，阿霉素(doxyrubicin)，核苷酸模擬物，等)。在敏感的細胞(例如需要DNA修復或復制所需的端粒酶活性的復制細胞)中，反義多核苷酸能促進細胞死亡。所說反義多核苷酸基本上與本文公開的哺乳動物端粒酶RNA序列的互補序列的至少25個鄰接核苷酸相同。所說反義多核苷酸典型地是ssDNA，ssRNA，甲基膦酸酯骨架多核苷酸，硫代磷酸酯骨架多核苷酸，混合骨架多核苷酸，聚酰胺核酸，和本領(lǐng)域已知的類似反義結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的一個方面中，施用反義多核苷酸以在細胞(如可復制的人類細胞)中抑制端粒酶RNA組分的轉(zhuǎn)錄和/或活性和端粒酶活性。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了模板錯配多核苷酸，所說的多核苷酸具有基本上與哺乳動物端粒酶RNA組分相同的序列，并且包含端粒重復模板序列，該模板序列相對于人類端粒酶重復序列5’-TTAGGG-3’具有至少一堿基錯配，其它互補于該序列。在天然產(chǎn)生的模板序列中，模板錯配多核苷酸典型地包括單一核苷酸錯配，并且在模板序列中可以包括兩個核苷酸錯配，可以是鄰近的錯配核苷酸或者其中錯配的核苷酸被一個或多個配對(互補)核苷酸分開。本發(fā)明的模板錯配多核苷酸一般地能夠與人類端粒酶多肽組分一起顯示出端粒酶活性，并且進而在人類端粒酶重復序列中的選定(錯配)的核苷酸位置產(chǎn)生由端粒重復復制，修復，和/或添加而導致的錯摻，由此產(chǎn)生依賴于用于基本復制和保持端粒長度的突變的有義端粒酶RNA組分連續(xù)存在的端粒。
本發(fā)明的另一個有用的核酸類型是能夠特異性地切割人類端粒酶RNA組分使該酶失活的核酶。本發(fā)明的再一個有用的核酸類型是能夠特異性地結(jié)合到人類端粒酶RNA組分上并由此可用于例如，檢測樣品中端粒酶的存在的探針或者引物。最后，本發(fā)明的有用的核酸包括產(chǎn)生本發(fā)明的核酸的重組表達質(zhì)粒。這種質(zhì)粒的一種尤其有用的類型是用于人類基因治療的質(zhì)粒。用于人類基因治療的本發(fā)明的有用的質(zhì)粒有各種類型，不僅包括那些編碼反義寡核苷酸或者核酶的那些質(zhì)粒，而且包括驅(qū)動人類端粒酶RNA組分或者人類(或者具有基本上同源于人RNA組分的RNA組分序列的其它物種)端粒酶RNA組分或者其基因的缺失或改變的(突變的)的變體表達的那些質(zhì)粒。
在一個實施方案中，具有在生理條件下足以特異性雜交的互補于哺乳動物端粒酶RNA組分的部分之多核苷酸來源于在多核苷酸合成期間或合成后經(jīng)共價鍵添加化學取代基，從而形成能夠特異性地雜交到所說的端粒酶RNA組分上的衍生的多核苷酸。所說的衍生的多核苷酸能定位具有所說的RNA組分的內(nèi)源端粒酶，其中所說的衍生的多核苷酸產(chǎn)生端粒酶RNA組分和/或蛋白質(zhì)組分的改變或者化學修飾，從而改變(典型地是降低)端粒酶酶促活性。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了適于診斷與異常端粒酶RNA組分豐度和/或者結(jié)構(gòu)相關(guān)的疾病之多核苷酸。通過檢測端粒酶RNA組分豐度和/或端粒酶RNA組分結(jié)構(gòu)的改變(例如截短，序列變異，缺失或者插入，等)和/或在從病人移植的細胞中端粒酶RNA組分基因的重排或擴增，或者檢測特定的哺乳動物端粒酶RNA組分等位基因(例如通過RFLP或等位基因特異性PCR分析)，包含基本上相同于或基本上互補于哺乳動物端粒酶RNA組分核苷酸序列之序列的多核苷酸探針可以用于疾病狀態(tài)(例如，瘤形成或者是預瘤形成)的診斷。雖然可以使用Northern印跡法，斑點印跡法，或者在分離自細胞樣品的大量RNA或多聚腺苷酸化(poly A+)RNA上的溶液雜交，也可以是使用利用端粒酶RNA組分特異性引物的PCR或者LCR擴增，但所說的檢測通常經(jīng)采用標記(例如32P，35S，14C，3H，熒光，生物素化，地高辛配基化)的互補于哺乳動物端粒酶RNA組分的反義多核苷酸的原位雜交法進行。與相同細胞類型的非致瘤性細胞比較含有改變量(典型地是明顯增加)的端粒酶RNA組分的細胞被鑒別為候選病態(tài)細胞，如前致瘤性或者直接致瘤性細胞，并且可以被鑒別為具有轉(zhuǎn)移潛力的細胞。同樣地，對細胞樣品中端粒酶RNA組分基因座或緊密連鎖的基因座的特殊病癥的重排或者擴增的檢測將鑒別病理狀態(tài)或者是待發(fā)展成病理狀態(tài)(例如癌，遺傳病)的易感性的存在。所說的端粒酶RNA組分多核苷酸探針也用于個體的法醫(yī)鑒別，例如嫌疑犯或者不明死者的親權(quán)檢驗或者鑒別。
第二方面，本發(fā)明提供了通過將細胞與治療有效量的改變端粒酶活性的藥劑接觸以治療與細胞或者是一組細胞內(nèi)的端粒酶活性有關(guān)的疾病的方法。這些藥劑包括編碼端粒酶RNA組分的核酸，形成三股螺旋的寡核苷酸，反義寡核苷酸，核酶，以及質(zhì)粒和其它基因治療載體(例如腺病毒載體，腺伴隨病毒載體，等等)，它們是經(jīng)表達如前所述的端粒酶RNA組分，端粒酶RNA組分的反義RNA，或者錯配端粒酶RNA組分來用于人類基因治療。在一個有關(guān)的方面，本發(fā)明提供了包含這些治療藥劑以及藥學上可接受的載體或其鹽的藥物組合物，該組合物可以包括用于定向運送治療藥劑的脂轉(zhuǎn)染復合物，脂質(zhì)體或免疫脂質(zhì)體中的配制品。本發(fā)明也提供了這樣的端粒酶介導的治療劑與其它藥物的組合物，所述藥物如抗腫瘤劑和其它細胞毒素或細胞抑制劑；抗真菌劑(例如用于愛滋病患者的治療)；核苷酸，核苷，及其類似物；以及適于治療瘤形成，增生，HIV感染/愛滋病和相關(guān)疾病之類的疾病和以異常端粒酶代謝為特征的其他疾病的其它藥劑。所說方法包括使用能夠特異性地雜交到哺乳動物端粒酶中的端粒酶RNA組分上的衍生的多核苷酸，其中所說的衍生的多核苷酸被傳送到具有端粒酶活性的哺乳動物細胞，經(jīng)定位于端粒酶RNA組分并滅活或抑制端粒酶活性來抑制端粒酶活性。
本發(fā)明也提供了抑制瘤形成或編程性細胞死亡的治療劑，這些治療劑經(jīng)抑制或者加強端粒酶RNA組分的形成調(diào)節(jié)端粒酶功能，這樣的藥劑可以用作為藥物。這些藥物可以用于治療各種人類和獸醫(yī)疾病，例如瘤形成，增生，神經(jīng)變性疾病，老化，愛滋病，真菌感染等。在一個實施方案中，所說藥劑由能夠轉(zhuǎn)錄端粒酶RNA組分序列或其補體或者能競爭性地抑制功能性端粒酶全酶形成的酶促失活的端粒酶RNA組分的基因治療載體組成。
第三方面，本發(fā)明提供了用于測定細胞、細胞群、組織樣品或任何以上所述的提取物中的人類端粒酶RNA組分，端粒酶或端粒酶活性的水平、數(shù)量或存在的診斷方法。在一個有關(guān)的方面，本發(fā)明提供了用于這些方法的有用的試劑(包括以上指出的引物與探針)，任選地包裝成試劑盒，該試劑盒附有采用試劑盒實施所述診斷方法的說明。
本發(fā)明提供了用于診斷人類患者疾病(例如，瘤形成)的方法，其中一種診斷測定法(例如，特異性地結(jié)合人類端粒酶RNA組分或者基因序列的標記的端粒酶RNA組分探針對固定細胞的原位多核苷酸雜交)用于測定人類患者的生物樣品中是否存在端粒酶RNA組分的預定的特殊病癥的濃度。如果測定表明端粒酶RNA組分的存在在正常范圍之外(例如在所預定的特殊病癥的濃度之外)，則患者被診斷為具有疾病狀態(tài)或易感性。
在一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸用于診斷涉及瘤形成，增生，早熟或異常的細胞衰老的病理狀態(tài)或遺傳病，或與端粒酶功能有關(guān)的其他疾病，特別是涉及端粒酶RNA組分或者基因序列的結(jié)構(gòu)或豐度改變的或者與特殊病癥的端粒酶RNA組分等位基因(其可由RFLP和/或等位基因特異性PCR，或其它適合的檢測方法檢測)連鎖的病態(tài)和疾病。典型地，所述方法用于診斷人類患者的疾病(例如瘤形成)，其中的診斷測定(例如確定端粒酶RNA組分的量和/或結(jié)構(gòu))用來確定在人類患者生物樣品的細胞中是否存在端粒酶RNA組分的預定的特殊病癥的濃度或者結(jié)構(gòu)；如果測定表明存在正常范圍外(例如在所預定的特殊病癥的濃度之外)的特殊病癥量的端粒酶RNA組分，則患者被診斷為具有疾病或疾病易感性。
第四方面，本發(fā)明提供了重組端粒酶制劑和生產(chǎn)這種制劑的方法。這樣，本發(fā)明提供了重組人類端粒酶，它包括人類端粒酶蛋白質(zhì)組分以及哺乳動物物種的端粒酶蛋白質(zhì)組分以及本發(fā)明的重組RNA組分，所述物種具有基本上同源于人類端粒酶RNA組分之RNA組分。本發(fā)明的這樣的重組RNA組分分子包括不同于天然產(chǎn)生的RNA組分分子的那些RNA組分分子(一個或多個堿基取代，缺失，末端添加和/或插入)以及在重組宿主細胞中產(chǎn)生的與天然產(chǎn)生的RNA組分分子相同的RNA組分分子。用于產(chǎn)生這樣的重組端粒酶分子的方法包括用編碼本發(fā)明的RNA組分分子的重組表達載體轉(zhuǎn)化表達端粒酶蛋白質(zhì)組分的真核宿主細胞，以及在使得端粒酶蛋白質(zhì)組分與端粒酶RNA組分表達和裝配形成能夠添加序列(不必是由天然端粒酶添加的同一序列)至染色體DNA端粒上的活性端粒酶分子的條件下，培養(yǎng)用所說的載體轉(zhuǎn)化的所說的宿主細胞。
在第五方面，本發(fā)明提供了純化人類端粒酶蛋白質(zhì)組分以及哺乳動物物種的端粒酶蛋白質(zhì)組分的方法，所述物種具有基本上同源于人類端粒酶RNA組分之RNA組分。本發(fā)明也提供了用于分離和鑒別編碼這些蛋白質(zhì)組分的核酸的方法。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了純化的人類端粒酶和純化的哺乳動物物種(所述物種具有基本上同源于人類端粒酶RNA組分之RNA組分)端粒酶以及編碼這樣的端粒酶制劑的一種或多種組分的純化的核酸。本發(fā)明也提供了包含作為有效成分的端粒酶蛋白質(zhì)組分或者核酸的藥物組合物，所述核酸編碼編碼端粒酶蛋白質(zhì)組分的核酸或者與其相互作用。
在第六方面，本發(fā)明提供了用于鑒別調(diào)節(jié)(即抑制，加強，或改變特異性)哺乳動物端粒酶活性的藥劑的方法。這樣的端粒酶調(diào)節(jié)劑常常是小分子(例如小于約3000道爾頓)，并且能常常為治療目的用來體外和體內(nèi)修飾端粒酶活性，并且用作實驗試劑和/或藥物。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了從藥劑庫或者文庫鑒別候選藥劑方法，所述候選藥劑通過調(diào)節(jié)哺乳動物端粒酶RNA組分與端粒酶蛋白質(zhì)組分的非共價結(jié)合調(diào)節(jié)端粒酶活性。如果需要，所說端粒酶RNA組分能在宿主細胞中從重組模板產(chǎn)生或由化學合成產(chǎn)生。典型地，將哺乳動物端粒酶蛋白質(zhì)組分(如可以是從端粒酶表達細胞純化的，也可以是將天然產(chǎn)生的端粒酶RNA組分除去(例如通過RNA酶處理)后的)在適合的水性結(jié)合條件下與哺乳動物端粒酶RNA組分接觸以便在不存在添加的藥劑時(即在對照結(jié)合反應中)在RNA和蛋白質(zhì)組分之間形成非共價結(jié)合。將在選自藥劑文庫或庫的一種或多種藥劑存在下的端粒酶RNA組分和蛋白質(zhì)組分之間的非共價相互作用的量值與在包含端粒酶RNA和蛋白質(zhì)組分并且缺乏藥劑的對照結(jié)合反應中的非共價相互作用的量值進行比較，使端粒酶RNA和蛋白質(zhì)組分之間的非共價結(jié)合的量值在統(tǒng)計學上明顯增加的藥劑從而被確定為候選端粒酶調(diào)節(jié)劑。非共價結(jié)合的相對量值可以用任何適合的方法測定，包括特異性結(jié)合親和性的測定(例如通過競爭性結(jié)合測定)，在合適的端粒重復模板上的端粒酶催化活性的測定，或哺乳動物端粒酶RNA和蛋白質(zhì)組分之間的功能性非共價相互作用的其它合適的測定法，如凝膠移位或EMSA(電泳遷移率變動分析)。在一個用于檢測候選端粒酶調(diào)節(jié)劑的實施方案中，用合適的可檢測標記物標記端粒酶RNA組分或者蛋白質(zhì)組分之一或兩者。在存在和不存在選自藥劑文庫或庫的藥劑時分別測定非共價結(jié)合。非共價結(jié)合的測定包括如下測定所標記的端粒酶組分(RNA組分或蛋白質(zhì)組分)結(jié)合到其關(guān)聯(lián)端粒酶組分(分別為蛋白質(zhì)組分或者RNA組分)上的程度(所述的關(guān)聯(lián)端粒酶組分單獨標記或未標記)，所述測定例如包括捕獲(例如固定化)包含所說標記端粒酶組分和所說關(guān)聯(lián)端粒酶組分的結(jié)合復合物，從所說的結(jié)合復合物分離(例如經(jīng)洗滌)未結(jié)合的標記端粒酶組分從而產(chǎn)生分離的結(jié)合組分，并且經(jīng)測定可檢測標記物的存在檢測分離的結(jié)合組分中的結(jié)合復合物。產(chǎn)生端粒酶RNA和蛋白質(zhì)組分之間的非共價結(jié)合的量值在統(tǒng)計學上明顯降低或增加的藥劑從而被鑒別為候選端粒酶調(diào)節(jié)劑。降低非共價結(jié)合的藥劑是候選端粒酶抑制因子(或拮抗劑)，而增加端粒酶組分非共價結(jié)合的藥劑是候選端粒酶興奮劑。
在一個實施方案中，通過其導致哺乳動物端粒酶酶促活性的統(tǒng)計學上明顯降低或增加的能力鑒別候選端粒酶調(diào)節(jié)劑，所說的哺乳動物端粒酶包含純化的端粒酶蛋白質(zhì)組分和端粒酶RNA組分。
在一個實施方案中，通過其導致報道基因多核苷酸序列(例如β-半乳糖苷酶基因，螢光素酶基因，HPRT基因)轉(zhuǎn)錄的統(tǒng)計學上明顯降低或增加的能力鑒別候選端粒酶調(diào)節(jié)劑，所說報道基因多核苷酸序列可操作連接到代謝活性哺乳動物細胞的哺乳動物端粒酶RNA組分基因(優(yōu)選地是人類端粒酶RNA組分基因)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列上。在一種變化方案中，哺乳動物細胞中的內(nèi)源端粒酶RNA組分基因用同源定向構(gòu)建體靶引，以可操作的連接方式將報道基因多核苷酸序列置入內(nèi)源基因染色體基因座的內(nèi)源端粒酶RNA組分基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如啟動子)上。在另一變化方案中，包含報道基因多核苷酸的外源多核苷酸可操作連接到哺乳動物端粒酶RNA組分基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動子和上游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點)；將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移進哺乳動物細胞，在所述細胞中，它可以非同源地整合進染色體位置和/或作為附加型多核苷酸保持或復制。從而在用所述藥劑處理的細胞中產(chǎn)生報道基因多核苷酸的統(tǒng)計學上顯著的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的藥劑作為候選哺乳動物端粒酶調(diào)節(jié)劑被鑒別出來。
用于鑒別候選端粒酶調(diào)節(jié)劑的組合物典型地包括(1)一種哺乳動物端粒酶蛋白質(zhì)組分，其可以是例如從表達端粒酶的哺乳動物細胞純化的，優(yōu)選地是從靈長類(例如人類)細胞純化的，并且其典型地是用RNA酶處理或其它處理剝離掉任何如果有的相關(guān)RNA組分，所說的其它處理與除去RNA組分和保留蛋白質(zhì)(在合適的結(jié)合條件下在存在相關(guān)端粒酶RNA組分時)重構(gòu)端粒酶活性的能力相容，(2)一種哺乳動物端粒酶RNA組分，優(yōu)選地是經(jīng)細胞中重組多核苷酸的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的人類RNA組分，和(3)水性結(jié)合條件(例如生理條件，端粒酶測定條件)，以及任選的(4)包含至少一個可復制或可延伸的哺乳動物端粒酶重復序列的報道基因多核苷酸，其典型地互補于所說RNA組分的端粒重復互補模板部分的序列，和任選的(5)在端粒測定條件之下適合于復制和/或延伸報道基因多核苷酸的所說端粒重復序列之核苷酸；典型地是將一種藥劑添加到這種組合物中，與缺乏所說藥劑的對照組合物比較非共價結(jié)合和/或端粒酶活性而進行評價。
第七方面，本發(fā)明也提供了哺乳動物端粒酶RNA組分基因的無效等位基因(nullalleles)，其是例如經(jīng)異源多核苷酸的同源基因靶引進哺乳動物端粒酶RNA組分基因以功能性滅活端粒酶RNA組分基因產(chǎn)生的。本發(fā)明也提供了包含端粒酶RNA組分無效等位基因的非人類無效(knockout)動物，在一個變化方案中，本發(fā)明提供了純合端粒酶RNA組分無效無效等位基因和基本上缺乏內(nèi)源端粒酶活性(由缺乏內(nèi)源端粒酶RNA組分產(chǎn)生)的非人類無效動物。這樣的無效動物用作毒理學篩選的市售受試者，出售給藥物研究實驗室用以鑒別或研究端粒酶調(diào)節(jié)劑，用作寵物和農(nóng)用牲畜等。
第八方面，本發(fā)明提供了使哺乳動物細胞無限增殖化的方法，所說細胞例如生物反應器中的所需的發(fā)酵細胞或具有作為商業(yè)性研究受試者的具有有利特性的所需細胞株，該方法包括將表達功能性端粒酶RNA組分的多核苷酸引入到哺乳動物細胞中，所說組分能夠在端粒酶蛋白質(zhì)組分的存在下形成功能性端粒酶。
從附圖，本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，實施例，以及權(quán)利要求的描述，可以明顯看出本發(fā)明的特征和優(yōu)點。定義本文中使用的術(shù)語＂端粒酶RNA組分多核苷酸＂指至少為20個核苷酸的多核苷酸，其中所說的多核苷酸包括至少20個核苷酸的區(qū)段，其至少85％相同于天然產(chǎn)生的哺乳動物端粒酶RNA組分序列，典型地是靈長類端粒酶RNA組分，如人類或猴子端粒酶RNA組分。與天然產(chǎn)生的端粒酶RNA組分序列或它的補體相比具有序列變異的某些端粒酶RNA組分的多核苷酸可以適合作為雜交探針，PCR引物，LCR擴增引物，錯配RNA組分等。
術(shù)語“相應于”本文用來指一個多核苷酸序列與全部或部分參照多核苷酸序列同源(即，相同，不是嚴格的進化相關(guān))，或指一個多肽序列同源于參照多肽序列。相反，術(shù)語＂互補于＂本文用來指互補序列同源于全部或部分參照多核苷酸序列。舉例來說，核苷酸序列＂TATAC＂相應于參照序列＂TATAC＂，并互補于參照序列＂GTATA＂。
下列術(shù)語用來描述兩個或更多個多核苷酸序列之間的關(guān)系＂參照序列＂，＂比較窗＂，＂序列等同性＂，＂序列等同性的百分比＂，以及＂基本上的等同性＂。＂參照序列＂是用作序列比較的基礎(chǔ)的限定序列；參照序列可以是一種較大的序列的子集，例如，全長端粒酶RNA組分基因序列的區(qū)段。一般地，參照序列至少20個核苷酸長，通常是至少25個核苷酸長，并且常常是至少50個核苷酸長。由于兩個多核苷酸各自可以(1)包含兩個多核苷酸之間類似的序列(即完整的多核苷酸序列的一部分)，和(2)可以進一步包含兩個多核苷酸之間不同的序列，所以兩個(或更多個)多核苷酸之間的序列比較典型地是通過在＂比較窗＂上比較兩多核苷酸的序列，以鑒別和比較序列類似的局部區(qū)域。
本文使用的＂比較窗＂指至少25個鄰接核苷酸位置的概念性區(qū)段，其中多核苷酸序列可以與至少25個鄰接核苷酸的參照序列比較，且其中就兩個序列的優(yōu)化對比而言比較窗中的多核苷酸序列的部分與參照序列(這種序列不包括添加或缺失)比較可以包含20％或更少的添加或缺失。用于對比比較窗的優(yōu)化序列對比可以采用Smith和Waterman(1981)，Adv.Appl.Math.2482的局部同源算法，Needleman和Wunsch(1970)，分子生物學雜志48443的同源對比算法，Pearson和Lipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)852444的相似性檢索方法，通過計算機化實施這些方法(威斯康星遺傳學軟件包7.0中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA，遺傳學計算機小組，575科學Dr.，Madison，WI)，或通過檢查，選擇由各種方法產(chǎn)生的最好的對比(例如在比較窗上產(chǎn)生最高同源性百分比)。
術(shù)語＂序列等同性＂意指兩個多核苷酸序列在比較窗上相同(即以逐個比較核苷酸為基礎(chǔ))，術(shù)語“序列等同性的百分比”是經(jīng)以下步驟計算的，在比較窗中比較兩個優(yōu)化對比序列，確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(即A，T，C，G，U或I)的位置的數(shù)量，用配對位置的數(shù)量除以比較窗中的位置的總數(shù)(即窗的大小)，將所得結(jié)果乘以100即得序列等同性的百分比。術(shù)語“基本上的等同性”本文用來指多核苷酸序列的特征，其中在至少20個核苷酸位置的比較窗(常常是在至少30-50個核苷酸位置的比較窗)上，其中的多核苷酸包括與參照序列比較具有至少80％序列等同性的序列，更優(yōu)選地至少85％等同性，常常是89-95％序列等同性，更常見的是至少99％的序列等同性，序列等同性的百分比通過將參照序列與多核苷酸序列進行比較而計算，所說多核苷酸序列可以包括在比較窗上的與參照序列比較總共20％或更少的缺失或者添加。參照序列可以是一種較大序列的子集，例如本文公開的全長端粒酶RNA組分基因序列的一個區(qū)段。
特異性雜交本文定義為在探針多核苷酸(例如可以包括取代、缺失和/或添加的本發(fā)明的多核苷酸)和特異性靶多核苷酸(例如端粒酶RNA組分或者基因組基因序列)之間形成雜合子，其中所說的探針優(yōu)選地雜交到特異性靶上，以便例如可以在從合適的細胞源(例如表達端粒酶RNA組分的體細胞)制備的RNA的Northern印跡上鑒別相應于端粒酶RNA組分基因的一個或多個RNA種類(或特異性切割或加工的端粒酶RNA組分種類)的單個帶。特異性地雜交到哺乳動物端粒酶RNA組分或者人類端粒序列上的本發(fā)明的多核苷酸可以在本文提供的序列數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上按照本領(lǐng)域中已知的方法和熱力學原理制備，所述方法和原理在Maniatis等，分子克隆實驗室手冊，第二版，(1989)，ColdSpring Harbor，N.Y.和Berger和Kimmel，酶學方法，第152卷，分子克隆技術(shù)指南，學院出版公司(Academic Press，Inc.)，San Diego，CA中有描述，這些文獻本文一并參考。
本文使用的術(shù)語＂合適的結(jié)合條件＂指水性條件，其中哺乳動物端粒酶RNA組分與其關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)組分結(jié)合，并且從一種包含端粒重復單位適合模板形成有能力催化復制，修復，和/或添加端粒重復單位的酶促活性端粒酶全酶；這樣的端粒重復模板可以存在或不存在。通常，合適的結(jié)合條件可以是生理條件。本文使用的＂生理條件＂指溫度，pH值，離子強度，粘度等生物化學參數(shù)，它們與存活的有機體相容和/或典型地在活培養(yǎng)的哺乳動物細胞中胞內(nèi)存在，特別是在所說的哺乳動物細胞核中存在的條件。例如，在典型的實驗室培養(yǎng)條件下培育的哺乳動物細胞中的核內(nèi)或胞質(zhì)條件是生理條件。體外轉(zhuǎn)錄混合物的合適的體外反應條件一般是生理條件，并且可以由各種本領(lǐng)域已知的核提取物例證性說明。一般來說，體外生理條件可以包括50-200mM NaCl或KCl，pH值6.5-8.5，20-45℃和0.001-10mM二價陽離子(例如鎂離子，鈣離子)；優(yōu)選地是大約150mMNaCl或KCl，pH值7.2-7.6，5mM二價陽離子，并且常常包含0.01-1.0％非特異性蛋白質(zhì)(例如BSA)。通常存在非離子除垢劑(Tween，NP-40，Triton X-100)，存在量通常為大約0.001至2％，典型地為0.05-0.2％(V/V)。具體的水性條件可以由操作者按照常規(guī)方法選擇。作為一般指導，下列緩沖水性條件可以使用10-250mM NaCl，5-50mMTris HCl，pH值5-8，任選地加入二價陽離子和/或金屬螯合劑和/或非離子除垢劑和/或膜組分和/或消泡劑和/或閃爍劑。
本文使用的術(shù)語＂標記物＂或“標記的”指可檢測的標記物的摻入，例如，摻入放射性標記的氨基酸或在多肽上結(jié)合生物素部分，該生物素部分可由標記的抗生物素蛋白(例如，可由光學的或calorimetric方法檢測的包含熒光標記或酶促活性的鏈霉抗生物素蛋白)檢測。標記多肽和糖蛋白的各種方法是本領(lǐng)域已知的并且可以使用的。多肽的標記的例子包括但不限于放射性同位素(例如，3H，14C，35S，125I，131I)，熒光標記(例如，F(xiàn)ITC，堿性蕊香紅，鑭系元素磷光體)，酶促標記(例如，辣根過氧物酶，β-半乳糖苷酶，螢光素酶，堿性磷酸酶)，生物素基團，被第二報道者(例如，亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)對序列，第二抗體結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄激活劑多肽，金屬結(jié)合區(qū)，表位標記)識別的預定的多肽表位。在一些實施方案中，經(jīng)各種長度的間隔臂連接標記以減少潛在的位阻。
本文使用的術(shù)語＂統(tǒng)計學上顯著的＂意指一般在至少3次分開的對照試驗讀出測定的平均值之上或之下至少兩個標準偏差的結(jié)果(即測定讀出)，和/或由Student’s T-檢驗或其它統(tǒng)計學上顯著性的本領(lǐng)域接受的測定法測定時為統(tǒng)計學上顯著的結(jié)果。
本文使用的術(shù)語＂特殊病癥濃度＂，＂特殊病癥的量＂，以及＂特殊病癥雜交模式＂分別指樣品中的端粒酶RNA組分的濃度，量，或定位模式，其指示發(fā)展為致瘤性疾病如癌，肉瘤，或白血病等的病理(例如，致瘤性的，衰老的，免疫缺陷的，神經(jīng)變性的，炎性的等)狀態(tài)和易感性的存在。特殊病癥量是在細胞或細胞樣品中的落在由預測性和/或回顧性統(tǒng)計臨床研究建立正常的臨床值的范圍之外的端粒酶RNA組分的量，該量在。一股地，具有致瘤性疾病(例如癌，肉瘤，或白血病)的個體將顯示出細胞或組織樣品中的端粒酶RNA組分的量在表征為正常的非病態(tài)個體的濃度范圍外；典型地特殊病癥濃度至少是在平均正常值外大約一個標準偏差，更常見的至少是在平均的正常值之上大約兩個標準偏差或更高。然而，幾乎所有臨床診斷性試驗均產(chǎn)生一定百分比的假陽性和假陰性。診斷測定的靈敏性和選擇性必須足以滿足診斷的目標與任何有關(guān)的調(diào)節(jié)的需要。一般來說，本發(fā)明的診斷方法用于鑒別可能患有疾病的個體，在由合格的保健醫(yī)生所作的區(qū)分疾病診斷中提供額外的參數(shù)。
本文使用的術(shù)語＂疾病等位基因＂指能夠產(chǎn)生可識別疾病的基因的等位基因。疾病等位基因可以是顯性的或隱性的，并且可以直接產(chǎn)生疾病，或者與特定的遺傳背景或預先存在的病理狀態(tài)結(jié)合起來產(chǎn)生疾病。疾病等位基因可以是基因庫中存在的或在個體中經(jīng)體細胞突變從頭產(chǎn)生的。
術(shù)語＂抗腫瘤劑＂本文用來指在人類中有抑制(通常包括抑制轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移性潛力)腫瘤發(fā)展或擴散的功能性性質(zhì)的藥劑。
本文使用的術(shù)語＂可操作連接＂指功能關(guān)系中多核苷酸元件的連接。當一種核酸被置入另一核酸序列的功能關(guān)系中時，其是＂可操作連接＂的。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它們是可操作連接到編碼序列上的?？刹僮鬟B接意指所連接的DNA序列典型地是鄰接的并且當需要連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)時是鄰接的并在閱讀框架中。然而，因為增強子一般在由幾千堿基與啟動子分開時起作用，并且內(nèi)含子序列可以是可變長度的，所以某些多核苷酸元件可以是可操作連接的但是不是鄰接的。結(jié)構(gòu)基因(例如HSV tk基因)是可操作連接到相應于內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的多核苷酸序列上的，其一般以基本上與天然產(chǎn)生的基因相同的時序和細胞類型特異性模式被表達。
本文使用的術(shù)語＂轉(zhuǎn)錄單位＂或＂轉(zhuǎn)錄復合物＂指包含下列基因或序列的多核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因(外顯子)、順式作用連接啟動子和對結(jié)構(gòu)序列有效轉(zhuǎn)錄必需的其它順式作用序列、對結(jié)構(gòu)序列的適當?shù)慕M織特異性和發(fā)育轉(zhuǎn)錄必需的遠側(cè)調(diào)節(jié)元件、對有效轉(zhuǎn)錄和翻譯重要的附加順式序列(例如，聚腺苷酸化位點，mRNA穩(wěn)定性控制序列)。
本文使用的術(shù)語＂轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)＂指提高或抑制順式連接的結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的能力；這樣的提高或抑制作用可以是在特異性事件發(fā)生時(如用誘導劑刺激)伴隨發(fā)生的和/或僅在一定的細胞類型中是顯然的。
本文使用的術(shù)語＂轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)＂指包含功能性啟動子和任何相關(guān)的轉(zhuǎn)錄元件(例如增強子，CCAAT盒，TATA盒，SP1位點，等等)的DNA序列，所述元件是可操作連接到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)上的多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄必需的。
本文使用的術(shù)語＂無效等位基因＂指基因座包括突變或者結(jié)構(gòu)改變，使得其基本上不能指導功能性基因產(chǎn)物的有效表達。＂無效細胞＂是具有至少一個內(nèi)源基因的無效等位基因的細胞，典型地是無效等位基因純合的。這樣，例如，無效細胞可以是在端粒酶RNA組分基因座上的無效等位基因純合的，以使這樣的無效細胞基本上不能表達功能性端粒酶RNA組分。附圖簡要描述

圖1.在各種反應條件下用常規(guī)測定方法測定表達突變模板的TRC3 DEAE-瓊脂糖凝膠分級分離提取物(其來源于突變TRC3表達穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子)之細胞的端粒酶活性。在下列條件下測定表達MuC+17 TRC3(1，4，7，10，13，16道，標為C*)、MuC TRC3(2，5，8，11，14，17道，標為C)或MuA TRC3(3，6，9，12，15，18道，標為A)的細胞提取物在正常反應條件下(1-6道)，正常加0.5mM ddCTP(7-9道)，正常減dTTP加0.5mM ddTTP(10-12道)，或正常減dATP加0.5mM ddATP(13-18道)。1-9道的測定反應含有8μM總dGTP，其中1μM是32P-dGTP(800Ci/mmol)。為了有利于突變端粒酶檢測，10-18道的測定反應含有8μM總dGTP，其中2μM是32P-dGTP(800 Ci/mmol)。在端粒酶測定前，用無DNA酶的RNA酶處理提取物(25微克/毫升，30℃10分鐘)(1-3，16-18道)。
圖2.用定量RT-PCR測定端粒酶RNA組分(hTR)和GAPDH RNA的穩(wěn)態(tài)水平。對照顯示所有PCR定量直到25個循環(huán)都在線性范圍內(nèi)。對5個正常的端粒酶陰性細胞系(1-5)和5個腫瘤端粒酶陽性細胞系(6-10)進行RT-PCR分析1)初級胎肺；2)初級胎手皮膚；3)成人初級前列腺；4)初級竇道(sinovial)成纖維細胞；5)包皮成纖維細胞；6)黑素瘤LOX；7)白血病U251；8)NCIH23肺癌；.9)結(jié)腸腫瘤SW620；10)乳腺腫瘤MCF7。PCR產(chǎn)物以32P標記，在6％PAGE上分離，用PhosphorImager定量測定。相對轉(zhuǎn)錄以任意單位表示。
圖3.在端粒酶RNA組分反義和載體對照細胞中平均TRF長度。在潮霉素和嘌呤霉素培養(yǎng)基中選擇能穩(wěn)定表達10-3-hTR反義或者載體對照的HeTe7細胞，并且在23PDL轉(zhuǎn)染后收集。純化核DNA，用HinfI和RsaI切割，在0.5％瓊脂糖凝膠上分離。在凝膠中用(TTAGGG)3寡核苷酸探查DNA以標記端粒末端限制片段(TRF)。用分子動力學PhosphorImager掃描凝膠，按Allsopp等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)8910114的描述定量測定平均TRF。虛線表示反義和對照組平均的平均TRF。
圖4是原位PCR方法的示意圖。優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明提供了與核蛋白人類端粒酶有關(guān)的方法，試劑，遺傳工程修飾的動物和細胞，以及藥物組合物。
此后使用的名稱和以下描述的細胞培養(yǎng)，分子遺傳學，核酸化學和雜交中的方法可以是本領(lǐng)域已知的和普遍使用的。標準的技術(shù)用于重組核酸方法，多核苷酸合成，以及微生物培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如電穿孔，脂轉(zhuǎn)染)。所述技術(shù)和方法按照本領(lǐng)域和提供這些方法和技術(shù)的各種一般性參考文獻(一般可參見，Sambrook等，分子擴增實驗室手冊，第二版，(1989)Cold Spring Harbor實驗室出版社，Cold Spring Harbor，N.Y.，此文獻本文一并參考)中的常規(guī)方法進行。
按照制造商提供的說明可以在應用生物系統(tǒng)寡核苷酸合成儀上合成寡核苷酸。
現(xiàn)有技術(shù)中描述了用于PCR擴增的方法(PCR技術(shù)DNA擴增的原理和應用，編者GA Erlich，F(xiàn)reeman出版社，紐約NY(1992)；PCR方案方法和應用指南，編者Innis，Gelfland，Snisky，and White，學院出版社，San Diego，CA(1990)；Mattila et等(1991)核酸研究，194967；Eckert，K.A.和Kunkel，T.A.(1991)PCR方法和應用，117；PCR，編者McPherson，Quirkes，和Taylor，IRL出版社，牛津大學；美國專利4,683,202，這些文獻本文一并參考)。
總述本發(fā)明一部分涉及人類端粒酶RNA組分和該RNA組分的基因(包括相關(guān)轉(zhuǎn)錄控制元件)的克隆與分離。人類端粒酶RNA組分的核苷酸序列示于如下。為方便起見，用核糖核苷酸的標準縮寫(A是核糖腺嘌呤，G是核糖鳥嘌呤，C是核糖胞苷，并且U是尿苷)表示序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚以下所示序列也代表cDNA的序列，只是在其中核糖核苷酸由脫氧核糖核苷酸代替(由胸苷代替尿苷)。‘ ‘‘‘‘ 50GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUC‘ ‘‘‘‘ 100UAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGC‘ ‘‘‘‘ 150UGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCU‘ ‘‘‘‘ 200UCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUC‘ ‘‘‘‘ 250GCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCC‘ ‘‘‘‘ 300UGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGC‘ ‘‘‘‘ 350GAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGU‘ ‘‘‘‘ 400UCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGC‘ ‘‘‘‘ 450GCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGC‘ ‘‘‘‘ 500AGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCAC‘ ‘‘‘‘ 550CCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGC‘ 559CAGUGUGCU以上序列以5’-3’方向示出，并且給出了供參考的編號。據(jù)信RNA組分的模板序列在由第50-60位核苷酸(5’-CUAACCCUAAC-3’)所限定的區(qū)域內(nèi)，其互補于由約三分之一至三分之二的端粒序列重復單位組成的端粒序列。
這一序列源于cDNA克隆和RNA組分的基因組克隆。當RNA組分首先從相應的基因轉(zhuǎn)錄時，至少某些產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄物比以上所示的約560個核苷酸的序列長得多，并且事實上可以包含1000個以上的核苷酸。然而，從由以上所示的約560個核苷酸序列組成的轉(zhuǎn)錄物可以裝配完整功能性端粒酶分子。據(jù)信天然端粒酶中的RNA組分的3’末端在由以上序列的第514-559位核苷酸所限定的區(qū)域內(nèi)；一種分析表明3’末端可以是第538位核苷酸的U殘基。包含少于以上所示序列的1-559位核苷酸的重組RNA組分分子也可以用于制備活性端粒酶。
從插入到λ載體FIXII中的人類DNA的基因組文庫鑒別和分離基因組克隆，包含RNA組分基因序列的基因組克隆含有約15kb插入物，被稱為克隆28-1。所述基因位于染色體3的q臂的遠端上。以下用標準的脫氧核糖核苷酸縮寫字母以5’-3’方向示出了從該約15kb插入物的一端的SauIIIA1限制性內(nèi)切酶識別位點至內(nèi)HindIII限制性內(nèi)切酶識別位點的序列信息，所述序列包含所有成熟RNA組分序列以及RNA組分基因的轉(zhuǎn)錄控制元件?！? ‘‘‘‘ 50GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGTACT‘ ‘‘‘‘ 100CAAGATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTGACA‘ ‘‘‘‘ 150AGATTTAGTGCCTACTTAGATATGAAGGGGAAAGAAGGGTTTGAGATAAT‘ ‘‘‘‘ 200GTGGGATGCTAAGAGAATGGTGGTAGTGTTGACATATAACTCAAAGCATT‘ ‘‘‘‘ 250TAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGCTAAAAA‘ ‘‘‘‘ 300CAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGCTAT‘ ‘‘‘‘ 350GAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAGAGG‘ ‘‘‘‘ 400GAGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGACAGCGACAACTCCAC‘ ‘‘‘‘ 450GGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCCTGTCAT‘ ‘‘‘‘ 500TTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCCGGG‘ ‘‘‘‘ 550TGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCGGGT‘ ‘‘‘‘ 600GGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAA‘ ‘‘‘‘ 650CCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCG‘ ‘‘‘‘ 700CCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGAACC‘ ‘‘‘‘ 750CGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCATCCA‘ ‘‘‘‘ 800GCCTGGGCGAAAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAAATCGTTACAAT‘ ‘‘‘‘ 850TTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACTACT‘ ‘‘‘‘ 900TTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGGGAG‘ ‘‘‘‘ 950ATTCAGTCCTTAAGATTAATAATGTAGTAGTTACACTTGATTAAAGCCAT‘ ‘‘‘‘ 1000CCTCTGCTCAAGGAGAGGCTGGAGAAGGCATTCTAAGGAGAAGGGGGCAG‘ ‘‘‘‘ 1050GGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTGTAG‘ ‘‘‘‘ 1100TCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGTGAT‘ ‘‘‘‘ 1150GATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTTCCT‘ ‘‘‘‘ 1200GTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGCAGA‘ ‘‘‘‘ 1250GGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAAAGA‘ ‘‘‘‘ 1300AGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGCAAC‘ ‘‘‘‘ 1350GTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCCAAC‘ ‘‘‘‘ 1400CAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCTTGG‘ ‘‘‘‘ 1450CCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGC‘ ‘‘‘‘ 1500AGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCAT‘ ‘‘‘‘ 1550TTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCC‘ ‘‘‘‘ 1600CCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCC‘ ‘‘‘‘ 1650TGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTG‘ ‘‘‘‘ 1700GCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCCCGA‘ ‘‘‘‘ 1750ACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCCACT‘ ‘‘‘‘ 1800GCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGCGAG‘ ‘‘‘‘ 1850GGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTCCCG‘ ‘‘‘‘ 1900CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC‘ ‘‘‘‘ 1950ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA‘ ‘‘‘‘ 2000TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT‘ ‘‘‘‘ 2050GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA‘ ‘‘‘‘ 2100AGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGTTCC‘ ‘‘‘‘ 2150TGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGTATT‘ ‘‘‘‘ 2200ACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTCCCA‘ ‘‘‘‘ 2250AGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCATTT‘ ‘‘‘‘ 2300TTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGATCTA‘ ‘‘‘‘ 2350AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA‘ ‘‘‘‘ 2400GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTGAGC‘ ‘‘‘‘ 2425AGTAGGATATAACCCCCACAAGCTTRNA組分序列在堿基1459上開始。在該序列上的各種轉(zhuǎn)錄控制元件被鑒別。在第1431-1436位核苷酸上發(fā)現(xiàn)一個A/T盒共有序列；在第1406-1414位核苷酸以及第1508-1526位核苷酸上發(fā)現(xiàn)熒光PSE共有序列；在第1399-1406位核苷酸上發(fā)現(xiàn)一個CAAT盒共有序列；在第1354-1359位核苷酸上發(fā)現(xiàn)一個SP1共有序列；在第1234-1245位核苷酸上發(fā)現(xiàn)一個β/γ-干擾素反應元件共有序列。當?shù)?159位核苷酸上游序列在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進細胞的載體中缺失時，在人類細胞如HT1080中的人類端粒酶RNA組分的穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)錄(端粒酶表達)基本上不改變。
松鼠猴(其被認為屬于遺傳上與人類最有差異的非人類靈長類動物之一)的DNA包含端粒酶RNA組分基因，其可用由相應于或互補于所公開的人類端粒酶RNA組分多核苷酸序列之序列組成的PCR引物進行擴增。其它非人類靈長類也被認為具有端粒酶RNA組分基因，該基因也可用源于人類端粒酶RNA組分基因的序列的PCR引物進行擴增。
端粒酶RNA組分多核苷酸哺乳動物端粒酶RNA組分序列和其基因的公開(如以上所示的有關(guān)人類端粒酶和圖5中所示出的有關(guān)松鼠猴端粒酶)使構(gòu)建包含至少15個鄰接的核苷酸(典型地至少20至25個鄰接的多核苷酸)序列的分離的多核苷酸成為可能，所述的序列基本上與哺乳動物端粒酶RNA組分序列或哺乳動物RNA組分基因序列相同。此外，哺乳動物端粒酶RNA組分(和基因)序列使得構(gòu)建核酸雜交探針和PCR引物成為可能，所述探針和引物可以用于檢測細胞，細胞樣品，組織切片，反應載體，雜交膜等中的關(guān)聯(lián)端粒酶RNA組分和/或基因的RNA和DNA序列。
包含哺乳動物端粒酶RNA組分序列的多核苷酸可以包含有利于轉(zhuǎn)錄的序列(表達序列)，RNA穩(wěn)定序列等，鑒于本發(fā)明所公開的序列信息和本發(fā)明的指導，構(gòu)建這些多核苷酸的一般原理是本領(lǐng)域公知的，并且在Maniatis等，分子克隆實驗室手冊，第二版，(1989)，Cold Spring Harbor，N.Y.中有描述。這樣的多核苷酸例如但不限于可以包含啟動子，任選的用于真核表達宿主表達的增強子，和任選的載體復制必需的序列。典型的真核表達盒包括多核苷酸序列，當其被轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生哺乳動物端粒酶RNA組分轉(zhuǎn)錄物；這樣的多核苷酸序列被連接到合適啟動子例如HSV tk啟動子或者pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動子(所述啟動子任選地可操作連接到增強子上)的下游(即5’到3’轉(zhuǎn)錄方向)。
另外，在不需要功能性端粒酶RNA組分的表達時，本發(fā)明的多核苷酸不需轉(zhuǎn)錄功能性端粒酶RNA組分轉(zhuǎn)錄物。本發(fā)明的多核苷酸可以用作檢測端粒酶RNA組分RNA或者DNA序列的雜交探針和/或PCR引物(擴增引物)和/或LCR寡聚物。
另外，本發(fā)明的多核苷酸可以作為檢測相關(guān)基因的RNA或DNA序列，或相關(guān)物種(典型地是哺乳動物物種)的端粒酶RNA組分基因的雜交探針或引物。對于這樣的雜交和PCR用途，本發(fā)明的多核苷酸不需轉(zhuǎn)錄功能性端粒酶RNA組分。這樣，本發(fā)明的多核苷酸可以包含基本上的缺失，添加，核苷酸取代和/或轉(zhuǎn)座，只要哺乳動物端粒酶RNA組分序列的特異性雜交或特異性擴增被保留。
可以用基于本文公開的核苷酸序列設計的雜交探針由常規(guī)雜交篩選方法(例如，Benton WD和Davis RW(1977)科學196180；Goodspeed等(1989)基因761)從克隆文庫(例如得自Clontech，Palo Alto，CA)分離哺乳動物端粒酶RNA組分和相應基因序列的基因組克隆或者cDNA克隆。當cDNA克隆是所需的時，包含源于體細胞RNA或者其它表達端粒酶RNA組分的細胞RNA的cDNA的克隆文庫是優(yōu)選的。另外，可以經(jīng)寡核苷酸化學合成構(gòu)建相應于所有或部分本文公開的序列的合成多核苷酸序列。另外，采用基于本文公開的序列數(shù)據(jù)之引物的聚合酶鏈反應(PCR)可以用來從基因組DNA，RNA庫，或cDNA克隆文庫擴增DNA片段。美國專利4,683,195和4,683,202描述了PCR方法。
這些多核苷酸具有各種用途，包括作為端粒酶RNA組分探針，作為在細胞中生產(chǎn)功能性或非功能性端粒酶RNA組分的模板，作為標準化端粒酶RNA組分檢測測定的商業(yè)診斷試劑，作為施用于動物的基因治療多核苷酸；在其其它用法中，這些多核苷酸也可以用作食物，易燃的能源，UV-吸收太陽篩試劑，和增加粘性的溶質(zhì)。
本文描述的在人類端粒酶RNA組分和RNA組分的基因的克隆期間構(gòu)建的質(zhì)粒是本發(fā)明的重要的方面。這些質(zhì)?？梢杂脕硪曰旧霞兓男问缴a(chǎn)人類端粒酶的RNA組分及其基因，這是本發(fā)明的另一個重要的方面。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚基本上純化的形式的各種其它質(zhì)粒，以及非質(zhì)粒核酸是本發(fā)明提供的有用的材料，所述質(zhì)粒和非質(zhì)粒核酸包括人類端粒酶RNA組分的核苷酸序列的全部或至少其有用部分。
一般來說，就本發(fā)明的核酸和包含該核酸的制劑而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，本發(fā)明的核酸包括DNA和RNA分子兩者，及其合成的非天然產(chǎn)生的類似物，以及脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，和/或兩者的類似物的異源多聚體。本發(fā)明的核酸或核酸類似物的具體的組合物取決于使用所述材料的目的和所述材料所置入的環(huán)境。修飾的或者合成的，非天然產(chǎn)生的核苷酸設計來用于各種目的并在各種環(huán)境中保持穩(wěn)定，如存在核酸酶的環(huán)境，這是本領(lǐng)域公知的。與天然產(chǎn)生的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸比較，修飾的或者合成的非天然產(chǎn)生的核苷酸在核苷酸碳水化物(糖)，磷酸酯連接鍵，或堿基部分可以是不同的，或在某些情況下甚至可以包含非核苷酸堿基(或根本沒有堿基)。參見，例如，Arnold等，PCT專利出版物WO 89/02439，名稱為＂核苷酸探針的非核苷酸連接試劑＂，本文一并參考。正因為本發(fā)明的核酸可以包含各種核苷酸，所以可以利用那些核酸的寬范圍的各種功能。
關(guān)聯(lián)基因的分離如以上描述所表明的，包含人類端粒酶RNA組分序列的純化的核酸的獲得提供了有價值的診斷和治療方法和試劑，以及其它重要的益處。本發(fā)明的一種重要的益處是本發(fā)明的方法與試劑可以用于從任何哺乳動物物種分離端粒酶RNA組分和RNA組分的基因，所述物種具有基本上同源于本發(fā)明的人類RNA組分的RNA組分。術(shù)語＂基本上同源＂指人類RNA組分的寡核苷酸或核酸序列與另一種哺乳動物物種的RNA組分序列的核酸序列特異性雜交所需的同源程度。給定這樣的基本上的同源性，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠使用本發(fā)明的核酸和寡核苷酸的引物和探針鑒別和分離基本上同源的序列。
例如，人們可以探查基因組或者cDNA文庫以檢測同源的序列。人們也可以在低的或中等嚴格的條件下用相應于RNA組分序列區(qū)域的引物和PCR擴增法從哺乳動物物種的RNA或者DNA制劑擴增特異性同源的核酸序列。通過采用這些和其它類似的技術(shù)，普通技術(shù)人員不僅可以容易地從人類細胞分離變體RNA組分核酸，而且也可以從其它哺乳動物細胞分離同源的RNA組分核酸，所述的哺乳動物細胞如靈長類細胞，獸醫(yī)目標哺乳動物(即，牛，羊，馬，狗，以及貓)細胞，以及嚙齒類(即，大鼠，小鼠，以及倉鼠)細胞。同樣這些核酸可以用于制備轉(zhuǎn)基因動物，該動物對篩選和測定調(diào)節(jié)端粒酶活性的藥物具有極大的價值。例如，通過用本發(fā)明的質(zhì)粒，人們可以在mus spretus胚干細胞中使RNA組分基因＂無效＂或用重組誘導型基因代替天然RNA組分基因，然后產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠可用作為與老化或衰老有關(guān)的疾病的研究模型或檢驗系統(tǒng)，以下實施例9說明這樣的方法怎樣用于鑒別和分離靈長類的RNA組分序列。
用包含人類或猴子端粒酶RNA組分或者基因多核苷酸序列的約至少20個鄰接核苷酸(或其補體)之序列的多核苷酸探針，通過篩選合適的非人類哺乳動物基因組或者cDNA克隆文庫(例如來源于小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、倉鼠、犬、牛、羊、狼、豬)或在合適載體如酵母人工染色體，粘粒，或噬菌體λ(例如，λCharon 35)中的其它基因組文庫或者cDNA文庫可以鑒別和分離人類和猴子端粒酶RNA組分和/或關(guān)聯(lián)基因的其它哺乳動物同系物。典型地，按照常規(guī)雜交方法，在高度嚴格的條件進行雜交和洗滌。分離陽性克隆并測序。說明性地但非限制性地，相應于人類端粒酶RNA組分的559個核苷酸的全長多核苷酸序列可被標記并用作從λEMBL4或λGEM11(Promega公司，Madison，威斯康星)中的非人類基因組克隆文庫分離基因組克隆的雜交探針。噬斑篩選的典型的雜交條件(Benton和Davis(1978)科學196180；Dunn等(1989)生物化學雜志26413057)可以是50％甲酰胺，5XSSC或SSPE，1-5X Denhardt’s溶液，0.1-1％SDS，100-200微克剪切的異源DNA或者tRNA，0-10％葡聚糖硫酸鹽，1×105到1×107cpm/ml具有約1×108cpm/μg比活性的變性探針，在42℃-37℃溫育約6-36小時。除了不包括探針和溫育時間典型地減少外，預雜交條件基本上相同。洗滌條件典型地是1-3X SSC，0.1-1％SDS，45-70℃在約5-30分鐘更換洗滌溶液。對于用人類端粒酶RNA組分多核苷酸探針分離非人類端粒酶RNA組分多核苷酸而言，在較低嚴格條件下雜交常是優(yōu)選的，如大約39℃，并且按下列步驟溫度順序洗滌室溫，37℃，39℃，42℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，以及70℃，在進行每步后中止并檢測背景探針信號(如果使用放射性標記的探針，通過放射自顯影照片和/或磷光體圖象任選地檢測信號)，當經(jīng)驗性測定獲得適合的信/噪比時，終止洗滌的步驟。
包含大約至少30-50個核苷酸，優(yōu)選地至少100核苷酸的序列的多核苷酸可以用作鑒別和分離相應于所公開的基因和RNA組分序列的種系基因之PCR引物和/或雜交探針，所說多核苷酸相應于或互補于本文所示的人類與猴子端粒酶RNA組分序列。這樣的種系基因可以由本領(lǐng)域各種常規(guī)方法分離，包括但不限于，經(jīng)雜交篩選噬菌體λ中的基因組文庫或粘粒文庫，經(jīng)用源于本文公開的序列的引物擴增基因組序列。人類基因組文庫是公眾可獲得的或可以從人類DNA從頭構(gòu)建。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是核苷酸取代，缺失，以及添加可以摻入本發(fā)明的多核苷酸。核苷酸序列變化可以產(chǎn)生自各種等位基因等的序列多態(tài)性。然而，這樣的核苷酸取代，缺失，以及添加基本上不應破壞多核苷酸在產(chǎn)生特異性雜交的足夠嚴格的條件下雜交到本文所示的一個全長人類或猴子端粒酶RNA組分多核苷酸序列上的能力。
哺乳動物端粒酶RNA組分多核苷酸可以是短的寡核苷酸(例如20-100個堿基長)，例如用作雜交探針和PCR(或LCR)引物。所說多核苷酸序列也可以包括較大的多核苷酸的一部分(例如包含端粒酶RNA組分克隆的克隆載體)，并且可以與另一個多核苷酸序列經(jīng)多核苷酸連接鍵融合。典型地，端粒酶RNA組分多核苷酸包括至少25個連續(xù)核苷酸，其基本上與天然產(chǎn)生的端粒酶RNA組分或基因序列相同，更常見的是端粒酶RNA組分多核苷酸包括至少50至100個連續(xù)核苷酸，其與天然產(chǎn)生的哺乳動物端粒酶RNA組分序列基本上相同。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，對端粒酶RNA組分靶序列的特異性雜交所需的端粒酶RNA組分多核苷酸的最小長度將取決于若干因素G/C含量，錯配堿基(如果有任何錯配堿基的話)的位置，與靶多核苷酸群相比較序列唯一性的程度，以及多核苷酸的化學性質(zhì)(例如甲基膦酸酯骨架，聚酰胺核酸，硫代磷酸酯等)等。
如果需要，可以由操作者憑借判斷力選擇用于擴增基本上全長cDNA拷貝的PCR擴增引物。同樣地，可以選擇用以擴增端粒酶RNA組分基因(猴子或人類)的部分的擴增引物。
這些序列的各種均可用作雜交探針和PCR擴增引物，以檢測端粒酶RNA組分的存在，例如，診斷以細胞中端粒酶RNA組分水平升高或降低為特征的致瘤性疾病，或進行組織分型(即鑒別以表達端粒酶RNA組分為特征的組織)等。這些序列也可以用于檢測在DNA樣品中的基因組端粒酶RNA組分基因序列，例如法醫(yī)DNA分析(例如通過RFLP分析，PCR產(chǎn)物長度分布，等等)，或用于診斷以端粒酶RNA組分基因的擴增和/或重排為特征的疾病。
作為舉例但不作為限制，以下一對寡核苷酸引物可以用來擴增端粒酶RNA組分多核苷酸序列(例如cDNA)，或作為雜交探針(例如作為生物素化的或者末端標記的寡核苷酸探針)5’-AGCACACTGGCCCAGTCAGTCAGGTTTG-3’和5’-GGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGA-3’鑒于本文所公開的和能夠由其得到的端粒酶RNA組分序列，其它合適的PCR引物，LCR引物，雜交探針，以及引物等對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。人類端粒酶RNA組分多核苷酸及其補體可以用作檢測哺乳動物端粒酶RNA組分的RNA或DNA序列的雜交探針或引物。只要人類端粒酶RNA組分序列的特異性雜交或特異性擴增被保留，這樣的雜交和PCR應用就可能包含基本上的缺失，添加，核苷酸取代和/或轉(zhuǎn)座。然而，這樣的核苷酸取代，缺失，以及添加基本上不應破壞多核苷酸在產(chǎn)生特異性雜交的足夠嚴格的條件下雜交到端粒酶RNA組分或基因序列上的能力。
作為舉例但不作為限制，人類端粒酶RNA組分多核苷酸可以包括從第48位核苷酸到第209位核苷酸的序列，其被認為在端粒酶蛋白質(zhì)組分的存在下足以重構(gòu)人類端粒酶全酶5′-UCUAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGCUGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCUUCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUCGCCCCUCCC-3′或作為DNA為5′-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCCCCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCCTGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTGGCCCGTTCGCCCCTCCC-3′.人類端粒酶RNA組分多核苷酸也可以包含第1-559位核苷酸或由它們組成，并且可以包含其它核苷酸或者核苷酸序列的末端添加。無規(guī)模板(template-scrambled)變體由第48-209位核苷酸組成，但其中端粒重復模板序列被改變，就結(jié)合到端粒酶蛋白質(zhì)組分以重構(gòu)端粒酶全酶而言，其能夠與由野生型序列48-209組成的截短的RNA組分競爭。
對人類端粒酶RNA組分的結(jié)構(gòu)分析指示出具有形成二級結(jié)構(gòu)的傾向的區(qū)域，如發(fā)夾環(huán)。例如，人類端粒酶RNA組分的約第200位核苷酸到第350位核苷酸的區(qū)域具有基本的發(fā)夾環(huán)特點。端粒酶RNA組分其它部分也具有明顯二級結(jié)構(gòu)的特點，就提到的二級結(jié)構(gòu)而言，通過計算機分析預料的采用類似的二級結(jié)構(gòu)形式的其它核苷酸序列可以由技術(shù)人員取代。雖然多種計算機程序適于測定采取基本上等同的二級結(jié)構(gòu)的核苷酸序列，但可以使用UWGCG序列分析軟件包程序FOLD，SQUIGGLES，CIRCLES，DOMES，NOUNTAINS，以及STEMLOOP。同樣地，非核苷酸結(jié)構(gòu)模擬物(如肽核酸，等)可由分子模擬程序設計，以模仿出具有所需的人類端粒酶RNA組分區(qū)特征性二級結(jié)構(gòu)的模擬物。這些結(jié)構(gòu)模擬物可以用于治療或者各種用途(例如競爭性拮抗劑，等等)。
反義本發(fā)明的一種特別有用的核酸類型是反義寡核苷酸，其可以用于體內(nèi)或體外抑制人類端粒酶活性。反義寡核苷酸包含從大約10到大約25至200個或更多個(即，如果需要，大到足以形成穩(wěn)定的雙鏈，小到根據(jù)輸送模式足以體內(nèi)施用)核苷酸的特異序列，該序列互補于人類端粒酶RNA組分中的核苷酸的特定序列。這些寡核苷酸的作用機制可以涉及結(jié)合RNA組分以阻止功能性核糖核蛋白端粒酶的裝配或阻止RNA組分作為端粒DNA合成的模板，使端粒酶RNA組分不穩(wěn)定并降低其半衰期，和/或抑制端粒酶RNA組分基因的轉(zhuǎn)錄。
用于體內(nèi)和/或體外抑制端粒酶活性的例證性的本發(fā)明的反義寡核苷酸包括以上提到的寡核苷酸，它們與確定克隆pGRN7是否包含人類端粒酶RNA組分的cDNA的試驗相關(guān)。使用了以上提到的三種這樣的寡核苷酸用于體外證明端粒酶活性的抑制作用。這些寡核苷酸各自的序列示于如下。T3 5’-CTCAGTTAGGGTTAGACAAA-3’P3 5’-CGCCCTTCTCAGTTAGGGTTAG-3’TA35’-GGCGCCTACGCCCTTCTCAGTT-3’這些寡核苷酸也可用于在人類細胞中抑制端粒酶活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到本發(fā)明提供了寬范圍的能夠抑制端粒酶活性的反義寡核苷酸。本發(fā)明的另一類有用的反義寡核苷酸是寡核苷酸Tel-Au，其具有序列5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’，與本發(fā)明的任何反義寡核苷酸一樣，它可以用硫代磷酸酯核苷酸，手性甲基膦酸酯，天然產(chǎn)生的核苷酸，或它們的混合物合成以賦予穩(wěn)定性和所需的Tm。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，各種修飾的核苷酸類似物如O-甲基核苷酸，硫代磷酸酯核苷酸和甲基膦酸酯核苷酸可以用來生產(chǎn)本發(fā)明的核酸，其與用天然產(chǎn)生的核苷酸生產(chǎn)的核酸相比具有更多所需性質(zhì)(即核酸酶抗性，更緊密結(jié)合性，等等)。提供寡核苷酸核酸酶抗性的其它技術(shù)包括在PCT專利出版物94/12633中所描述的那些。
涉及調(diào)節(jié)端粒酶活性的其他實施方案包括采用互補于全部或部分人類端粒酶RNA組分(hTR)序列的特異性反義多核苷酸的方法，所說反義多核苷酸例如人類端粒酶RNA組分基因或其轉(zhuǎn)錄的RNA的反義多核苷酸，包括可能與端粒酶全酶相關(guān)的截短的形式。這樣的互補反義多核苷酸可以包括核苷酸取代，添加，缺失，或轉(zhuǎn)座，只要特異性結(jié)合到相應于端粒酶RNA組分或其基因的相關(guān)靶序列上被保留為所說多核苷酸的一種功能性性質(zhì)即可?；パa反義多核苷酸包括可溶性反義RNA或者DNA寡核苷酸，它們可以特異性地雜交到端粒酶RNA組分物種上，并阻止端粒酶RNA組分基因的轉(zhuǎn)錄(Ching等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.美國8610006；Broder等(1990)Ann.Int.Med.113604；Loreau等(1990)FEBS Letters 27453；Holcenberg等WO91/11535；U.S.S.N.07/530,165；WO91/09865；WO91/04753；WO90/13641；和EP 386563，各文獻本文一并參考)。因此，所說的反義多核苷酸抑制功能性端粒酶RNA組分的產(chǎn)生。因為端粒酶RNA組分表達(轉(zhuǎn)錄速率和/或RNA穩(wěn)定性)與端粒酶全酶的激活和酶促活性有關(guān)，所以阻止相應于端粒酶RNA組分的RNA的轉(zhuǎn)錄和/或端粒酶RNA組分與人類端粒酶蛋白質(zhì)組分的相互作用和/或端粒酶RNA組分與端粒序列的相互作用的反義多核苷酸可以抑制端粒酶活性和/或反轉(zhuǎn)表型，例如，在不存在反義多核苷酸的情況下，表達端粒酶活性的細胞的無限增殖化或致瘤性轉(zhuǎn)化。如果需要，包含治療有效劑量的端粒酶RNA組分反義多核苷酸的組合物可以用來治療其發(fā)病機理需要端粒酶活性的疾病(例如瘤形成)，或抑制配子產(chǎn)生或保持(如作為避孕劑)。雖然這樣的多核苷酸典型地包含約至少25個連續(xù)核苷酸的序列，但可以產(chǎn)生各種長度的反義多核苷酸，所說的序列基本上互補于天然產(chǎn)生的端粒酶RNA組分多核苷酸序列，典型地，其完美地互補于人類端粒酶RNA組分序列，常常是互補于與端粒重復序列互補的端粒酶RNA組分的序列或與端粒酶RNA組分的接觸端粒酶多肽亞單位的部分互補。
可以從轉(zhuǎn)染細胞或轉(zhuǎn)基因細胞中的異源表達盒生產(chǎn)反義多核苷酸。所說異源表達盒可以是基因治療載體，如腺病毒或者腺伴隨病毒載體，或其它基因治療載體的一部分。所說異源盒可以在多核苷酸上，這種多核苷酸不能獨立復制，并用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種適合的方法轉(zhuǎn)移進細胞(例如脂轉(zhuǎn)染，biolistics，脂質(zhì)體，免疫脂質(zhì)體，電穿孔，等等)。另外，所述多核苷酸可以包括被施用到外環(huán)境，即在體外的培養(yǎng)基中或體內(nèi)應用時為間質(zhì)腔和體液(例如，血液，CSF)中的可溶性寡核苷酸。在外部環(huán)境中的可溶性反義多核苷酸表現(xiàn)出可接近細胞質(zhì)并抑制特異性的RNA物種。在一些實施方案中，反義多核苷酸包括甲基膦酸酯部分，C-5丙烯基部分，2’氟代核糖(fluororibose)，或聚酰胺核酸(戊糖核酸)(Egholm等(1992)美國化學會雜志1141895；Wittung等(1994)自然368561；Egholm等(1993)自然365566；Hanvey等(1992)科學2581481，本文一并參考)。有關(guān)反義多核苷酸的一般方法參見《反義RNA和DNA》，(1988)，D.A.Melton編輯，Cold Spring Harbor實驗室，Cold Spring Harbor，NY)。
除本發(fā)明的反義寡核苷酸之外，人們可以構(gòu)建結(jié)合到在折疊的RNA組分中或在RNA組分基因中的雙聯(lián)核酸上的寡核苷酸，形成抑制端粒酶活性的含三股螺旋的核酸或三聯(lián)核酸。用形成三股螺旋的堿基配對規(guī)則和RNA組分的核苷酸序列構(gòu)建本發(fā)明的這些寡核苷酸(Cheng等(1988)生物化學雜志26315110；Ferrin和Camerini-Otero(1991)科學3541494；Ramdas等(1989)生物化學雜志26417395；Strobel等(1991)科學2541639；Hsieh等(1990)op.cit.；Rigas等。(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)839591，本文一并參考)。這些寡核苷酸可以以多種方式阻斷端粒酶活性，包括阻止端粒酶基因的轉(zhuǎn)錄或以阻止RNA組分形成功能性核蛋白端粒酶或作為端粒DNA合成的模板的方式結(jié)合到端粒酶RNA組分的雙螺旋區(qū)。典型地，取決于作用方式，本發(fā)明的三螺旋形成寡核苷酸包含從大約10到大約25至200或更多個(即，如果需要，大到足以形成穩(wěn)定的三螺旋，小到根據(jù)輸送方式足以體內(nèi)施用)核苷酸的特異序列，該特異序列“互補”(在此，互補意味著能夠形成穩(wěn)定的三股螺旋)于端粒酶RNA組分或者端粒酶RNA組分基因中的特異序列。
除了本發(fā)明的反義寡核苷酸和形成三股螺旋的寡核苷酸之外，與人類端粒酶RNA組分至少一部分序列相同的有義寡核苷酸也可以用于抑制端粒酶活性。本發(fā)明的這種類型的寡核苷酸的特征是包含(1)少于形成功能性端粒酶所需的RNA組分的全序列，或(2)形成功能性端粒酶所需的RNA組分的全序列以及使得形成的RNA無功能的一個或多個核苷酸取代或者插入。由于＂突變＂RNA組分結(jié)合人類端粒酶蛋白質(zhì)組分形成失活的端粒酶分子，在兩種情況下都觀察到端粒酶活性的抑制作用。因此，這些寡核苷酸的作用機制涉及裝配非功能性核蛋白端粒酶或者阻止功能性核蛋白端粒酶的裝配。一個例子是由核苷酸48-209組成的但其中端粒酶重復模板序列被改變的無規(guī)模板變體，這種無規(guī)模板變體能夠競爭結(jié)合到端粒酶蛋白質(zhì)組分上。本發(fā)明的這種類型的有義寡核苷酸典型地包含約20、50、100、200、400、500或更多個核苷酸的特異序列，其與人類端粒酶RNA組分中的特異核苷酸序列相同。
此外，反義多核苷酸可以包括衍生的取代基，它基本上不干擾對哺乳動物端粒酶RNA組分的雜交。已用附加的化學取代基修飾的反義多核苷酸可以被引入到代謝活性的真核細胞中以便與細胞中的端粒酶的端粒酶RNA組分雜交。典型地，分別在多核苷酸合成期間或其后衍生這樣的反義多核苷酸，添加化學取代基，這樣它們定位于端粒酶RNA組分中的互補序列，在那里它們產(chǎn)生對局部DNA序列和/或端粒酶蛋白質(zhì)組分的改變或化學修飾。優(yōu)選的連接的化學取代基包括銪(III)texaphyrin，交聯(lián)劑，補骨脂素，金屬螯合物(例如鐵催化斷裂的鐵/EDTA螯合物)，拓撲異構(gòu)酶，內(nèi)切核酸酶，外切核酸酶，連接酶，磷酸二酯酶，光動力卟啉，化學治療藥物(例如亞德里亞霉素，doxirubicin)，插入劑，堿基修飾劑，免疫球蛋白鏈，以及寡核苷酸。鐵/EDTA螯合物是特別優(yōu)選的化學取代基，其中多核苷酸序列的局部斷裂是所需的(Hertzberg等(1982)J.Am.Chem.Soc.104313；Hertzberg和Dervan(1984)生物化學233934；Taylor等(1984)四面體40457；Dervan，PB(1986)科學232464)。雖然鏈親和素/生物素和地高辛配基/抗地高辛配基抗體連接方法也可以使用，但優(yōu)選的吸附化學法包括直接連接，例如，經(jīng)由一個附加的反應性氨基(Corey和Schultz(1988)科學2381401，這些文獻本文一并參考)和其它直接連接化學法，在美國專利5,135,720，5,093,245和5,055,556(這些文獻本文一并參考)中提供了連接化學取代基的方法。其它連接化學法可以由操作者判斷使用。相應于哺乳動物端粒酶RNA組分全部或?qū)嵸|(zhì)性部分的多核苷酸(即＂有義＂多核苷酸)也可以是衍生化的，可以用于與基因組中端粒重復序列反應，并在染色體的端粒區(qū)產(chǎn)生對化學環(huán)境的加合或其它修飾。
錯配模板這樣，本發(fā)明的另一種有用的寡核苷酸包括人類端粒酶RNA組分的改變或突變的序列。Yu等，1990，自然344126指出四膜蟲端粒酶RNA組分的突變形式可以摻入四膜蟲細胞的端粒酶中，并且這種摻入對那些細胞具有有害作用。人類端粒酶RNA組分的突變形式的摻入可以對具有端粒酶活性的人類細胞具有類似的效應，而不影響沒有端粒酶活性的正常的人類細胞。這樣的突變形式包括其中序列5’-CTAACCCCTA-3’突變成5’-CAAACCCAA-3’，5’-CCAACCCCAA-3’，或5’-CTCACCCTCA-3’的那些突變形式。這些改變的RNA組分序列改變摻入染色體DNA的端粒重復單位，由此影響染色體結(jié)構(gòu)和功能。這樣的寡核苷酸可以設計成包含限制性內(nèi)切酶識別位點，用在經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化端粒DNA或延伸的端粒酶底物診斷改變的RNA組分的存在的診斷方法中。
為了說明本發(fā)明的這一方面，用質(zhì)粒(命名為pGRN33，從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，保藏號ATCC75926)進行位點特異性誘變，所述質(zhì)粒包含λ克隆28-1的約2.5kbHindIII-SacI片段(參見以下實施例7)以及SV40復制起點(但是沒有啟動子活性)。將所形成的質(zhì)粒，命名為pGRN34(包含5’-CAAACCCAA-3’)，pGRN36(包含5’-CCAACCCCAA-3’)以及pGRN37(包含5’-CTCACCCTCA-3’)，轉(zhuǎn)化進真核宿主細胞(表達SV40大T抗原的293衍生細胞株)并用轉(zhuǎn)化子細胞抽提物進行端粒酶測定。
所述測定顯示細胞中的端粒酶活性導致形成包含改變的序列的核酸，表明基因組克隆包含一個功能性RNA組分基因，以及質(zhì)粒包含一個改變的但是有功能的RNA組分基因。這些結(jié)果說明本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)重組端粒酶制劑的方法和這樣的制劑。本發(fā)明提供了重組人類端粒酶，它包含與本發(fā)明的重組RNA組分的功能性相結(jié)合的人類端粒酶蛋白質(zhì)組分。本發(fā)明的這樣的重組RNA組分分子包括由一個或多個堿基取代、缺失或插入而導致的不同于天然產(chǎn)生的RNA組分分子的那些RNA組分分子，以及與在重組宿主細胞中產(chǎn)生的天然產(chǎn)生的RNA組分分子相同的那些RNA組分分子。用于產(chǎn)生這樣的重組端粒酶分子的方法包括用編碼本發(fā)明的RNA組分分子的重組表達載體轉(zhuǎn)化表達端粒酶蛋白質(zhì)組分的真核宿主細胞，以及培養(yǎng)用所述載體轉(zhuǎn)化的所述宿主細胞，所述的培養(yǎng)是在使所述蛋白質(zhì)組分與RNA組分表達和裝配形成活性端粒酶分子的條件下進行的，其中所說的活性端粒酶分子能夠使序列(不必是與由天然端粒酶添加的序列相同的序列)添加至染色體DNA端粒上。這樣的重組DNA表達載體(或質(zhì)粒)的其它有用的實例包括下述一些質(zhì)粒，這些質(zhì)粒包含人類端粒酶RNA組分的基因，其具有使基因無功能的缺失，插入或其它修飾。盡管需要高效轉(zhuǎn)化與重組系統(tǒng)，但這些質(zhì)粒使內(nèi)源RNA組分基因“無效”(使處理過的細胞不可避免地死亡)的人類基因治療來說尤其有用。
核酶實施方案本發(fā)明的稱為核酶的其它寡核苷酸也可以用于抑制端粒酶活性。不同于以上描述的反義和其它寡核苷酸(其結(jié)合到RNA，DNA，或端粒酶蛋白質(zhì)組分上)，核酶不僅結(jié)合而且特異性地切割進而潛在地失活靶RNA，如人類端粒酶RNA組分。這樣一種核酶可以包含互補于端粒酶RNA的5’-和3’末端序列。依賴切割位點，核酶可以使端粒酶酶失活。參見PCT專利出版物93/23572，同上?；诨仡櫲祟惗肆Ｃ窻NA組分的RNA序列本領(lǐng)域技術(shù)人員會注意到存在幾個有用的核酶靶位點，它們易于被例如錘頭基序核酶切割。本發(fā)明的這種類型的例證性核酶包含以下的核酶，它們是具有以下序列的RNA分T15’-UAGGGUUACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAAAAAU-3’；25’-UUAGGGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGACAAAA-3’；35’-UCUCAGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGGGUUA-3’和45’-CCCGAGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCCGCG-3’。用于核酶介導的酶活性的抑制作用的其它優(yōu)選的靶位點可以按以下文獻描述的方法確定Sullivan等PCT專利出版物94/02595和Draper等，PCT專利出版物93/23569，兩者本文一并參考。如Hu等PCT專利出版物94/03596(本文一并參考)所描述的，反義和核酶功能可以結(jié)合在一種寡核苷酸中。此外，核酶可以包含一個或多個修飾的核苷酸或修飾的核苷酸間連接鍵，如以上以及有關(guān)本發(fā)明的反義寡核苷酸的說明性描述所描述的。一方面，修飾RNA酶的催化亞單位P(人類或大腸桿菌)(參見，Altman S(1995)生物技術(shù)13327)產(chǎn)生相應于哺乳動物端粒酶RNA組分的部分(其堿基配對于端粒重復序列)的指導序列；這樣的RNA酶P變體可以切割端粒序列。一方面，修飾RNA酶的催化亞單位P(人類或大腸桿菌)產(chǎn)生互補于哺乳動物端粒酶RNA組分的部分的指導序列，以使所說的RNA酶P變體可以切割端粒酶RNA組分。這樣的工程核酶可以在細胞中表達并可以用各種方法(例如脂質(zhì)體，免疫脂質(zhì)體，biolistics，直接攝入進細胞等)轉(zhuǎn)移?；谒_的催化裂解人類端粒酶RNA組分和/或人類端粒重復序列的端粒酶RNA組分序列信息，對其它形式的核酶(I組內(nèi)含子核酶(Cech T(1995)生物技術(shù)13323)；錘頭核酶(Edgington SM(1992)生物技術(shù)10256)可以進行基因工程操作。
由此，本發(fā)明提供了各種抑制端粒酶活性的寡核苷酸。這些寡核苷酸可以用于本發(fā)明的治療疾病的治療方法，該方法包括具有對患者施用治療有效量的本發(fā)明的端粒酶抑制劑或激活劑。應用在以上提到的依存的美國專利申請和PCT專利出版物93/23572中描述的測定方法，人們可以測定端粒酶抑制作用或激活作用以確定應當以治療有效量施用的藥劑的量。如以上討論的那些應用中所指出的，端粒酶活性的抑制作用使無限增殖細胞死亡，而端粒酶活性的激活可以增加細胞的復制壽命。端粒酶抑制療法是針對涉及無限增殖細胞的失控生長的癌的一種有效的治療方法，端粒酶激活是預防細胞衰老的一種有效的治療方法。抑制或者阻斷端粒酶活性的藥劑的運送可以阻止端粒酶的作用，并且最終導致處理的細胞的衰老和死亡，所述藥劑如反義寡核苷酸，形成三股螺旋的寡核苷酸，核酶，或驅(qū)動端粒酶突變RNA組分表達的質(zhì)粒。
治療和預防方面此外，本發(fā)明提供了保證正常的細胞必定死亡的治療方法；例如，可以用標準的遺傳工程方法修飾RNA組分，以便經(jīng)遺傳重組缺失編碼所述組分(例如經(jīng)體外誘變)的全部或部分天然基因。這方法在基因治療中有用，其中，修飾成包含表達質(zhì)粒的正常細胞被引入患者中，同時人們想要確保癌細胞不被引入；或者，如果將這樣的細胞引入，就使那些細胞不可避免地死亡。
因為端粒酶僅在腫瘤，種系，和生血系統(tǒng)的某些干細胞中是活性的，所以其它正常的細胞不受到端粒酶抑制療法的影響。也可以采取措施以避免端粒酶抑制劑與種系或于細胞接觸，雖然這不是必需的。例如，因為種系細胞表達端粒酶活性，端粒酶抑制可能負性影響精子發(fā)生和精子生存力，說明端粒酶抑制劑可以是有效的避孕藥或不育劑。然而這些避孕藥的作用可能不是為了治療癌癥接受本發(fā)明的端粒酶抑制劑的患者所需的。在這種情況下，人們可以以保證所述的抑制劑僅在治療期間產(chǎn)生以便對種系細胞的負性影響僅僅是瞬時的之方式施用本發(fā)明的端粒酶抑制劑。
本發(fā)明的其它治療方法使用本發(fā)明的端粒酶RNA核酸刺激端粒酶活性和延長復制細胞壽命。這些方法可以通過向細胞施用本發(fā)明的功能性重組端粒酶核蛋白進行。例如，核蛋白可以在脂質(zhì)體中向細胞輸送，或人類端粒酶RNA組分基因(或具有不同調(diào)節(jié)元件的重組基因)可以在真核表達質(zhì)粒(具有或不具有編碼端粒酶蛋白質(zhì)組分表達的序列)中應用，以在各種正常的人類細胞中激活端粒酶活性，所述的正常人類細胞因為端粒酶RNA組分或蛋白質(zhì)組分的低水平表達，而缺乏可檢測的端粒酶活性。如果端粒酶RNA組分不足以刺激端粒酶活性，則RNA組分可以與表達端粒酶蛋白質(zhì)組分的基因一同轉(zhuǎn)染以刺激端粒酶活性。這樣，本發(fā)明提供了治療與細胞或細胞組中端粒酶活性有關(guān)的疾病的方法，該方法通過將細胞與治療有效量的在細胞中改變端粒酶活性的藥劑接觸。
摻入端粒酶RNA基因的額外的拷貝的細胞可以顯示出端粒酶活性增加和相關(guān)的延長的復制壽命。這種療法可以在來自體內(nèi)的后來要引入到宿主的細胞上進行或者在體內(nèi)進行。通過添加來自體內(nèi)的外源端粒酶基因至正常的二倍體細胞中以穩(wěn)定化或增加端粒長度的優(yōu)點包括端粒穩(wěn)定可以阻止細胞衰老，并且允許細胞潛在地無限擴增；并且具有延長的壽命的正常的二倍體細胞可以體外培養(yǎng)，以用于藥物試驗，病毒制造，或其它有用的目的。此外，各種類型的體外擴增干細胞可以用于特殊疾病的細胞療法，如以上所指出的。
通過在細胞鄰近危象時阻止端粒關(guān)鍵性地變短，端粒穩(wěn)定作用也可以在復制細胞中抑制癌發(fā)生。在危象時，由于失去端粒帽子的保護效應，產(chǎn)生大量基因組不穩(wěn)定性。＂遺傳覆蓋物＂被改組，幾乎所有細胞死亡。從這一過程逃生的少有的細胞典型地是具有許多基因重排的典型的非整倍體，并且通過表達端粒酶在它們的端粒中產(chǎn)生再建的穩(wěn)定性。如果通過保持端粒的長度可以阻止危象，則也可以阻止與危象有關(guān)的基因組不穩(wěn)定性，從而限制個體細胞經(jīng)歷形成轉(zhuǎn)移性癌需要的所需數(shù)量的遺傳突變的機會。
可以被端粒酶基因治療(涉及增加靶細胞的端粒酶活性的療法)靶向的細胞包括但不限于生血干細胞(愛滋病和化療后)，血管內(nèi)皮細胞(心和腦部血管病)，皮膚成纖維細胞和基部的皮膚角質(zhì)形成細胞(愈傷和燒傷)，軟骨細胞(風濕性關(guān)節(jié)炎)，人腦星形細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞(阿耳茨海默氏疾病)，成骨細胞(骨質(zhì)疏松)，視黃醛細胞(眼睛疾病)，和胰島細胞(I型糖尿病)。
典型地，本發(fā)明的治療方法包括施用寡核苷酸，這種寡核苷酸在體內(nèi)生理條件下通過抑制或者刺激端粒酶活性起作用，并且在那些條件下穩(wěn)定。如以上所指出的，修飾的核酸可以在賦予這樣的穩(wěn)定性和保證輸送所述寡核苷酸到所需的組織，器官，或細胞中有用。在用于治療目的的寡核苷酸的輸送中有用的方法在Inouye等美國專利5,272,065(本文一并參考)中描述。
盡管寡核苷酸可以作為合適藥物配制品中的藥物直接被輸送，人們也可以用本發(fā)明的基因治療和重組DNA表達質(zhì)粒輸送寡核苷酸。一種這樣的例證性質(zhì)粒在以下實施例8中描述，一般來說，這樣的質(zhì)粒包含用于驅(qū)動寡核苷酸轉(zhuǎn)錄的啟動子和任選的增強子(與包含在啟動子序列之內(nèi)的任何序列分開)，和提供高水平轉(zhuǎn)錄的附加型保持或染色體整合的其它調(diào)節(jié)元件(如果需要)?；谙俨《镜妮d體經(jīng)常用于基因治療，并且適合于與本發(fā)明的試劑和方法一起使用。參見PCT專利出版物94/12650；94 12649；和9412629。用于這種目的有用的啟動子包括金屬硫蛋白啟動子，組成型腺病毒的主要晚期啟動子，地塞米松誘導型MMTV啟動子，SV40啟動子，MRP polIII啟動子，組成型MPSV啟動子，四環(huán)素誘導型CMV啟動子(如人類立即早期CMV啟動子)，和組成型CMV啟動子?；蛑委熡杏玫馁|(zhì)粒可以包含其它功能性元件，如可選擇的標記，識別區(qū)，和其它基因。重組DNA表達質(zhì)粒也可以用于制備經(jīng)非基因治療的各種方法輸送的本發(fā)明的寡核苷酸，雖然用體外化學合成制造短的寡核苷酸更經(jīng)濟。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了包含治療有效量的本發(fā)明的端粒酶抑制劑和端粒酶激活劑的藥物組合物。本發(fā)明的端粒酶抑制劑的藥物組合物包含人類端粒酶突變RNA組分，結(jié)合人類端粒酶RNA組分或RNA組分基因的反義寡核苷酸或形成三股螺旋的寡核苷酸，或能夠切割人類端粒酶RNA組分的核酶，或它們的組合，或在藥學上可接受的載體或鹽中的其它藥物。其它本發(fā)明的藥物組合物包含端粒酶激活劑制劑，例如純化的人類端粒酶或者端粒酶蛋白質(zhì)組分的mRNA和端粒酶RNA組分，用來治療衰老相關(guān)疾病。在一個方面，將突變的有義哺乳動物端粒酶RNA組分施用于細胞群；與人類端粒酶重復序列相對，所說的突變有義端粒酶RNA組分包含至少一個堿基錯配，但是能夠與人類端粒酶多肽組分一起顯示出端粒酶活性，在人類端粒酶重復序列中的選定核苷酸位置產(chǎn)生錯摻，進而產(chǎn)生依賴于實質(zhì)性復制用突變有義端粒酶RNA組分的連續(xù)存在的端粒。提供了一種治療方法，其中將突變的有義端粒酶RNA組分施用于細胞群體足夠長的時間，以引入基本上不能作為天然產(chǎn)生的哺乳動物端粒酶RNA組分的模板的端粒序列，接著撤去突變的有義端粒酶RNA組分，其在細胞群中導致平均端粒長度的迅速喪失，并且加速衰老或細胞死亡率。
所述的治療藥劑可以以適合于腸胃外，鼻，口，或其它方式施用的配制品提供。參見PCT專利出版物93/23572，見上。
診斷方法除以上描述的藥物配制品與治療方法之外，本發(fā)明提供了診斷方法和試劑。本發(fā)明提供了用于測定細胞，細胞群或組織樣品中的人類端粒酶RNA組分、端粒酶或端粒酶活性的水平，含量，或存在的診斷方法。在一個有關(guān)的方面，本發(fā)明提供了這些方法有用的試劑，任選地可與實施所述診斷的方法的說明書一道包裝成試劑盒。如上有關(guān)用來確定克隆pGRN7包含人類端粒酶RNA組分cDNA的試驗所指出的，在腫瘤細胞中RNA組分的水平是升高的。這樣，RNA組分的檢測對于診斷腫瘤細胞是有用的。
此外，特異性地結(jié)合到人類端粒酶RNA組分(或其基因的每條鏈)上的探針或者引物可以用于檢測樣品中端粒酶核酸存在的診斷方法中。引物和探針是互補于并因此將結(jié)合靶核酸的寡核苷酸。雖然引物和探針可以在序列和長度方面不同，首要的區(qū)別因素是一種功能引物用于起始DNA合成，如在PCR擴增中，而探針典型地僅用于結(jié)合靶核酸。引物或者探針的典型的長度可以從8至20至30或更多個核苷酸。引物或者探針也可以被標記以便有利于檢測(即，用于這個目的典型的是放射性或熒光分子)或純化/分離(即，生物素或抗生物素蛋白經(jīng)常用于這一目的)。
本發(fā)明的一種尤其優(yōu)選的診斷方法涉及從懷疑患有癌的患者中采集的細胞和組織樣品中的端粒酶RNA組分序列的檢測。該方法典型地涉及在僅完全配對(互補)的序列相互結(jié)合(雜交)的條件下，將標記的探針或引物與RNA組分序列結(jié)合。結(jié)合至樣品RNA上的標記的材料的檢測將與端粒酶活性的存在和癌細胞的存在有關(guān)。由于缺乏端粒酶蛋白質(zhì)組分的表達，一些細胞可以表達端粒酶RNA組分但是仍然保持端粒酶陰性。如果人們需要檢測這樣的細胞中的端粒酶活性的存在，則首先分離蛋白質(zhì)，然后確定蛋白質(zhì)組分是否包含端粒酶RNA組分，這將標志端粒酶活性存在。本發(fā)明的診斷方法在原位檢測端粒酶活性在組織活檢和組織切片中的存在中尤其有用，該方法典型地在用本發(fā)明的特異性PCR引物對端粒酶RNA組分進行擴增之后進行。
本發(fā)明也提供了用于診斷疾病狀態(tài)(例如，瘤形成或預瘤形成)的端粒酶RNA組分多核苷酸探針，其用來檢測從患者移植的細胞中端粒酶RNA組分，或端粒酶RNA組分基因的重排或擴增，或檢測特殊病癥的端粒酶RNA組分等位基因(例如，通過RFLP或等位基因特異性PCR分析)。雖然可以使用Northem印跡法，斑點印跡法，或者分離自細胞樣品的大量RNA或poly A+RNA的溶液雜交，以及采用端粒酶RNA組分特異性引物的PCR或者LCR擴增，但所說的檢測典型地是采用標記的(例如32P，35S，14C，3H，熒光，生物素化地高辛配基化)端粒酶RNA組分多核苷酸的原位雜交法。與相同細胞類型的非致瘤性細胞比較含有改變量的端粒酶RNA組分的細胞作為候選病態(tài)細胞(如前致瘤性或者直接致瘤性細胞)被鑒別，并且可以作為具有轉(zhuǎn)移潛力的細胞被鑒別。同樣地，對細胞樣品中端粒酶RNA組分基因座或緊密連鎖的基因座的特殊病癥重排或者擴增的檢測將證實病理狀態(tài)或者是待發(fā)展成病理狀態(tài)(例如癌，遺傳病)之易感性的存在。所說的多核苷酸探針也用于法醫(yī)鑒定，例如嫌疑犯或者不明死者的親權(quán)檢驗或者鑒別。
人群中，可以存在端粒酶RNA組分的基本主要序列的小的改變，包含等位變體，限制位點多態(tài)性，以及與遺傳病相關(guān)的先天性端粒酶RNA組分疾病的等位基因。
如果需要，可以由操作者經(jīng)判斷選擇擴增基本上全長端粒酶RNA組分拷貝的PCR擴增引物。同樣地，可以選擇擴增端粒酶RNA組分基因或RNA的部分的擴增引物。
端粒酶RNA組分表達依據(jù)包含人類端粒酶RNA組分之序列的引物，探針，或其它核酸的長度和預期的功能，本發(fā)明的表達質(zhì)?？梢允怯杏玫?。例如，本發(fā)明的全長RNA組分的重組生產(chǎn)可以用本發(fā)明的重組DNA表達質(zhì)粒進行，這種表達質(zhì)粒含有一種核酸，該核酸包含用于在適合的啟動子控制下轉(zhuǎn)錄的RNA組分的核苷酸序列。這樣的質(zhì)粒的宿主細胞可以是任何原核或真核細胞，啟動子以及選來摻入表達質(zhì)粒的其它調(diào)節(jié)元件和選擇標記將取決于生產(chǎn)方法使用的宿主細胞。
完整的RNA組分基因，即在所述基因5’區(qū)包括任何調(diào)節(jié)序列的啟動子和RNA組分編碼區(qū)，可以用來在人類細胞中表達RNA組分，所述人類細胞包括由病毒轉(zhuǎn)化或癌而導致的無限增殖化的人類細胞。RNA組分基因的啟動子可以被調(diào)節(jié)，然而，因這一和其它原因人們可能想要表達不同的啟動子控制之下的RNA組分。另一方面，RNA組分基因的啟動子可離開RNA組分編碼序列獨立地應用而表達其它感興趣的編碼序列。例如，人們可以通過將RNA組分基因的啟動子與報道基因編碼序列之編碼序列融合研究對RNA組分基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，所述編碼序列例如β-半乳糖苷酶或其它酶或蛋白質(zhì)(其表達可以容易地監(jiān)測)的編碼序列。由此，人類端粒酶RNA組分的基因的啟動子和其它調(diào)節(jié)元件不僅可以用來表達RNA組分而且可以用來在人類細胞中表達人類端粒酶蛋白質(zhì)組分，反義或者其它寡核苷酸，和其它感興趣的基因產(chǎn)物。包含人類端粒酶RNA組分完整基因的表達質(zhì)粒對各種目的(包含基因治療)來說尤其有用。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚各種表達質(zhì)?？梢杂脕砩a(chǎn)本發(fā)明的有用的核酸，本文使用的術(shù)語＂質(zhì)粒＂指可以用來把特異性遺傳信息攜帶至宿主細胞之中并且保持所述信息一段時間的任何類型的核酸(來源于噬菌體，病毒，染色體，等等)。
端粒酶蛋白質(zhì)組分的分離本發(fā)明的藥劑使得可以克隆與分離編碼人類和其它哺乳動物端粒酶的蛋白質(zhì)組分的核酸，從前它們是不可獲得的。獲得這些核酸提供了與由包含人類端粒酶RNA組分的核酸序列之核酸提供的益處互補的益處。例如，如以上所指出的，在一些實例中通過采用純化的人類端粒酶蛋白質(zhì)組分的制劑和獲得其編碼的核酸，本發(fā)明的治療益處可以增強。本發(fā)明的編碼人類端粒酶RNA組分的核酸可以用于分離編碼人類端粒酶蛋白質(zhì)組分的核酸，從而獲得這樣的益處。這樣，本發(fā)明提供了用于分離和純化人類端粒酶蛋白質(zhì)組分以及鑒別和分離編碼人類端粒酶蛋白質(zhì)組分的核酸的方法。在相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了純化的人類端粒酶，純化的編碼人類端粒酶蛋白質(zhì)組分的核酸，人類端粒酶蛋白質(zhì)組分的重組表達質(zhì)粒。本發(fā)明也提供了以人類端粒酶蛋白質(zhì)組分或者如下核酸作為有效成分的藥物組合物，所述核酸編碼人類端粒酶蛋白質(zhì)組分或者與編碼人類端粒酶蛋白質(zhì)組分的核酸相互作用，如以上所述的任何反義寡核苷酸，形成三股螺旋的寡核苷酸，核酶，或重組DNA表達質(zhì)粒。
克隆的人類端粒酶RNA組分可以用于鑒別和克隆編碼核蛋白端粒酶的蛋白質(zhì)組分的核酸。若干不同的方法可以用于完成蛋白質(zhì)組分的鑒別和克隆。例如，人們可以用采用親和性配體的酶或部分變性的酶的親和性捕獲，所述配體為(1)互補于RNA組分的核苷酸序列以結(jié)合完整的酶的RNA組分；或(2)結(jié)合部分或完全變性酶的蛋白質(zhì)組分的RNA組分。配體可被附著到固體支持物上或經(jīng)化學修飾(例如生物素化)以便爾后在固體支持物上的固定化。與包含人類端粒酶的細胞抽提物接觸，其后洗滌和洗脫結(jié)合到支持物上的端粒酶給出高度純化的端粒酶制劑。然后，可以任選地進一步純化蛋白質(zhì)組分或直接通過蛋白質(zhì)測序分析。測定的蛋白質(zhì)序列可以用于制備引物和探針以克隆cDNA或者鑒別包含編碼端粒酶蛋白質(zhì)組分的核酸的基因組庫中的克隆。
采用工程RNA組分的端粒酶親和性捕獲也可以用體外轉(zhuǎn)錄的端粒酶RNA和端粒酶活性的重建系統(tǒng)實施。參見Autexier和Greider，1994，基因和發(fā)展8563-575，本文一并參考。所述RNA經(jīng)基因工程操作包含標記物，類似于蛋白質(zhì)表位標記。標記物可以是可獲得緊密結(jié)合配體的RNA序列，例如，RNA序列特異性抗體，序列特異性核酸結(jié)合蛋白，或一種緊密結(jié)合到特異性RNA序列上的有機染料?？梢杂脴藴实姆椒ㄔ囼灦肆Ｃ笇擞浳镄蛄信c位置的容忍度。這種方法的改變的RNA組分的合成和重建步驟也可以在體內(nèi)進行。然后，利用RNA標記物固定化配體的親和性捕獲可以用于分離酶。
表達篩選也可以用于分離端粒酶的蛋白質(zhì)組分。在這種方法中，cDNA表達文庫可以用標記的端粒酶RNA篩選，編碼特異性地結(jié)合到端粒酶RNA的蛋白質(zhì)的cDNA可被鑒別。采用翻譯抑制作用的一種分子遺傳方法也可以用于分離編碼端粒酶蛋白質(zhì)組分的核酸。在這種方法中，端粒酶RNA序列將被融合到一個選擇性標記的上游。當在一個適合的系統(tǒng)中表達時，選擇標記將是有功能的。當編碼端粒酶RNA結(jié)合蛋白質(zhì)的cDNA被表達時，蛋白質(zhì)將結(jié)合其識別序列，進而阻斷選擇性標記的翻譯，由此使得可以鑒別編碼蛋白質(zhì)的克隆。在這種方法的其它實施方案中，選擇標記的阻斷的翻譯將允許轉(zhuǎn)化細胞生長?？梢员皇褂玫钠渌到y(tǒng)包括在PCT專利出版物WO 94/10300中描述的“相互作用阱系統(tǒng)”；在Li和Herskowitz 1993年12月17日，科學2621870-1874和Zervos等，1993年1月29日，細胞72223-232中描述的＂一雜種＂系統(tǒng)；和市售的由Clontech提供的＂兩雜種＂系統(tǒng)。
用于檢測特異性結(jié)合蛋白質(zhì)和活性的端粒酶RNA結(jié)合或者端粒酶活性測定可以用來促進端粒酶的純化和編碼所述酶的核酸的鑒別。例如，包含RNA組分序列的核酸可以用作親和試劑以分離、鑒別和純化與RNA組分所含序列特異結(jié)合的肽類，蛋白質(zhì)或其它化合物，如人類端粒酶蛋白質(zhì)組分。對檢測這種結(jié)合和分離特異性地結(jié)合到RNA組分上的組分而言，可以利用幾種不同的方式，包括凝膠移位、濾膜結(jié)合、足跡法、Northwestern(蛋白質(zhì)印跡的RNA探針)和光交聯(lián)。這些測定可以用于鑒別結(jié)合蛋白質(zhì)，跟蹤結(jié)合蛋白質(zhì)的純化，確定RNA結(jié)合位點，測定結(jié)合蛋白質(zhì)的分子大小，標記蛋白質(zhì)以便制備性分離并后續(xù)用于免疫動物產(chǎn)生抗體，以獲得在偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中用于分離蛋白質(zhì)或鑒別編碼該蛋白質(zhì)的核酸的抗體。
哺乳動物端粒酶蛋白質(zhì)組分的純化哺乳動物端粒酶蛋白質(zhì)組分可以用常規(guī)的生物化學方法從表達端粒酶的細胞純化，如HT1080細胞，293細胞，和其它適合的無限增殖化細胞系。例如但不限于，人類端粒酶可基本上按照美國專利申請08/288,501(1994年8月10日申請，本文一并參考)中描述的方法從細胞抽提物分離。哺乳動物端粒酶抽提物可以通過用RNA酶活性或其它適合的方法處理除去端粒酶RNA組分，所述方法分解和/或降解端粒酶RNA組分而留下基本上完整的端粒酶蛋白質(zhì)組分，該組分可以由添加外源端粒酶RNA組分重構(gòu)，如可以經(jīng)重組等產(chǎn)生。這樣純化的端粒酶蛋白質(zhì)組分(可任選地除去內(nèi)源端粒酶RNA組分)可以用于本文描述的藥劑篩選測定和其它用途。
基因治療將外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移進細胞(即DNA介導的轉(zhuǎn)染)是用于細胞生物學和分子遺傳學基礎(chǔ)研究的必要的方法，和開發(fā)用于人類基因治療的有效方法的基礎(chǔ)。
迄今為止，在美國大多數(shù)批準的基因轉(zhuǎn)移試驗依賴于攜帶作為逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組一部分的治療性多核苷酸的復制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Miller等(1990)分子細胞生物學104239；Kolberg R(1992)NIH研究雜志443；Cometta等(1991)人類基因治療2215)。腺病毒載體在人類基因治療中潛在的用途也有描述(Rosenfeld等(1992)細胞68143)。
已批準的用于人類的其它基因轉(zhuǎn)移方法是脂質(zhì)體中的質(zhì)粒DNA直接向腫瘤細胞原位的物理轉(zhuǎn)移。不同于病毒載體必須在培養(yǎng)的細胞中繁殖，質(zhì)粒DNA可以是純化至均一性的，由此致病污染的可能性降低。在一些情況下(例如腫瘤細胞)，不需要外源DNA穩(wěn)定地整合進轉(zhuǎn)導的細胞，因為瞬時的表達可以足夠殺滅腫瘤細胞。脂質(zhì)體介導的DNA轉(zhuǎn)移以由許多研究者描述(Wang和Huang(1987)生物化學生物物理研究通訊147980；Wang和Huang(1989)生物化學289508；Litzinger和Huang(1992)生物化學生物物理學報1113201；Gao和Huang(1991)生物化學生物物理研究通訊179280；Felgner WO91/17424；WO91/16024)。
免疫脂質(zhì)體也已作為外源多核苷酸的載體被描述(Wang和Huang(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)847851；Trubetskoy等(1992)生物化學生物物理學報1131311)。通過包含特異性抗體(其預計結(jié)合到特異性細胞類型表面抗原上)，與脂質(zhì)體比較，可以期待免疫脂質(zhì)體具有改進細胞類型特異性。Behr等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)866982報道用脂多胺作為調(diào)節(jié)自身轉(zhuǎn)染的試劑，不再需要添加任何磷脂形成脂質(zhì)體。
因此，將基本上與端粒酶RNA組分序列或其補體的至少25個核苷酸，優(yōu)選地是50至100個或者更多個核苷酸相同的多核苷酸可操作連接到異源啟動子以形成能夠在人類細胞中表達端粒酶RNA組分或者反義端粒酶RNA組分多核苷酸的轉(zhuǎn)錄單位。這樣一種轉(zhuǎn)錄單位可以包括在轉(zhuǎn)基因，腺病毒載體，或其它基因治療法中，以便輸送到人類細胞中，用于例如端粒酶相關(guān)疾病(例如瘤形成)的治療。端粒酶RNA組分有義或反義表達構(gòu)建體的合適的輸送方法由操作者考慮可接受的實施和調(diào)節(jié)的需要進行選擇。
轉(zhuǎn)基因動物實施方案哺乳動物端粒酶RNA組分的基因組克隆，特別是基本上與小鼠端粒酶RNA組分相同的端粒酶RNA組分基因可用于構(gòu)建同源定向構(gòu)建體，其用于產(chǎn)生具有至少一個功能被破壞的端粒酶RNA組分等位基因的細胞和轉(zhuǎn)基因非人類動物?，F(xiàn)有技術(shù)可以找到構(gòu)建同源定向構(gòu)建體的指導文獻，包括Rahemtulla等(1991)自然353180；Jasin等(1990)基因進展4157；Koh等(1992)科學2561210；Molina等(1992)自然357161；Grusby等(1991)科學2531417；Bradley等(1992)生物/技術(shù)10534，本文一并參考。同源定向可以用來產(chǎn)生所謂的“無效”小鼠，其是失活端粒酶RNA組分等位基因雜合或純合的。這樣的小鼠可以作為為免疫的系統(tǒng)發(fā)展，瘤形成，精子發(fā)生研究的實驗動物商業(yè)性出售，也可以用作寵物，可以用作動物蛋白質(zhì)(食物)，和其它用途。
按照下文中的描述衍生嵌合小鼠Hogan等，操縱小鼠胚實驗室手冊，ColdSpring Harbor實驗室(1988)和畸形癌和胚干細胞實施方法，E.J.Robertson編，IRL出版社，華盛頓，D.C.，本文一并參考的(1987)。胚干細胞是按照出版的方法操作(畸形癌和胚干細胞方法，E.J.Robertson編，IRL出版社，華盛頓，D.C.(1987)；Zjilstra等(1989)自然342435；和Schwartzberg等(1989)科學246799，各文獻本文一并參考)。
另外，端粒酶RNA組分cDNA或基因組基因拷貝可以用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因，其以高水平和/或在轉(zhuǎn)錄控制序列(不是天然產(chǎn)生的，與端粒酶RNA組分基因鄰近)的轉(zhuǎn)錄控制下表達端粒酶RNA組分。例如但不限于，可將組成型啟動子(例如HSV-tk或pgk啟動子)，或細胞-譜系特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如CD4或CD8基因啟動子/增強子)可操作連接到端粒酶RNA組分多核苷酸序列上形成轉(zhuǎn)基因(典型地與選擇標記如neo基因表達盒結(jié)合)。這種轉(zhuǎn)基因可以引入到細胞(例如，ES細胞，生血干細胞)，并且可以按照常規(guī)方法獲得轉(zhuǎn)基因細胞和轉(zhuǎn)基因非人類動物。轉(zhuǎn)基因細胞和/或轉(zhuǎn)基因非人類動物可以用來篩選抗腫瘤劑和/或篩選潛在的致癌因子，因為端粒酶RNA組分的過度表達或者端粒酶RNA組分的不適當?shù)谋磉_可以導致預致瘤或致瘤狀態(tài)。
藥劑篩選測定參照實驗實施例實施端粒酶RNA組分多核苷酸，端粒酶蛋白質(zhì)組分制劑，端粒重復模板，和結(jié)合反應等。一般地，端粒酶蛋白質(zhì)組分由從表達端粒酶的哺乳動物細胞常規(guī)純化獲得，并且在其用于本文所描述的測定中之前除去相關(guān)的RNA組分。具體水性條件可以由操作者按照常規(guī)方法選擇。作為一般性指導，下列緩沖水性條件可以使用10-250mM NaCl，5-50mM Tris HCl，pH值5-8，任選地添加二價陽離子和/或金屬螯合劑和/或非離子除垢劑和/或膜組分。對這些基本條件可以進行增加、減少、修改(如pH值)和替換(如KCl替換NaCl或緩沖液替換)是本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的。對基本結(jié)合條件可以修改，只要在對照反應中形成特異性端粒酶全酶和/或出現(xiàn)端粒酶活性。在對照反應(不包含藥劑)中不允許特異性結(jié)合和斷裂的條件不適合用于結(jié)合測定中。
優(yōu)選地，為測定端粒酶RNA組分對固定化的端粒酶蛋白質(zhì)組分的結(jié)合，用可檢測的標記物標記端粒酶RNA組分，典型地是使用生物素基團，熒光部分，或放射性標記摻入的核苷酸。端粒酶蛋白質(zhì)組分合適的標記法包括但不限于通過摻入放射性標記的氨基酸(例如14C-標記的亮氨酸，3H-標記的甘氨酸，35S標記的甲硫氨酸)進行放射性標記，通過用125I或131I翻譯后放射性碘化(例如Bolton-Hunter反應和氯胺T)進行放射性標記，通過用P翻譯后磷酸化(例如，磷酸化酶和無機放射性標記的磷酸鹽)進行標記，通過摻入熒光標記物(例如，熒光素或堿性蕊香紅)進行熒光標記，或通過本領(lǐng)域已知的其它常規(guī)方法標記。在一種多肽通過連接到底物上而固定化的實施方案中，其它組分一般用可檢測的標記物標記。
使標記的端粒酶RNA或者蛋白質(zhì)組分分別與固定化的端粒酶蛋白質(zhì)或RNA組分接觸，藥劑可以改變標記組分的量，這種組分是固定化的(即，其結(jié)合關(guān)聯(lián)端粒酶組分，并且被捕獲)。可以改變結(jié)合反應的時間和溫度，只要選擇的條件允許特異性結(jié)合在不存在藥劑的對照反應之中發(fā)生。優(yōu)選實施方案使用的反應溫度至少15℃，更優(yōu)選地是35至42℃，和大約至少15秒的培養(yǎng)時間，雖然在一些實施方案中為得到結(jié)合平衡更長的時間是優(yōu)選的。結(jié)合復合物的動力學和熱力學穩(wěn)定性決定可用的時間，溫度，鹽，pH值，和其它反應條件的變化的程度。然而，對于任何特殊的實施方案，所需結(jié)合反應條件可以由本領(lǐng)域的操作者用常規(guī)方法容易的校準，這可以包括采用Scatchard分析，Hill分析和其它方法(蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)和分子原理(1984)Creighton(編者)，W.H.Freeman andCompany，紐約)的結(jié)合分析。
通過包含非標記的競爭蛋白質(zhì)(例如清蛋白)和/或非標記的RNA分別測定標記的端粒酶蛋白質(zhì)組分與固定化的端粒酶RNA組分的特異性結(jié)合。在結(jié)合反應完成后，檢測特異性地結(jié)合固定化物種的標記物種的量。舉例性的但不是限制性的，在合適的結(jié)合溫育期后，除去含有非固定化標記的端粒酶蛋白質(zhì)組分的水相，用合適的緩沖液(任選地含有阻斷劑)洗滌含有固定化結(jié)合的端粒酶全酶物種的底物和任何與之結(jié)合的標記的端粒酶蛋白質(zhì)組分，除去洗滌緩沖液。洗滌后，測定保持特異性結(jié)合到固定化標記組分上的可檢測標記的量(例如經(jīng)光學，酶促，放射自顯影，或其它放射化學方法)。
在一些實施方案中，包括添加抑制非特異性結(jié)合的非標記的阻斷劑。這樣的阻斷劑的例子包括但不限于下列小牛胸腺DNA，鮭精DNA，酵母RNA，各種長度寡核苷酸的混合序列(隨機或假隨機序列)，牛血清清蛋白，非離子除垢劑(NP-40，吐溫，曲通X-100等)，脫脂乳蛋白，Denhardt’s試劑，聚乙烯吡咯烷酮，F(xiàn)icoll，和其它阻斷劑。操作者可以根據(jù)其判斷選擇阻斷劑包含在結(jié)合試驗中的合適濃度。
在端粒酶RNA組分或者端粒酶蛋白質(zhì)組分是固定化的實施方案中，可以使用對底物的共價或者非共價連接。共價鍵化學方法包括但不限于本領(lǐng)域熟知的方法(Kadonaga和Tijan(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.(美國)835889)。一個非限制性的例子是對用溴化氰衍生的底物(如CNBr-衍生的瓊脂糖凝膠4B)的共價連接。用間隔基減少底物的潛在的位阻是合乎需要的。對底物的蛋白質(zhì)非共價結(jié)合包括但不限于，蛋白質(zhì)對帶電表面的結(jié)合和與特異性抗體結(jié)合。
在一個實施方案中，根據(jù)其阻斷端粒酶蛋白質(zhì)組分與端粒酶RNA組分的結(jié)合鑒別候選治療劑。
盡管如果突變端粒酶RNA組分在對照測定條件下(例如生理條件)結(jié)合到端粒酶蛋白質(zhì)組分上所以有時使用突變端粒酶RNA組分序列，但典型地，這些方法中使用的端粒酶RNA組分包括天然產(chǎn)生的哺乳動物端粒酶RNA組分序列(例如人類RNA組分)。
在一個實施方案中，通過其在代謝活性哺乳動物細胞中統(tǒng)計學上明顯降低或增加報道基因多核苷酸序列(例如β-半乳糖苷酶基因，螢光素酶基因，HPRT基因)的轉(zhuǎn)錄的能力來鑒別候選端粒酶調(diào)節(jié)劑，所述報道基因序列可操作連接到哺乳動物端粒酶RNA組分基因，優(yōu)選地是人類端粒酶RNA組分基因上。報道基因(例如HPRT)可以插入到哺乳動物端粒酶RNA組成的ds cDNA的限制位點或平頭末端位點中，以產(chǎn)生同源定向構(gòu)建體或轉(zhuǎn)基因，其中在存活的哺乳動物細胞中，報道基因在內(nèi)源端粒酶RNA組分基因啟動子和相關(guān)轉(zhuǎn)錄控制元件的轉(zhuǎn)錄控制下。由此產(chǎn)生報道基因劑量依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的藥劑作為候選端粒酶調(diào)節(jié)劑被鑒別。
在一種變化方案中，用同源定向構(gòu)建體靶引哺乳動物細胞中的內(nèi)源端粒酶RNA組分基因，以便以可操作的鍵將報道基因多核苷酸序列與內(nèi)源基因染色體基因座的內(nèi)源端粒酶RNA組分基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如啟動子)相連。在另一變化中，包含報道基因多核苷酸的外源多核苷酸可操作地連接到哺乳動物端粒酶RNA組分基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動子和上游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點)；外源多核苷酸被轉(zhuǎn)移進哺乳動物細胞，其中其可以非同源整合進染色體位置和/或作為附加型多核苷酸被保持或復制。由此，在用藥劑處理過的細胞中產(chǎn)生報道基因多核苷酸的統(tǒng)計學上的明顯轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的藥劑作為候選哺乳動物端粒酶調(diào)節(jié)劑被鑒別出來。
降低細胞修復端粒損害或抑制端粒復制(例如經(jīng)競爭性抑制內(nèi)源性天然產(chǎn)生的端粒酶)能力的端粒酶調(diào)節(jié)劑是候選抗腫瘤劑或者使細胞(例如致瘤細胞)對端粒損害劑(例如烷基化試劑和電離輻射)敏感的致敏劑。
然后進一步在試驗中試驗候選抗腫瘤劑的抗腫瘤活性，所述試驗通常用于預測用作人類抗腫瘤藥物的適宜性。這些試驗的例子包括但不限于(1)候選藥劑抑制不依賴于貼壁的轉(zhuǎn)化細胞在軟瓊脂中生長能力的能力，(2)降低移植進nu/nu小鼠的轉(zhuǎn)化細胞的致腫瘤性的能力，(3)逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化細胞形態(tài)轉(zhuǎn)化的能力，(4)在nu/nu小鼠中降低移植瘤生長的能力，(5)抑制自發(fā)或化學誘發(fā)致癌作用動物模型中瘤或腫瘤前細胞形成的能力，和(6)在施用藥劑的轉(zhuǎn)化細胞中誘導更加不同表型的能力。
用于檢測藥劑抑制或增強端粒酶蛋白質(zhì)組分端粒酶RNA組分結(jié)合和/或端粒酶酶促活性的測定提供來高效率地篩選藥劑庫(例如化合物文庫，肽文庫等)以鑒別端粒酶拮抗劑或者興奮劑。這樣的拮抗劑和興奮劑可以調(diào)節(jié)端粒酶活性，并且進而調(diào)節(jié)端粒修復能力和復制潛力。
對患者施用有效劑量的特異性抑制端粒酶活性的藥劑可以用于治療病理狀態(tài)(例如癌，炎癥，淋巴增殖性疾病，自身免疫性疾病，神經(jīng)變性疾病等)的治療性或預防性方法中，所述病理狀態(tài)經(jīng)調(diào)節(jié)端粒酶活性和DNA修復和復制有效地治療。
閱讀本發(fā)明說明書公開的內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員會清楚，本發(fā)明提供了與人類端粒酶有關(guān)的有價值的藥劑，和各種有用的治療和診斷方法。以上必需的描述提供了這些方法的有限的例子，但這并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。從下列實施例與權(quán)利要求可以明顯看出本發(fā)明的其它特點與優(yōu)點。
下列實施例描述本發(fā)明的具體的方面，用來說明本發(fā)明和提供用于本領(lǐng)域技術(shù)人員分離和鑒別人類端粒酶RNA組分之方法的描述。實施例并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制，因為實施例僅提供對理解和實施本發(fā)明有用的特定方法。實驗實施例總述人類端粒酶RNA組分的克隆需要涉及的陰性選擇和陽性選擇循環(huán)的新方法，描述如下。然而，最初嘗試了用逆轉(zhuǎn)錄克隆RNA組分和克隆cDNA 5’末端的稱作5’-RACE的PCR擴增的方法。逆轉(zhuǎn)錄反應首先用與人類端粒DNA的單鏈部分的重復單位相同的引物開始，該引物由此互補于一種被認為存在于人類端粒酶RNA組分中的序列，所述引物在其5’-末端也包含相應于限制性內(nèi)切酶識別位點的序列。然而，當由逆轉(zhuǎn)錄反應和PCR擴增產(chǎn)生的cDNA用凝膠電泳和存在于凝膠中的核酸帶的核苷酸序列分析檢測時，僅發(fā)現(xiàn)核糖RNA序列。當用嵌套引物嘗試這一5’-RACE方法的變化方法時，也遇到類似的問題。
成功的克隆努力開始于從純化的人類端粒酶制劑和具有人類端粒酶活性的細胞系以及不具有可檢測的人類端粒酶活性的細胞系制備cDNA。在以下實施例1中詳細描述了用于制備cDNA的方法。兩個陰性選擇步驟和連續(xù)的陽性選擇循環(huán)與兩種人類細胞系的cDNA制劑結(jié)合使用，以降低不需要的序列的濃度，并且提高所需的RNA組分序列的濃度。
陰性選擇步驟涉及生物素化的PCR產(chǎn)物的制備，所述產(chǎn)物是從由沒有可檢測的端粒酶活性之人類細胞系制備的cDNA制備的。將生物素化的PCR產(chǎn)物變性，然后在包含很低濃度的非生物素化PCR產(chǎn)物的溶液中再雜交(100生物素化的產(chǎn)物1非生物素化的產(chǎn)物)，所述非生物素化產(chǎn)物是從由沒有可檢測的端粒酶活性之人類細胞系制備的cDNA制備的?？紤]到存在端粒酶陰性細胞株可能包含某些低含量的RNA組分的可能性，實施雜交步驟以僅針對在兩種細胞系中大量表達的RNA進行區(qū)別或選擇。在對Cot(選來允許最豐富表達的RNA雜交)雜交后，通過結(jié)合到鏈親和素化的磁性顆粒上除去不需要的材料；收集顆粒后剩下的上清液包含所需的人類端粒酶RNA組分cDNA。cDNA的PCR擴增的方法在以下實施例2中描述。
經(jīng)接下來的陽性選擇循環(huán)進一步富集所需的cDNA。在陽性選擇步驟中，將互補于人類端粒酶RNA組分中預期的模板序列的生物素化探針與PCR產(chǎn)物雜交，所述PCR產(chǎn)物來源于具有端粒酶活性的人類細胞系之PCR擴增的cDNA富集(經(jīng)陰性選擇)樣品。在雜交之后，將探針/靶復合物結(jié)合到親和素化的磁性小珠上，然后收集該復合物并用作在進一步的陽性選擇循環(huán)中富含RNA組分序列的核酸的來源。陽性選擇方法在以下實施例3和4中更詳細地描述。
在陽性選擇的第三個循環(huán)之后，由凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，移去相應于大小約200 bp的核酸的凝膠凝膠段。從凝膠段洗脫核酸，并經(jīng)PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物以限制性內(nèi)切酶NotI消化，然后經(jīng)連接插入到質(zhì)粒pBluescriptIISK+(從Stratagene購得)的NotI位點。將所形成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進大腸桿菌宿主細胞，分離單獨的菌落，并且用作進一步分析和DNA測序的核酸的來源。然后一些在這種試驗中陽性的克隆由DNA測序和各種其它試驗分析。
這些其它的試驗包括下列(1)測定互補于推定的RNA組分的反義寡核苷酸是否在已知包含端粒酶的人類細胞抽提物中抑制端粒酶活性；(2)測定對推定的RNA組分克隆序列具有特異性的PCR引物是否可以用來擴增在端粒酶樣品中存在的核酸，和觀察到的產(chǎn)物(如果有的話)是否在端粒酶純化期間跟蹤端粒酶活性；和(3)測定對推定的RNA組分克隆序列具有特異性的PCR引物是否可以用來擴增在已知端粒酶活性高的細胞(即腫瘤細胞)抽提物中以較高的量(與已知不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生低量端粒酶活性的細胞抽提物比較)存在的核酸。命名為質(zhì)粒pGRN7的克隆在這一試驗中產(chǎn)生的結(jié)果與證實該質(zhì)粒包含相應于人類端粒酶RNA組分的cDNA的測定一致。
這樣，相應于pGRN7的推定的RNA組分序列之序列的反義寡核苷酸顯示出體外端粒酶抑制作用。同樣地，當端粒酶是用下述方法從細胞抽提物純化的時，對pGRN7的推定的RNA組分序列具有特異性的PCR引物擴增出適當大小的核酸，且擴增產(chǎn)物的量與在收集的組分中觀察到的端粒酶活性的量很好地相關(guān)，所述純化方法包括(1)DEAE層析；(2)Sephadex S300層析；和(3)甘油梯度，SP瓊脂糖凝膠，或苯基瓊脂糖凝膠分離和組分收集。最后，基于用對包含在pGRN7中的推定的RNA組分特異的引物進行的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增(RT-PCR)，正常(沒有可檢測的端粒酶活性)和癌(端粒酶活性存在)以及精巢(端粒酶活性存在)的細胞抽提物，細胞顯示出相應的PCR產(chǎn)物量。關(guān)于RT-PCR方案在以下實施例5和6中描述。
上述結(jié)果提供了人類端粒酶RNA組分已被克隆的令人信服的證據(jù)，因此隨后將質(zhì)粒pGRN7用于分離人類細胞系RNA組分基因組克隆，如以下實施例7的描述。該基因組克隆從購自Stratagene的插入到λ載體FIXII中的人類DNA基因組文庫中鑒別和分離。包含RNA組分基因序列的所需的克隆包含約15kb插入物，命名為克隆28-1。該克隆保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，可以以保藏號75925獲得。從這種噬菌體亞克隆各種限制片段并測序?；蛞捕ㄎ坏饺旧w3的q臂遠端。以上示出了λ克隆28-1的從約15kb插入物一個末端的SauIIIA1限制性內(nèi)切酶識別位點至內(nèi)部HindIII限制性內(nèi)切酶識別位點獲得的序列信息，其包含RNA組分基因的所有成熟RNA組分序列和轉(zhuǎn)錄控制元件。
實施例1制備可PCR擴增的cDNA經(jīng)硫氰酸胍抽提從293和IMR-90細胞或經(jīng)酚/氯仿抽提從純化的端粒酶組分獲得RNA。在2％瓊脂糖凝膠上按大小分級分離293細胞的總RNA，分離出大小不到500bp的RNA。
用從Besda研究實驗室(BRL)獲得的SuperscriptRMII逆轉(zhuǎn)錄酶進行第一鏈cDNA合成。在11微升總體積時在水中將約0.5至1.0微克RNA與約40納克隨機引物(6聚體；pdN6)混合。在95℃加熱溶液10分鐘。然后在冰上冷卻5-10分鐘。由離心收集變性核酸。通過以下順序的添加重懸變性RNA和引物混合物4微升5x第一鏈合成緩沖液；2微升0.1M二硫蘇糖醇(DTT)；1微升RNAsin(Pharmacia)；和1微升dNTP(2.5mM各儲備溶液)。在42℃溫育反應混合物1分鐘，然后，添加1微升SuperscriptTMII RTase(BRL)(200單位)，并且混合進反應液中，然后在42℃溫育60分鐘。將包含新合成的cDNA的反應混合物放置在冰上直到進行第二鏈合成。
第二鏈cDNA合成按如下進行。將第一鏈cDNA合成反應混合物(從上)的約20微升反應混合物與下列組分以所示順序混合111.1微升水；16微升10x大腸桿菌DNA連接酶緩沖液；3微升dNTP(2.5mM各貯液)；1.5微升大腸桿菌DNA連接酶(得自BRL，15單位)；7.7微升大腸桿菌DNA聚合酶(得自Pharmacia，40單位)；和0.7微升大腸桿菌RNA酶H(BRL)。輕輕混合形成的溶液，在16℃溫育2小時，這時向反應試管中添加1微升(10單位)T4 DNA聚合酶，在相同的溫度(16℃)下繼續(xù)溫育5分鐘。而后停止反應，通過以酚/氯仿提取反應物兩次，以乙醇沉淀核酸，和離心反應混合物沉淀核酸來收集核酸。
在20微升TE緩沖液中重懸由離心收集的cDNA沉淀，并連接到稱為＂NotAB＂的寡核苷酸上，所說的寡核苷酸由兩種寡核苷酸組成(NH2是氨基阻斷基團)NotA 5′-pATAGCGGCCGCAAGAATTCA-NH2NotB 5’-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT-3’按以下方法制備雙鏈寡核苷酸在46.25微升水中把50微升NotA寡核苷酸(100pmol)與50微升NotB寡核苷酸(100pmol)混合，在95℃加熱形成的溶液5分鐘，當溶液仍然是熱的時添加3.75微升20xSSC緩沖液。然后將含混合物的試管放置在含熱水的燒杯中(大約70-75℃的溫度)，將溫度緩慢降低至15℃之下，以便兩種寡核苷酸可以雜交形成雙鏈寡核苷酸NotAB。由沉淀和離心收集形成的核酸。
將雙鏈NotAB寡核苷酸重懸在約30微升TE緩沖液中，然后經(jīng)在總體積20微升中于16℃溫育反應混合物過夜連接到反應混合物中的cDNA上，所說反應混合物包含10微升以上描述的cDNA制劑；約50pmol NotAB(由OD260計算)；2微升10x T4 DNA連接酶緩沖液；1.2微升T4 DNA連接酶；0.2微升10mMATP；和水。通過在65℃加熱反應混合物10分鐘熱終止反應。將約1至2微升所形成的混合物典型地用于PCR擴增；如實施例2所述可以擴增連接混合物10至15個循環(huán)(94℃，45秒；60℃，45秒；和72℃，1.5分)，并作為貯存液保存。
實施例2cDNA的PCR擴增通過制備擴增反應混合物常規(guī)擴增cDNA，所述反應混合物的組成為5微升10X PCR緩沖液(500mMKCl；100mMTris，pH8.3；和20mMMgCl2；5-8微升dNTP(各2.5mM)；1微升Taq聚合酶(Boehringer-Mannheim)；0.1微升基因32蛋白質(zhì)(Boehringer-Mannheim)；6微升Not B引物(20μM貯存液)；2微升cDNA(按實施例1的描述制備)，和水。然后以50至100微升礦物油覆蓋這一混合物，PCR擴增進行10至15個循環(huán)，94℃，45秒；60℃，45秒；和72℃，1.5分。在擴增之后，反應混合物以酚/氯仿提取，用乙醇沉淀擴增的核酸，并且離心收集。然后將沉淀溶解在TE緩沖液中制備貯液。
實施例3用于扣除雜交和循環(huán)選擇的PCR擴增為制備用于扣除雜交和循環(huán)選擇的PCR產(chǎn)物，在如實施例2所述制備的(除進行21-24個循環(huán)的引物退火，延伸，和產(chǎn)物變性外)50微升PCR反應混合物中擴增如實施例2所述制備的約1微升貯存液。在擴增之后，反應混合物以酚/氯仿提取，乙醇沉淀，并且由離心收集。產(chǎn)物產(chǎn)量通過小份反應混合物的凝膠電泳之后的溴化乙錠染色估計。對于扣除雜交，在生物素化的dUTP存在下擴增來自端粒酶陰性細胞(IMR-90)的cDNA文庫。以端粒酶陰性細胞(IMR-90)的cDNA對端粒酶陽性細胞(293)的cDNA的100比1比率完成扣除雜交。在65℃采用標準條件48-72小時。典型地，約2微克部分純化的cDNA和陰性選擇材料的核酸產(chǎn)物用于至少2圈循環(huán)選擇。
在循環(huán)選擇后，如實施例4的描述，約1至2微升選擇的“拉下(pull-down)”產(chǎn)物(從總體積20微升中取出)按實施例2描述進行PCR擴增22個循環(huán)，用乙醇沉淀，并且離心收集，供進一步循環(huán)選擇。
實施例4PCR擴增的cDNA的陽性選擇對于用于克隆人類端粒酶RNA組分的循環(huán)選擇方法的陽性選擇步驟而言，用25微升TE緩沖液稀釋約2微克PCR擴增的cDNA，然后與1.25微升20X SSC混合，形成的溶液加熱至95℃維持3分鐘。溫度降低至60℃維持5分鐘，加入1微升(0.1微克/微升)R2或R4生物素化的探針。這些探針的序列如下所示。所述探針是O-甲基-RNA探針，因此U是O-甲基尿苷，A是O-甲基核糖腺嘌呤，G是O-甲基核糖鳥嘌呤，I是次黃苷。
R25’-UUAGGGUUAGII-生物素R45’-AUUGGGUUAUII-生物素R2探針對端粒重復是特異性的，R4探針對RNA酶P是特異性的，其用來跟蹤循環(huán)選擇方法的有效性與效率。通過實施對RNA酶P RNA(已知序列的分子)的同時但分別的循環(huán)選擇，就目標分子(在這種情況下是人類端粒酶RNA組分)而言，人們對循環(huán)選擇方法是合適地起作用可以有更大的信心。
在65℃R2或R4探針添加到混合物中之后，將雜交反應混合物的溫度降低至30℃，接著在這一溫度下溫育混合物5分鐘，然后，將反應混合物的溫度進一步降低至14℃溫育60分鐘。最后，混合物在4℃溫育2-12小時。
將每一樣品(R2或R4)的整個雜交反應混合物在4℃添加至400微升0.5X SSC中，再添加到冰冷的磁性小珠(從Promega購買，在使用之前以0.5x SSC預洗滌4次)試管中。在4℃將形成的混合物溫育30分鐘確保完全結(jié)合到磁性小珠上。然后在室溫下在磁性儀器(Promega)上短暫溫育每一反應試管以拉下小珠。把小珠重懸于冷的0.5X SSC(600微升)中并置入冰上(在試管中)。用0.5X SSC以這種方式洗滌樣品三次以上。在把小珠置回磁性儀器上收集之前在65℃通過將小珠重懸于100微升水中并溫育5分鐘從小珠洗脫核酸。將這一方法重復三次以上；最后一次，在把小珠放到磁性儀器上收集之前在65℃溫育重懸的小珠5分鐘。收集所有100微升上清液(各樣品)并在SpeedVacTM離心機中干燥成20微升。然后，PCR擴增回收的DNA另一個擴增和選擇循環(huán)。在每一擴增之后，PCR產(chǎn)物用酚-三氯申烷抽提兩次，用乙醇沉淀，并在20微升TE緩沖液中重懸。
典型地，PCR擴增由凝膠電泳證實。此外，用各種對照監(jiān)測循環(huán)選擇方法。作為一種對照，PCR＂臂＂(作為引物雜交位點的限定序列的寡核苷酸)被放置到包含賦予新霉素抗性基因的核酸上，將形成的核酸與PCR擴增的cDNA混合，并在各選擇中用定量PCR監(jiān)測。作為另一種對照，用RNA酶P跟綜RNA酶P選擇的文庫和端粒酶RNA組分選擇的文庫。
實施例5RT-PCR方案基本上依據(jù)實施例1描述的方法制備第一鏈cDNA，RNA從包含0.1至1微克RNA的端粒酶組分純化；典型地，使用從300微升組分制備的RNA的約三分之一至五分之一。將RNA與10微升中的40至80納克隨機六聚體混合。在95℃(用熱循環(huán)儀器)變性10分鐘并冰冷。將變性RNA和6聚體添加到反應混合物中，所述反應混合物包含4微升5X第一鏈合成緩沖液，其由逆轉(zhuǎn)錄酶(RTase，從BRL購得)的制造廠商提供，2微升0.1M二硫蘇糖醇，1微升10mMdNTP(各種)，1微升RNA酶抑制劑(Pharmacia)和水，總體積為9微升。將合并的混合物放置到42℃水浴中。在溫育1-2分鐘之后，將SuperscriptTMII RTase(BRL)添加到混合物中，繼續(xù)在42℃溫育60分鐘。通過在95-98℃加熱試管10分鐘停止反應。第一鏈cDNA由短暫離心收集，等分到新的試管，迅速在干冰中凍結(jié)，并且在-80℃存儲或立即使用。
實施例6用特異性引物組PCR擴增cDNA
對使用放射活性標記的核苷酸的20微升PCR反應，將1微升按照實施例5的方法制備的cDNA與下列物質(zhì)混合20pmol引物1，20pmol引物2，2.5微升2.5mMdNTP，5μCiα-32P-dATP，2單位(Boehringer-Mannheim)Taq聚合酶，0.2微克T4基因32蛋白質(zhì)(Boehringer-Mannheim)，2微升10x緩沖液(500mM Kcl，100mM Tris-HCl-pH8.3和20mM MgCl2)和水至總體積20微升。然后向試管中加一滴礦物油。
端粒酶RNA組分克隆的PCR擴增條件是94℃45秒，60℃45秒，72℃1.5分鐘。循環(huán)次數(shù)依用于RNA制備的純化材料的類型而不同，但是典型地在18至25個循環(huán)的范圍內(nèi)。就所有定量RT-PCR而言，每個樣品進行具有不同循環(huán)數(shù)的幾個反應，以確定PCR擴增在何時變得飽和和非線性。
對于RNA酶P用作對照而言，PCR擴增的條件是94℃45秒，50℃45秒，和72℃1.5分。同樣，循環(huán)次數(shù)從15至22，取決于樣品的性質(zhì)。用于RNA酶P擴增的引物的序列顯示如下P35’-GGAAGGTCTGAGACTAG-3’P45’-ATCTCCTGCCCAGTCTG-3’以這兩種引物獲得的PCR產(chǎn)物大小約110bp。
在PCR之后，產(chǎn)物(5至10微升反應混合物)裝載到6％天然聚丙烯酰胺凝膠上并電泳。在電泳之后，干燥凝膠并露置于PhosphorImagerTM盒或者放射自顯影膠片進行分析。
實施例7克隆人類端粒酶RNA組分的基因如Maniatis等(實驗室分子克隆手冊)的描述實施用于克隆人類端粒酶RNA組分基因的方法。插入到噬菌體λ載體FIXII中的來自人肺成纖維細胞細胞系WI-38的DNA的基因組DNA文庫從Stratagene購得。將噬菌體以每平板大約25,000噬斑的濃度平板接種到三套15(150mm)平板上。平板是以NZY瓊脂和NZY頂級瓊脂糖鋪成的；用于噬菌體轉(zhuǎn)化的細胞是XLlBlueMRAP2細胞；轉(zhuǎn)化體在37℃過夜培養(yǎng)大約16小時。然后把平板在4℃冷卻大約1小時，然后將噬斑移至C/P尼龍環(huán)形物(Bio Rad來源的濾紙)。重復這一方法以獲得與所述濾紙相同的一套濾紙。將濾紙(雙份)變性，中和，在6x SSC緩沖液中平衡，露置于UV照射下，使核酸交聯(lián)到濾紙上，然后在印跡紙上干燥。
在50％甲酰胺緩沖液中37℃預雜交一小時。濾紙用約218bp的放射性標記的克隆pGRN7的NotI片段探查，所述片段已在經(jīng)電泳分離后用電洗脫從5％聚丙烯酰胺凝膠分離，并按照制造商的說明采用切口翻譯試劑盒(來源于Boehringer-MannheimBiochemicals)用α-32P-dCTP切口翻譯。每個濾紙用約25納克(約10μCi標記)探針，雜交在50％甲酰胺雜交緩沖液中于37℃進行一夜。在雜交之后，濾紙在室溫下洗滌六次；前3次洗滌用含0.1％SDS的6x SSC，后3次洗滌只用6x SSC。在將幾個雙份濾紙起始露置于PhosphorImager盒中檢查雜交效率和信號強度后，濾紙在0.5x SSC中于65℃洗滌。然后用兩個強化屏將濾紙置入柯達XARS膠卷下，使其在-70℃露置在膠卷下大約100小時。
從含噬菌體的濾紙發(fā)出一個強信號，后來命名為28-1，其含人類端粒酶RNA組分的基因。相應于在濾紙上觀察到的信號的噬斑用于制備第二平板，以便可以培養(yǎng)分離的噬斑(通過以標記的pGRN7核酸探查確認)以用于大規(guī)模分離噬菌體DNA。噬菌體28-1從美國典型培養(yǎng)物保藏中心可以獲得(保藏號75925)，包含約15kb插入物并包含幾個限制片段，這些片段含有與pGRN7上RNA組分序列雜交的序列，這些片段為4.2kbEcoRI限制性內(nèi)切酶片段；4.2kb ClaI限制性內(nèi)切酶片段，和2.5kb HindIII-SacI限制性內(nèi)切酶片段。后一片段包含以上所示的RNA組分的整個約560個核苷酸的序列，并被認為包含RNA組分的完整的基因。包含pBluescript載體中的2.5kb HindIII-SacI限制性內(nèi)切酶片段的質(zhì)粒命名為質(zhì)粒pGRN33，從美國典型培養(yǎng)物保藏中心可以獲得(保藏號ATCC______)。在人類基因可以包含不是2.5kb片段上的那些序列的程度內(nèi)，那些序列可以從噬菌體28-1或從其它通過以2.5kb片段探針(或本發(fā)明的另一個探針)探查識別的噬菌體克隆分離。以上提到的限制性內(nèi)切酶片段是在單獨限制性內(nèi)切酶消化物中制備的；消化產(chǎn)物在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳分離，或者僅僅對于2.5kb組分，用3％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；從凝膠切下所需的帶并制備用來供亞克隆，制備采用GeneCleanTM試劑盒II(來源于Biol0l公司)或在0.1x TBE中，100V 2小時電洗脫進Spectropor#2透析管(僅用于約2.5kb片段)。
將這些限制性內(nèi)切酶片段亞克隆進大腸桿菌表達/誘變質(zhì)粒，這些質(zhì)粒源于基于pUC的質(zhì)?；蛟从趐BluescriptII質(zhì)粒，這些質(zhì)粒也包含SV40復制起點(但沒有SV40啟動子活性)。形成的質(zhì)?？梢杂糜谥苽涓淖兊?突變的)RNA組分核酸，以供為各種目的引入到人類或其它真核細胞，如以上優(yōu)選的實施方案描述中所描述的。
實施例8
人類端粒酶RNA組分的反義質(zhì)粒用下列引物組經(jīng)PCR擴增RNA組分cDNA制備反義表達質(zhì)粒(1)NotB和G1，其產(chǎn)生小于質(zhì)粒中cDNA插入物的反義核酸；和(2)NotB和R3C，其產(chǎn)生全長(相對于質(zhì)粒中的插入物)反義核酸。NotB的核苷酸序列在以上實施例1中示出；G1與R3C引物的核苷酸序列顯示如下。
G15’-GAGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAAGCA-3’R3C5’-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG-3’在PCR擴增后，擴增片段在PmlI位點被克隆進約10kb表達質(zhì)粒；該質(zhì)粒包含作為選擇標記的賦予嘌呤霉素抗性，DHFR和賦予潮霉素B抗性的基因，SV40復制起點；配置來表達人類端粒酶RNA組分基因的反義鏈的誘導型人類金屬硫蛋白基因啟動子(人們也可以用更強的啟動子獲得更高的表達水平)和SV40晚期poly A添加位點。
將形成的質(zhì)粒，命名為PGRN42(NotB/G1產(chǎn)物)和pGRN45(NotB/R3C產(chǎn)物)，用磷酸鈣方法(參見Maniatis等，同上)轉(zhuǎn)染進纖維肉瘤細胞系HT1080。HT1080細胞通常是無限增殖的；人類端粒酶RNA組分的反義RNA的表達應該阻止人類端粒酶RNA組分與蛋白質(zhì)組分的結(jié)合，阻斷活性端粒酶形成并使細胞死亡。
實施例9從非人類哺乳動物鑒別和分離RNA組分核酸為了說明本發(fā)明的藥劑如何用于從其它哺乳動物物種鑒別和分離基本上同源的核酸，使用與人類RNA組分序列互補的PCR引物在PCR中擴增同源的序列。用于說明本發(fā)明的這一方面的一個例證性的引物對由引物+10(具有序列5’-CACCGGGTTGCGGAGGGAGG-3’)和引物R7(具有序列5’-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCA-3’)組成。基因組DNA是從黑猩猩，松鼠猴，獼猴，和狒狒組織制備的，以大約0.5-4mg/ml濃度溶解在TE緩沖液中。
對于每一種組織類型，制備PCR混合物，該混合物包含1微升基因組DNA，48微升Master Mix(其組成為1x TaqExtenderTM緩沖液，購自Stratagene，200μM各種dNTP和0.5μM各引物)和0.5微升Taq聚合酶(5單位/微升，Boehringer Mannheim)Tth聚合酶(TaqExtenderTM聚合酶，Stratagene)1∶1混合物。反應試管裝載在熱循環(huán)器上，該熱循環(huán)器設定為首先于94℃加熱反應混合物5分鐘，然后完成在94℃30秒鐘，63℃10秒鐘和72℃45秒鐘的27個循環(huán)。擴增反應完全之后，將約10微升各反應混合物裝載在2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。電泳后，使凝膠染色，用UV照射，人們可以觀察到每一種反應混合物均包含預計大小(約200bp)的帶。從這些帶可以克隆核酸并測序，可以按以上有關(guān)人類端粒酶RNA組分基因的描述克隆各種這樣的哺乳動物物種的RNA組分基因其余部分。此后的實施例14描述松鼠猴端粒酶RNA組分基因測序的實施例。
實施例10突變的有義人類端粒酶RNA組分序列這一實施例說明在模板區(qū)改變端粒酶RNA組分序列會改變?nèi)祟惗肆Ｃ负铣傻男蛄?，導致染色體端粒酶重復中的變化。
為了確定重新編程TRC3模板區(qū)是否產(chǎn)生導致人類端粒酶活性中合成的端粒重復部分中相應的變化，將表達整個端粒酶RNA組分(TRC3)基因序列的基因片段克隆并誘變處理。Southern印跡分析顯示TRC3雜交到人類基因組中的單拷貝基因上。從λ噬菌體文庫分離TRC3的基因組拷貝，其顯示出與在基因組Southern印跡上用TRC3探查時觀察到的相同的限制圖譜。將2.6kb HindIII-Sacl片段亞克隆進pBluescript的修飾形式，產(chǎn)生基因組TRC3質(zhì)粒pGRN33。用引物延伸，RACE PCR和RT-PCR繪制所述RNA的5’和3’末端圖。RNA轉(zhuǎn)錄物的大小為約550個堿基，與它在Northern印跡上的遷移一致。TRC3轉(zhuǎn)錄區(qū)在具有1.4kb上游序列的基因組克隆的中央。
將從純化的端粒酶制劑提取的RNA用于下列實驗。5’RACE在32P-dATP存在下用反義TRC3引物(R3B5’-CAACGAACGGCCA GCAGCTGACATT)制備第一鏈cDNA，用PAGE分離延伸產(chǎn)物并經(jīng)放射自顯影鑒別，切下并抽提。用T4 RNA連接酶將寡核苷酸(NotA5’-pATAGCGGCCGCTT GCCTTCA-NH2)連接到這些第一鏈產(chǎn)物，然后用嵌套引物R3c(5-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG)，和與NotA寡核苷酸互補的寡核苷酸(NotB5′-TGAATTCTTGCGGCCGCTAT)進行PCR。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分離，切下帶并用寡核苷酸Gl(5’-AGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAGCA)為引物直接測序。3’末端作圖嘗試完成3’RACE未獲成功。其后，使用RT-PCR策略，其中使用一系列與基因組DNA序列互補的反義引物用于引導第一鏈cDNA合成。在這系列中的引物從轉(zhuǎn)錄物5’末端開始向3’末端每大約150bp被間隔。然后用第一鏈引物和其序列在已知的TRC3轉(zhuǎn)錄物內(nèi)部(F3b5-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG)的引物進行PCR。當使用由設計為+100-+450(相對于5’的編號)之間的所有引物而不是用設計為+558-+950的任何引物制備的cDNA時，觀察到預料大小的逆轉(zhuǎn)錄酶敏感性PCR帶。其將成熟TRC3轉(zhuǎn)錄物的推定的3’末端置入+450和+558之間。此后的引物設計和RT-PCR被限制在+545和+558間隔之間。
經(jīng)基因組質(zhì)粒pGRN33的體外誘變(基本上按照Perez等，生物化學雜志26922485的描述完成)，預料的TRC3模板序列從CUAACCCUA改變成CCAACCCCA(MuC)或CAAACCCAA(MuA)。如果摻入功能性端粒酶，這些突變RNA應當能作為合成TTGGGG(MuC)或TTTGGG(MuA)而不是野生型重復TTAGGG的模板。這些突變端粒酶活性可以容易地與野生型活性區(qū)別，因為它們表現(xiàn)出活性不再需要dATP，且僅野生型活性對ddATP的終止敏感。雙重突變體(MuC+17)也被制備，其中除MuC模板之外在+180bp存在17bp插入。這一突變允許用探針探查17bp的插入或按大小特異性檢測改變的RNA。
基因組序列的2.6kb足以體內(nèi)表達TRC3。用MuC+17質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細胞，用17bp插入序列作為引物在逆轉(zhuǎn)錄步驟中經(jīng)RT PCR檢測轉(zhuǎn)染的DNA。在MuC+17轉(zhuǎn)染細胞而不是模擬轉(zhuǎn)染細胞中檢測到RNA，表明2.6kb基因組克隆足以表達TRC3。用HT1080細胞的磷酸鈣轉(zhuǎn)染與pCMVneo一同從這三種突變質(zhì)粒衍生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。在G418中選擇抗性克隆，經(jīng)RT-PCR(Irving等(1992)實驗細胞研究202161)證實MuC+17 RNA的表達。
為試驗突變端粒酶活性，測定未轉(zhuǎn)染細胞和具有整合的MuC*，MuC或MuA載體(圖1中C*，C，或A)的三個穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的抽提物。由于突變體抽提物預期包含野生型和突變型端粒酶活性，采用各種測定條件以區(qū)別它們。在正常的反應條件(dTTP，32P-dGTP和dATP)下，來自突變構(gòu)建體系列的所有三種抽提物顯示出對RNA酶敏感的野生型端粒酶活性(圖1，第1-6道)。如預期的，當ddCTP包含在反應中時，這一活性不受影響(圖1，7-9道)，但被ddTTP消除(10-12道)。相反，當ddATP代替dATP時，C(14道)和A(15道)抽提物仍然顯示對RNA酶敏感的端粒酶活性(17和18道)，而C*(13道)和對照抽提物不顯示這一活性。這些結(jié)果表明ddATP抗性活性代表的端粒酶由MuC或MuA TRC3 RNA重構(gòu)。相反，在C*中的17bp插入物抑制重構(gòu)，說明端粒酶重構(gòu)對TRC3序列是非常特異性的。
為了確認由突變MuA合成的序列是(GGGTTT)n，我們改進了擴增添加到單一端粒酶引物上的端粒酶重復(Kim等(1994)科學2662011)的現(xiàn)有的PCR方法。用合成的引物，我們鑒別出反應條件，其中具有序列d(CCCAAACCCAAACCCAA)的3’引物僅擴增(TTTGGG)n重復，而不擴增包含(TTAGGG)n的重復。
為了區(qū)別由野生型與突變端粒酶添加的端粒酶重復，將兩步測定與限制端粒酶反應應用的核苷酸的策略結(jié)合。由于MuA和MuC將分別產(chǎn)生(TTTGGG)n和(TTGGGG)n的端粒重復序列，所以首先將細胞抽提物在室溫下在僅存在dTTP和dGTP時用TS底物溫育10分鐘，使得可以添加端粒酶重復。然后剩余端粒酶活性通過煮沸抽提物5分鐘破壞。然后如Kim等(1994，同上)所述，在存在所有4種dNTP和痕量32P-dCTP時用合適的反向引物經(jīng)PCR檢測具有特異性DNA序列的端粒酶產(chǎn)物。對檢測MuA產(chǎn)物而言，反向引物是(ACCCAA)4，PCR條件是94℃10秒，60℃30秒和72℃30秒，20個循環(huán)。對檢測MuC產(chǎn)物而言，分別使用三個反向引物(CCCCAA)3，(CCAACC)3和(CCAACC)3，其給出具有相應的遷移率變動(與端粒酶產(chǎn)物退火的預期的位置一致)的PCR產(chǎn)物。除退火溫度是50℃而外，使用的PCR條件與以上相同。在相同的條件下，沒有端粒酶產(chǎn)物從親本細胞或用野生型TRC-3基因轉(zhuǎn)染的細胞產(chǎn)生。在我們的PCR擴增條件特異性試驗中，含(TTTGGG)n和(TTGGGG)n的合成寡核苷酸分別產(chǎn)生具有(ACCCAA)4或(CCCCAA)3反向引物的適當?shù)?nt階梯PCR產(chǎn)物，而(TTAGGG)n寡核苷酸不產(chǎn)生任何具有(ACCCAA)4或(CCCCAA)3反向引物的PCR產(chǎn)物。
用這些條件，在修飾的端粒酶測定中，從MuA而不是從MuC或野生型細胞抽提物產(chǎn)生了產(chǎn)物，表明包含MuA的細胞的端粒酶產(chǎn)生(TTTGGG)n重復。類似方法用來分析MuC突變，其合成(TTGGGG)n重復。上述數(shù)據(jù)一起有力地證明TRC3基因編碼人類端粒酶RNA組分，由此我們已將TRC3重新命名為hTR，用來指人類端粒酶RNA。
實施例11在致死細胞和無限增殖細胞中的端粒酶RNA組分大多數(shù)癌細胞高水平表達端粒酶活性，而在大多數(shù)正常的人類體細胞中檢測不到端粒酶(Kin等(1994)同上)。為了確定在無限增殖癌細胞系中端粒酶RNA組分水平是否提高，在五種致死原代細胞株(其缺乏可檢測的端粒酶活性)和具有高水平的端粒酶活性的五種無限增殖癌細胞系中用RT-PCR分析端粒酶RNA組分和GAPDH轉(zhuǎn)錄物水平。當比較GAPDH的水平時，在腫瘤細胞系中的端粒酶RNA組分轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定狀態(tài)水平比原代細胞中的高3-12倍(圖2A)。在高水平表達端粒酶的無限增殖癌細胞中端粒酶RNA組分水平增加，有趣的是，在致死原代細胞中也存在低的但可檢測水平的端粒酶RNA組分，而不具有可檢測的端粒酶活性(1-5道)。
也在各種正常的人類組織中用Northern印跡分析檢查端粒酶RNA組分水平。睪丸和卵巢具有端粒酶RNA組分的最高水平，這是所預料到的，因為這些組織表達高水平的端粒酶活性。然而，一些其它組織也表達端粒酶RNA組分(圖2B和2C)，這些包括正常的腎，前列腺，和成人的肝臟，這些均缺少可檢測水平的端粒酶活性。這些結(jié)果證實了來源于細胞系的數(shù)據(jù)(圖2A)并且提示端粒酶RNA可能在一些人類組織中存在但是是失活的。類似的RNA表達的組織特異性區(qū)別在小鼠組織中見到；然而，許多正常的小鼠組織是端粒酶活性陽性的。在人類細胞中的端粒酶活性的明顯增加的抑制作用可以幫助解釋為什么小鼠細胞自發(fā)地在培養(yǎng)中無限增殖，而人類細胞不是如此。
實施例12反義hTR(人類端粒酶RNA組分)轉(zhuǎn)錄物在HeLa細胞中的表達而導致的細胞危象和細胞死亡為了測定端粒酶在無限增殖化細胞中的功能，將反義hTR表達構(gòu)建體引入HeLa細胞。將包含人類端粒酶RNA組分cDNA克隆(TRC3)的1至193bp的200bp EcoRI DNA組分分別插入到p10-3與pBBS212的EcoRI位點上以便產(chǎn)生質(zhì)粒p10-3-hTR和pBBBhTR。質(zhì)粒p10-3-hTR在四環(huán)素調(diào)節(jié)的CMV基本啟動子(相對于兩種不同方向上游的5個Tet操縱基因)轉(zhuǎn)錄控制下表達反義端粒酶RNA組分(如Gossen等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)895547中所述)。質(zhì)粒pBBS-hTR在MPSV啟動子(Lin等(1994)基因147287)的控制之下表達反義hTR。平行地，也使缺乏反義hTR編碼序列的對照表達載體經(jīng)電穿孔進入HeLa細胞。在三個單獨實驗中選擇包含反義或者對照質(zhì)粒的克隆。最初，表達反義hTR的41個培養(yǎng)物與具有對照質(zhì)粒的細胞一樣培養(yǎng)。然而，在23至26群體倍增水平轉(zhuǎn)染后，41個反義表達培養(yǎng)物中的33個經(jīng)歷危象(表I)。在這些培養(yǎng)物中的細胞危象的特征是顯著地抑制細胞生長(從20到26PD)，其后在一周期限內(nèi)長并且細胞從平板脫離。在經(jīng)歷危象的33個培養(yǎng)物的28個中，在大多數(shù)細胞死亡后三周之內(nèi)觀察到很少(1％)的回復突變集落?；貜屯蛔兗毎梢源韽姆戳xhTR構(gòu)建體的抑制作用逃逸的變異體。與反義克隆相反，載體對照細胞系在50倍增內(nèi)的生長和死亡沒有任何變化。
表I反義hTR導致較短的平均TRF和細胞危象進行三個獨立實驗，其中HeTe7細胞(高水平表達四環(huán)素抑制子VP16嵌合蛋白的HeLa細胞)用以下兩個質(zhì)粒分別經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染，所述質(zhì)粒是在四環(huán)素-VP16誘導型CMV基本啟動子控制下表達反義hTR的質(zhì)粒p10-3-hTR，和在MPSV啟動子(54)的控制下表達反義hTR的質(zhì)粒pBBs-hTR。[在這些實驗中沒有四環(huán)素調(diào)節(jié)作用被觀察到，用p10-3-hTR的實驗典型地在不存在四環(huán)素的情況下進行，因為四環(huán)素-VP16誘導型CMV基本啟動子控制下的螢光素酶或反義hTR的對照實驗表明在HeTe7細胞中存在或不存在四環(huán)素對螢光素酶或反義hTR表達幾乎沒有影響。事實上，在HeTe7細胞中的反義hTR構(gòu)建體的早期的實驗中，在四環(huán)素的存在下，在23至26 PDL時細胞仍然經(jīng)歷危象]。作為對照，HeTe7細胞也在相同的條件之下用親代載體轉(zhuǎn)染。從各轉(zhuǎn)染系列分離11至18個穩(wěn)定的克隆。直到20PDL，所有分離物的克隆都顯示出相同的形態(tài)和生長曲線，此時，大多數(shù)反義表達克隆的生長明顯減慢(10-3-hTR和pBBs-hTR)。到23-26PDL，這些細胞經(jīng)歷危象，其特征是出現(xiàn)變大的和變圓的細胞。然而并非所有由pBBs-hTR轉(zhuǎn)染HeTe7細胞產(chǎn)生的克隆都經(jīng)歷危象；8個表達反義hTR的克隆繼續(xù)類似于對照培養(yǎng)物生長。在PDL 23時收獲所有的克隆細胞并測定平均TRF長度。用非配對t-檢驗法計算P值。對各系列，示出了經(jīng)歷危象的克隆的比例。
為了說明反義表達克隆中端粒長度和端粒酶抑制作用是否與細胞危象相關(guān)，在23PDL時測定了在幾個前危象對照和實驗集落中的端粒長度和端粒酶活性。所有包含對照載體的集落具有類似于親本細胞系(3.15kb)的平均TRF長度(3.22和3.27kb)，而經(jīng)歷危象的包含反義載體構(gòu)建體的克隆具有在2.39和2.72kb之間的或比親本系短17至26％的平均TRF長度(圖3)。這些數(shù)據(jù)與在包含反義克隆中由于端粒酶活性的抑制作用失去的端粒重復一致。為了直接試驗這一點，在14個克隆中測定端粒酶活性。端粒酶活性在許多反義克隆中一般較低但可檢測，雖然因為平均TRF從3.22降至2.39kb(P＝0.0008)，變短的端粒說明水平不足以保持端粒長度。在8個包含反義載體(pBBS-hTRb)的沒有經(jīng)歷危象的克隆中，端粒長度未明顯地改變(3.03對3.33 P＝0.355)，并且端粒酶活性類似于對照。這些結(jié)果共同證明，一旦端粒達到關(guān)鍵的長度，端粒喪失就導致危象和細胞死亡。
在表達反義端粒酶RNA組分的HeLa細胞中的細胞危象進一步支持端粒酶抑制作用可以對人類癌癥提供特異性的和有效的治療。
實施例13原位擴增和檢測端粒酶RNA原位檢測A.熒光原位雜交(FISH)可以經(jīng)靶向端粒酶RNA組分的標記探針的原位雜交進行在細胞或組織混合種群中端粒酶陽性細胞的鑒別。細胞樣品的組織固定在微載玻片，充分浸透，并用于原位雜交。人類端粒酶RNA(hTR)的原位雜交的一個例子是首先將載玻片浸沒在預溫至70-74℃的70％去離子化甲酰胺/2X SSC溶液中2-3分鐘使核酸變性。然后將載玻片轉(zhuǎn)移到70％冰冷EtOH中，然后到95％EtOH中，再到100％EtOH中(在各溶液中均4分鐘)。干燥100-200納克(每片)標記的htRNA探針(用生物素，地高辛配基，放射性同位素，熒光標記物標記的約500bp DNA探針)，重懸于100％去離子化甲酰胺，在75℃溫育8分鐘變性，并且立即在冰上冷卻。將10微升2X雜交緩沖液(4X SSC；4X Denhardt’s溶液；20％葡聚糖硫酸鹽；100mMTris，pH值7.5)加入到10微升重懸的探針中。把探針/雜交混合物(20微升)加入到固定的樣品上，以蓋玻片遮掩，并且用膠接劑或釘子密封蓋玻片。37℃溫育樣品8-48小時。在雜交之后，撤走蓋玻片，于37℃以2XSSC/50％去離子化甲酰胺洗滌樣品兩次；然后于37℃在2X SSC中洗滌兩次(每次5分鐘)。接著在顯微鏡下觀察樣品。B.引物原位標記(PRINS)傳統(tǒng)的原位雜交檢測方法的另一種變化的方法是引物(Primed)原位標記(PRINS)。經(jīng)PRINS的hTR檢測包括首先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)合成hTR的cDNA，接著用hTR-特異性寡核苷酸探針和鏈延長摻入標記核苷酸經(jīng)PRINS檢測?？梢杂酶鞣N方法完成hTR的RT反應。RT反應的一個實例是采用GeneAmp耐熱rTth逆轉(zhuǎn)錄酶RNA PCR試劑盒(Perkin Elmer)。按這種方法，將10微升RT混合物(10mMTris-HCI pH值8.3；90mMKCl；1mM MnCl2；200μM dNTPs；2.5UrTth DNA聚合酶；0.4μM反向引物[例如，R7G5′-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCAG-3’])置入固定并浸透的樣品上，用蓋玻片密封，用指甲油固定，用礦物覆蓋，在70℃溫育30分鐘。然后，通過在二甲苯中洗滌5分鐘和接著在100％EtOH中洗滌5分鐘除去礦物油。取下蓋玻片，用DepC水短暫洗滌，然后用100％EtOH洗滌，在空氣中干燥5分鐘。將10微升PRINS混合物(5％(V/V)甘油；10mMTris-HCl，pH值.3；100mM KCl；0.05％(W/V)吐溫20；0.75mMEGTA；2.5mMMgCl2；0.4μM正向引物[例如，U3b5’-GCCTGGGAGGGGTGGTGGCTATTTTTTG-3’]；200μMdA，dG，dCTP；110μMdTTP；90μM標記的dUTP)置入樣品上。用蓋玻片密封，用指甲油固定，用礦物油覆蓋，在70℃溫育30分鐘到3小時。然后將樣品在加熱到70℃的洗滌緩沖液(4X SSC；0.05％Tween20)中洗滌2分鐘。然后觀察信號。C.原位RT-PCRhTR的RT-PCR檢測包括經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(病毒逆轉(zhuǎn)錄酶或經(jīng)耐熱DNA聚合酶的內(nèi)在的RT活性)合成靶RNA的cDNA，接著經(jīng)原位PCR擴增靶cDNA。各種RT反應(包含在11.B部分中討論的RT方案)可以用于hTR的cDNA合成。此外，用于PRINS檢測方法中的相同的緩沖條件和引物也可以用于RT-PCR，但將最終的溫育改為70℃30分鐘到3小時。將樣品在熱循環(huán)儀上擴增30-40個循環(huán)(94℃/40秒鐘，55℃/90秒鐘)(參見11.B部分)。PCR后，將樣品在加熱到70℃的洗滌緩沖液(4X SSC；0.05％Tween20)中洗滌3次，每次2分鐘。然后觀察信號。
另一種可供選擇的方法是采用GeneAmp原位PCR系統(tǒng)1000和GeneAmp原位PCR核心試劑盒(Perkin Elmer)擴增起始RT反應產(chǎn)生的cDNA。
在固定并浸透的樣品上的原位RT-PCR的一個步驟可以用GeneAmp EZ rTth RNAPCR方案與GeneAmp原位PCR系統(tǒng)1000(Perkin Elmer)結(jié)合來完成。這一方法包括按照制造商的方案(GeneAmp原位PCR系統(tǒng)1000，Perkin Elmer)，將40-50微升EZ RNAPCR緩沖液混合物(50mM N-二甘氨酸；115mM醋酸鉀；8％(W/V)甘油，pH值8.2；300μM脫氧腺苷，脫氧鳥苷，dCTP；165μM dTTP；135μM標記的dUTP；5-10U rTth DNA聚合酶；2.5mM Mn(OAc)2；0.45-1μM htRNA特異性引物例如，R7和U3b)置入到在顯微鏡載玻片上的固定并浸透的樣品上，并且用硅化腈密封襯墊與夾子密封。然后將樣品放置在GeneAmp原位PCR儀中于94℃加熱120秒鐘，接著擴增30-40個循環(huán)(94℃45秒，60℃45秒)。擴增后，按以上所述洗滌和顯影樣品。
為了在PCR擴增期間減少可能起因于熒光標記的直接摻入的背景信號，可以使用間接檢測法，該方法為用非標記的dNTP進行PCR擴增，接著用對擴增產(chǎn)物特異性的標記雜交探針進行原位雜交。這種方法中，信號由以上描述的任何RT-PCR方法擴增(不用標記dNTP或引物)，擴增產(chǎn)物經(jīng)原位雜交檢測。D.應用產(chǎn)物延伸引物進行原位PCR原位PCR的成功取決于阻止細胞基質(zhì)內(nèi)的擴增產(chǎn)物的滲漏到胞外。因此，一般的實際情況是小于500bp的PCR產(chǎn)物是原位PCR所不期望的。為了阻止小于500bp的PCR產(chǎn)物從細胞基質(zhì)滲漏，通常采用將“大的”dNTP(例如，生物素，熒光標記物，地高辛配基標記的dUTP)摻入PCR產(chǎn)物。另一種阻止原位PCR中小產(chǎn)物滲漏的方法是將產(chǎn)物延伸引物摻入原位PCR方案。
所述方法包括在原位PCR中，使用在5’末端包含3-4個6bp重復順序的引物(例如，[5’-TTTCCC-3’]3-4]，接著是對靶特異性的序列(參見圖4引物1)，與合適的反向引物(引物2)以及僅由重復序列構(gòu)成的第三引物(引物3，例如，[5’-TTTCCC-3’]4)一起擴增特異性靶。由于引物3對靶PCR產(chǎn)物的3’端的交錯(staggered)結(jié)合，引物3的存在將延長PCR產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^降低起始PCR條件的退火溫度誘導PCR產(chǎn)物延長。
例如，如果在引物1中的靶序列的退火的溫度是60℃，樣品將最初被擴增15-20個循環(huán)(94℃/45℃和60℃/45℃)，然后是被擴增15-20個循環(huán)(94℃/45℃和50℃/45℃)。在第二PCR步驟中降低的退火溫度將有利于通過增加引物3對重復序列的交錯結(jié)合機會來產(chǎn)生延長的PCR產(chǎn)物。所形成的延長的PCR產(chǎn)物不易于從細胞基質(zhì)滲漏，由此，在原位PCR分析中，產(chǎn)生更好的信號保持。
實施例14非人靈長類端粒酶RNA組分為了說明可以用基于人類RNA組分的引物獲得其它哺乳動物端粒酶RNA組分序列，將人類序列PCR引物用于從松鼠猴(其被認為屬于遺傳上與人類最有差異的非人靈長類物種之一)基因組DNA擴增端粒酶RNA組分序列。
用引物F3b(5’-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG-3’)和H3+20(5’-CTCAAGGTCATCGCCAAGGT-3’)如所述擴增松鼠猴基因組DNA。觀察到一個單一DNA帶，接著將其克隆進載體pBluesc如tII SK(Stratagene San Diego，CA)。用采用反向通用引物(5’-AACAGCTATGACCATG-3’)，引物210-3’(5’-TCACGTCTCCTGCCAATTTGC-3’)或引物H3+20的PCR方法部分測序所形成的克隆，獲得的松鼠猴端粒酶RNA組分的部分序列是5′-GGCGCGCTTCCCTGAGCTGTGGACGTGCACCAGGACTCGGCTCACACATGCAGTTCGCTTTCCTGCTGGTGGGGGGACGCCGATCGTGGCCATCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAATCCCTAAATCTGACTGA-3′和5′-TTTTGAGAGATCATTAAGTATTTAATGAATATTTAGCTAGAAGATCTAAACGAAAATTCAAGTTGTGTTCCTTTAGTGGTCATCGGTTTATGCCGAAGGTTACAAATTTCTTCTTTGAAAAATTAGACCATTGGCGATGATCCTTGA-3′當與人類端粒酶RNA組分基因序列對比時，獲得下列對比結(jié)果，其中采用人類端粒酶RNA組分基因的編號慣例(連字號“-”是為了優(yōu)化序列對比所引入的間隙)1900人 CGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTC猴 GGCGCGCTTCCCTGAGCTGT-GGACGTGCACC-AGGACTCGGCTC1950人 ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCA猴 ACACATGCAGTTCGCTTTCCTGCTGGT-GGGGGGACGCCGATCGTGGCCA2000人 TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACT猴 TCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAATCCCTAAATCTGACT2050人 GACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAA猴 GA和 2300人 TTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGATCTA猴 TTTTGAGAGATCATTAAGTATTTAATGAATATTTAGCTAGAAGATCTA2350人 AATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGA猴 AACGAAAATT-CAAGTTGTGTTCCTTTAGTGGTCATCGGTTTATGCCGAA2400人 GGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACC-TTGGCGATGA-CCTTGAGC猴 GGTTACAAATTTCTTCTTTGAAAAATTAGACCATTGGCGATGATCCTTGA以上實施例描述了本發(fā)明的各個方面以及怎樣制備本發(fā)明的某些核酸。這些實施例無意于提供權(quán)利要求所包含的本發(fā)明的許多不同的實施方案的毫無遺漏的描述。
權(quán)利要求
1.一種基本上純化形式的哺乳動物端粒酶RNA組分。
2.一種哺乳動物端粒酶RNA組分，該組分包含基本上與以下序列相同的多核苷酸GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUCUAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGCUGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCUUCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUCGCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCCUGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGCGAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGUUCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGCGCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGCAGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCACCCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGCCAGUGUGCU.
3.權(quán)利要求1的RNA組分，該組分具有以下序列GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUCUAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGCUGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCUUCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUCGCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCCUGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGCGAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGUUCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGCGCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGCAGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCACCCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGCCAGUGUGCU.
4.一種基本上純化形式的寡核苷酸，該寡核苷酸包含與權(quán)利要求3的RNA組分的長度為10至500個核苷酸的鄰接序列相同或精確互補的序列。
5.權(quán)利要求4的寡核苷酸，該寡核苷酸是寡脫氧核糖核苷酸。
6.權(quán)利要求4的寡核苷酸，該寡核苷酸是寡核糖核苷酸。
7.權(quán)利要求5的寡核苷酸，該寡核苷酸在結(jié)合到入端粒酶RNA組分上時抑制或阻斷所述端粒酶活性。
8.權(quán)利要求5的寡核苷酸，該寡核苷酸是質(zhì)粒pGRN33。
9.權(quán)利要求5的寡核苷酸，該寡核苷酸是λ克隆28-1。
10.一種重組表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含權(quán)利要求5的寡核苷酸，并且還包含配置來驅(qū)動序列與所說寡核苷酸相同或互補的RNA的轉(zhuǎn)錄的啟動子。
11.權(quán)利要求10的重組表達質(zhì)粒，其中所說的質(zhì)粒在真核宿主細胞中起作用產(chǎn)生所說的寡核苷酸。
12.權(quán)利要求11的重組表達質(zhì)粒，其中所說的質(zhì)粒在原核宿主細胞中起作用產(chǎn)生所說的寡核苷酸。
13.權(quán)利要求11的重組表達質(zhì)粒，其中所說的質(zhì)粒包含人類端粒酶RNA組分的人類基因。
14.權(quán)利要求13的重組表達質(zhì)粒，其中所說的基因包含以下核苷酸序列5′-GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGTACTCAAGATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTGACAAGATTTAGTGCCTACTTAGATATGAAGGGGAAAGAAGGGTTTGAGATAATGTGGGATGCTAAGAGAATGGTGGTAGTGTTGACATATAACTCAAAGCATTTAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGCTAAAAACAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGCTATGAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAGAGGGAGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGACAGCGACAACTCCACGGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCCTGTCATTTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCCGGGTGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCGGGTGGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAACCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCATCCAGCCTGGGCGAAAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAATCGTTACAATTTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACTACTTTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGGGAGATTCAGTCCTTAAGATTAATAATGTAGTAGTTACACTTGATTAAAGCCATCCTCTGCTCAAGGAGAGGCTGGAGAAGGCATTCTAAGGAGAAGGGGGCAGGGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTGTAGTCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGTGATGATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTTCCTGTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGCAGAGGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAAAGAAGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGCAACGTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCCAACCAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCTTGGCCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGCAGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCATTTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCCCCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCCTGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTGGCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCCCGAACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCCACTGCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGCGAGGGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTCCCGCGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTCACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCATCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACTGACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAAAGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGTTCCTGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGTATTACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTCCCAAGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCATTTTTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGATCTAAATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGAGGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTGAGCAGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT-3’
15.一種用權(quán)利要求10的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的真核宿主細胞，所說質(zhì)粒編碼可與哺乳動物端粒酶蛋白質(zhì)組分相結(jié)合的RNA分子，產(chǎn)生能夠?qū)⒑塑账嶂貜蛦挝恍蛄刑砑拥蕉肆Ｉ系亩肆Ｃ富钚浴?br> 16.權(quán)利要求14的宿主細胞，其中所說的重復單位是5’-TTAGGG-3’。
17.權(quán)利要求14的宿主細胞，其中所說的重復單位不是5’TTAGGG-3。
18.權(quán)利要求15的宿主細胞，其中所說的RNA分子是GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUCUAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGCUGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCUUCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUCGCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCCUGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGCGAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGUUCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGCGCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGCAGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCACCCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGCCAGUGUGCU.
19.權(quán)利要求15的宿主細胞，其中所說的重組表達載體包括由以下序列限定的核苷酸序列5′-GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGTACTCAAGATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTGACAAGATTTAGTGCCTACTTAGATATGAAGGGGAAAGAAGGGTTTGAGATAATGTGGGATGCTAAGAGAATGGTGGTAGTGTTGACATATAACTCAAAGCATTTAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGCTAAAAACAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGCTATGAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAGAGGGAGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGACAGCGACAACTCCACGGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCCTGTCATTTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCCGGGTGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCGGGTGGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAACCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCATCCAGCCTGGGCGAAAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAATCGTTACAATTTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACTACTTTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGGGAGATTCAGTCCTTAAGATTAATAATGTAGTAGTTACACTTGATTAAAGCCATCCTCTGCTCAAGGAGAGGCTGGAGAAGGCATTCTAAGGAGAAGGGGGCAGGGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTGTAGTCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGTGATGATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTTCCTGTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGCAGAGGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAAAGAAGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGCAACGTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCCAACCAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCTTGGCCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGCAGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCATTTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCCCCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCCTGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTGGCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCCCGAACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCCACTGCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGCGAGGGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTCCCGCGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTCACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCATCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACTGACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAAAGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGTTCCTGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGTATTACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTCCCAAGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCATTTTTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGATCTAAATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGAGGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTGAGCAGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT.
20.一種哺乳動物端粒酶RNA組分，該組分包含基本上同源于權(quán)利要求3的RNA組分序列中的至少20個連續(xù)核苷酸序列相同的序列。
21.一種生產(chǎn)重組端粒酶的方法，所說方法包括用編碼權(quán)利要求19的RNA組分的重組表達載體轉(zhuǎn)化表達端粒酶蛋白質(zhì)組分的真核宿主細胞，并且在能夠表達和裝配蛋白質(zhì)組分和RNA組分以形成能夠?qū)⑿蛄刑砑拥饺旧wDNA端粒上的活性端粒酶分子的條件下培養(yǎng)用所說載體轉(zhuǎn)化的所說宿主細胞。
22.一種組合物，該組合物包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的基本上純化的人類端粒酶RNA組分和基本上純化的人類端粒酶蛋白質(zhì)。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所說的人類端粒酶RNA組分是從表達具有互補于人類端粒酶RNA組分序列的序列的重組多核苷酸的宿主細胞純化的。
24.權(quán)利要求22的組合物，該組合物還包含候選端粒酶調(diào)節(jié)劑。
25.一種用于鑒別突變哺乳動物端粒酶RNA組分多核苷酸的方法，該方法包括合成基本上與端粒酶RNA組分多核苷酸序列相同并且至少有一個核苷酸不同的突變端粒酶RNA組分多核苷酸；檢測定突變端粒酶RNA組分多核苷酸結(jié)合到基本上純化的哺乳動物端粒酶蛋白質(zhì)的結(jié)合。
26.一種鑒別候選端粒酶調(diào)節(jié)劑的方法，該方法包括進行異源二聚化或端粒酶活性測定，包括(1)包含一種與人類端粒酶RNA組分基本上相同并能結(jié)合人類端粒酶蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸，(2)一種基本上純化的人類端粒酶蛋白質(zhì)，和(3)一種藥劑；測定藥劑是否抑制人類端粒酶RNA和人類端粒酶蛋白質(zhì)的異源二聚化或端粒酶活性；鑒定抑制所述的異源二聚化或端粒酶活性的藥劑作為抑制端粒酶活性的候選端粒酶調(diào)節(jié)劑。
27.一種用于在人類細胞中抑制端粒酶活性的方法，該方法包括將一種外源多核苷酸轉(zhuǎn)移進細胞，該外源多核苷酸包含具有至少25個連續(xù)核苷酸的基本上相同于或基本上互補于人類端粒酶RNA序列的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄單位，所說多核苷酸序列可操作連接到促進可操作連接的多核苷酸在所說細胞中轉(zhuǎn)錄的異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列上。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所說的細胞是致瘤性細胞。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所說的外源多核苷酸包含以下序列或其補體5′-GGGUUGCGGAGGGAGGGUGGGCCUGGGAGGGGUGGUGGCCAUUUUUUGUCUAACCCUAACUGAGAAGGGCGUAGGCGCCGUGCUUUUGCUCCCCGCGCGCUGUUUUUCUCGCUGACUUUCAGCGGGCGGAAAAGCCUCGGCCUGCCGCCUUCCACCGUUCAUUCUAGAGCAAACAAAAAAUGUCAGCUGCUGGCCCGUUCGCCCCUCCCGGGACCUGCGGCGGGUCGCUGCCCAGCCCCCGAACCCCGCCUGGAGGCCGCGGUCGGCCGGGGCUUCUCCGGAGGCACCCACUGCCACCGCGAAGAGUUGGGCUCUGUCAGCCGCGGGUCUCUCGGGGGCGAGGGCGAGGUUCACCGUUUCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGUCCCGCGCGCGGCGCGAUUCCCUGAGCUAUGGGACGUGCACCCAGGACUCGGCUCACACAUGCAGUUCGCUUUCCUGUUGGUGGGGGGAACGCCGAUCGUGCGCAUCCGUCACCCCUCGCCGGCAGUGGGGGCUUGUGAACCCCCAAACCUGACUGACUGGGCCAGUGUGCU-3′
30.權(quán)利要求27的方法，其中所說的異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包含在人類細胞中為組成型活性的啟動子。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所說的外源多核苷酸是具有人類端粒酶RNA組分轉(zhuǎn)錄單位的腺病基因組。
32.權(quán)利要求27的方法，其中所說的轉(zhuǎn)錄單位產(chǎn)生基本上互補于人類端粒酶RNA組分的反義RNA。
33.權(quán)利要求27的方法，其中所說的外源多核苷酸包含以下序列或其補體5′-GATCAGTTAGAAAGTTACTAGTCCACATATAAAGTGCCAAGTCTTGTACTCAAGATTATAAGCAATAGGAATTTAAAAAAAGAAATTATGAAAACTGACAAGATTTAGTGCCTACTTAGATATGAAGGGGAAAGAAGGGTTTGAGATAATGTGGGATGCTAAGAGAATGGTGGTAGTGTTGACATATAACTCAAAGCATTTAGCATCTACTCTATGTAAGGTACTGTGCTAAGTGCAATAGTGCTAAAAACAGGAGTCAGATTCTGTCCGTAAAAAACTTTACAACCTGGCAGATGCTATGAAAGAAAAAGGGGATGGGAGAGAGAGAAGGAGGGAGAGAGATGGAGAGGGAGATATTTTACTTTTCTTTCAGATCGAGGACCGACAGCGACAACTCCACGGAGTTTATCTAACTGAATACGAGTAAAACTTTTAAGATCATCCTGTCATTTATATGTAAAACTGCACTATACTGGCCATTATAAAAATTCGCGGCCGGGTGCGGTGGCTCATACCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAAGCGGGTGGATCACTTGAGCCCTGGCGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAACCCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAACTAGCTGGGCGTGGTGGCAGGCGCCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGACACGAGAATCGCTTGAACCCGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCACTAGACTCCATCCAGCCTGGGCGAAAGAGCAAGACTCCGTCTCAAAAAAAAAAATCGTTACAATTTATGGTGGATTACTCCCCTCTTTTTACCTCATCAAGACACAGCACTACTTTAAAGCAAAGTCAATGATTGAAACGCCTTTCTTTCCTAATAAAAGGGAGATTCAGTCCTTAAGATTAATAATGTAGTAGTTACACTTGATTAAAGCCATCCTCTGCTCAAGGAGAGGCTGGAGAAGGCATTCTAAGGAGAAGGGGGCAGGGTAGGAACTCGGACGCATCCCACTGAGCCGAGACAAGATTCTGCTGTAGTCAGTGCTGCCTGGGAATCTATTTTCACAAAGTTCTCCAAAAAATGTGATGATCAAAACTAGGAATTAGTGTTCTGTGTCTTAGGCCCTAAAATCTTCCTGTGAATTCCATTTTTAAGGTAGTCGAGGTGAACCGCGTCTGGTCTGCAGAGGATAGAAAAAAGGCCCTCTGATACCTCAAGTTAGTTTCACCTTTAAAGAAGGTCGGAAGTAAAGACGCAAAGCCTTTCCCGGACGTGCGGAAGGGCAACGTCCTTCCTCATGGCCGGAAATGGAACTTTAATTTCCCGTTCCCCCCAACCAGCCCGCCCGAGAGAGTGACTCTCACGAGAGCCGCGAGAGTCAGCTTGGCCAATCCGTGCGGTCGGCGGCCGCTCCCTTTATAAGCCGACTCGCCCGGCAGCGCACCGGGTTGCGGAGGGAGGGTGGGCCTGGGAGGGGTGGTGGCCATTTTTTGTCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGCTCCCCGCGCGCTGTTTTTCTCGCTGACTTTCAGCGGGCGGAAAAGCCTCGGCCTGCCGCCTTCCACCGTTCATTCTAGAGCAAACAAAAAATGTCAGCTGCTGGCCCGTTCGCCCCTCCCGGGACCTGCGGCGGGTCGCTGCCCAGCCCCCGAACCCCGCCTGGAGGCCGCGGTCGGCCGGGGCTTCTCCGGAGGCACCCACTGCCACCGCGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCCGCGGGTCTCTCGGGGGCGAGGGCGAGGTTCACCGTTTCAGGCCGCAGGAAGAGGAACGGAGCGAGTCCCGCGCGCGGCGCGATTCCCTGAGCTATGGGACGTGCACCCAGGACTCGGCTCACACATGCAGTTCGCTTTCCTGTTGGTGGGGGGAACGCCGATCGTGCGCATCCGTCACCCCTCGCCGGCAGTGGGGGCTTGTGAACCCCCAAACCTGACTGACTGGGCCAGTGTGCTGCAAATTGGCAGGAGACGTGAAGGCACCTCCAAAGTCGGCCAAAATGAATGGGCAGTGAGCCGGGGTTGCCTGGAGCCGTTCCTGCGTGGGTTCTCCCGTCTTCCGCTTTTTGTTGCCTTTTATGGTTGTATTACAACTTAGTTCCTGCTCTGCAGATTTTGTTGAGGTTTTTGCTTCTCCCAAGGTAGATCTCGACCAGTCCCTCAACGGGGTGTGGGGAGAACAGTCATTTTTTTTTGAGAGATCATTTAACATTTAATGAATATTTAATTAGAAGATCTAAATGAACATTGGAAATTGTGTTCCTTTAATGGTCATCGGTTTATGCCAGAGGTTAGAAGTTTCTTTTTTGAAAAATTAGACCTTGGCGATGACCTTGAGCAGTAGGATATAACCCCCACAAGCTT-3′
34.一種用于人類疾病基因治療的多核苷酸，所說多核苷酸包含一種轉(zhuǎn)錄單位，該轉(zhuǎn)錄單位包含具有至少25個連續(xù)核苷酸的基本上相同于或基本上互補于人類端粒酶RNA序列的多核苷酸序列，該多核苷酸序列可操作連接到促進可操作連接的多核苷酸在所說細胞中轉(zhuǎn)錄的異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列上。
35.一種切割人類端粒酶RNA組分或人類端粒重復序列的核酶。
36.一種用于檢測患者中端粒酶相關(guān)疾病存在的方法，該方法包括以下步驟從患者分離細胞樣品；檢測細胞樣品中的人類端粒酶RNA組分RNA以確定診斷值；把診斷值與作為細胞樣品的相同類型的標準化正常細胞中人類端粒酶RNA組分表達的標準值比較；將比標準值高得足以指示病理狀態(tài)的存在的診斷值診斷為指示存在與端粒酶相關(guān)的疾病狀態(tài)。
37.一種用于檢測患者中致瘤性疾病存在的方法，該方法包括以下步驟從患者分離細胞樣品；檢測細胞樣品中的人類端粒酶RNA組分RNA以確定診斷值；將診斷值與在與細胞樣品相同類型的非致瘤細胞中表達的人類端粒酶RNA組分的標準值進行比較；將比標準值高得足以指示致瘤狀態(tài)的存在的診斷值診斷為指示存在致瘤狀態(tài)。
38.一種用于測定哺乳動物端粒酶RNA組分在細胞或細胞樣品中存在的方法，該方法包括用端粒酶RNA組分多核苷酸，端粒酶RNA組分引物，或者端粒酶RNA組分多核苷酸或端粒酶RNA組分引物的互補序列進行擴增或雜交。
39.一種包含一對哺乳動物端粒酶RNA組分多核苷酸PCR引物的組合物。
40.權(quán)利要求39的組合物，其中所說的引物由相應于或互補于人類端粒酶RNA組分基因序列的序列組成。
41.一種包含哺乳動物端粒酶RNA組分多核苷酸雜交探針的組合物。
42.權(quán)利要求41的組合物，其中所說的探針包含相應于或互補于人類端粒酶RNA組分基因序列的至少25個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了作為藥物，治療及診斷試劑有用的包含哺乳動物端粒酶RNA組分的核酸。
文檔編號A61P35/00GK1158617SQ95194952
公開日1997年9月3日 申請日期1995年7月6日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月7日
發(fā)明者布賴恩特·維爾蓬圖, 馮均力, 沃爾特·芬克, 威廉·H·安德魯斯 申請人:杰龍公司