專利名稱：：含有增加活性化合物生物利用度的膽汁鹽和緩沖劑的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種藥物組合物，特別是通常不易被胃腸道吸收的蛋白質(zhì)，肽類和其它活性分子的口服組合物。多年的醫(yī)療實踐已經(jīng)使用或建議使用許多用于治療或預(yù)防多種疾病或病癥的生物活性物質(zhì)。最為人知的但不是唯一的處方生物活性蛋白質(zhì)是胰島素，它被用于控制糖尿病。其它生物活性蛋白質(zhì)包括生長因子，白介素和降鈣素，非蛋白質(zhì)生物活性物質(zhì)包括低聚核苷酸和多糖類。一種最容易的給藥方法是口服。這種可以使用糖漿，酏劑，片劑，膠囊劑，顆粒劑，粉劑或其它任何常用制劑形式的給藥途徑通常是簡單且直接的，并且對于患者來說經(jīng)常是最少不便和痛苦的給藥途徑。然而，不幸的是，當(dāng)口服大多數(shù)這類物質(zhì)時，它們極不易被吸收。首先，蛋白質(zhì)類藥物和其它生物活性物質(zhì)的優(yōu)選給藥途徑是使這些物質(zhì)通過胃，而胃是許多物質(zhì)包括蛋白質(zhì)不適應(yīng)的環(huán)境。由于胃的酸性，水解和蛋白酶解環(huán)境已經(jīng)有效地將蛋白質(zhì)類物質(zhì)消化為氨基酸和寡肽類，然后進(jìn)行合成代謝，因此，很難想象，如果簡單地采用口服給藥，多種生物活性蛋白質(zhì)類物質(zhì)中能否有或能有幾種在通過胃時幸存下來而在小腸中被身體吸收。采用腸包衣制劑可使其不受胃酸環(huán)境的侵蝕，但盡管如此，相對大的分子如肽類和蛋白質(zhì)類也很難在小腸內(nèi)被身體吸收。結(jié)果，對許多糖尿病患者來說，許多蛋白質(zhì)類藥物必須經(jīng)非腸道給藥，即經(jīng)常用皮下，肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射方式給藥，因而，患者要承受由此帶來的所有不便，缺點和困難。這不是孤立的問題，因為需要用蛋白質(zhì)類物質(zhì)控制疾病是非常普遍的。例如，在世界上許多國家有大量的糖尿病患者，而且有許多其它疾病需要使用蛋白質(zhì)類化合物或其它大分子來治療。骨質(zhì)疏松癥是另一種能用蛋白質(zhì)(在此情況下使用降鈣素)治療的疾病，而且，蛋白生長激素可用于治療侏儒癥。因此，明顯地需要一種蛋白質(zhì)和其它大分子類藥物制劑，它們可以口服，并且提供可接受的活性物質(zhì)的生物利用度。已知，當(dāng)藥物活性化合物與某些膽汁鹽一起給藥時，它們的生物利用度增加?？麻_米(Kakemi)等人曾討論過這個問題，[《化學(xué)藥物通訊》(Chem.Pharm.Bull，)18(2)275-280(1970)]，他認(rèn)為當(dāng)多種物質(zhì)與?；悄懰猁}或甘膽酸鹽一起給藥時，能增加其生物利用度?？聨赚?Kojima)等人的進(jìn)一步實驗[《化學(xué)藥物通訊》(Chem.Pharm.Bull)，25(6)1243-1248(1977)]說明膽酸鈉能增加多種物質(zhì)的吸收，但也加速細(xì)胞膜部分的釋放。另外，在現(xiàn)有技術(shù)的一些其它文獻(xiàn)中是用膽汁鹽作為吸收增強(qiáng)劑，其中包括GB-A-22444918，它告訴我們，當(dāng)促生長素抑制素與膽酸衍生物如鵝膽酸或烏索脫氧膽酸一起給藥時，促生長素抑制素的生物利用度可以得到改善。據(jù)信，膽汁鹽改進(jìn)生物活性物質(zhì)的吸收是由于它們作用于表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜。細(xì)胞膜變得更容易透過可能是由于膽汁鹽的去垢作用從細(xì)胞膜上除去了脂，并且使它們變得更易流動。一種理論認(rèn)為，細(xì)胞膜增加通透性能使活性物質(zhì)穿過表皮細(xì)胞。此外，由于細(xì)胞膜通透性增加引起的細(xì)胞質(zhì)鈉或鈣水平的改變，可能會改變表皮細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，這將導(dǎo)致緊密連接完整性的變化，從而使活性物質(zhì)能夠穿過細(xì)胞間的間隙。不論何種機(jī)理，似乎都表明，增加細(xì)胞膜通透性會使吸收增加。然而，包含膽汁鹽的藥物制劑總是有問題，因為，當(dāng)使用需要量的膽汁鹽以改進(jìn)生物利用度時，它們具有不可接受的高毒性。有人已經(jīng)指出，與膽汁鹽接觸的表皮細(xì)胞的通透性增加會增加離子流進(jìn)或流出細(xì)胞。為使這些細(xì)胞保持存活，細(xì)胞內(nèi)離子如鈉，鉀和鈣離子的濃度必須保持在相對窄的范圍內(nèi)，并且該范圍可能是由于膽汁鹽的存在引起的離子流動增加而使細(xì)胞內(nèi)離子濃度超出細(xì)胞存活的范圍。因此，用膽汁鹽作為吸收增強(qiáng)劑的問題是它們總被認(rèn)為具有不可接受的低治療指數(shù)。在整個說明書中使用的術(shù)語“治療指數(shù)”指下列之比毒性劑量增強(qiáng)吸收劑量因此，能夠減小膽汁鹽毒性且有效地增加膽汁鹽在某點的治療指數(shù)是極為有用的，在該點膽汁鹽可被用于藥物組合物而沒有不可接受的毒副作用。本發(fā)明第一方面是提供一種藥物和/或獸醫(yī)用組合物，該組合物含有生物活性物質(zhì)，膽汁酸或鹽以及一種將腸內(nèi)pH調(diào)節(jié)到7.5-9的緩沖劑。WO-A-9012583公開了含有活性成份，膽汁鹽和膽汁附加成份的藥物組合物。然而該文獻(xiàn)認(rèn)為可能只有附加成份在這種組合物中是有用的，這種附加成份是附加膽汁鹽和膽汁脂，特別是磷脂。雖然碳酸氫鹽(本發(fā)明優(yōu)選的pH調(diào)節(jié)劑)是膽汁的一個組分，但在WO-A-9012583中沒有提到碳酸氫鹽，很明顯，碳酸氫鹽沒被指望作為含有膽汁鹽和藥物活性劑的組合物的有用成份。因此，碳酸氫鹽或其它pH調(diào)節(jié)劑在有效增加膽汁鹽治療指數(shù)方面的作用在該已有文獻(xiàn)中肯定沒有公開。應(yīng)該理解，在本發(fā)明中術(shù)語“膽汁鹽”和“膽汁酸”可以交換使用，因為，無論是鹽或其相應(yīng)的酸是否存在，都將取決于周圍環(huán)境的pH值。因此，本發(fā)明固體制劑既可以包含膽汁鹽，也可以包含膽汁酸。但是，如果藥用組合物經(jīng)常是使用膽汁酸，則其pH要能夠使膽汁酸在溶液中被轉(zhuǎn)化成鹽的形式。當(dāng)本發(fā)明組合物使用膽汁鹽時，優(yōu)選有適當(dāng)?shù)钠胶怆x子存在，如鈉或鉀。還可以使用，例如，銨離子，但不作為優(yōu)選離子。膽汁鹽是天然產(chǎn)生的表面活性劑。它們是一組具有基于膽甾烷酸的普通“骨架”結(jié)構(gòu)的化合物，在所有哺乳動物和高等蔬菜中都發(fā)現(xiàn)有膽甾烷酸。膽汁鹽可以是一，二或三羥基化物；它們通常包含一個3α-羥基，而其它羥基，最常見的是在C6，C7或C12，既可以在分子平面的上方(β)也可以在下方(α)。在這類化合物中所說膽汁鹽包括在帶有作為伯側(cè)鏈部分的羧基的兩親多元甾醇中。在哺乳動物中它們最普通的實例來自于膽甾醇代謝，而且被發(fā)現(xiàn)于膽汁，并以衍生物形式存在于整個腸道。在本說明書中，該術(shù)語也可以用于天然產(chǎn)生膽汁鹽的合成類似物，因為它們也表現(xiàn)出類似的生物作用?；蛴糜谖⑸镅苌肿樱缢箧滄咚峒捌溲苌?。膽汁鹽既可以是非結(jié)合的也可以是結(jié)合的。術(shù)語“非結(jié)合的”指其中伯側(cè)鏈有單個羧基的膽汁鹽，該羧基在端位且未被取代。非結(jié)合膽汁鹽的實例包括膽酸鹽，烏索脫氧膽酸鹽，鵝脫氧膽酸鹽和脫氧膽酸鹽。結(jié)合膽汁鹽是其中伯側(cè)鏈有一個取代羧基的膽汁鹽。取代基通常是通過氮原子連到膽汁鹽的羧基上的氨基酸衍生物。結(jié)合膽汁鹽的實例包括牛磺膽酸鹽，甘膽酸鹽，牛磺脫氧膽酸鹽和甘脫氧膽酸鹽。在單劑量制劑中膽汁酸的含量取決于所選的具體膽汁酸，以及膽汁酸在腸道內(nèi)水性流體中的溶解度和溶解范圍。對于鵝脫氧膽酸和大多數(shù)其它酸，該含量應(yīng)在10mg-1g范圍內(nèi)，優(yōu)選20-200mg，最優(yōu)選30-100mg。對于脫氧膽酸，考慮到它活性稍大，因此該含量的最大值一般不超過500mg。許多動物(尤其是人和其它哺乳動物)的腸道對中性以下的pH有天然適應(yīng)作用。本發(fā)明組合物含有將腸道的pH調(diào)節(jié)到pH7.5-9的緩沖劑。該試劑既可以依靠其本身的化學(xué)性質(zhì)或通過控制用量，但通常是依靠兩者“適應(yīng)性地”調(diào)節(jié)pH值。對腸道來說，最佳pH是調(diào)節(jié)到7.8-8.3的范圍。如果在本發(fā)明中可以成功地使用簡單的緩沖劑來調(diào)節(jié)腸道的pH為上述指定范圍，那么最好該pH調(diào)節(jié)劑還有緩沖腸道pH至上述范圍的能力。這樣就可以得到更長的持續(xù)藥效，這在許多場合是需要的。而且，緩沖劑有更大的適應(yīng)患者與患者本身腸道pH之間差別的能力，以及對任何單個患者觀察期間腸道pH的存活力；特別是，緩沖劑能起到安全屏障作用，保證患者腸道的pH在本發(fā)明制劑給藥過程中基本上不會變化到安全限以外。用于本發(fā)明調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)值的最佳試劑中的兩種是碳酸和碳酸氫根離子，它們可以分別使用，也可以結(jié)合使用。在下面的討論中，主要用碳酸氫鹽說明所涉及的原理，但同樣的原理適用于能對腸內(nèi)pH產(chǎn)生類似效果的其它試劑。直接確定將pH調(diào)節(jié)到預(yù)期范圍內(nèi)所必需的試劑用量是很困難的，因為腸內(nèi)pH可以在5-7變化，而且其中水含量以及其本身的緩沖能力也在變化，其作用是維持一個低的pH。因此，要確定控制pH的試劑的適當(dāng)用量就需要考慮到“最壞情況”。通過觀察將潛在pH調(diào)節(jié)劑加到pH6.0的50mMMES(嗎啉代乙磺酸)溶液中pH的變化情況，可以獲得一個指導(dǎo)用量。用于本發(fā)明的濃度是要將pH調(diào)節(jié)到7.5-9；優(yōu)選濃度是調(diào)節(jié)到7.8-8.3。(由于下面將要解釋的原因，pH調(diào)節(jié)劑的重量含量表示一般是在10ml液體中產(chǎn)生所需濃度的量)。下面列出分散在蒸餾水或MES中的不同濃度的優(yōu)選碳酸氫鹽所得到的pH值。碳酸氫鹽濃度水MES(摩爾數(shù))0.0028.866.420.0048.676.580.0088.636.860.0168.577.140.0318.557.400.0628.497.680.1258.417.930.2508.308.140.5008.168.051.0008.027.96因此，大多數(shù)情況下本發(fā)明碳酸氫鹽的最小用量約為0.045M，它在腸內(nèi)產(chǎn)生的pH約為7.5。對10ml分散液，這等價于40mg碳酸氫鈉。碳酸氫鈉的飽和水溶液(＜2M)的pH約為8.01。由此可見，不必考慮所用的優(yōu)選碳酸氫鹽的濃度，pH不會達(dá)到9.0以上。在某些情況下，膽汁酸本身的鹽溶液濃度已足以使pH升到適宜的水平，盡管其作用沒有優(yōu)選碳酸氫鹽強(qiáng)。因此，雖然不總需要，但用膽汁鹽本身或其它膽汁鹽作為pH調(diào)節(jié)劑也是可能的。組合物的緩沖能力越大，上述指定范圍內(nèi)的pH在腸內(nèi)保持的時間越長，進(jìn)而，本發(fā)明效果時間也將越長。適用于本發(fā)明的最佳緩沖劑中的兩種是碳酸和碳酸氫根離子，它們可以分別使用，也可以結(jié)合使用。如上所述，本發(fā)明組合物的優(yōu)點在于它們能夠有效地增加組合物中的膽汁鹽的治療指數(shù)。結(jié)合和非結(jié)合膽汁鹽都具有這種有益的功效，但結(jié)合膽汁鹽中碳酸或碳酸氫根離子的作用與非結(jié)合膽汁鹽中的稍有不同。對于結(jié)合膽汁鹽，足量碳酸氫鹽或碳酸鹽的存在使在細(xì)胞暴露于給定量的膽汁鹽時有效增加細(xì)胞膜通透性，并且不影響細(xì)胞存活力。這意味著為達(dá)到通透性給定的增加值可減少膽汁鹽的用量，即在不增加膽汁鹽副作用的同時增加細(xì)胞的通透性。對于碳酸鹽或碳酸氫鹽存在下的非結(jié)合膽汁鹽，在細(xì)胞暴露于膽汁鹽期間細(xì)胞通透性不增加，相反地，在暴露于膽汁鹽之后對細(xì)胞的毒性作用減小。這意味著在不影響細(xì)胞存活力的情況下膽汁鹽的給藥量在碳酸氫根或碳酸根離子存在下有所增加。總之，當(dāng)單位劑量組合物分散在適量液體(該液體存在于整個腸內(nèi))中時pH調(diào)節(jié)劑的用量將取決于該組合物對患者的給藥情況，即讓組合物分布在整個腸內(nèi)。雖然更精確的計算可以參照上述MES緩沖劑試驗，但pH調(diào)節(jié)劑的濃度至少約為0.01M。但是，對于優(yōu)選的碳酸鹽和碳酸氫鹽，碳酸氫鹽或碳酸鹽的濃度通常大于0.05M。雖然可以使用更高的濃度，如高至1M，但最優(yōu)選的濃度是至少約為0.1M。本發(fā)明組合物可能分布在小腸內(nèi)的具體長度為30cm，在這段長度的腸內(nèi)的液體含量可能約為10ml。但是，作為適宜長度被隨意選取的30cm應(yīng)該壓縮，而本發(fā)明不想對分布在小腸這段距離上的組合物加以限制。理由是想讓分布在腸內(nèi)的組合物保持較短或長得多的時間，例如，持續(xù)釋放的組合物可以更緩慢地分散，并因此可以在小腸內(nèi)分布更長的長度。這些組合物是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的，他們能夠很容易地確定最適合的組合物類型，以符合具體的治療要求。如果采用的組合物要分散于小腸內(nèi)較長或較短的一段距離，那么水的用量應(yīng)該相應(yīng)地增多或減少，所說的水中含有分散后達(dá)到指定濃度的單位劑量組合物。分散在水中以確定所需碳酸氫鹽最小用量的單位劑量將是在任何時間給患者給藥的劑量。對于液體制劑，這個劑量是醫(yī)生或藥劑師通過計算預(yù)先確定的劑量。對于固體制劑如片劑或囊劑，單位劑量通常是單個藥片或單個膠囊。但是，也有患者需要超過一片或一粒膠囊的情況，例如，如果需要大劑量活性物質(zhì)，則在這種情況下可將所需量的碳酸氫鹽分成兩個或多個片劑或膠囊。顯然，由于他們可以增加膽汁酸的溶解性，因此優(yōu)選碳酸根或碳酸氫根離子的其他有益作用還會提高。一般，膽汁鹽開始被轉(zhuǎn)化為pH為6.8或以下的相應(yīng)的酸，而該酸不溶于水溶液。由于緩沖劑有將本發(fā)明組合物緩沖到pH約為7.5或以上的作用，所以將出現(xiàn)溶解了的膽汁鹽而不是不溶性膽汁酸。當(dāng)溶解了的膽汁鹽在溶液中時，它能夠作用于上皮細(xì)胞，而這在固體酸形式時是不可能的。緩沖劑的濃度越高，得到滿意pH就越快，進(jìn)而膽汁酸或鹽溶解得越快；這將造成膽汁鹽在溶液中有較高的局部濃度，進(jìn)而導(dǎo)致更大效率地提高對生物活性物質(zhì)的通透性。還一個原因可能是由于碳酸根或碳酸氫根離子的特殊有益作用是以某種方式與碳酸氫鹽受體被表達(dá)在腸細(xì)胞表面這樣一個事實相聯(lián)系。但是，這種聯(lián)系的本質(zhì)——如果它確實存在的話——目前還不清楚，而且，在任何情況下，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)這種理論的修正或其它情況都不能限制本發(fā)明的效力。用碳酸氫鹽得到的結(jié)果通常是超乎尋常的。如上所述，可以認(rèn)為，碳酸氫根或碳酸根離子的作用之一是保證膽汁鹽能夠溶解。然而，鈣離子的存在增加了pH使膽汁鹽成為普通形式，而且，由于pH值低使得不溶的膽汁酸開始從溶液中沉淀出來。pH值根據(jù)具體的膽汁鹽而變化，但要能防止膽汁酸沉淀。由于這個原因，組合物中經(jīng)常含有鈣離子螯合劑是有利的。所說螯合劑包括二或三羧酸鹽(如檸檬酸鹽)，乙二胺四乙酸鹽(EDTA)，乙二醇雙(β-氨基乙醚)N，N，N’，N’-四乙酸鹽(EGTA)或肌醇六磷酸鹽，以及其它多磷化合物。當(dāng)用檸檬酸鹽作為鈣離子螯合劑時，最好它是能溶于水的形式。因此，盡管有些情況下也可以使用檸檬酸銨，但最適合的鹽是檸檬酸鈉或鉀。特別地，術(shù)語“生物活性物質(zhì)”包括藥物活性蛋白質(zhì)類物質(zhì)。該蛋白質(zhì)類物質(zhì)可以是純蛋白質(zhì)，或含有蛋白質(zhì)，例如，既含有蛋白質(zhì)又含有糖基的糖蛋白。該物質(zhì)既可用作人藥或獸藥用于治療或預(yù)防疾病或其癥狀，也可以用于整容和診斷。符合本發(fā)明并可用于口服或直腸給藥制劑的蛋白質(zhì)類生物物質(zhì)的實例包括蛋白質(zhì)或肽激素或激素釋放因子，如胰島素，降鈣素和生長激素，無論是人或動物的，還是半合成或全合成的；或其它生物活性肽，如人干擾素α，以及包括IL-1，IL-2，IL-3，IL-4和IL-5在內(nèi)的白介素。這些蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)的類似物和活性片段也可以使用。由于胰島素正常情況下很難在本發(fā)明預(yù)期的pH值溶解，但本發(fā)明不僅能使胰島素產(chǎn)生作用而且使其作用得很好，這一點非常重要。由于胰島素與膽汁鹽之間不期望的相互作用使胰島素似乎只能進(jìn)行分散，其中膽汁鹽的作用是使其在碳酸氫鹽或其它高pH溶液中穩(wěn)定。生物活性物質(zhì)也可以是低聚核苷酸，如反義低聚核苷酸及其可用于干擾核酸在病毒感染或癌細(xì)胞復(fù)制方面，或可用于校正不適宜細(xì)胞的增生的其它形式方面的類似物。多糖類如肝素也適用于本發(fā)明，因為多糖類是一種或多種蛋白質(zhì)，核酸或多糖類的結(jié)合形式。生物活性物質(zhì)的分子量應(yīng)該優(yōu)選不超過20,000Da。這是因為即使使用了本發(fā)明組合物使細(xì)胞的通透性有所增加，但要用大于這個量的活性分子來達(dá)到有效的生物利用度也絕非一件容易的事。因此，一般情況下，活性分子越小，其傳遞越容易。所以，優(yōu)選分子量小于10,000Da的生物活性分子，最優(yōu)選分子量小于5,000Da的。目前，生物活性物質(zhì)的用量本質(zhì)上依賴于它的內(nèi)在潛力。所有必須的是當(dāng)口服時在足量物質(zhì)存在的情況下仍表現(xiàn)出其具有所需的活性。對于藥品，給藥量要遵從醫(yī)生或臨床醫(yī)師的指導(dǎo)。其它可以使用的賦形劑包括用作填充劑的乳糖，用以保證組合物的均勻性和有助于制劑；Ac-di-solTM(交聯(lián)羥甲醚纖維素鈉)，一種有助于片劑崩解的膨脹劑；以及在制粒過程中常被用作粘合劑的聚乙烯基吡咯烷酮。除了液體劑型外通常還有固體劑型。固體劑型是優(yōu)選的，因為依靠腸包衣可以很容易地避免活性物質(zhì)在胃中被消化，而且，可以更容易地保證活性成份和膽汁鹽完整和同時到達(dá)小腸；這對于液體劑型實現(xiàn)起來要困難地多。如果組合物是固體劑型，為了長期存放，它應(yīng)該基本是干的。它可以是片，塊，粉，顆粒或微粒形式，并可以含有適當(dāng)?shù)?，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的填充劑或粘合劑。粉末，顆粒或微?？梢猿溆谀z囊。如上所述，膽汁酸或膽汁鹽都可以用于固體制劑。液體劑型有上述不足。但為了某種特殊需要本發(fā)明組合物也可制成液體形式，用腸包衣膠囊也許是糖漿或酏劑最好的給藥方式。為了迅速或持續(xù)釋放或?qū)⑦@兩種釋放形式結(jié)合，本發(fā)明組合物可制成相應(yīng)的形式。該組合物還可以被制成立即釋放，延遲釋放或脈沖釋放型制劑。組合物中所用緩沖劑的量取決于組合物的制劑方法和它在腸內(nèi)分散所需要的時間。因此，在緩釋制劑中緩沖劑的含量通常比即釋制劑中的用量要大得多?？傊?，本發(fā)明組合物可以用藥劑制備領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)通過簡單地混合各種組分來制備。本發(fā)明還涉及改進(jìn)活性物質(zhì)生物利用度的方法，該方法包括給患者聯(lián)合施用活性物質(zhì)，膽汁鹽和將腸內(nèi)pH調(diào)整到7.5-9的緩沖劑。因此，本發(fā)明第二個方面是提供膽汁鹽和調(diào)整腸內(nèi)ph至7.5-9的緩沖劑在制備某種制劑方面的用途，該制劑用于增加與其聯(lián)合使用的生物活性物質(zhì)的生物利用度。本發(fā)明第一方面的優(yōu)選特征已作了必要的說明。下面將用實施例和附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明，其中圖1表示Caco-2細(xì)胞體外暴露于平衡鹽或碳酸氫鹽溶液中的膽汁鹽之后的存活力比較，結(jié)果用膽汁鹽的最大耐受濃度mg/ml表示；圖2表示Caco-2細(xì)胞體外暴露于HBSS或碳酸氫鹽溶液中的結(jié)合膽汁鹽期間和之后的中性紅通透性比較，結(jié)果用膽汁鹽的最大耐受濃度mg/ml表示；圖3表示Caco-2細(xì)胞體外暴露于HBSS或碳酸氫鹽溶液中的非結(jié)合膽汁鹽期間和之后的中性紅通透性比較，結(jié)果用膽汁鹽的最大耐受濃度mg/ml表示；圖4曲線表示細(xì)胞染料用不同緩沖劑中的鵝脫氧膽酸鹽培養(yǎng)之后染料釋放的百分比；圖5曲線表示用不同緩沖劑中的鵝脫氧膽酸鹽培養(yǎng)之后線粒體活性減少的百分比；圖6涉及實施例3，它表示給豬注射(intrajejunally)給藥后pH和膽汁鹽濃度對鮭降鈣素的作用效果；及圖7涉及實施例4，它表示口服胰島素固體劑型與碳酸氫鹽結(jié)合使用時效率提高的程度。實施例所用溶液的制備以在DMEM(Dulbecco’sModifiedEagleMedium)中0.5mg/ml的濃度制備中性紅儲液，然后，在使用前用TCM(TissueCultrueMedium)或HBSS(HanksBalancedSaltSolution)稀釋成1∶10。制備的HBSS含有以下成份g/LmMCaCl2.2H2O0.191.26KCl0.405.37KH2PO40.060.44MgCl2.6H2O0.100.49MgSO4.7H2O0.100.41NaCl8.00133.33NaHCO30.354.17Na2HPO40.483.38D-葡萄糖1.005.56酚紅0.01.制備0.1M碳酸氫鈉蒸餾水溶液(緩沖溶液)。類似地制備乙酸鈉，硼酸鈉和碳酸鈉的0.1M蒸餾水溶液。它們都在實施例中作為緩沖液。在HBSS或在一種0.1M緩沖液中制備含有各種濃度膽汁鹽的試驗溶液。試驗下列膽汁鹽非結(jié)合膽汁鹽膽酸鈉，烏索脫氧膽酸鈉，鵝脫氧膽酸鈉，脫氧膽酸鈉；結(jié)合膽汁鹽?；悄懰徕c，甘膽酸鈉，牛磺脫氧膽酸鈉，甘脫氧膽酸鈉。以在蒸餾水中為5mg/ml的濃度制備MTT儲液，使用前用TCM稀釋成1∶10。實施例1和2中所述的試驗為已知試驗并符合英國標(biāo)準(zhǔn)(BS5750)。Caco-2細(xì)胞是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍認(rèn)為最合適的腸細(xì)胞體外模型。實施例1測定細(xì)胞毒性和細(xì)胞膜通透性的體外培養(yǎng)實驗細(xì)胞的制備在96孔微量滴定盤的每個孔中以200μl等分地加入濃度為1×105細(xì)胞/ml的Caco-2細(xì)胞懸浮液。在最外側(cè)的孔中加入200μl鹽水，以抵銷蒸發(fā)作用。在37℃含5％CO2的空氣中將細(xì)胞在高葡萄糖Dulbecco改性的伊格爾介質(zhì)(DMEM)組織培養(yǎng)基(TCM)中培養(yǎng)8天，并根據(jù)需要添加。然后用該細(xì)胞進(jìn)行最初損害或恢復(fù)的研究。A.評價毒性對最初損害的影響中性紅染料被活細(xì)胞所攝取。有較強(qiáng)通透性膜的細(xì)胞會失去染料使之進(jìn)入到培養(yǎng)基浴中。因此，在暴露于試驗物質(zhì)之后，測定殘留在細(xì)胞中染料的量即可直接評價細(xì)胞膜的通透性。因而，在此方法中，細(xì)胞首先被染色，然后用試驗物質(zhì)培養(yǎng)，最后測定用試驗物質(zhì)進(jìn)行的培養(yǎng)在暴露期間引起染料從細(xì)胞泄漏的程度。采用2小時暴露時間；該實驗根據(jù)以下方法進(jìn)行。從每個孔的細(xì)胞單層中除去TCM，代之以200μl染料。將眾盤在37℃的含5％CO2的空氣中培養(yǎng)2小時，然后檢查均勻染色和正常形態(tài)情況。從各孔中除去染料并代之以150μl適當(dāng)緩沖劑。再從第2列孔中除去緩沖劑并代之以150μl最大濃度的試驗溶液。在第3列各孔中加入150μl試驗溶液，通過反復(fù)抽吸達(dá)到均勻混合，再將其中150μl移到第4列孔中。對各盤重復(fù)這個過程以得到每行為另一行稀釋度兩倍的試驗物質(zhì)的稀釋液。各盤中有一行以HBSS作為對照組，另一行如果需要可作為緩沖液對照組。在37℃的5％CO2中培養(yǎng)細(xì)胞2小時，然后從各孔抽吸染料，并將各盤在含有1％冰醋酸的50％乙醇解吸附溶液(100μl/孔)中搖蕩培養(yǎng)20分鐘。為了給殘留在細(xì)胞中的染料定量，在550nm位置測量吸收度。將讀數(shù)值與緩沖液對照組比較來評價染料從細(xì)胞漏出的情況。因此，該試驗被用于暴露于膽汁鹽期間細(xì)胞膜通透性的測量。B.毒害后的恢復(fù)中性紅染料被活細(xì)胞攝取而非存活細(xì)胞不被染色。細(xì)胞膜透過性增加的細(xì)胞染料含量會減少。在不同方法中，細(xì)胞首先用試驗物質(zhì)培養(yǎng)，然后用染料培養(yǎng)，最后測定用試驗物質(zhì)進(jìn)行的培養(yǎng)在暴露之后引起細(xì)胞不能吸收/保留中性紅的程度。采用2小時暴露時間和在最佳生長物質(zhì)中的3小時恢復(fù)時間，在此期間染料被吸收。該實驗用以下方法從各孔中除去TCM并代之以150μl適當(dāng)緩沖液。從第2列孔中除去緩沖液并代之以150μl最大濃度的試驗溶液。在第3列各孔中加入150μl試驗溶液，通過反復(fù)抽吸達(dá)到均勻混合，再將其中150μl移到第4列孔中。對各盤重復(fù)這個過程以得到每行為另一行稀釋度兩倍的試驗物質(zhì)的稀釋液。各盤中有一行以HBSS作為對照組，另一行如果需要可作為緩沖液對照組。在37℃的5％CO2中培養(yǎng)細(xì)胞2小時。從各孔的細(xì)胞單層中除去上清液并代之以200μl染料。將各盤在37℃的含5％CO2的空氣中培養(yǎng)細(xì)胞3小時。然后從各孔中抽吸染料，并將各盤在含有1％冰醋酸的50％乙醇解吸附溶液(100μl/孔)中搖蕩培養(yǎng)20分鐘。在550nm位置測量吸收度。將讀數(shù)值與緩沖液對照組比較來評價活化攝取染料后中性紅從細(xì)胞漏出的情況。因此，該試驗被用于暴露于膽汁鹽后恢復(fù)期間內(nèi)細(xì)胞膜通透性的測量。碳酸氫鹽與HBSS對用膽汁鹽處理的細(xì)胞的作用效果比較列于表1和2及圖2和3。HBSS與碳酸氫鹽，乙酸鹽與硼酸鹽緩沖劑的作用效果比較列于圖4和5。應(yīng)該注意的是，對于HBSS，各組分的比例被調(diào)整到當(dāng)它們被溶解于蒸餾水時能使溶液的pH達(dá)到7.0-7.2。在小腸中，pH將低于這個值。相對而言，正如從以前所給的表可以看到的那樣，采用碳酸氫鹽可使pH接近于8.0，而且，在這里所述各實驗結(jié)束時也肯定如此。實施例2利用MTT染色測定線粒體活性進(jìn)而測定細(xì)胞毒性的體外培養(yǎng)試驗細(xì)胞的制備在96孔微量滴定盤的每個孔中以200μl等分地加入濃度為1×105細(xì)胞/ml的Caco-2細(xì)胞懸浮液。在各盤最外側(cè)孔中加入200μl鹽水，以抵銷蒸發(fā)作用。在37℃含5％CO2的空氣中將細(xì)胞在高葡萄糖DMEM組織培養(yǎng)基(TCM)中培養(yǎng)8天，并根據(jù)需要添加。線粒體活性試驗MTT是四唑金翁鹽，它是在存活細(xì)胞中通過線粒體脫氫酶的轉(zhuǎn)化形成的不溶性紫色晶體。死亡的細(xì)胞不影響該轉(zhuǎn)化過程。晶體的形成可用比色法進(jìn)行定量分析，并用來評價線粒體活性以及細(xì)胞存活性。MTT儲液，試驗溶液和緩沖液的制備如上所述。在此方法中，細(xì)胞首先用試驗物質(zhì)培養(yǎng)，然后用MTT培養(yǎng)，最后測定用試驗物質(zhì)進(jìn)行的培養(yǎng)改變了細(xì)胞線粒體活性的程度。采用2小時暴露時間和3小時恢復(fù)時間，在此期間加入染料。從各孔中除去TCM并代之以150μl適當(dāng)緩沖劑。從第2列孔中除去緩沖劑并代之以150μl最大濃度的試驗溶液。在第3列各孔中加入150μl試驗溶液，通過反復(fù)抽吸達(dá)到均勻混合，再將其中150μl移到第4列孔中。對各盤重復(fù)這個過程以得到每行為另一行稀釋度兩倍的試驗物質(zhì)的稀釋液。各盤中有一行以HBSS(參見實施例1)作為對照組，另一行如果需要可作為緩沖劑對照組。在37℃5％CO2中培養(yǎng)細(xì)胞2小時。從各孔的細(xì)胞單層中除去上清液并代之以200μlMTT。將各盤在37℃5％CO2中培養(yǎng)細(xì)胞3小時，然后用肉眼觀察以評價各孔的染色水平。從各孔中抽吸染料，并將各盤在含有0.1MHCl的無水異丙醇解吸附溶液(100μl/孔)中搖蕩培養(yǎng)20分鐘。在550-650nm處測量吸收度。將讀數(shù)值與緩沖劑對照組比較來評價線粒體活性的變化。以下對照組染色的減弱表明線粒體活性的減弱，而且是培養(yǎng)基中活性物質(zhì)毒性的充分體現(xiàn)。結(jié)果實施例1和2的結(jié)果列于表1和2，圖1至圖5說明在高pH緩沖劑存在下，用碳酸氫鹽作為具體實例時結(jié)合和非結(jié)合膽汁酸所發(fā)揮的作用。表1-在碳酸氫鹽或HBSS存在下Caco-2細(xì)胞在體外所能耐受的非結(jié)合膽汁鹽的最大濃度(mg/mL)</tables>表2-在碳酸氫鹽或HBSS存在下Caco-2細(xì)胞在體外所能耐受的結(jié)合膽汁鹽的最大濃度(mg/mL)表1和2表示實施例1和2所述實驗結(jié)果。表中第一列列出了試驗介質(zhì)中的膽汁鹽，試驗介質(zhì)本身列于第二列。試驗介質(zhì)是HBSS或0.1M碳酸氫鈉溶液。暴露于膽汁鹽期間和之后對中性紅測定的結(jié)果給出用mg/mL表示的膽汁鹽最大濃度，其中細(xì)胞通透性保持未受影響(與在沒有膽汁鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞相比)。在MTT一列的結(jié)果表示膽汁鹽的最大濃度，其中細(xì)胞的存活性在培養(yǎng)之后保持未受影響。表1給出了非結(jié)合膽汁鹽的實驗結(jié)果，而且它指出在各種情況下，在中性紅和MTT(暴露之后)兩列中通過碳酸氫鹽施加膽汁鹽比通過HBSS施加的數(shù)值大，盡管在中性紅(暴露期間)一列兩數(shù)的差別不大。這表示，在用膽汁鹽培養(yǎng)期間細(xì)胞的通透性在碳酸氫根離子存在時不會有大的改變，但是，由于培養(yǎng)之后細(xì)胞中出現(xiàn)毒性作用，所以需要更多的膽汁鹽。因此，這意味著在碳酸氫根離子存在時及毒性明顯地作用于細(xì)胞之前，這些細(xì)胞可以暴露于更多的膽汁鹽。因為可以增加膽汁鹽的用量，所以，培養(yǎng)之后細(xì)胞的通透性也可以在不受細(xì)胞存活性影響的情況下得以增加。表2給出了結(jié)合膽汁鹽的實驗結(jié)果，而且它指出在各種情況下，當(dāng)在碳酸氫鹽存在的情況下施用膽汁鹽時中性紅(暴露期間)列的數(shù)字增加，而中性紅和MTT(暴露之后)兩列中數(shù)值不變。這表示，在用膽汁鹽培養(yǎng)時，有碳酸氫鹽存在比沒有碳酸氫鹽存在需要較少的膽汁鹽來增加細(xì)胞的通透性。所列結(jié)果還表示，培養(yǎng)之后細(xì)胞的通透性和存活性不受膽汁鹽存在的影響。因此，在碳酸氫根離子存在時，可在培養(yǎng)期間用結(jié)合膽汁鹽，在不增加膽汁鹽濃度的情況下增加細(xì)胞的通透性，而且也不會反向影響細(xì)胞存活性。圖1至圖3是表1和2所列結(jié)果的圖形表示。圖1表示碳酸氫鹽對用膽汁鹽溶液培養(yǎng)的細(xì)胞的存活性的作用效果，是MTT存活性試驗的測量結(jié)果。對于結(jié)合膽汁鹽，可以看到，碳酸氫鹽的存在不影響用膽汁鹽培養(yǎng)之后的細(xì)胞的存活性，而對于非結(jié)合膽汁鹽，膽汁鹽的濃度在碳酸氫鹽存在時明顯增加，用這樣的膽汁鹽處理的細(xì)胞不影響它們的存活性。圖2表示在用結(jié)合膽汁鹽培養(yǎng)期間和之后通過中性紅測定測量的細(xì)胞存活性?？梢钥闯?，在暴露期間，在0.1M碳酸氫鹽存在時，為增加細(xì)胞存活性所需要的膽汁鹽的用量低于HBSS存在時。但是，在暴露之后，細(xì)胞的通透性轉(zhuǎn)為正常。這意味著，對于給定量的膽汁鹽，細(xì)胞通透性在暴露期間可以明顯增加。然而，在暴露之后，與對照組(用膽汁鹽和HBSS而非碳酸氫鹽培養(yǎng)的細(xì)胞)相比細(xì)胞的存活性保持未變。圖3類似于圖2，是非結(jié)合膽汁鹽存在情況下的結(jié)果。在這種情況下，可以看到，在暴露于膽汁鹽期間碳酸氫鹽并沒有非常清晰地影響細(xì)胞的通透性，而是在暴露之后，而且，在不引起細(xì)胞通透性增加的情況下可以施用的膽汁鹽的最大濃度增加，因而，在碳酸氫鹽存在時細(xì)胞通透性明顯減小。圖4的曲線表示在中性紅測定中將染色細(xì)胞暴露于不同pH值的膽汁鹽后染料釋放的百分比，以鵝脫氧膽酸鹽為例。該曲線相當(dāng)明確得到表示從用pH在7.5以上培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞中釋放的染料要少得多，而且，這種對細(xì)胞短期和長期恢復(fù)預(yù)見性的培養(yǎng)在升高pH的情況下會更好。同樣，圖5表示在升高pH的條件下毒性明顯減小，該圖表示在用不同緩沖液中的鵝脫氧膽酸鹽培養(yǎng)之后線粒體活性減少的百分比。pH7.0培養(yǎng)基的制備是將含有3％(v/v)1MHEPES(羥乙基亞丙基乙磺酸)的HBSS溶液調(diào)至pH7.0。pH7.5培養(yǎng)基的制備是將含有50mMTRIZMATM的HBSS溶液調(diào)至pH7.5。pH8.0培養(yǎng)基的制備是將含有50mMTRIZMATM的HBSS溶液調(diào)至pH8.0。pH8.5培養(yǎng)基的制備是將含有50mMTricine的HBSS溶液調(diào)至pH8.5。該結(jié)果還表明，用0.1MpH為8.0的碳酸氫鹽可以觀察到此現(xiàn)象，但僅用pH為7.5的HBSS則觀察不到。在下列實施例所報告的體內(nèi)實驗中可以證明所用碳酸氫鹽的濃度在腸內(nèi)環(huán)境中確實具有所需要的作用。實施例3體內(nèi)效率研究——鮭降鈣素(SalmonCalcitonin)先將用于研究的豬(大白×大白/長白豬，雄性，65kg)麻醉后進(jìn)行準(zhǔn)備性手術(shù)，10天后將兩個電極經(jīng)中央隱靜脈動脈插入背側(cè)主動脈。將內(nèi)徑約1.6-2mm的插管插入空腸。隨意給這些豬喂些水，禁食一夜，然后每天早晚喂食兩次。在治療的那些天禁止早晨喂食，直到取得最后的血樣之后。將藥劑鮭降鈣素(sCT)經(jīng)插管滴注到空腸內(nèi)，然后用溫消毒水沖洗。給藥前后取血樣多次，每次8ml，并分成兩部分。一部分允許在室溫凝結(jié)，抽取血清并儲存于-20℃，以備后用。另一部分被轉(zhuǎn)移到肝素化管，并加入4000kiu(iu為國際單位)抑肽酶。離心之后傾析血漿并貯存于-20℃。用鈣敏感螯合劑偶氮胂III絡(luò)合之后比色法測量血清鈣濃度。用9只豬進(jìn)行研究。分3天給藥，每次相隔至少一天，以隨機(jī)三路交叉方式，因此，所有的豬都接受三次治療。每次的治療劑可以僅含溶解于2ml磷酸鹽緩沖鹽水的625iusCT，pH為7.5，或與25mg鵝脫氧膽酸鈉(_Δ_)一起使用，或與50mg鵝脫氧膽酸鈉(_■_)一起使用，或與50mg鵝脫氧膽酸鈉一起使用，然后用鹽酸將pH降至6.5(_×_)。結(jié)果示于圖6，以血漿鈣濃度與時間相對于降鈣素的變化表示。由此可見，膽汁鹽在提高降鈣素攝取量方面的效率依賴于所含膽汁鹽的濃度，以及給藥時的pH值。實施例4體內(nèi)效率研究——胰島素用實施例3所用相同方法對豬進(jìn)行預(yù)處理。用標(biāo)準(zhǔn)酶分析方法對血樣的葡萄糖進(jìn)行分析。用2ml含200iu胰島素的溶液(在pH5時加肽至該溶液)，或用胰島素固體制劑，以及用或不用碳酸氫鈉對動物給藥。每個藥劑含有300mg上述制劑，并能在使用前迅速懸浮于2ml磷酸鹽緩沖鹽水溶液。兩種制劑的組分以重量-重量形式列于下表。無碳酸氫鹽(wt/wt)有碳酸氫鹽(wt/wt)牛胰島素2.4牛胰島素2.4鵝脫氧膽酸16.7鵝脫氧膽酸16.7乳糖74.9乳糖66.6Ac-di-sol3.0Ac-di-sol3.0聚乙烯基吡咯烷酮3.0聚乙烯基吡咯烷酮3.0碳酸氫鈉8.3pH＜7.0pH＞7.5結(jié)果示于圖6，以血漿葡萄糖濃度與時間相對于胰島素的變化表示。由此可見，膽汁酸鵝脫氧膽酸在提高通過腸的肽攝取量方面的效率由于固體藥劑中碳酸氫鈉的存在而明顯改善。權(quán)利要求1.一種藥用和/或獸用組合物，包括生物活性物質(zhì)，膽汁酸或鹽，以及將腸內(nèi)pH調(diào)至7.5-9的緩沖劑。2.權(quán)利要求1的組合物，其中緩沖劑將腸內(nèi)pH調(diào)至7.8-8.3。3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中存在可溶性平衡離子。4.權(quán)利要求1，2或3的組合物，其中膽汁酸或鹽是非結(jié)合的。5.權(quán)利要求4的組合物，其中膽汁酸或鹽是鵝脫氧膽酸或烏索脫氧膽酸或它們的鹽。6.權(quán)利要求1，2或3的組合物，其中膽汁酸或鹽是結(jié)合的。7.權(quán)利要求1-6中任一組合物，其中pH調(diào)節(jié)劑適于將腸內(nèi)pH調(diào)整到所述范圍。8.權(quán)利要求7的組合物，其中緩沖劑含有碳酸根和/或碳酸氫根離子。9.權(quán)利要求8的組合物，其中碳酸氫根或碳酸根的濃度至少約為0.1M。10.權(quán)利要求8或9的組合物，其中含有當(dāng)將單位劑量組合物分散于10ml水中時足以使碳酸氫根或碳酸根濃度至少達(dá)到0.045M的碳酸氫根或碳酸根離子。11.權(quán)利要求1-10中任一組合物，其中pH調(diào)節(jié)劑本身含有膽汁酸或鹽。12.權(quán)利要求1-11中任一組合物，其中包括鈣離子螯合劑如二-或三-羧酸鹽，例如，檸檬酸鹽，乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇雙(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)，或多磷酸鹽如肌醇六磷酸鹽。13.權(quán)利要求1-12中任一組合物，其中生物活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)如胰島素，降鈣素，生長激素，干擾素，白介素或它們中任一個的活性片段。14.權(quán)利要求1-12中任一組合物，其中生物活性物質(zhì)是低聚核苷酸(或其類似物)或多糖類。15.權(quán)利要求1-14中任一組合物，其中生物活性物質(zhì)的分子量小于約20,000Da。16.權(quán)利要求15的組合物，其中生物活性物質(zhì)的分子量小于約10,000Da。17.權(quán)利要求1-16中任一組合物，被制成干燥固體制劑。18.權(quán)利要求17的組合物，其為片劑，丸劑，粉劑，顆粒或微粒形式。19.膽汁鹽和將腸內(nèi)pH調(diào)至7.5-9的緩沖劑的用途，同時使用緩沖劑可以增加生物活性物質(zhì)的生物利用度。20.一種改善活性物質(zhì)生物利用度的方法，該方法包括給患者在施用活性物質(zhì)的同時共同施用膽汁鹽和將腸內(nèi)pH調(diào)至7.5-9的緩沖劑。21.一種改善膽汁鹽(與其作為通透性增強(qiáng)劑提高活性物質(zhì)在腸內(nèi)的能力有關(guān))有效治療指數(shù)的方法，該方法包括給患者在施用活性物質(zhì)的同時共同施用膽汁鹽和將腸內(nèi)pH調(diào)至7.5-9的緩沖劑。全文摘要本發(fā)明組合物含有膽汁鹽和可將腸內(nèi)pH調(diào)整到7.5-9的緩沖劑如碳酸鹽或碳酸氫鹽，它能夠在使毒性副作用(膽汁鹽通常都伴有毒副作用)最小的同時增加活性分子的生物利用度。文檔編號A61K38/28GK1163573SQ9519483公開日1997年10月29日申請日期1995年8月25日優(yōu)先權(quán)日1995年8月25日發(fā)明者R·R·C·紐申請人:科特克斯有限公司