專利名稱：：用于端粒酶抑制的改性寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于端粒酶抑制的化合物。更具體地，本發(fā)明提供了靶向端粒酶RNA成分的并具有提高的細(xì)胞吸收特性的改性寡核苷酸。
背景技術(shù)：
：用于治療應(yīng)用的寡核苷酸的發(fā)展在核酸的醫(yī)藥用途方面存在很大興趣。例如，在潛在的治療應(yīng)用方面，反義、核糖酶、核糖適體(aptamer)和RNA干擾(RNAI)技術(shù)全部得到了發(fā)展。核酸尤其是寡核苷酸用于體內(nèi)傳送的設(shè)計(jì)需要考慮各種因素包括結(jié)合強(qiáng)度、目標(biāo)特異性、血清穩(wěn)定性、對核酸酶的抗性和細(xì)胞吸收。為了生產(chǎn)具有適于體內(nèi)使用特征的寡核苷酸，已經(jīng)提出了多種方法，如改性的主鏈化學(xué)(modifiedbackbonechemistry)、傳送載體中的配方以及與各種其它部分的共軛。具有適于全身傳送特征的療用寡核苷酸特別有益。具有改性化學(xué)主鏈的寡核苷酸評述于Micklefield，Backbonemodificationofnucleicacids:synthesis,structureandtherapeuticapplications,CumMed.Chem.,8(10):1157-79,2001禾卩Lyer等，Modifiedoligonucleotides—synthesis,propertiesandapplications,Curr.Opin.Mol.Ther.,1(3):344-358,1999。改性的主鏈化學(xué)的實(shí)例包括-肽核酸(PNA)(參見Nielsen,MethodsMol.Biol"208:3-26，2002)，-封閉的核酸(LNA)(參見Petersen&Wengel,TrendsBiotechnol.,21(2):74-81,2003)，—〖流ft石粦酸酉旨('參見Eckstein,AntisenseNucleicAcidDrugDev.,10(2):117-21,2000)，—甲基膦酸酯(參見Thiviyanathan等，Biochemistry,41(3):827-38，2002)—氨基磷酸酯(參見Gryaznov，Biochem.Biophys.Acta，1489(1):131-0,1999;Pmzan等，NucleicAcidsRes.,30(2):559-68,2002)，和一硫代氣基憐酸酉旨(參見Gryaznov等，NucleosidesNucleotidesNucleicAcids,20(4-7):401-10,2001;Herbert等，Oncogene,21(4):638-42,2002)。已經(jīng)報(bào)道了這些類型寡核苷酸中每種的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。例如，肽核酸(PNA)呈現(xiàn)良好的核酸酶抗性和結(jié)合強(qiáng)度，但是在測試培養(yǎng)物中細(xì)胞吸收有所降低；硫代磷酸酯展示了良好的核酸酶抗性和可溶性，但是通常作為P-手性混合物合成并顯示出幾種序列非特異性的生物效應(yīng)；甲基膦酸酯顯示了良好的核酸酶抗性和細(xì)胞吸收，但是通常也作為P-手性混合物合成并具有降低的雙鏈體穩(wěn)定性。N3'—P5'氨基磷酸酯核苷酸間鍵合顯示了良好的結(jié)合特性、核酸酶抗性和可溶性(Gryaznov禾口Letsinger,NucleicAcidsResearch,20:3403-3409,1992;Chen等，NucleicAcidsResearch,23:2661-2668,1995;Gryaznov等，Proc.Natl.Acad.Sci.，92:5798-5802，1995;Skorski等，Proc.Natl.Acad.Sci.,94:3966-3971,1997)。然而，相對于天然氨基磷酸酯對應(yīng)物，它們還顯示出升高的酸不穩(wěn)定性(Gryaznov等，NucleicAcidsResearch,24:1508-1514，1996)。寡核苷酸的酸穩(wěn)定性對于理想使用寡核苷酸試劑來作為口服治療劑是一個(gè)重要性質(zhì)。將硫原子加入N3'—P5'硫代氨基磷酸酯寡核苷酸主鏈提供了升高的酸穩(wěn)定性。和許多其它療用化合物一樣，寡核苷酸的多陰離子性質(zhì)會(huì)降低化合物穿過脂質(zhì)膜的能力，限制細(xì)胞吸收的效率。已經(jīng)提出各種解決方法來提高治療劑的細(xì)胞吸收，包括配制于脂質(zhì)體中(對于評述，參見PedrosodeLima等，CurrMedChem，10(14):1221-1231,2003和Miller,CurrMedChem.,10(14):1195-211，2003)以及與親脂部分共軛。后一方》去白勺實(shí)例包括U.S.專禾UNo.5，411,947(Methodofconvertingadrugtoanorallyavailableformbycovalentlybondingalipidtothedrag);U.S.專禾l)No.6,448,392(Lipidderivativesofantiviralnucleosides:liposomalincorporationandmethodofuse);U.S.專禾UNo.5,420,330(Lipo-phosphoramidites);U.S.專禾UNo.5，763，208(Oligonucleotidesandtheiranalogscapableofpassivecellmembranepermeation);Gryaznov&Lloyd，NucleicAcidsResearch,21:5卯9-5915,1993(Cholesterol-conjugatedoligonucleotides);U.S.專禾UNo.5,416,203(Steroidmodifiedoligonucleotides);WO90/10448(Covalentconjugatesoflipidandoligonucleotide);Gerster等，AnalyticalBiochemistry,262:177-184(1998)(QuantitativeanalysisofmodifiedantisenseoJigonucleotidesinbiologicalfluidsusingcationicnanoparticlesforsolid-phaseextraction);Bennett等，Mol.Pharmacol.,41:1023-1033(1992)(Cationiclipidsenhancecellularuptakeandactivityofphophorothioateantisenseoligonucleotides);Manoharan等，AntisenseandNucleicAcidDrugDev.,12:103-128(—2002)■(Oligonucleotideconjugatesaspotentialantisensedrugswithimproveduptake,biodistribution,targeteddeliveryandmechanismofaction);禾口Fiedler等，Langenbeck，sArch.Surg.,383:269-275(1998)(Growthinhibitionofpancreatictumorcellsbymodifiedantisenseoligodeoxynucleotides)。作為治療劑目標(biāo)的端粒酶端粒酶是催化端粒重復(fù)序列添加至染色體末端的核糖蛋白。參見Blackburn,1992,Ann.Rev.Biochem.,61:113-129。存在大量描述端粒、端粒酶、細(xì)胞衰老和癌癥之間關(guān)聯(lián)的文獻(xiàn)(對于綜述，參見，Oncogene,21巻，2002年1月，其是聚焦于端粒酶雜志的完整文獻(xiàn))。因此端粒酶已經(jīng)鑒定為癌癥治療劑的極佳目標(biāo)(target)(參見Lichsteiner等，AnnalsNewYorkAcad.Sci.,886:1-11，1999)。編碼人端粒酶的蛋白質(zhì)和RNA部分的基因已經(jīng)得到了克隆和測序(各自參見U.S.專利No.6，261,836和5,583,016)并在研究端粒酶抑制劑中花費(fèi)了許多努力。迄今為止鑒定的端粒酶抑制劑包括小分子化合7物和寡核苷酸。各種出版物描述了靶向編碼端粒酶蛋白質(zhì)部分的mRNA(其的人形式稱為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和hTERT)或端粒酶全酶的RNA部分(其的人形式稱為人端粒酶RNA或hTR)，來使用寡核苷酸抑制端粒酶。通常認(rèn)為靶向hTERTmRNA的寡核苷酸作為常規(guī)反義藥物，因?yàn)樗鼈兣cmRNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解，并因此防止了hTRET蛋白質(zhì)的產(chǎn)生(參見，例如，U.S.專利No.6,444,650)。設(shè)計(jì)耙向hTR的特定寡核苷酸來結(jié)合存在于端粒酶全酶屮的hTR分子，并因此破壞酶的功能(參見，例如，U.S.專利No.6，548,298)。描述設(shè)計(jì)來降低或消除端粒酶活性的各種寡核苷酸的出版物實(shí)例包括U.S.專禾廿No.6,444,650(Antisensecompositionfordetectingandinhibitingtelomerasereversetranscriptase);U.S.專禾UNo.6,331,399(Antisenseinhibitionoftertexpression);U.S.專禾JNo.6,548，298(Mammaliantelomerase);VanJanta-Lipinski等，NucleosidesNucleotides,18(6-7):1719-20,1999(ProteinandRNAofhumantelomeraseastargetsformodifiedoligonucleotides);Gryaznov等，NucleosidesNucleotidesNucleicAcids,20:401-410,2001(Telomeraseinhibitors-oligonucleotidephosphoramidatesaspotentialtherapeuticagents);Herbert等，Oncogene,21(4):638-42,2002(OligonucleotideN3，—P5'phosphoramidatesasefficienttelomeraseinhibitors);Pruzan等，NucleicAcidsResearch,30(2):559-568,2002(Allostericinhibitorsoftelomerase:oligonucleotideN3'-P5'phosphoramidates);PCT申請WO011/18015(OligonucleotideN3'-P5'thiophosphoramidates:theirsynthesisanduse);禾口Asai等，CancerResearch,63:3931-3939,2003(Anoveltelomerasetemplateantagonist(GRN163)asapotentialanticanceragent)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的組合物和方法涉及端粒酶抑制化合物，包括寡核苷酸和至少一個(gè)共價(jià)共軛的脂質(zhì)基團(tuán)。與未改性的寡核苷酸相比較，本發(fā)明的化合物具有優(yōu)良的細(xì)胞吸收特性。這意味著與未改性的形式相比較，使用較小量的共軛寡核苷酸就能獲得相等的生物效應(yīng)。當(dāng)應(yīng)用于人的治療情況吋，這可以轉(zhuǎn)換成降低的毒性風(fēng)險(xiǎn)和成本節(jié)約。本發(fā)明的化合物抑制細(xì)胞(包括癌細(xì)胞)中的端粒酶，其所得到的效果抑制了細(xì)胞的增殖。因此，本發(fā)明化合物的主要應(yīng)用是作為癌癥治療劑，和本發(fā)明提供了可以如此使用的化合物的藥物制劑。本發(fā)明的化合物可以通過以下通式進(jìn)行表示O-(x-L)n其中O表示寡核苷酸，x是任意的連接物(linker)基團(tuán)，L表示脂質(zhì)部分和n是l-5的整數(shù)。通常，薩1或2，但當(dāng)n》時(shí)，每個(gè)脂質(zhì)部分L是可獨(dú)立選擇的。脂質(zhì)部分通常在3'和5'端之一(或如果11=2，每個(gè))共價(jià)連接寡核苷酸，但也可以連接于其它的位點(diǎn)，包括一個(gè)或多個(gè)堿基。脂質(zhì)基團(tuán)L通常是脂族烴或脂肪酸，包括烴和脂肪酸的衍生物，實(shí)例是具有14-20個(gè)碳的飽和直鏈化合物，如肉豆蔻酸(C14，也稱為十四酸)、棕櫚酸(C16，也稱為十六酸)和硬脂酸(C18，也稱為十八酸)及其相應(yīng)的脂族烴形式，十四垸、十六烷和十八烷，以及衍生物如胺和酰胺衍生物?？梢允褂玫钠渌线m脂質(zhì)基團(tuán)的實(shí)例是固醇，如膽固醇，和取代的脂肪酸和烴，尤其是這些基團(tuán)的多-氟化形式。寡核苷酸成分O可以是核糖核酸或脫氧核糖核酸或其改性形式，和連接核酸堿基的鍵合可以由任何合適的化學(xué)物質(zhì)形成，包括但不限于磷酸二酯；磷酸三酯；甲基磷酸酯；P3'—N5'氨基磷酸酯；N3'—P5'氨基磷酸酯；N3'—P5'硫代氨基磷酸酯；和硫代磷酸酯連接物。優(yōu)選N3'—P5'氨基磷酸酯和N3'—P5'硫代氨基磷酸酯。寡核苷酸部分O的序列包括至少一個(gè)與端粒酶RNA部分序列的選定"靶向"片段互補(bǔ)(優(yōu)選精確互補(bǔ)(exactlycomplementary))的序列片段。在特定實(shí)施方案中，寡核苷酸O部分的序列含有與人端粒酶RNA部分，hTR(提供于SEQIDNO:l中的序列)的以下片段之一中的序列互補(bǔ)的序列片段46-56，137-196，290-319和350-380。O部分中與hTR片段精確互補(bǔ)的序列長度優(yōu)選至少為5個(gè)堿基，更優(yōu)選至少8個(gè)堿基，甚至更優(yōu)選至少10個(gè)堿基?？梢詫⒉慌chTR精確互補(bǔ)，卻可以提供額外有利功能的額外序列片段加入O部分。木發(fā)明的實(shí)例化合物包括以下結(jié)構(gòu)中所示的那些，其中o部分具有N3'—P5'硫代氨基磷酸酯核苷酸間鍵合且與hTR(SEQIDNO:])的堿基42-54精確互補(bǔ)。在第一個(gè)實(shí)例結(jié)構(gòu)中，L，脂質(zhì)部分是棕櫚酰胺(源自棕櫚酸)，通過氨基甘汕連接物與寡核哲酸O的5'硫代磷酸酯基團(tuán)共軛s0HOHIIITACK3G丌AGACAAOH在第二個(gè)實(shí)例結(jié)構(gòu)中，L通過寡核苷酸的3'氨基與棕櫚酰胺共軛:TAGGGTTASACAA""NH與相應(yīng)的未改性寡核苷酸相比較，本發(fā)明的化合物(包括這些實(shí)例化合物)顯示出具有優(yōu)良的細(xì)胞吸收特性，因此是細(xì)胞端粒酶活性的更有效抑制劑。作為這些特性的結(jié)果，本發(fā)明的化合物是癌細(xì)胞增殖的高效抑制劑。本發(fā)明的化合物還可以用于抑制端粒酶酶活性的方法。這樣的方法包括使端粒酶與本發(fā)明的化合物接觸。本發(fā)明的化合物還可以用于抑制可表達(dá)端粒酶的細(xì)胞中的端粒酶，從而抑制這樣細(xì)胞的增殖。這樣的方法包括使具有端粒酶活性的細(xì)胞與本發(fā)明的化合物接觸。如此處理的細(xì)胞(可以是體外的細(xì)胞或休內(nèi)的細(xì)胞)，通常會(huì)使端?？s短并停止增殖。因?yàn)榘┘?xì)胞需要端粒酶活性來用于長期增殖，因此本發(fā)明的化合物對于抑制癌細(xì)胞的生長尤其有用，且可以用于治療應(yīng)用中來治療癌癥。因此本發(fā)明包括將在此所述的化合物用于醫(yī)學(xué)中，尤其是用于治療癌癥中。本發(fā)明還提供了藥物組合物，包括與藥物學(xué)上可接受的賦形劑一起配制的根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸軛合物。圖1顯示了本發(fā)明化合物中各種脂質(zhì)L基團(tuán)與寡核苷酸連接的實(shí)施例。圖2顯示了木發(fā)明化合物實(shí)例合成方法的示意圖。圖2A、2B和2C顯示了用于生產(chǎn)其中脂質(zhì)部分共軛寡核苷酸3'端的化合物的合成方法。圖2C中所不的圖解是從脂質(zhì)醛開始的還原性胺化；這在脂質(zhì)基團(tuán)和寡核苷酸之間產(chǎn)生了胺鍵(以下的參見示意圖B)，與圖2A中所示的相反，其中起始原料是脂肪酸的羧酸、酸酐或?；刃问剑瑢?dǎo)致氨鍵的形成(參見以下的示意圖A)。圖2B顯示了適于生產(chǎn)3'-硫代氨基磷酸酯鍵的圖解。該實(shí)施例中，顯示了氨基甘油連接物序列(0-CH2CH2CH2-NHC(0))-，但是將認(rèn)識到可以使用該合成而不需要這樣的連接物，或使用可替換的連接物序列。圖2D顯示了可以用于產(chǎn)生其中脂質(zhì)部分通過磷酸酯基團(tuán)(或硫代磷酸酯基團(tuán)，當(dāng)X二S時(shí))共軛寡核苷酸5'端化合物的合成方法。這些示意圖中，寡核昔酸的3'顯示為氨基，與優(yōu)選的硫代氨基磷酸酯(X=S)和氨基磷酸酯(x=o)化學(xué)物質(zhì)的寡核苷酸鍵一致。圖2E顯示了脂質(zhì)基團(tuán)改性的被護(hù)堿基的實(shí)例(該情況中，通過共軛十四烷基來改性鳥苷)，其可以用于標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成方法中來制備其中一個(gè)或多個(gè)脂質(zhì)基團(tuán)共價(jià)連接一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的寡核苷酸。圖2中，使用以下縮寫i=Cl-C(0)-R7(i-Pr)2NEt，或HO-C(0)-R7C.A，或[C(0)-R"]20/(i-Pr)2NEtii=DMTO-CH2CHO(CEO-P[N(i-Pr)2]-CH2-NHC(0)-R7Tetr出=寡核苷酸鏈延伸iv=R"-HC=0+[H]R-5'-CPG-支持的P,N-被護(hù)的寡核苷酸11'=去保護(hù)的NP-或NPS-寡核苷酸R'H1質(zhì)部分，L(如果需要，其可以與連接物共軛，參見R'"共軛氨基甘油連接物的實(shí)例)R"'=-0-CH2(CHOH)CH2-NHC(0)-R"X=0、S;Y=H，或C(O)-R"，ZO或NH圖3和4是曲線圖，顯示了本發(fā)明的化合物各自抑制U251和DU145細(xì)胞中端粒酶活性的能力(對于全部描述參見實(shí)施例3)。在這些和以下的圖中，A、B和C是描述于實(shí)施例3中并顯示于圖9中的化合物。圖5是凝膠圖像，顯示了在人腫瘤異種移植模型小鼠中解剖的人腫瘤細(xì)胞上進(jìn)行的，隨后使用或未使用本發(fā)明化合物處理后的TRAP測試結(jié)果(對于全部描述參見實(shí)施例4)。圖6是圖表，顯示了異種移植后，使用或未使用本發(fā)明化合物處理的具有人骨髓瘤小鼠中骨髓瘤蛋白質(zhì)的血漿含量，(對于全部描述參見實(shí)施例5)。圖7和8是圖表，顯示_了使用或未使用本發(fā)明的化合物對具有人骨髓瘤異種移植小鼠中的腫瘤體積、端粒酶活性和端粒長度的影響(對于全部描述參見實(shí)施例6)。圖9描繪了實(shí)施例3-7中所用化合物A、B和C的結(jié)構(gòu)，其中寡核苷酸部分含有硫代氨基磷酸酯連接物。序列表陽隨序列表的SEQIDNO:l提供了人端粒酶RNA部分(hTR)的序列(還參見Feng等，Sciences269(5228):1236-1241，1995，和基因庫登錄號No.U86046)。通過參照與SEQIDNO:l中序列位置是互補(bǔ)的這些公開文件來涉及各種其序列與SEQIDNO:l中所含片段互補(bǔ)的寡核苷酸。具體實(shí)施方式A.定義"烷基"指的是具有1至20個(gè)碳的烷基和取代烷基，如甲基、乙基、丙基等等。低級烷基通常指的是Q至C5。典型地，中級烷基指的是Q至C1Q。"?；?指的是具有結(jié)構(gòu)RCO的基團(tuán)，其中R是垸基。低級酰基是其中R是低級烷基的?；?。"烷基胺"指的是帶有連接的氮的烷基，例如，1-甲基1-丁胺(CH3CHNH2CH2CH2CH3)。"芳基"指的是具有5-20個(gè)碳原子的芳族環(huán)基團(tuán)，如苯基、萘基、蒽基或取代的芳基，如垸基-或芳基-取代如甲苯基、乙苯基、二苯基，等。還包括環(huán)中具有一個(gè)或多個(gè)氮、氧或硫原子的雜環(huán)芳族環(huán)基團(tuán)。"寡核苷酸"指的是具有約2至約200個(gè)相連亞基的核糖和/或脫氧核糖核苷亞基聚合物。核苷亞基可以通過各種亞基間鍵合來連接，包括但不限于，磷酸二酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、P3'—N5'氨基磷酸酯、N3'—P5'氨基磷酸酯、N3'—P5'硫代氨基磷酸酯和硫代磷酸酯鍵合(linkage)。此外，"寡核苷酸"包括本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的糖(例如，2'取代)、堿基(參見以下"核苷"的定義)以及3鄰5'端的改性。在其中寡核苷酸部分包括多個(gè)亞基間鍵合的實(shí)施方案中，可以使用相同的化學(xué)物質(zhì)來形成每個(gè)鍵合或可以使用鍵合化學(xué)物質(zhì)的混合物。如在此所用的術(shù)語"多核苷酸"，具有和"寡核苷酸"相同的意思，并與"寡核苷酸"交替使用。不管什么時(shí)候通過字母的序列來表示寡核苷酸，如"ATGUCCTG"，將理解為核苷酸是從左到右5'—3'的次序。如此寡核苷酸堿基序列的表示并不是暗示在寡核苷酸中使用任何特定類型的核苷酸間亞基。如此處所用的"核苷"包括天然核苷，包括2'-脫氧和2'-羥基形式，例如如Komberg禾卩Baker，DNAReplication,第2版(Freeman,SanFrancisco,1992)中所述的，和類似物。關(guān)于核苷的"類似物"包括具有改性核酸堿基部分(參見以下"核酸堿基"的定義)和/或改性糖部分的合成核苷，例如，由Scheit概述的，NucleotideAnalogs(JohnWiley，NewYork,1980)。這樣的類似物包括設(shè)計(jì)來提高結(jié)合特性(如穩(wěn)定性、特異性等)的合成核苷，如Uhlmann和Peyman所述的(ChemicalReviews,90:543-584，1990)。在此廣泛使用的術(shù)語"脂質(zhì)"包括溶于有機(jī)溶劑，但在水中溶解不足，甚至根本不溶的物質(zhì)。術(shù)語脂質(zhì)包括但不限于烴、油、脂肪(如脂肪酸、甘油)、固醇、類固醇以及這些化合物的衍生形式。優(yōu)選的脂質(zhì)是脂肪酸及其衍生物，烴及其衍生物，和固醇如膽固醇。如在此所用的，術(shù)語脂質(zhì)還包括含有脂質(zhì)和親水部分的兩性化合物。脂肪酸通常在直鏈中含有偶數(shù)碳原子(通常為12-24個(gè)碳)并可以是飽和的或不飽和的，以及可以含有或可以通過改性來含有各種取代基。為了簡單，術(shù)語"脂肪酸"還包括脂肪酸衍生物，如通過圖2A所示的合成示意圖產(chǎn)生的脂肪酰胺(參見例如，圖1A-1E中所示的化合如在此所用的術(shù)語"烴"包括僅有氫和碳，通過共價(jià)鍵連接而構(gòu)成的化合物。術(shù)語包括開鏈(脂族)烴，包括直鏈和支鏈烴，和飽和的以及單-和多-不飽和烴。術(shù)語還包括含有一個(gè)或多個(gè)芳環(huán)的烴。術(shù)語"取代的"指的是已經(jīng)通過一個(gè)原子交換另一個(gè)原子而改性的化合物。尤其是，所用的術(shù)語涉及鹵代烴和脂肪酸，尤其是其中氟取代了一個(gè)或多個(gè)氫原子的那些。如在此所用的"核酸堿基"包括(0典型的DNA和RNA核酸堿基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶)，(ii)改性的核酸堿基或核酸堿基類似物(例如，5-甲基-胞嘧啶、5-溴尿嘧啶或次黃嘌呤)和(iii)核酸堿基類似物。核酸堿基類似物是分子結(jié)構(gòu)模擬典型DNA或RNA堿基的化學(xué)物質(zhì)。如在此所用的，"嘧啶"意思是天然核苷中產(chǎn)生的嘧啶，包括胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶及其類似物，如含有氧、甲基、丙基、甲氧基、羥基、氨基、硫、鹵素和取代基的那些。如在此所用的術(shù)語進(jìn)一歩包括具有連接的保護(hù)基團(tuán)的嘧啶，如Hr苯甲酰胞嘧啶。更多的嘧啶保護(hù)基團(tuán)由Beaucage和Iyer所公開(Tetrahedron48:223-2311，1992)。如在此所用的，"嘌呤"意思是天然核苷中產(chǎn)生的嘌呤，包括腺嘌呤和鳥嘌呤和次黃噪呤及其類似物，如含有氧、甲基、丙基、甲氧基、羥基、氨基、硫、鹵素和取代基的那些。如在此所用的術(shù)語進(jìn)一歩包括具有連接的保護(hù)基團(tuán)的嘌呤，如N2-苯甲酰鳥嘌呤、Nr異丁酰鳥嘌呤、N6-苯甲酰腺嘌吟，等等。更多的嘌呤保護(hù)基團(tuán)由Beaucage和Iyer所描述(以上所引用的)。如在此所用的，術(shù)語"被護(hù)的"作為化學(xué)物質(zhì)名稱的部分指的是本領(lǐng)域己知的用于化合物特定部分的保護(hù)基團(tuán)，例如，關(guān)于核苷"5'-被護(hù)-羥基"包括三苯基甲基(即，三苯甲基)，對茴香基二苯甲基(即，單甲氧基三苯甲基或MMT)，二-對茴香基苯甲基(即，二甲氧基三苯甲基或DMT)，等等。本領(lǐng)域已知的保護(hù)基團(tuán)包括描述于以下參考文獻(xiàn)中的那些Gait，編輯，OligonucleotideSynthesis:APraticalApproach(IRLPress,Oxford,1984);Amarnath禾口Broom，ChemicalReviews,77:183-217，1977;Pon等，Biotechniques,6:768-775，1988;Ohtsuka等，NucleicAcidsResearch,10:6553-6570，1982;Eckstein,編輯，OligonucleotidesandAnalogues:APraticalApproach(IRLPress，Oxford，1991);Greene禾口Wuts，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第二版，(JohnWiley&Sons,NewYork,1991);Narang，編輯，SynthesisandApplicationsofDNAandRNA(AcademicPress,NewYork，1987);Beaucage和Iyer(以上所引用的)，等等參考文獻(xiàn)。術(shù)語"鹵素"或"鹵"以其常規(guī)意思來使用，指的是氯、溴、氟或碘取代基。在此所描述和所要求的化合物中，鹵素取代基通常是氟、溴或氯，優(yōu)選氟或氯。B.本發(fā)明化合物的設(shè)計(jì)本發(fā)明的化合物可以通過通式來表示O-(x-L)n，其中O表示寡核苷酸，x是任意的連接物基團(tuán)，L表示脂質(zhì)部分和n是l-5的整數(shù)。因此化合物的設(shè)計(jì)需要兩個(gè)部分O和L的選擇，和這些實(shí)體之間結(jié)構(gòu)鍵合的確定，該鍵合可以包括任意連接物基團(tuán)x。O的選擇寡核苷酸成分O可以認(rèn)為是化合物的"效應(yīng)物"部分，因?yàn)樵摬糠滞ㄟ^結(jié)合端粒酶的RNA部分來影響端粒酶的抑制。因此，選擇O的序列使其包括與SEQIDNO:l中所示的端粒酶RNA序列互補(bǔ)的片段。與端粒酶RNA部分互補(bǔ)的片段在理論上可以靶向端粒酶RNA的任何部分，但端粒酶RNA的特定片段是用于抑制寡核苷酸的優(yōu)選目標(biāo)。一個(gè)優(yōu)選的目標(biāo)片段是跨越SEQIDNO:l的核苷酸30-67的片段，其包括"模板片段"，跨越SEQIDNO:l的核苷酸46-56的序列5'-CUAACCCUAAC-3'的11個(gè)核苷酸片段。模板片段用來限定端粒酶加入染色體末端的端粒重復(fù)序列且對于端粒酶活性是必要的(參見Chen等，Cell100:503-514，2000;Kim等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA98(14):7982-7987，2001)。因此特別優(yōu)選含有包括與模板片段全部或部分互補(bǔ)的序列的寡核苷酸部分的本發(fā)明化合物。另一優(yōu)選目標(biāo)片段是跨越hTR的核苷酸137-179的片段(參見Pmzan等，Nucl.AcidsResearch,30:559-568，2002)。i亥片段中，跨越141-153的序列是優(yōu)選H標(biāo)。PCT公開W098/28442描述了使用至少7個(gè)核苷酸長的寡核苷酸來抑制端粒酶，其中將寡核苷酸設(shè)計(jì)成與hTR序列的模板片段外的易接近部分互補(bǔ)，包括hTR的核苷酸137-196，290-319，和350-380。優(yōu)選靶向hTR序列的O的片段與相應(yīng)的hTR序列精確互補(bǔ)。雖然在特定情況中錯(cuò)配是允許的，但期望它們會(huì)降低所得到寡核苷酸軛合物的特異性和活性。在特定實(shí)施方案中，因此選擇寡核苷酸O的堿基序列來包括至少5個(gè)與端粒酶RNA精確互補(bǔ)的核苷酸的序列，并且如果使用增加長度的互補(bǔ)序列，如至少8個(gè)，至少10個(gè)，至少12個(gè)，至少13個(gè)或至少15個(gè)與端粒酶RNA精確互補(bǔ)的核苷酸，那么可以獲得增強(qiáng)的端粒酶抑制。在其它實(shí)施方案中，寡核苷酸的序列包括至少5至20個(gè)，至少8至20個(gè)，至少10至20個(gè)或至少10至15個(gè)與端粒酶RNA序列精確互補(bǔ)的核苷酸的序列。當(dāng)選擇寡核苷酸O的全長與端粒酶RNA互補(bǔ)時(shí)，可以獲得最佳的端粒酶抑制活性。然而，全長寡核苷酸部分與目標(biāo)序列的精確互補(bǔ)不是必需的，寡核苷酸序列可以包括與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的片段。例如，可以加入這樣的片段來給予化合物其它特性，如有助于純化的序列。如果寡核苷酸成分O包括與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的片段，通常將這樣的片段放置于5'或3'端的一端或兩端。在其中精確互補(bǔ)的片段靶向模板片段的情況中，可以用與連接在5'端的端粒酶樣(富含G)序列精確互補(bǔ)的短(5-8個(gè)核苷酸)片段獲得有效的端粒酶抑制。與人端粒酶RNA互補(bǔ)且可以包括其作為寡核苷酸部分O的一部分或其可以用作整個(gè)寡核苷酸部分O的實(shí)例序列包括以下<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>CGGTGGAAGGCGG141-153ACGGTGGAAGGCG142-154AACGGTGGAAGGCGGC143-155ATGAACGGTGGAAGGCGG144-158ACATTTTTTGTTTGCTCTAG160-179TAGGGTTAGACAA42-54GTTAGGGTTAG46-56GTTAGGGTTAGAC44-56GTTAGGGTTAGACAA42-56GGGTTAGAC44-52CAGTTAGGG50-58CCCTTCTCAGTT54-65CGCCCTTCTCAG56-67用于o部分合成中的核苷酸間鍵合類型的選擇可以由任何可獲得的寡核苷酸化學(xué)物質(zhì)構(gòu)成，包括但不限于，磷酸二酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、P3'—N5'氨基磷酸酯、N3'—P5'氨基磷酸酯、N3'—P5'硫代氨基磷酸酯和硫代磷酸酯鍵合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸部分O具有至少一個(gè)N3'—P5'氨基磷酸酯或N3'—P5'硫代磷酸酯鍵合，該鍵合可以通過以下結(jié)構(gòu)來表示3'-[-NH-P(=0)(-XR)-0-]5'，其中X是O或S，且R選自氫、烷基或芳基；或其藥物學(xué)上可接受的鹽。通常，但不是必需的，寡核苷酸O內(nèi)的所有核苷酸間鍵合是相同類型的，盡管可以使用不同鍵合的混合物來合成寡核苷酸部分。其中脂質(zhì)部分共軛至寡核苷酸的3'端，通過寡核苷酸上的3'氨基極大地有助于軛合物的合成。因此，即使沒有選擇優(yōu)選的化學(xué)物質(zhì)之一，3'氨基的加入也是有利的。L的選擇與沒有和脂質(zhì)部分共軛的寡核苷酸相比，本發(fā)明的化合物在細(xì)胞中產(chǎn)生端粒酶抑制更有效?？梢韵嘈胖|(zhì)部分L用來提高化合物的細(xì)胞吸收，尤其是有助于穿過細(xì)胞膜。雖然還沒有完全闡明該發(fā)生的機(jī)理，一個(gè)可能性是脂質(zhì)部分可以幫助化合物以單個(gè)分子或聚合體(膠束的)形式與細(xì)胞膜結(jié)合，隨后內(nèi)在化。然而，使用本發(fā)明不需要對準(zhǔn)確機(jī)理的理解。脂質(zhì)部分可以是與未改性寡核苷酸相比較提供升高的細(xì)胞吸收的任何脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物。優(yōu)選的脂質(zhì)是烴、脂肪(例如，甘油、脂肪酸和脂肪酸衍生物，如脂肪酰胺)和固醇。其中脂質(zhì)部分是烴時(shí)，L部分可以是取代或未取代的環(huán)烴或脂族直鏈或支鏈烴，其可以是飽和的或不飽和的。優(yōu)選實(shí)例是全部飽和或多飽和的直鏈未分支的烴。烴鏈的長度為C2-C3fJ，但使用Cs-C22的碳鏈可以獲得最佳的端粒酶抑制效果。飽和烴(垸烴)的優(yōu)選實(shí)例如下學(xué)名碳鏈?zhǔn)耐镃14H30十五烷CI5H32十六烷C16H34十七烷C17H36十八烷CwH38十九烷C19H40二十烷C20H42還可以選擇單-和多-不飽和形式的烴(烯烴和多烯，如二烯烴和三烯烴)，優(yōu)選具有一個(gè)至三個(gè)雙鍵的化合物，盡管可以使用具有多個(gè)雙鍵的化合物。也可以使用炔(含有一個(gè)或多個(gè)三鍵)和alkenyne(三鍵和雙鍵)?？梢允褂玫某Ｒ妴?和多-不飽和烴的實(shí)例包括圖1M、1L和10中所示的那些。本發(fā)明的化合物中可以使用取代形式的烴，優(yōu)選使用在體內(nèi)和體外為惰性的取代基。特別優(yōu)選的取代基是氟。多氟代烴的實(shí)例通式結(jié)構(gòu)包括CF3(CF2)n-(CH2)m-，其中m至少是l，優(yōu)選至少是2，in=l-30，如氟代十三垸CF3(CF2)9(CH2)3;禾口CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)c-，其中a、b和c獨(dú)立地為l-30。圖1W顯示了共軛寡核苷酸5'端的多氟代烴的實(shí)例。其它合適的脂質(zhì)部分包括簡單的脂肪酸和脂肪酸衍生物，甘油和更復(fù)雜的脂質(zhì)如固醇，例如膽固醇。脂肪酸及其衍生物可以是全部飽和的或單-和多-不飽和的。碳鏈的長度為C2-C3。，但是用C8-C^的碳鏈可以獲得最佳的端粒酶抑制效果。飽和脂肪酸的優(yōu)選實(shí)例如下俗名碳鏈肉豆蔻酸]4:0棕櫚酸16:0硬脂酸18:0花生酸20:0還可以使用單-和多-不飽和形式的脂肪酸，優(yōu)選具有--個(gè)至三個(gè)雙鍵的化合物，盡管還可以使用具有多個(gè)雙鍵的化合物。可以使用的常見單-和多-不飽和脂肪酸的實(shí)例包括學(xué)名俗名碳鏈順-9-十六酸棕櫚油酸16:l(n-7)順-9-十八酸巖芹酸18:l(n扁12)順-9-十八酸油酸18:](n-9)9,12-十八碳二烯酸亞油酸18:2(n-6)6,9,12-十八碳三烯酸Y-亞油酸18:3(n-6)9，12,15-十八碳三烯酸a-亞油酸18:3(n-3)5,8,11,14-二十碳四烯酸花生四烯酸20:4(n-6)本發(fā)明的化合物中也可以使用碳鏈中具有一個(gè)或多個(gè)三鍵的脂肪酸，以及支鏈脂肪酸。本發(fā)明的化合物中可以使用取代形式的脂肪酸。和烴基團(tuán)一樣，優(yōu)選體內(nèi)和體外為惰性的取代基，特別優(yōu)選氟。適用于本發(fā)明的脂肪酸多氟代衍生物的實(shí)例通式結(jié)構(gòu)是CF3(CF2)n-(CH2)mCO-，其中m至少是1，優(yōu)選至少是2，且n=l-30，和CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)cCO-，其中a、b和c獨(dú)立地為l-30。本發(fā)明具有脂肪酸多氟代衍生物的實(shí)例化合物顯示于圖ru和iv中。通常一至五個(gè)L部分(n=l-5)與O部分共價(jià)連接，任意地通過連接物。更常見使用1或2個(gè)L部分。其中多于一個(gè)L部分與O部分連接時(shí)，每個(gè)L部分是可獨(dú)立選擇的。將認(rèn)識到描述為具有如L部分的特定烴的本發(fā)明化合物和描述為學(xué)名十四烷酸十六烷酸十八烷酸二十烷酸具有特定脂肪酸(與特定烴具有相同數(shù)目的碳原子)的本發(fā)明化合物是最相關(guān)的，區(qū)別僅在于連接L部分與寡核苷酸的鍵的性質(zhì)，其依次是用來生產(chǎn)化合物的合成方法的結(jié)果。例如，和以下更詳細(xì)描述的，當(dāng)合成具有共軛寡核苷酸3'-氨基端的L部分的化合物(具有氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯核苷酸間鍵合)時(shí)，使用脂肪酸的醛形式(脂肪醛)作為起始原料，來在脂質(zhì)鏈和寡核苷酸之間形成胺鍵，使得脂質(zhì)基團(tuán)看起來像烴。相反，使用相同脂肪酸的羧酸、酸酐或?；刃问降难苌铮瑢?dǎo)致形成酰胺鍵，使得脂質(zhì)基團(tuán)看起來象脂肪酸衍生物，尤其在脂肪酰胺這樣的情況中(如以上定義部分所述的，為了簡單的緣由，術(shù)語"脂肪酸"當(dāng)描述在此廣泛使用的共軛的L基團(tuán)時(shí)包括脂肪酸衍生物，包括脂肪酰胺)。這在以下的示意圖(和圖2A和2C中)中說明了，其描繪了連接C,4脂質(zhì)部分的氨基磷酸酯寡核苷酸的3'-氨基端。示意圖A中，L是十四酸(肉豆蔻酸)，其中L和O基團(tuán)之間的連接是酰胺。示意圖B中，L是十四烷烴，L和O基團(tuán)之間的連接是胺。O和L成分的連接O和L部分之間的鍵合可以是直接鍵合，或可以通過任意的連接物部分，x。連接物基團(tuán)可以用來幫助化合物的化學(xué)合成(在以下的合成部分中討論)。不管連接物基團(tuán)是否用于介導(dǎo)O和L部分的共軛，寡核苷酸部分O上都會(huì)存在多個(gè)L部分可以方便共軛的位點(diǎn)。合適的連接位點(diǎn)包括5'和3'端，一個(gè)或多個(gè)糖環(huán)，核苷間主鏈和寡核苷酸的核酸示意圖A示意圖8堿基。通常，L部分連接寡核苷酸的3'或5'端。如果L部分連接3'端，可以直接連接3'取代基，在氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯寡核昔酸的優(yōu)選情況屮是3'氨基(實(shí)例顯示于圖1A-C中)，在其它情況中，如常見的磷酸二酯寡核苷酸是3-羥基?；蛘?，L部分可以通過3'連接的磷酸酯基團(tuán)來連接(實(shí)例顯示于圖1Z中，其中十四烷烴通過O-烷基連接物連接硫代氨基磷酸酯寡核苷酸的3'磷酸酯。如果L部分連接5'端，通常通過5'連接的磷酸酯基團(tuán)來連接(參見圖1F，其顯示了使用氨基甘汕連接物，和圖1G，其顯示了使用二氨基甘油連接物)?？梢酝ㄟ^任何合適的原子連接O部分上的堿基，例如鳥苷的N"氨基(參見圖1Q-R)。當(dāng)n>l時(shí)使得多個(gè)脂質(zhì)部分連接O部分，獨(dú)立選擇的L部分可以連接于任何合適的位點(diǎn)上。例如，一個(gè)L基團(tuán)可以連接每一端，各種L基團(tuán)可以連接堿基，或兩個(gè)或多個(gè)L基團(tuán)可以連接于一端(參見圖1E、1J、]K)?？梢允褂萌我獾倪B接物部分x來連接化合物的O和L部分。如果使用連接物，如以上圖2圖例中所述的將其引入合成方法中。合適連接物基團(tuán)的實(shí)例包括氨基甘油和O-烷基甘油型連接物，其各自可以通過通式結(jié)構(gòu)來圖示其中R'二H、OH、NH2或SH;Y=0、S或NR;R二H或烷基，且n和m獨(dú)立地為1-18的整數(shù)。合適連接物的特定實(shí)例是氨基甘油連接物，其中R'-OH，Y二O，且n和m各自為1:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>-氨基甘油連接物，其中R^OH，Y=NH，且n和m各自為l:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>和O-垸基甘油連接物，其中I^H。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>c.本發(fā)明化合物的實(shí)例本發(fā)明化合物的實(shí)例顯示于圖1中。為了簡單，只顯示了寡核苷酸的一個(gè)堿基，用圖示的通式堿基，B，和R表示寡核苷酸剩余部分的連接點(diǎn)。連接3'端的化合物用3'氮來說明，與優(yōu)選的硫代氨基磷酸酯和氨基磷酸酯寡核苷酸化學(xué)物質(zhì)一致。圖1A-1L說明了具有連接5'或3'端的飽和脂質(zhì)基團(tuán)的化合物。圖1M-1P說明了具有單-或多-不飽和脂質(zhì)基團(tuán)的化合物。圖1Q-1R說明了具有通過堿基(該情況中，是鳥苷)共軛寡核苷酸的脂質(zhì)基團(tuán)的化合物。圖1S和1CC各自說明了3'-和5'-共軛的膽固醇脂質(zhì)部分。圖1U和1V說明了5'-共軛的多氟代脂肪酸衍生物，和圖1W說明了5'共軛的多氟代烴。圖1X-Z說明了含有氧的脂質(zhì)部分。在此所用的每個(gè)脂質(zhì)基團(tuán)的名稱說明如下圖1A:3'-肉豆蔻酰胺圖1B:3'-棕櫚胺圖1C:3'-硬脂酰胺圖1D:3'-棕櫚酰胺-丙基-硫代磷酸酯圖1E:3'-賴氨酰-二-硬脂酰胺圖1F:5'-棕櫚酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯圖1G:5'-棕櫚酰胺-二-氨基甘油-硫代磷酸酯圖1H:5'-硬脂酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯圖II:3'-十二垸基圖1J:3'-二-十二垸基圖1K:3'-二-癸基圖1L:3'-二十烷基酰胺圖1M:3'-油基酰胺圖1N:3'-亞麻酸酰胺圖10:3'-亞油酸酰胺圖1P:3'-三苯甲基圖1Q:N、十四烷基鳥苷圖1R:N、十八垸基鳥苷圖1S:3'-膽固醇酰胺-氨基丙三醇-硫代磷酸酯圖1T:5'-(12-OH)-硬脂酰-硫代磷酸酯圖1U:5'-Cll-聚四氟乙烯-硫代磷酸酯圖IV:5'-C13-聚四氟乙烯-硫代磷酸酯圖1W:5'-OH-C10-聚四氟乙烯-硫代磷酸酯圖IX:5'-OH-棕櫚酰-硫代磷酸酯圖1Y:5'-十八烷基-硫代磷酸酯圖1Z:3'-十八烷基-硫代磷酸酯圖1AA:3'-棕櫚酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯圖1BB:3'-thioctylamide圖1CC:5'-膽固醇酰胺-氨基甘油-硫代磷酸酯圖1DD:5'-(2-OH)-十六醇-硫代磷酸酯D.本發(fā)明化合物的合成可以使用用于所選化學(xué)物質(zhì)類型的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案來合成本發(fā)明化合物的寡核苷酸部分。具有優(yōu)選N3'—P5'氨基磷酸酯和N3'—P5'硫代氨基磷酸酯化學(xué)物質(zhì)的寡核苷酸的合成方法各自描述于McCurdy等，(1997)TetrahedronLetters,38:207-210禾口Pongracz&Gryaz麗，(1999)TetrahedronLetters,49:7661-7664。根據(jù)所選鍵合物的性質(zhì)，包括描述于Mishra等，(1995)BiochemicaetBiophysicaActa，1264:229-237，Shea等，(19卯)NucleicAcidsRes.18:3777-3783，和R畫p等，(1998)Bioconj.Chem.9:341-349的方法，可以使用各種合成方法來共軛脂質(zhì)部分和寡核苷酸。其中脂質(zhì)部分共軛于寡核苷酸5'或3'端的本發(fā)明化合物的合成，可以通過在合適的末端使用合適的官能團(tuán)來實(shí)現(xiàn)，最常見為氨基，其可以與羧酸、酸酐和醛以及活性酯反應(yīng)。硫醇基團(tuán)也適于作為官能團(tuán)(參見Kupihar等，(2001)BioorganicandMedicinalChemistry9:1241-1247)。司購得用于寡核苷酸合成的不同鏈長的氨基-和硫醇-改性劑。具有N3'—P5'氨基磷酸酯和N3'—P5'硫代氨基磷酸酯鍵合的寡核苷酸含有3'-氨基(而不是最常見寡核苷酸化學(xué)物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的3'-羥基)，因此這些寡核苷酸提供了用于共軛脂質(zhì)基團(tuán)和寡核苷酸3'-端的獨(dú)特優(yōu)勢?？梢允褂酶鞣N方法，用優(yōu)選的N3'—P5'氨基磷酸酯和N3'—P5'硫代氨基磷酸酯化學(xué)物質(zhì)來連接脂質(zhì)基團(tuán)和寡核苷酸的末端。產(chǎn)生本發(fā)明軛合化合物的合成示意圖的實(shí)例顯示于圖2中。為了連接3'端，通過使全部被護(hù)的固體載體束縛的寡核苷酸的游離3'-氨基與相應(yīng)的酸酐反應(yīng)，接著用氨去保護(hù)并純化來合成軛合化合物?；蛘撸褂门己蟿?如碳化二亞胺)偶合脂質(zhì)的羧酸和載體束縛(supportbound)的寡核苷酸的3'-氨基，HBTU或2-氯-l-甲基吡啶碘可以用于共軛脂質(zhì)基團(tuán)。這兩種方法將在脂質(zhì)和寡核苷酸之間形成酰胺鍵。還可以使用鏈延伸過程中連接寡核苷酸的脂質(zhì)的氨基磷酸酯衍生物將脂質(zhì)連接寡核苷酸鏈。該方法產(chǎn)生了連接脂質(zhì)和寡核苷酸的氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯鍵合(通過丙基-棕櫚?；?-羥基-丙基-棕櫚酰基化合物來示例)。再一方法包括全部被護(hù)的載體束縛的寡核苷酸的游離3'-氨基和合適的脂質(zhì)醛反應(yīng)，接著用氰基硼酸鈉還原，其產(chǎn)生胺鍵。為了連接5'端，使用改性的、含有脂質(zhì)的固體載體來合成寡核苷酸，接著以5'-至3'的方向合成寡核苷酸，如Pongracz&Gryaznov(1999)中所述的。改性載體的實(shí)例提供于以下的示意圖C中。在其中n=14的情況中，脂肪酸是棕櫚酸3'-氨基-l,2-丙二醇和棕櫚酰氯反應(yīng)，接著二甲氧基三苯甲基化和琥珀?；峁┝擞糜谂己瞎腆w載體的中間產(chǎn)物。R是長鏈垸基胺控制的多孔玻璃。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>E.端粒酶抑制測試本發(fā)明的軛合物可以用于抑制或降低端粒酶的酶活性和/或具有端粒酶活性的細(xì)胞增殖。這些內(nèi)容中，酶活性或細(xì)胞增殖的抑制或降低指的是比其中酶或細(xì)胞沒有用軛合物處理的對照實(shí)驗(yàn)所測量的活性水平低。特定實(shí)施方案中，所測量活性的抑制或降低至少為10%的降低或抑制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到對于特定應(yīng)用優(yōu)選測量活性的降低或抑制為至少20%、50%、75%、90%或100%?？梢栽跓o細(xì)胞測試(稱為生化測試)和細(xì)胞中測定本發(fā)明化合物抑制端粒酶活性的能力。測量端粒酶活性的方法，以及使用這樣的方法來測定化合物的端粒酶抑制活性是公知的。例如，TRAP測試是用于測量細(xì)胞提取物系統(tǒng)中端粒酶活性的標(biāo)準(zhǔn)測試方法并已經(jīng)廣泛用于端粒酶抑制化合物的研究中(Kim等，Science266:2011，1997;Weinrich等，NatureGenetics17:498，1997)。TRAP測試測量了引入延伸產(chǎn)物(多核苷酸)中的放射性核苷酸含量，該延伸產(chǎn)物是通過將核苷酸添加至端粒酶底物或引物而形成的?？梢酝ㄟ^檢測屏(例如，Phosphorimager屏)上，曝光于分離放射性產(chǎn)物的凝膠的條帶強(qiáng)度來測量引入的放射性。TRAP測試還詳細(xì)地描述于U.S.專利No.5，629，154，5,837,453禾Q5,863,726中，其在測試端粒酶抑制化合物活性中的用途描述于各種出版物中，包括WO01/18015。此外，對于測量端粒酶活性的研究目的，以下所試劑盒是可購得的TRAPeze⑧XK端粒酶檢測試劑盒(Cat.s7707;IntergenCo.,PurchaseNY);和TeloTAGGG端粒酶PCRELISA陽性(Cat.2,013,89;RocheDiagnostics,IndianapolisIN)。測量生化測試中化合物抑制端粒酶能力的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案是直接的(非基于PCR的)無細(xì)胞端粒酶測試，稱為"Flashplate測試"，描述于Asai等，CancerResearch,63:3931-3939(2003)中?？梢杂帽磉_(dá)端粒酶的細(xì)胞在限定的吋間段培養(yǎng)化合物，然后測定細(xì)胞提取物中的端粒酶活性來測定本發(fā)明化合物在細(xì)胞中抑制端粒酶的能力?；诩?xì)胞測試的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案是描述于Asai等(2003)中的細(xì)胞基端粒酶測試。適于這樣測試的表達(dá)端粒酶的腫瘤細(xì)胞系包括HME50-5E人乳房上皮細(xì)胞(由Dr.JerryShay提供，UniversityofTexasSouthwesternMedicalCenter)、卵巢腫瘤細(xì)胞系OVCAR-5(MIISB，Millan)和SK-OV-3(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)、人腎癌Caki-1細(xì)胞(日本生物來源研究中心，JCRB)、人肺癌1549細(xì)胞(ATCC)、人表皮樣癌A431細(xì)胞GCRB)和人前列腺癌DU145細(xì)胞(ATCC)。F.細(xì)胞增殖測試本發(fā)明化合物的關(guān)鍵治療應(yīng)用是抑制表達(dá)端粒酶的細(xì)胞尤其是腫瘤細(xì)胞的生長。抑制細(xì)胞中端粒酶活性的本發(fā)明化合物將和其他已知的抑制端粒酶的化合物一樣，誘導(dǎo)端粒酶陽性細(xì)胞的驟退，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長停止并死亡。然而，重要地，在沒有表達(dá)端粒酶的正常人細(xì)胞中，如成纖維來源的BJ細(xì)胞，沒有由本發(fā)明化合物處理而誘導(dǎo)的驟退或其它毒性?？梢允褂皿w外腫瘤細(xì)胞系或在體內(nèi)的異種移植動(dòng)物模型中測試化合物特異性抑制腫瘤細(xì)胞生長的能力。用于這樣生長曲線測試的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案是描述于Asai等(2003)中的短期細(xì)胞生活力測試。選擇用于治療應(yīng)用的本發(fā)明化合物中，優(yōu)選化合物在低于約lOuM的濃度下在沒有表達(dá)端粒酶的正常細(xì)胞中沒有產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒性效應(yīng)?？梢允褂媒⒌娜四[瘤異種移植模型來證實(shí)本發(fā)明化合物體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞生長的能力，其中將測試化合物直接給藥于腫瘤部位或全身給藥，接著通過物理測量腫瘤的生長。期望用本發(fā)明化合物治療的動(dòng)物在開始給藥時(shí)會(huì)平均增長一段時(shí)間，但隨著繼續(xù)治療，腫瘤塊開始縮小。相反，未治療的對照小鼠如預(yù)料地，腫瘤塊會(huì)繼續(xù)增長。合適的體內(nèi)腫瘤移植測試的優(yōu)選實(shí)例描述于Asai等(2003)中。其它實(shí)例描述于Scorski等，Proc.Natl.Sci.USA,94:3966-3971(1997)和Damm等，EMBOJ.,20:6958-6968(2001)中。G.本發(fā)明化合物的配制本發(fā)明提供了可以特定地并有效地抑制端粒酶活性的化合物，因此其可以用于抑制端粒酶陽性細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞的增殖。很多種類癌細(xì)胞己經(jīng)顯示為端粒酶陽性，包括皮膚癌、結(jié)締組織、脂肪、乳房、月巿、胃、胰腺、卵巢、子宮頸、子宮、腎、膀胱、結(jié)腸、前列腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、視網(wǎng)膜和血液腫瘤(如骨髓瘤、白血病和淋巴瘤)的細(xì)胞。因此，在此提供的化合物可以廣泛用于治療多種惡性腫瘤中。更重要地，本發(fā)明的化合物有效將區(qū)分惡性和正常細(xì)胞的治療提升了一個(gè)高度，避免了依靠不區(qū)分地殺滅分裂細(xì)胞試劑的最常用化療方案存在的許多有害副作用。此外，本發(fā)明的化合物比等量的未軛合寡核苷酸更有效，這意味著可以以較低量給藥，提供提高的安全性和明顯降低的治療成本。因此本發(fā)明的一個(gè)方面是治療患者癌癥的方法，包括將治療有效量的本發(fā)明化合物給藥于患者。包括本發(fā)明的化合物的端粒酶抑制劑可以結(jié)合其它癌癥治療方法(包括原發(fā)腫瘤的手術(shù)切除、化療劑和放射治療)來進(jìn)行使用。為了治療應(yīng)用，將本發(fā)明的化合物以治療有效量和藥物學(xué)上可接受的載體配制。任何給定的制劑中可以包括一種或多種(例如，具有不同的L或O部分)本發(fā)明的化合物。藥物學(xué)上可接受的載體可以是固體或液體的。液體載體可以用于溶液、乳濁液、懸浮液和加壓組合物的制備中。將化合物溶解或懸浮于藥物學(xué)上可接受的液體賦形劑中。用于寡核苷酸制劑非腸道給藥的液體載體的合適實(shí)例包括水(其可以含有添加劑，例如，纖維素衍生物，優(yōu)選羧甲基纖維素鈉溶液)、磷酸鹽緩沖的鹽溶液(PBS)、醇(包括單氫醇和多氫醇，例如甘油)及其衍生物，和油(例如，分餾的可可脂和花生油)。液體載體可以含有其它合適的藥物學(xué)添加劑，包括但不限于以下增溶劑、懸浮劑、乳化劑、緩沖劑、增稠劑、色素、粘度調(diào)節(jié)劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和滲透壓調(diào)節(jié)劑。為了化合物的非腸道給藥，載體還可以是油脂如乙基油酸酯和異丙基肉豆蔻酯。無菌載體可以用于非腸道給藥的無菌液體形式組合物中?？梢酝ㄟ^例如腹膜內(nèi)注射、皮下注射，靜脈內(nèi)或局部地來使用無菌液體藥物組合物、溶液或懸浮液。還可以通過血管內(nèi)或通過血管斯滕特固定模給藥寡核苷酸。用于加壓組合物的液體載體可以是鹵代烴或其它藥物學(xué)上可接受的推進(jìn)劑。這樣的加壓組合物還可以是脂質(zhì)密封的來用于通過吸入的傳送。為了通過鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)吸入或吹入給藥，可以將寡核苷酸配制于水溶液或部分水溶液中，然后可以用于氣物劑形式中?？梢酝ㄟ^與含有活性化合物的藥物學(xué)上可接受的載體進(jìn)行配制，以溶液、霜?jiǎng)┗蛳磩﹣砭植拷o藥化合物。本發(fā)明的藥物組合物可以以任何可接受的劑型口服給藥，包括但不限于，膠囊制劑、片劑、粉末或顆粒，和作為水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液。包括本發(fā)明寡核苷酸的藥物組合物和/或制劑可以包括載體、潤滑劑、稀釋劑、增稠劑、調(diào)味劑、乳化劑、分散助劑或結(jié)合劑。在口服使用片劑的情況中，通常使用的載體包括乳糖和淀粉糖漿。通常還加入潤滑劑，如硬脂酸鎂。對于膠囊形式的口服，有用的稀釋劑包括乳糖和干淀粉糖漿。當(dāng)口服使用需要含水懸浮液時(shí)，將活性成分與乳化劑和懸浮劑結(jié)合。如果需要，還可以加入特定的甜味劑、調(diào)味劑或色素。雖然本發(fā)明的化合物對于細(xì)胞和組織滲透具有優(yōu)良的特征，但將它們配制于例如脂質(zhì)體載體中會(huì)提供更大的益處。使用脂質(zhì)體來幫助細(xì)胞吸收描述于例如U.S.專利No.4,897,355和U.S.專利No.4,394,448中。多種出版物描述了脂質(zhì)體的制劑和制備。還可以通過混合其他的滲透促進(jìn)劑來配制化合物，如上述未軛合形式的脂質(zhì)部分，包括脂肪酸及其衍生物。實(shí)例包括油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、recinleate、甘油一油酸酯(又名l-單油酰基-rac-丙三醇)、甘油二月桂酸酯、辛酸、arichidonicacid、甘油l-單癸酸酯、l-十二垸基氮雜環(huán)庚烷-2-單、酰基肉毒堿、酰基膽堿、單-和二-甘油酯及其藥物學(xué)上可接受的鹽(即，油酸鹽、月桂酸鹽、癸酸鹽、肉豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、亞油酸鹽等)?？梢允褂煤幸环N或多種滲透促進(jìn)劑的復(fù)合制劑。例如，可以結(jié)合脂肪酸使用膽汁鹽來制得復(fù)合制劑。示例性混合物包括與癸酸鈉或月桂酸鈉(通常以約0.5至2。/。的濃度使用)結(jié)合的鵝脫氧膽酸(CDCA)(通常以約0.5至5%的濃度使用)。含有本發(fā)明寡核苷酸的藥物組合物和/或制劑還可以包括螯合劑、表面活性劑和非表面活性劑。螯合劑包括但不限于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、擰檬酸、水楊酸鹽(例如，水楊酸鈉，5-甲氧基水楊酸鹽和homovanilate)、膠原的N-?；苌?、月桂-9和|3-雙酮的N-氨基?；苌?烯胺)。表面活性劑包括，例如，月桂酸磺基酸鈉、多氧乙烯--9-月桂酰酯和多氧乙烯-20沖八垸基酯；和多氟代化學(xué)乳化劑，如FC-43。非表面活性劑包括，例如，不飽和環(huán)脲、1-烷基-和1-烯基氮雜環(huán)-烷酮衍生物，和非固醇消炎劑如二氯苯胺苯乙酸鈉、消炎痛和苯丁唑酮。因此，本發(fā)明的另一方面提供了配制藥物組合物的方法，該方法包括提供在此所述的化合物，并將化合物與藥物學(xué)上可接受的賦形劑結(jié)合。優(yōu)選以下述藥物學(xué)純度提供化合物。該方法進(jìn)一步包括在加入賦形劑之前或之后，將滲透促進(jìn)劑加入化合物中。典型地，藥物組合物遵守藥物純度標(biāo)準(zhǔn)。對于用作藥物制劑中的活性成分，通常純化本發(fā)明的化合物，使其與存在于制備它們的混合物中的其它反應(yīng)性的或潛在的免疫原性成分中分離。典型地，為了獲得其中核酸堿基化合物是活性成分的藥物學(xué)純度，以通過功能測試、色譜或凝膠電泳測定的至少約50%的均一性，更優(yōu)選60%、70%、80%或90%的均一性來提供活性成分。然后將根據(jù)通常使用的制備藥物制劑的方法將活性成分混入藥物中。因此，本發(fā)明提供在藥物學(xué)純度方面化合物需要提供至少約50%均一性，更優(yōu)選至少80%或90%的均一性的化合物。典型地，還將藥物組合物等分并以單劑量或多劑量單位進(jìn)行包裝。寡核苷酸化合物治療需要的劑量隨所用的特定組合物、給藥途徑、現(xiàn)有癥狀的嚴(yán)重程度、化合物的形式和待治療的特定患者而改變?？梢砸杂行Й@得臨床理想結(jié)果的制劑和含量將本發(fā)明的藥物組合物給藥于患者。對于癌癥的治療，理想的結(jié)果包括腫瘤塊的縮小(通過觸診或圖像測定的例如通過放射線照相、放射核苷酸掃描、CAT掃描或MTI)、腫瘤生長率的降低、轉(zhuǎn)移瘤形成的降低(如通過活體解剖樣本的組織化學(xué)分析測定的)生化標(biāo)記的降低(包括一般標(biāo)記如ESR，和腫瘤特異性標(biāo)記如血清PSA)和生命質(zhì)量的改善(如通過臨床測試測定的，例如，Karnofsky分值)、進(jìn)展的延長時(shí)間、無疾病生存和全部存活。得到這些效果所需的每劑中化合物的含量和劑量將根據(jù)許多因素而改變，包括疾病跡象、待治療患者的特征和給藥方式。典型地，給藥的劑型和途徑提供了疾病部位1uM至lnM化合物的局部濃度。通常，以給予有效結(jié)果而沒有導(dǎo)致任何有害或不利副作用的濃度給藥化合物?？梢酝ㄟ^給藥單個(gè)單位劑量或通過整天以合適間隔給藥分成方便的亞單位劑量來得到這樣濃度。以下實(shí)施例說明了本發(fā)明化合物的合成和活性，其中使用優(yōu)選的硫代氨基磷酸酯或氨基磷酸酯化學(xué)物質(zhì)合成寡核苷酸部分O。特定實(shí)施例中，脂質(zhì)部分共軛3'或5'端，或兩端，使用或未用連接物。這些化合物的通式結(jié)構(gòu)可以表示為其中R,和R2獨(dú)立地為H或脂質(zhì)部分(L)，Y是O(氨基磷酸酯寡核苷酸)或S(硫代氨基磷酸酯寡核苷酸)，n是整數(shù)，通常為4至49，和B表示堿基(對每個(gè)核苷亞基為可獨(dú)立選擇的)。該結(jié)構(gòu)中沒有描繪任意的連接物。實(shí)施例實(shí)施例1化合物的合成A.—般方法在ABI394合成儀上使用amidite轉(zhuǎn)移反應(yīng)以1ymol的規(guī)模合成寡核苷酸N3'—P5'氨基磷酸酯(NP)和硫代氨基磷酸酯(NPS)，各自根據(jù)McCurdy等(1997)TetrahedronLetters,38:207-210和Pongracz&Gryaz謂，(1999)TetrahedronLetters,49:7661-7664所述的方法。全部被護(hù)的單體結(jié)構(gòu)阻斷(blocks)是3'-氨基三苯甲基-核苷酸-5'-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基氨基)核苷氨基磷酸酯，尤其是3'-脫氧-胸苷，2',3'-二脫氧-N、異丁酰-鳥苷，2',3'-二脫氧-N氣苯甲酰-月泉苷，禾卩2'3'-二脫氧-N4-苯甲酰-胞苷，從Transgenomic,Inc.購買的(Omaha，Nebraska)。3'-氨基三苯甲基-5'-琥珀酰-核苷與含有氨基的長鏈控制多孔玻璃(LCAA-CPG)偶合并用作固體載體。以5'到3'的方向進(jìn)行合成。使用標(biāo)準(zhǔn)luM(ABIPerkinElmer)方法用碘氾20氧化歩驟合成具有NP主鏈的寡核苷酸，而使用硫?qū)嶒?yàn)方案制備具有NPS主鏈的寡核苷酸，其中乙腈:2,6-二甲基吡啶為1:1混合物的O.IM苯乙酰二硫化物(PADS)溶液用作硫化劑。用于制備兩種類型主鏈的偶合時(shí)間為25秒。THF:異丁酸酐2,6-二甲基吡啶的18:1:1混合物用作封端劑。使用三種方法來結(jié)合脂質(zhì)部分和寡核苷酸方法(0在合成儀上使用氨基磷酸酯試劑將脂質(zhì)部分引入3'端進(jìn)行偶合；方法(ii)使用改性的固體載體(示例于上述的示意圖C中)，在產(chǎn)生5'軛合物的延伸合成開始之前將脂質(zhì)基團(tuán)共軛于其上；和方法(m)游離3'-氨基的反應(yīng)，并且隨后在固體載體上去保護(hù)。以下提供了這些方法的更多詳細(xì)內(nèi)容。對于連接于3'端或核酸堿基的脂質(zhì)基團(tuán)，用濃縮的氨，或?qū)τ谶B接于5'端的脂質(zhì)基團(tuán)，用1:1的乙醇:濃縮氨的混合物，將寡核苷酸去保護(hù)，在55。C進(jìn)行6-8小時(shí)。在PharmaciaNAP-25凝膠過濾柱上將粗制產(chǎn)物脫鹽或用乙醇從1M氯化鈉中沉淀粗制產(chǎn)物，然后真空凍干。隨后使用BeckmanUltrasphereC18(5p)250X10mm柱通過反相HPLC將寡核苷酸產(chǎn)物純化。用線性梯度的50mM三乙胺醋酸鹽中的乙腈以2ml/分鐘的流速洗脫產(chǎn)物并用純凈的冷乙醇將其從1M氯化鈉中沉淀出來，轉(zhuǎn)化成鈉鹽。通過使用上述溶劑系統(tǒng)的分析RPHPLC和通過來測定PAGE化合物的純度。記錄VARIANUnityPlus400MHz設(shè)備上的'H和3'P質(zhì)譜并使用WATERSMicromassZMD質(zhì)譜儀獲得電噴霧離子質(zhì)譜(EMIMS)。B.脂質(zhì)基團(tuán)和寡核苷酸的共軛如上所述，可以使用各種方法來共軛脂質(zhì)部分和寡核苷酸。特定方法的詳細(xì)內(nèi)容如下方法(i)在該方法中，在寡核苷酸合成過程中作為3'核苷加入含有共軛的脂質(zhì)基團(tuán)的氨基磷酸酯試劑，致使脂質(zhì)基團(tuán)與寡核苷酸的3'端共軛。該方法舉例說明了含有兩個(gè)脂肪酸的氨基磷酸酯的合成和隨后的偶合。(i/a)3-棕櫚酰氨基-丙垸-1-0-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基氨基磷酸酯)的合成和偶合。向溶解于1:4的乙腈-二氯甲烷混合物中的l.OgU3.3mmo1)3-氨基-丙醇中，加入10ml的二異丙基乙胺和4.06ml(13.3mmol)的棕櫚酰氯。攪拌反應(yīng)過夜后，加入更多的二氯甲烷，然后依次用飽和的碳酸氫鈉、鹽水和水洗滌混合物。通過硫酸鈉干燥有機(jī)相并蒸發(fā)至干。將獲得的500mg(1.6mmo1)白色固體通過與干乙腈共蒸發(fā)來進(jìn)行共沸，并溶解于50ml二氯甲烷中。在加入l.lml二異丙基乙胺(4eq.)后，逐滴加入390ul(1.7mmo1)的2-氰乙基二異丙基氯代氨基磷酸酯。將反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)來得到澄清的溶液。依次用飽和的碳酸氫鈉和鹽水洗滌反應(yīng)混合物，通過硫酸鈉干燥并蒸發(fā)至干。通過硅膠色譜使用45:45:10v/v的乙酸乙酯:二氯甲烷:三乙胺溶劑系統(tǒng)來純化產(chǎn)物。在用于DNA合成儀之前，通過干燥器中的？205來干燥0.7g(90%)蠟狀固體。31PNMR(CDC13)148.45ppm，ESMS(MH+)514。為了在DNA合成儀上進(jìn)行偶合，在無水乙腈-二氯甲烷9:1的混合物中制備0.1M的溶液。該合成形成用于生產(chǎn)圖ID中所示軛合寡核苷酸的反應(yīng)(i/b)3-棕櫚酰氨基-l-羥基-丙垸-2-0-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基氨基磷酸酯)的合成和偶合將lgU0.97mmo1)3-氨基-丙二醇懸浮于10ml的吡啶中，逐滴加入3.017gU0.97mmo1)棕櫚酰氯的2mlDMF溶液并強(qiáng)烈攪拌。攪拌15分鐘后，將凝膠過濾并空氣干燥。從熱乙醇和熱2-丙醇中以白色粉末再結(jié)晶固體。將白色固體與吡啶共蒸發(fā)，然后溶解于30ml干吡啶中。加入2.89g(8.55mmo1)DMT-氯化物并將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，反應(yīng)后進(jìn)行TLC。用甲醇淬火后，將吡啶蒸發(fā)并由二氯甲烷-飽和碳酸氫鈉逐歩進(jìn)行反應(yīng)。使用4:1的己烷/乙酸乙酯作為洗脫劑，將所得到的油通過硅膠柱色譜純化。用吡啶共沸所得到的2.4gG.64mmo1)黃色油，溶于100ml二氯甲烷和4eq二異丙基乙胺(2.5ml)中。向攪拌的溶液中逐滴加入920p1(4mmo1)2-氯乙基二異丙基氯代氨基硫酸酯。反應(yīng)后進(jìn)行TLC并發(fā)現(xiàn)2小時(shí)后完成并如上逐步進(jìn)行。使用45:45:10的乙酸乙酯:二氯甲烷:三乙胺溶劑系統(tǒng)，通過硅膠色譜純化產(chǎn)物。在用于DNA合成儀上之前在干燥器中干燥獲得的固體(0.1M乙腈溶液)。31PNMR(CDC13)149.9，150.2ppm，ESMS(顯a+)854.57。該合成形成用于生產(chǎn)圖1AA中所示軛合寡核苷酸的反應(yīng)物。方法(ii)在該方法中，共軛脂質(zhì)部分的改性固體載體用作寡核苷酸5'至3'合成的起始點(diǎn)，形成5'軛合物。該方法舉例說明了兩種改性固體載體的合成和使用。(ii/a)3-棕櫚酰氨基-l-二甲氧基三苯甲基氧-2-琥珀酰氧-丙烷的合成將lg(10.97mmo1)3-氨基-l，2-丙二醇懸浮于10ml吡啶中。并逐滴加入3.017g(10.97mmo1)棕櫚酰氯的2mlDMF溶液并強(qiáng)烈攪拌。攪拌]5分鐘后，將凝膠過濾并空氣干燥。從熱乙醇和熱2-丙醇中以白色粉末再結(jié)晶固體。將白色固體與吡啶共蒸發(fā)，然后溶解于30ml干吡啶中。加入3.2g(9.46mmo1)DMT-氯化物并將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，反應(yīng)后進(jìn)行TCL。用甲醇淬火后，將吡啶蒸發(fā)并由二氯甲烷-飽和碳酸氫鈉逐步進(jìn)行反應(yīng)。將所得到的油通過硅膠柱色譜純化，使用4:1的己垸/乙酸乙酯作為洗脫劑。用吡啶共沸所得到的2.5gG.65mmo1)黃色油，然后加入475mg琥珀酸酐和483mg二甲基氨基吡啶并將反應(yīng)混合物攪拌l小時(shí)。通過TLC監(jiān)控反應(yīng)，且如果需要加入更多的琥珀酸酐。用冷的檸檬酸鈉緩沖液(pH=4)來洗滌二氯甲垸溶液并通過硫酸鈉干燥有機(jī)相，然后蒸發(fā)至干。獲得的終產(chǎn)物為2.0g(24.9%)。(ii/b)3-硬脂酰氨基-l-二甲氧基三苯甲基氧-2-琥珀酰氧-丙垸的合成將lg(10.97mmo1)3-氨基-丙二醇懸浮于10ml吡啶中，并逐滴加入3.32g(10.97mmo1)硬脂酰氯的10mlDMF溶液并強(qiáng)烈攪拌。攪拌15分鐘后，將凝膠過濾并空氣干燥。從熱乙醇和熱2-丙醇中以白色粉末再結(jié)晶固體。將白色固體與吡啶共蒸發(fā)，然后溶解于30ml千吡啶中。加入2.89g(8.55mmo1)DMT-氯化物并將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，反應(yīng)后進(jìn)行TLC。用甲醇淬火后，將吡啶蒸發(fā)并山二氯甲烷-飽和碳酸氫鈉逐歩進(jìn)行反應(yīng)。將所得到的油通過硅膠柱色譜純化，使用4:1的己烷/乙酸乙酯作為洗脫劑。將所得到的2.4g(3.64mmol)黃色油溶解于30ml二氯甲烷中，然后加入475mg琥珀酸酐和483mg二甲基氨基吡啶并將反應(yīng)混合物攪拌l小時(shí)。通過TLC監(jiān)控反應(yīng)，且如果需要加入更多的琥珀酸酐。用冷的檸檬酸鈉緩沖液(PH=4)來洗滌二氯甲烷溶液并通過硫酸鈉干燥有機(jī)相，然后蒸發(fā)至干。獲得的終產(chǎn)物為1.2g(14.4%)。然后將(ii/a)和(ii/b)中合成的產(chǎn)物共軛長鏈氨基控制的多孔玻璃(LCAA-CPG)來產(chǎn)生改性的固體載體，如下在100ml肽合成容器中，用干二甲基甲酰胺洗滌20g的LCAA-CPG(Transgenomic，Inc.,~200mmol/g-HN2裝載)。在分開的燒瓶中，將上述(ii/a)和(ii/b)中所述的5.55mmol產(chǎn)品溶解于40ml氯仿、3ml二異丙基乙胺中，并加入2.13g(8.3mmo1)2-氯-l-甲基吡啶碘。將該懸浮液倒過肽合成容器(具有活塞開口)中的干CPG直至通過CPG吸收約一半的溶液。然后關(guān)閉活塞和上端蓋子將容器搖晃直至溶液完全覆蓋CPG。(如果需要可以加入更多的氯仿，但是體積必需保持最小)。然后將容器放置于搖床上使反應(yīng)在室溫下過夜進(jìn)行。過濾CPG，然后用二氯甲垸、甲醇和乙腈洗滌。使用18:1:1THF-2,6-二甲基吡啶-異丁酸酐和CapB的1:1(N-甲基咪唑/THF)溶液在搖床上于室溫下1小時(shí)將未反應(yīng)的氨基封端。進(jìn)一步過濾后，用甲醇、二氯甲垸和乙腈洗滌珠子。通過測量使用甲醇高氯酸去封閉的樣品在498nm的二甲氧基三苯甲基陽離子吸收的標(biāo)準(zhǔn)方法確定裝載并發(fā)現(xiàn)為50-60umol/g。一旦產(chǎn)生改性的固體載體，將它們用于上述的寡核苷酸合成中。34該方法產(chǎn)生的寡核苷酸軛合物的實(shí)例顯示于圖1F、1G和1H中。方法(iii)在該方法中，完成寡核苷酸的合成而且其保持全部被護(hù)并束縛固體載體，3'端與脂質(zhì)基團(tuán)的酸酐(iii/a)、酸酐(iii/b)、酸(iii/c)或醛(iii/d)形式進(jìn)行反應(yīng)，如下。(iii/a)將含有游離3'-氮基的固體載體朿縛的全部被護(hù)的寡核苷酸(4umol)真空干燥并懸浮于3ml無水氯仿中。加入140u1(0.8mmo1)二異丙基乙胺和0.4mmol合適的?；?例如122u1棕櫚酰氯)后，混合物振蕩2分鐘并快速過濾，然后用氯仿、甲醇和乙腈洗滌。將干珠子懸浮于l-2ml濃縮的氫氧化銨中并在55。C下加熱5小時(shí)。然后將冷卻的氫氧化銨溶液過濾并蒸發(fā)。通過HPLC分離脂質(zhì)軛合產(chǎn)物。使用上述條件將產(chǎn)物洗脫約40分鐘。蒸發(fā)后，將產(chǎn)物從1M氯化鈉和乙醇中沉淀出來來獲得鈉鹽。(iii/b)向干的固體載體束縛的全部被護(hù)的寡核苷酸(lumol)中，加入O.lmmol合適的酐和170n1溶解于2ml氯仿中的二異丙基乙胺，并將含有混合物的小瓶放置于搖床上過夜。過濾后，如上用氯仿、甲醇和乙腈洗滌珠子，并將共軛的寡核苷酸去封閉并純化。(iii/c)在搖床上將lumol固體載體束縛的全部被護(hù)的寡核苷酸和O.lmmol合適酸的溶液、25mg2-氯-l-甲基吡啶碘(O.lmmol)和2ml氯仿中的170tU二異丙基乙胺反應(yīng)過夜。如上所述的進(jìn)行洗滌、去封閉和純化。(iii/d)將0.3mmo1所需酐的溶液、31.5mg氰基硼酸鈉和100ul0.5M醋酸鈉的2ml四氫呋喃加入到1umol固體載體束縛的全部被護(hù)的寡核苷酸中并放置于搖床上30分鐘。如上所述進(jìn)行洗滌、去封閉和純化。方法(iv)在該方法中，不將脂質(zhì)基團(tuán)共軛寡核苷酸的末端，而是共軛鏈上的核酸堿基，例如鳥苷。使用常規(guī)寡核苷酸鏈延伸實(shí)驗(yàn)方案合成這些化合物，如上所述，但是引入用共價(jià)軛合脂質(zhì)基團(tuán)改性的堿基，如圖2E中所示的，其中脂質(zhì)基團(tuán)共軛核酸堿基的化合物實(shí)例顯示于圖1Q和R中。實(shí)施例2化合物在生化和細(xì)胞基測試中的活性在生化Flashplate測試和細(xì)胞基測試中測試如在此所述的軛合寡核苷酸抑制端粒酶的能力，如上所述和Asai等(2003)中所述的。結(jié)果顯示于下表中。該表中，使用以下的縮寫寡核苷酸序列1=TAGGGTTAGACAA，與hTR，SEQIDNO:l的堿基42-54互補(bǔ)2二CAGTTAGGGTTAG，與hTR，SEQIDNO:l的堿基38-50互化學(xué)物質(zhì)NP表示具有氨基磷酸酯核苷酸間鍵合的寡核苷酸NPS表示具有硫代氨基磷酸酯核苷酸間鍵合的寡核苷酸軛合物5'表示脂質(zhì)部分共軛寡核苷酸的5'端3'表示脂質(zhì)部分共軛寡核苷酸的3'端人癌細(xì)胞類型(所有都來自ATCC):HT-3和A431:宮頸癌U-251:多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤DU145和LNCaP:前列腺癌Caki:腎透明細(xì)胞癌NCIH522:肺腺癌Ovcar:卵巢癌Hep3B:肝細(xì)胞癌<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>實(shí)施例3比較效用和生物利用率研究選擇本發(fā)明的兩種化合物，和非軛合寡核苷酸一起，分別進(jìn)行詳細(xì)研究。所選的化合物，圖示于圖9中，如下化合物A(未軛合)序列TAGGGTTAGACAA的硫代氨基磷酸酯寡核苷酸(該序列與hTR，SEQIDNO:l的堿基42-54互補(bǔ))(圖9A)。化合物B:共軛3'棕櫚酰胺的化合物A的寡核苷酸(圖9B)化合物C:共軛5'棕櫚酰胺-甘油-硫代磷酸酯的化合物A的寡核苷酸(圖9C)這個(gè)和以下的實(shí)施例中記載了對這些化合物的研究。下表顯示了當(dāng)與配對的RNA相結(jié)合時(shí)，這三種化合物中每種的熔化溫度(使用標(biāo)準(zhǔn)方法測定)，使用生化測試所測定的端粒酶抑制的IC5()值，使用細(xì)胞基(使用HT-3細(xì)胞)的測試所測定的端粒酶抑制的IC5()，如上所述。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>如表中所示的，未軛合寡核苷酸A對其目標(biāo)顯示出非常高的親和性，熔化溫度為70。C，生化測試中端粒酶抑制的IC5。為0.15nM(其中細(xì)胞吸收不是問題)。盡管化合物A具有良好的完整細(xì)胞吸收，以及在多個(gè)不同的腫瘤細(xì)胞系中(該實(shí)驗(yàn)HT-3細(xì)胞中1.6UM)具有端粒酶抑制的低微摩爾IC5。，這反映了相對于生化效能，在完整細(xì)胞中約有IO，OOO倍的效用丟失。脂質(zhì)基團(tuán)加入寡核苷酸的5'或3'端(各自化合物C和B)適度地降低了Tm，其在65.5-66.5。C下仍然保持非常高，并與未軛合化合物A相比較降低了生化效用6至11倍。然而，非常重要的是，與這些化合物的生化效用相比較，脂質(zhì)綴合化合物B和C在完整細(xì)胞中的效用僅降低100倍。更強(qiáng)細(xì)胞吸收的結(jié)果是，與未軛合寡核苷酸(化合物A)相比較，化合物B和C證明了HT-3細(xì)胞中效用至少提高了10倍。用其它類型的人癌細(xì)胞觀察到相似的結(jié)果。圖3和4，顯示了用化合物A、B和C各自在完整U251(人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)細(xì)胞和DU145(人前列腺癌)細(xì)胞中獲得的數(shù)據(jù)。在U251細(xì)胞中化合物C(5'-脂質(zhì)化形式)的IC5。比化合物A的約低10倍，在DU145細(xì)胞中約低38倍，證實(shí)了化合物C治療效率的提高。實(shí)施例4動(dòng)物模型的人腫瘤中端粒酶活性的抑制以下的實(shí)驗(yàn)中比較了非軛合寡核苷酸化合物A和脂質(zhì)軛合的寡核苷酸化合物C抑制動(dòng)物腫瘤生長中端粒酶的能力。在兩側(cè)用DU-145腫瘤細(xì)胞接種無胸腺(nu/nu)小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到50-100mmS大小時(shí)(兩個(gè)腫瘤/小鼠)，小鼠接受單尾靜脈注射PBS、FITC-標(biāo)記的化合物A，或FITL-標(biāo)記的化合物C(以40mg/kg給藥兩種化合物)。IV注射后24小時(shí)小鼠犧牲；收集一個(gè)腫瘤用于熒光顯像和另一個(gè)腫瘤用于通過TRAP測試的端粒酶活性分析。兩個(gè)治療組中的熒光水平是可比較的。然而，如圖5中所示，化合物C導(dǎo)致高于化合物A的端粒酶活性抑制。泳道中對應(yīng)于0.75ug腫瘤溶解產(chǎn)物的垂直箭頭表示這些樣品含有可比較含量的內(nèi)標(biāo)(通過水平箭頭來表示)。血液含有血色素和其它非特異性標(biāo)記聚合物抑制劑(用于端粒酶產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增中)，如通過凝膠左邊泳道中內(nèi)標(biāo)丟失來表示。然而，可以通過連續(xù)稀釋將這些非特異性抑制劑稀釋(降低反應(yīng)混合物中的腫瘤溶解產(chǎn)物)。在腫瘤溶解產(chǎn)物的最低濃度(右邊的三個(gè)泳道)，其中在全部三個(gè)處理?xiàng)l件下內(nèi)標(biāo)是可比較的，清楚的是化合物C抑制端粒酶活性的程度比可比較劑量的化合物A高。實(shí)施例5動(dòng)物模型中骨髓瘤蛋白含量的降低骨髓瘤患者的血漿含有特有的高含量(檢測為"骨髓瘤峰值"或M-蛋白)癌細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。M-蛋白含量的降低與疾病的緩解一致。該實(shí)驗(yàn)中，比較非軛合寡核苷酸化合物A和脂質(zhì)共軛的寡核苷酸化合物C注射入骨髓瘤細(xì)胞的動(dòng)物中后降低M-蛋白含量的能力。照射的NOD/SCID小鼠注射1(^CAG骨髓細(xì)胞然后通過腹膜內(nèi)(IP)注射PBS，化合物A的PBS或化合物C的PBS來進(jìn)行治療?；衔顰的劑量為25mg/kg/天(175mg/kg周X5周)；化合物C的劑量為頭2周25mg/kg/天，第三周停止，然后劑量為每周三天25mg/kg/天，持續(xù)兩周(五周內(nèi)平均劑量為100mg/kg/周)。治療的最后(培養(yǎng)后35天)，小鼠犧牲，并收集每組中的血漿(4-5只小鼠/組)用于測定骨髓瘤蛋白。如圖6中所示的，盡管化合物C的劑量低40。/c)(累積劑量為500mg對化合物A的875mg)，化合物C組證明了較低含量的骨髓瘤蛋白(將每只小鼠的值規(guī)格化)。實(shí)施例6動(dòng)物模型中人腫瘤生長的抑制以下實(shí)驗(yàn)中比較了非軛合寡核苷酸化合物A和軛合脂質(zhì)的寡核苷酸化合物C抑制動(dòng)物中腫瘤生長的能力。照射的NOD/SCID小鼠皮下接種CAG骨髓瘤細(xì)胞，腫瘤生長14天后用IP注射PBS、化合物A(25mg/kg/天M-F，或125mg/kg/周)或化合物C(25mg/kgMWF，或75mg/lcg/周)。如圖7所示，盡管劑量低40%，但化合物C證明了比化合物A高的抗腫瘤效率。(該研究中，以之前該模型中與抗腫瘤效率相關(guān)的劑量低30%的劑量來給藥化合物A，175mg/kg/周)。作為該研究的一部分，犧牲后研究了兩側(cè)CAG骨髓瘤，并分析端粒酶活性(通過TRAP測試)和通過DNA印跡分析TRF長度。如圖8中所示的，盡管以低40%的劑量給藥，但化合物C證明了腫瘤細(xì)胞中明顯更高的抑制端粒酶活性(降低83%)和端?？s短的誘導(dǎo)(2.85Kb平均TRP)。較高劑量的化合物A給予了較低的端粒酶抑制(41%)，并且隨著研究過程的流逝并沒有致使明顯的端?？s短。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>上述公開文本中提供的主題可以作為常規(guī)最佳化的主題來進(jìn)行改變，而沒有脫離本發(fā)明的精神或所附權(quán)利要求的范圍。序列表SEQ崎1ggg.yugegjgag|^|L^g§^ugggagg^^ugpiggosauuiiuyug橘糊s^a^a逸GUipgaagg,ugsg^gocgi^cuu國:g《yoGGC！gcpsfsyuuuu'ut^:i^gai。a。yuinipg,0。^s教s^:Gc^xu^JGcacegiiumtit^uagagetis婦caasa^aug^::趙geii,yg^2cc^uuc:geoc:euccegg9Q教21:0ea綱gc^gguc-瞬,eeG:縛^oeeg為效et⑧偶^n^，ag。eo，:g^uc^詳egggQt2utieyo^g敎ggca^《磁eug^ai^OTa鄉(xiāng)apiuggga^i^uo為，^乖ggpie^.ue鵬gg:og為糊e錢ggeoy:uus教gpc^fcapg為aga卸熟^gg這,sguec'ctfsp^gg0gegauy0c^yptfci^鄉(xiāng)420腦aSEc，o糊權(quán)利要求1.一種化合物，包括結(jié)構(gòu)O-(x-L)n，其中O是包括至少5個(gè)與人端粒酶RNA序列(SEQIDNO1)互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸；x是任意的連接物；L是脂質(zhì)部分；且n是1-5的整數(shù)，其中如果n＞1，每個(gè)(x-L)成分是可獨(dú)立選擇的。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中O包括至少10個(gè)與人端粒酶RNA序列(SEQIDNO:l)互補(bǔ)的堿基。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中L是選自取代的或未取代的脂肪酸或固醇的脂質(zhì)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物，其中L是氟取代的脂肪酸。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中L是取代的或未取代的烴。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其中L是氟取代的烴。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中n=l且x-L部分共價(jià)共軛寡核苷酸0的5'端。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中n=l且(x-L)部分共價(jià)共軛寡核苷酸0的3'端。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中n=2，一個(gè)獨(dú)立選擇的(x-L)部分共價(jià)共軛5'端以及一個(gè)獨(dú)立選擇的(x-L)部分共價(jià)共軛3'輛。10.根據(jù)權(quán)利要求]所述的化合物，軛寡核苷酸o的核酸堿基。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，N3'—P5'氨基磷酸酯鍵合。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，N3'—P5'硫代氨基磷酸酯鍵合。其中n=]且(x-L)部分共價(jià)共其中寡核苷酸的核苷酸間鍵合是其中寡核苷酸的核苷酸間鍵合是13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中寡核苷酸包括至少10個(gè)與人端粒酶RNA序列(SEQIDNO:l)互補(bǔ)的堿基。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中寡核苷酸的核苷酸間鍵合是N3'—P5'硫代氨基磷酸酯鍵合；O的序列包括至少12個(gè)與人端粒酶RNA序列(SEQIDNO:l)互補(bǔ)的堿基；n=l;(x-L)共價(jià)共軛0的5'或3'端；禾口L是脂肪酸。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的化合物，其中x是甘油或氨基甘油連接16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的化合物，其中化合物的結(jié)構(gòu)是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的化合物，其中L通過酰胺鍵直接連接寡核苷酸L的3'端。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的化合物，其中化合物的結(jié)構(gòu)是:19.一種抑制端粒酶酶活性的方法，該方法包括使端粒酶與根據(jù)權(quán)利20.—種抑制細(xì)胞中端粒酶酶活性的方法，該方法包括使細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物接觸。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。22.—種抑制癌細(xì)胞增殖的方法，該方法包括使細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物接觸。23.—種藥物組合物，包括配制于藥物學(xué)上可接受的賦形劑中的根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物。24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物在醫(yī)學(xué)中的用途。25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物用于治療癌癥的用途。全文摘要本發(fā)明公開了包括共價(jià)共軛脂質(zhì)部分的寡核苷酸部分的化合物。寡核苷酸部分包括與人端粒酶的RNA成分互補(bǔ)的序列。該化合物高效抑制細(xì)胞中的端粒酶活性并具有優(yōu)良的細(xì)胞吸收特性。文檔編號A61K48/00GK101293908SQ200810098490公開日2008年10月29日申請日期2004年9月9日優(yōu)先權(quán)日2003年9月9日發(fā)明者K·蓬格拉茨,S·格里亞茲諾夫申請人:杰龍公司