專利名稱：端粒酶陽性細胞中端粒長度的調(diào)節(jié)和癌癥治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥治療領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及端粒酶陽性細胞 中端粒延長的調(diào)節(jié)。更特別地，本發(fā)明涉及包括更昔洛韋(GCV)、 阿昔洛韋(ACV)及其酯前藥在內(nèi)的無環(huán)(acyclic)核苷類似物在 干擾端粒延長、誘導(dǎo)細胞凋亡以及治療或預(yù)防端粒酶陽性癌癥中的用途。
背景技術(shù)：
的"終結(jié)問題"i。為了克服這個問題，真核染色體具有特化的末端結(jié) 構(gòu)，即由TTAGGG重復(fù)組成的端粒2。端粒酶"是延長端粒并因此 在細胞倍增期間保持大多數(shù)癌細胞的染色體穩(wěn)定性的核糖核蛋白酶 5。在細胞倍增期間DNA從端粒末端的逐漸損失與體細胞中細胞增 殖潛力的控制有關(guān)6。
正常培養(yǎng)的人類細胞在培養(yǎng)中具有有限的復(fù)制潛力。培養(yǎng)中的正 常細胞進行復(fù)制直到它們達到群體生長停止的離散點。這被稱為死 亡期1 (Ml期)，是由于少數(shù)端?？s短到導(dǎo)致被稱為細胞老化的生 長停滯的大小而引起的。這個階段能夠通過消除p53和pRB人腫瘤 抑制基因的功能而被繞過。之后該細胞可繼續(xù)增殖而端粒長度進一 步變短，直到另一個被稱為死亡期2 (M2期)或轉(zhuǎn)折期的限制點。 在M2期的生長停滯是由細胞增殖和細胞死亡速率之間的平衡引起 的。在這個階段，當(dāng)大多數(shù)端粒非常短的時候，末端到末端的融合和染色體斷裂-融合引起顯著的染色體異常和細胞凋亡。在很少情 況下，細胞能夠脫離M2并通過穩(wěn)定其端粒的長度而變?yōu)闊o限增殖
的。這通過端粒酶活化或替代的端粒延長機制(ALT)而發(fā)生7，8。
人類生殖系細胞9和多數(shù)癌細胞3表達端粒酶。端粒酶是延長端
粒并因此在細胞倍增期間保持大多數(shù)癌細胞的染色體穩(wěn)定性的核糖 核蛋白酶1Q。實際上，端粒酶對已縮短的端粒的延長是人類癌細胞 中端粒維持的主要機制。端粒酶的抑制通過縮短端粒的長度而限制 人類端粒酶陽性癌細胞的生長"。
通過端粒酶延長已縮短的端粒是在人類癌細胞中維持端粒的眾 所周知的機制。從生物學(xué)的觀點來看，端粒酶在細胞分裂過程中通
過在端粒的末端添加TTAGGG型的重復(fù)DNA序列(端粒序列)來 延長端粒。通過這種作用，端粒酶提供了染色體穩(wěn)定性，并且使細 胞成為無限增殖的。為了獲得作為研究該酶的有用工具的選擇性抑 制劑，已經(jīng)在無細胞系統(tǒng)中研究了核苷類似物的抑制作用 (Yamaguchi 等,(2001, Nucleic Acids Research Supplement No. 1 211-212)。由于增殖的細胞(包括癌細胞)表達端粒酶活性，而正常 人體細胞不象在癌細胞中所見到的那樣以足以在多次細胞分裂中維 持端粒長度的水平表達端粒酶活性，因此端粒酶是治療增生性疾病 (包括癌癥)的良好靶標(biāo)。
當(dāng)前，以選擇性治療由端粒酶陽性細胞引起的癌癥為目標(biāo)的策略 涉及通過反義策略、顯性失活突變體或藥理藥物來調(diào)節(jié)TERT的功 能或端粒的長度(見，Bisoffi等，Eur J Cancer, 1998, 34 : 1242-1249; Roth等，Leukemia, 2003,17 : 2410-2417; Damm等，EMBO J.， 2001, 20: 6958-6968;美國專利6,294， 332、 6,194,206、 6,156,763禾口 6,046,307)。 已經(jīng)嘗試用核苷類似物(例如AZT)干擾人端粒酶活性以達到治療 癌癥的目的。然而現(xiàn)有技術(shù)中公開的為了改變端粒酶活性而施用核 苦類似物的方法不能令人滿意，或者不適合臨床情況，因為它們的 臨床應(yīng)用受到低治療比(即毒性劑量與有效劑量之比)的限制。
在藥物濃度為 100 |uM (Murakami, J., Nagai. N., Shigemasa. K.,Ohama. K. Inhibition of telomerase activity and cell proliferation by a reverse transcriptase inhibitor in gynaecological cancer cell lines. ￡J CVwcer 35， 1027-1034 (1999))或甚至800 jliM (Gomez DE, Tejera AM， Olivero OA-Irreversible telomere shortening by 3'-azido-2'，3'-dideoxythymidine (AZT) treatment. B/0c/2e/w Bz'op/zj^ Cbmww". 1998; 246(1》107-10; Tejera AM, Alonso DF, Gomez DE, Olivero OA. Chronic in vitro exposure to 3'-azido-2': 3'-dideoxythymidine induces senescence and apoptosis and reduces tumorigenicity of metastatic mouse mammary tumor cells. Sreas"/ Way r簡/. 2001;65(2):93-9)時，端粒酶陽性細胞系長時間暴露于AZT不 能誘導(dǎo)任何明顯的端?？s短。
服用300 mg單口服劑量的AZT后的血清濃度峰值小于10 fiM, 而在0.5小時內(nèi)快速吸收(Morse GD, Olson J, Portmore A, Taylor C, Plank C, Reichman RC. Pharmacokinetics of orally administered zidovudine among patients with hemophilia and asymptomatic human immunodeficiency virus (HIV) infection. /l /7Wra/ 1989 Mar;
U(2):57-65)。按照Retrovir (AZT)生產(chǎn)商的推薦，標(biāo)準(zhǔn)AZT治療為， 對于成人，每天以兩次或三次分開的劑量給予500或600 mg。已經(jīng) 報道在體外和體內(nèi)甚至短時間暴露于濃度為5 iaM的AZT也誘導(dǎo)不 希望的對哺乳動物細胞的毒性作用(Roskrow M, Wickramasinghe SN. Acute effects of 3'-azido-3'-deoxythymidine on the cell cycle of HL60 cells. //aema/o/. 1990; 12(2): 177-84)?；谶@些才艮道，可以
預(yù)測核苷類似物如AZT在足以提供抗端粒酶和抗腫瘤效力的高劑量 時可能具有高毒性，并且導(dǎo)致對人體中重要組織的損害。因此，需 要確定對人端粒酶具有調(diào)節(jié)或抑制活性的治療性核苷類似物，并且 發(fā)展針對端粒酶51起無限增殖及不希望的增殖的癌癥的治療方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供含有抗病毒核苷類似物的組合物和它們用于調(diào)節(jié)、抑 制或阻止真核細胞端粒酶活性以及治療增生性疾病(包括癌癥)的
病毒劑和抗巨細胞病毒劑活性的核普類似物可以改變增殖細胞(包 括癌細胞)中的端粒酶活性，因此起抗腫瘤劑的作用。在本發(fā)明的 一個方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用更昔洛韋或阿昔洛韋處理端粒酶陽性細胞誘
導(dǎo)進行性的端粒丟失、G2期停滯、染色體異常和最終的細胞死亡
進一步，這些抗腫瘤核苷類似物對端粒酶具有驚人的效果，其臨 床可接受的水平在增殖的細胞中足以控制端粒酶活性并且誘導(dǎo)細胞 死亡。這些發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在為以端粒酶活性為特征的癌癥(端粒酶陽性癌 癥)的治療或預(yù)防提供了新的治療途徑。
當(dāng)前，在應(yīng)用中還沒有基于無環(huán)、抗端粒酶和抗肺瘤核苷類似物 的治療性組合物。申請人第一次披露了使用無環(huán)核苷類似物(在此 也被稱為端粒酶的抑制劑或拮抗劑)在體內(nèi)抑制端粒酶在治療上具 有益處。而且，在該公開之前，本領(lǐng)域技術(shù)人員沒有認(rèn)識到可以預(yù) 測這種處理具有治療上的用途。
由于端粒酶參與控制細胞周期、細胞復(fù)制和老化，本發(fā)明的含有 核普類似物的組合物可以阻止或控制不受控制的細胞生長和腫瘤細 胞的無限增殖。本發(fā)明的組合物特別可用于治療細胞增殖性疾病， 特另'J是以端粒酶保持端粒為特征的人類胂瘤。
因此，一方面，本發(fā)明提供了一種治療與端粒酶有關(guān)的、特別是 細胞中端粒酶活性水平升高的疾病的方法。該方法包括給細胞或需 要治療的哺乳動物施用 一 種組合物，該組合物含有治療有效量的至 少一種為無環(huán)、抗端粒酶和抗胂瘤劑的核苷類似物。端粒酶活性水 平可以如下所述測定，或者通過任意其他現(xiàn)有的方法或等同的方法 測定。端粒酶活性的"升高的水平"是指特定細胞中端粒酶活性的 絕對水平與受試者或個體的正常細胞相比升高，或者與未患該疾病 的其他受試者或個體的正常細胞相比升高。這些疾病的例子包括癌 性疾病，或與通常不存在于個體中的細胞的存在有關(guān)的疾病。在一
個實施方案中，組合物含有除AZT、 ddl、 ddA、 d4T以外的核苷類 "f以4勿(Strahl C, Blackburn EH. Effects of reverse transcriptase inhibitors on telomere length and telomemse activity in two immortalized human cell lines.
M /CW/腸/. 1996;16(l):53-65)。優(yōu)選地，該組合物含有GCV或ACV 或它們的前藥。在另一實施方案中，這些組合物還可含有臨床上可 接受的水平的AZT。這些端粒酶抑制劑(直接抑制端粒酶活性或間 接整合到端粒中從而阻止端粒進一步延長)的應(yīng)用將導(dǎo)致在端粒酶 具有活性的胂瘤中端粒進行性縮短。 一旦端粒長度縮短到臨界長度， 腫瘤就進入轉(zhuǎn)折期并最終死亡。這些端粒酶抑制劑對正常體細胞沒 有影響或者只有極小的影響，因為正常細胞中的端粒酶活性通常較 低或者檢測不到。
干擾端粒酶活性可能直接導(dǎo)致細胞死亡或者可能加強化療劑最 終通過凋亡殺死細胞的效應(yīng)。具體地，本發(fā)明提供一種通過施用端 粒酶抑制劑和拮抗劑來抑制具有細胞數(shù)持續(xù)增長潛力的端粒酶表達 細胞增殖的方法。核普類似物的施用可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的任何期望的方法來實現(xiàn)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供一種在需要預(yù)防的哺乳動物或 個體(例如人)中預(yù)防以端粒酶表達為特征的癌癥的方法。該預(yù)防 方法包括給該哺乳動物施用治療有效量的組合物。該組合物含有本 發(fā)明的端粒酶抑制劑或拮抗劑。該抑制劑或拮抗劑阻斷端粒酶陽性 細胞中端粒的延長，由此抑制端粒酶表達細胞的增殖。該抑制劑是 無環(huán)核普類似物或這種類似物的藥學(xué)上可接受的鹽或富含該抑制劑 或拮抗劑的液體或固體食材。食品可以是，例如，黃油、人造黃油、 餅干、面包、蛋糕、蜜餞、糖果、酸奶酪或其他發(fā)酵乳制品、或適 于人類消費的谷類食品形式的功能性食物?；蛘呖梢允菭I養(yǎng)補充物、 營養(yǎng)物、藥品、食品、營養(yǎng)品、健康食品和/或特制食品。周期性地 測試人體中端粒酶陽性細胞的存在。 一旦在哺乳動物中不再檢測到 端粒酶陽性細胞，即可以停止使用抑制劑或拮抗劑。
除了治療方面以外，本發(fā)明還提供用于檢測病理性增殖的表達端 粒酶的細胞的診斷方法和試劑盒。本發(fā)明的這些和其他實施方案將
會在下文更為詳細地描述。


圖l說明用1.5 iuMGCV處理端粒酶陽性HeLa細胞系IO天后顯 示端粒長度縮短、大規(guī)模凋亡和細胞周期改變的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)。 未處理的細胞-上圖，處理過的細胞-下圖。
圖2說明用3 |uM ACV處理端粒酶陽性NuTu-19細胞系14天后 顯示端粒長度縮短、大規(guī)模凋亡和細胞周期改變的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)。 未處理的細胞-上圖，處理過的細胞-下圖。
圖3說明顯示用1.5 pM GCV處理10天的HeLa (上圖)和 NuTu-19 (下圖)細胞中細胞周期分布改變的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)。未處 理的細胞-灰色，處理過的細月包-黑色。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供涉及使用能夠干擾哺乳動物端粒酶活性的核苷類似 物的組合物和方法。特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些核苷類似物在臨床上可 接受的水平時可以影響細胞中的端粒/端粒酶功能。特別地，在本發(fā) 明的上下文中，"核苷類似物"是與天然存在的核苷具有結(jié)構(gòu)相似 性的化合物，但是僅限于無環(huán)類似物。本發(fā)明中涉及的無環(huán)核苷類 似物具有嘌呤(或嘧啶)骨架，該骨架具有一個尾部分(例如鳥嘌 呤中存在的9-(1,3-二羥基-2-丙氧曱基))，但是缺乏羥環(huán)(戊糖)。 本發(fā)明的類似物的例子包括但不限于如下化合物阿昔洛韋、更昔 洛韋、噴昔洛韋及相應(yīng)的前藥，即，分別為伐昔洛韋、纈更昔洛韋、 泛昔洛韋。阿昔洛韋's通過模擬細胞DNA組分鳥嘌呤起作用。鳥嘌 呤即DNA的AT-GC中的"G"。阿昔洛韋(9-[2(羥曱氧基)-曱基] 鳥。票呤)盡管在結(jié)構(gòu)上類似于"G",但是它的尾部一羥"環(huán)"(戊
糖)缺失，因此為"無環(huán)的，，。更昔洛韋13'14'15和噴昔洛韋'6''7也是 "無環(huán)的"，因為它們?nèi)狈αu環(huán)。在本發(fā)明的一個實施方案中，本 發(fā)明的無環(huán)核苷類似物的尾部具有至少 一個羥基，該羥基模擬核苷 的2'-脫氧核糖部分的3，-和5，-羥基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的無環(huán)核苷類 似物表現(xiàn)出抗端粒酶和抗腫瘤性質(zhì)，具有臨床上可接受程度的毒性。
無環(huán)核苷類似物阿昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋及相應(yīng)的前藥，即 伐昔洛韋、纈更昔洛韋、泛昔洛韋，均被批準(zhǔn)為臨床應(yīng)用的抗病毒 藥。它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和對抗病毒感染的劑量方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員 公知的。
盡管阿昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋及相應(yīng)的前藥作為治療皰疹
病毒或/和CMV感染的抗病毒藥是眾所周知的，但是它們在肺瘤疾 病中的應(yīng)用還是未知的。本領(lǐng)域中還知道這些抗皰滲病毒藥的目標(biāo) 酶是DNA聚合酶。
本發(fā)明表明無環(huán)抗病毒劑也可以針對增殖的細胞和腫瘤中的真 核細胞端粒酶。相信這些藥物一旦進入增殖的細胞內(nèi)即成為磷酸化 (例如二磷酸鹽和三磷酸鹽)形式，并且與端粒酶反應(yīng)的天然底物 (例如dGTP)竟?fàn)?。磷酸化類似物可以抑制天然底物向正在延長的 端粒DNA鏈中的整合，或者其本身可以整合到DNA中，由此干擾 端粒酶介導(dǎo)的聚合活性，最終導(dǎo)致鏈延長終止。實質(zhì)上，這些核苷 類似物通過鏈延長終止損害端粒DNA、縮短端粒并且導(dǎo)致細胞凋亡。 對端粒的損害對于快速生長的(例如腫瘤)細胞比對于正常細胞
具有更大的傷害。
已經(jīng)報道抗HIV和抗皰滲核苷類似物只有在從核苷磷酸化為核 苷酸的階段后才具有活性。因此，磷酸化可能是核苷類似物針對其 靶標(biāo)的活性的關(guān)鍵因素。在這方面，已經(jīng)報道AZT需要三次連續(xù)的 磷酸化才能具有針對端粒酶的活性。
本發(fā)明的無環(huán)核苷類似物是比現(xiàn)有技術(shù)已知的抗端粒酶核苷類 似物如AZT更強并且選擇性更高的抗端粒酶藥物；與核苷類似物如 AZT相比，其臨床上可接受的劑量18'19'2°，21'22足以實現(xiàn)抗端粒酶活性 和細月包凋亡或細月包死亡。
在更昔洛韋(GCV)和阿昔洛韋(ACV)治療后誘導(dǎo)端粒酶陽 性癌細胞的端粒縮短、G2/M停滯(在此也稱為G2停滯)和細胞凋 亡^口下所述進4亍。
為了檢測兩種細胞系(HeLa和NuTu-19)中的端粒酶特異性活
性，進行實時TRAP測定。報道的端粒酶陽性細胞系(HeLa)用于 進行比較4。在該試驗中兩種細胞系都為陽性(數(shù)據(jù)未顯示)。
用治療濃度的GCV ( 1.5 |uM)或ACV (3.0 )liM )處理端粒酶陽 性細胞系，以證明細胞內(nèi)的端粒DNA合成能夠被抑制，由此誘導(dǎo)端 粒縮短。GCV或ACV處理的和未處理的細胞中的端粒長度通過流 式細胞術(shù)使用端粒特異性肽核酸(PNA )探針進行測量23'24。為了檢 測細胞周期分布，將細胞用二碘化丙錠(PI)染色23。在兩種處理 14天后，兩種細胞系都證明有端?？s短、大規(guī)模凋亡和G2停滯(圖 1和圖2 )。
為了證明細胞周期分布的改變，用GCV或ACV處理HeLa和 NuTu-19細胞14天，用PI染色，同時通過流式細胞術(shù)分析。結(jié)果顯 示細胞周期的G2停滯(圖3)。重要的是注意到其改變是快速的并 且只在ACV處理14天后檢測到。相反，核苷類似物AZT對端粒酶 陽性細胞HeLa和NuTu-19中的端粒長度或細胞周期分布沒有影響， 甚至在升高的濃度例如100pM時也是如此(數(shù)據(jù)未顯示)。
同時，PI染色證明GCV或ACV處理的細胞在處理后期比未處 理的細胞有更高的DNA含量。這一事實的合理解釋是短端粒誘導(dǎo)了 染色體的末端-末端連接25。
細胞系的來源是子宮頸(HeLa)和上皮卵巢(NuTu-19)。細胞 在37°C、 5% C02的潮濕環(huán)境中在添加有10%胎牛血清的D-MEM培 養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了用GCV處理細胞，培養(yǎng)基中添加1.5 的GCV (Cymevene, Hoffman-La Roche )。為了用ACV處理細月包，培養(yǎng)基 中添加3 |iM的阿昔洛韋(Aciclovir, TEVA Pharm. Ind. Ltd, Israel)。
實時TRAP測定如述進行(Wege等，SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity. A^c/e/H/A M 2003;31(2):E3-3 )。
為了通過流式細胞術(shù)進行端粒長度測量，如Rufer, N.， Dragowska, W.， Thombury G.， Roosnek， E.， Lansdorp P.M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations were measured by flow cytometry. iVa .
歷ofec/z"o/. 16, 743-747 (1998))所述，將細胞用端粒特異性FITC偶聯(lián)的 (C3TA2)3PNA (Applied Biosystems)探針染色，并且用0.06 |ag/ml PI復(fù)
染。人淋巴細胞亞群中的端粒長度動力學(xué)通過流式細胞術(shù)檢測。A^. 腸tec/mo/, 16, 743-747 (1998》。
因此，在此已經(jīng)在廣泛接受的模型系統(tǒng)中證明了核苷類似物 GCV和ACV顯然可阻斷端粒酶陽性癌。決不能i/v為有用的端粒酶
和衍生物。實際上，可以證明根據(jù)本公開內(nèi)容設(shè)計和合成的大多數(shù) 有用的藥理化合物將是第二代衍生物或進一步化學(xué)修飾的無環(huán)核普
類似物。
盡管沒有提到通過本發(fā)明可能實現(xiàn)的有利應(yīng)用，但是以前為了治 療CMV(巨細胞病毒)感染而給AIDS或其他免疫缺陷患者施用GCV 意味著GCV可以容易地給癌癥患者施用。
進一步地，當(dāng)前大量無環(huán)核苷類似物對于HSV和CMV患者的 應(yīng)用，結(jié)合這些類似物以明顯較低劑量使用的能力，應(yīng)當(dāng)加快管理 部門對阿昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋及相應(yīng)的前藥(即伐昔洛韋、 纈更昔洛韋和泛昔洛韋)用于治療端粒酶誘導(dǎo)的和/或介導(dǎo)的癌癥的 批準(zhǔn)。
本發(fā)明還包括各種動物模型的使用。通過開發(fā)或分離表達端粒酶 的細胞系，能夠在各種實驗動物中產(chǎn)生疾病模型。這些模型可以采 用皮下、正位(orthotopic)或全身細胞施用，以才莫擬各種疾病狀態(tài)。例 如，可以將HeLa細胞系皮下注射進棵鼠體內(nèi)以獲得端粒酶陽性腫 瘤。產(chǎn)生的腫瘤在端粒重復(fù)擴增法(TRAP)分析中應(yīng)當(dāng)顯示端粒酶 活性。這樣的動物模型也提供了分別以及組合檢測核苷類似物的有 用工具。
確定一種化合物的體內(nèi)有效性包括不同的標(biāo)準(zhǔn)，包括但不限于存 活率、腫瘤消退、腫瘤進展的停滯或延緩、腫瘤消失以及轉(zhuǎn)移的抑 制或阻止。
用試驗化合物治療動物包括給動物施用適當(dāng)形式的化合物或組合物。本發(fā)明的藥物組合物、抑制劑或拮抗劑可以通過多種途徑施 用，包括但不限于口服、非腸道、經(jīng)鼻、口腔、直腸、陰道或局部。 此外，也可通過氣管內(nèi)滴注、支氣管滴注、皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、 腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射來施用。特別預(yù)期的是全身性靜脈內(nèi)注射、通 過血液或淋巴供應(yīng)的局部給藥和腫瘤內(nèi)注射。
本發(fā)明的組合物在許多方面是重要的。它們在端粒酶相關(guān)癌癥的 治療方案中至關(guān)重要，無論在癌癥治療中是單獨給藥，還是與本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的化療和/或放療方案相組合。另外，這些組合物僅 僅通過降低端粒酶活性，就將有助于選擇性誘導(dǎo)癌細胞的大規(guī)模凋 亡。
核苷類似物可以在生理學(xué)或藥學(xué)可接受的載體中施用于宿主來 治療增生性疾病等。藥學(xué)可接受的載體部分取決于待給藥的特定組 合物，以及用于施用該組合物的特定方法。
在本發(fā)明的 一 個方面，提供了預(yù)防或治療哺乳動物由于存在不恰 當(dāng)或病理性增殖的細胞或無限增殖的細胞而引起的疾病的方法。這 些不恰當(dāng)或病理性增殖的細胞或無限增殖細胞獨立于細胞的正常調(diào) 控機制而存在并復(fù)制。這些細胞是病理性的，因為它們由于細胞元 件即端粒酶的活性而不同于正常細胞。當(dāng)然，這里所使用的術(shù)語"不 恰當(dāng)增殖的細胞"有可能是良性的高度增殖細胞，但是除非另作說 明，否則這些細胞是指多種腫瘤和癌癥特有的惡性高度增殖細胞。
特別地，提供了預(yù)防或治療以表達端粒酶為特征的人類腫瘤的方 法。人類腫瘤包括胃癌、骨肉瘤、肺癌、胰腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌或 黑素瘤、脂肪癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、結(jié)締組織 癌、子宮癌、生殖器癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、 一見網(wǎng)膜癌、血液和'淋巴 癌、腎癌、膀胱癌、結(jié)腸癌和前列腺癌。才艮據(jù)本發(fā)明，疾病的預(yù)防 和治療是通過使用本發(fā)明的無環(huán)核普類似物(端粒酶的抑制劑或拮 抗劑)而獲得的。用于本發(fā)明的抑制劑或拮抗劑直接或間接地與端 粒酶相互作用從而抑制其活性，和/或被整合到端粒中并因此阻止端 粒進一步延長，盡管功能性端粒酶因此抑制了表達端粒酶的細胞的
生長。這樣，端粒酶的抑制劑或拮抗劑用于抑制細胞的生長。例如， 當(dāng)給患者施用端粒酶的抑制劑或拮抗劑時，這引起表達端粒酶的細 胞的進行性端?？s短、細胞周期停滯、和/或大規(guī)模凋亡。在本發(fā)明 中，術(shù)語"抑制生長，，或"生長的抑制，，也可以指減少或阻止細胞分裂。 在本發(fā)明中，表達端粒酶的細胞生長的抑制可以是大約100%或小于 100%，但不是0%。例如，與對照細胞(對照細胞表達端粒酶但是
不用抑制劑或拮抗劑處理)相比較，可以抑制大約10%至大約100 %,優(yōu)選至少約25%，更優(yōu)選至少約50%,再更優(yōu)選至少大約90 %、 95%或正好100%。生長的抑制能夠用本領(lǐng)域已知的任何方法來 檢測。例如，可以將被處理樣品中的活細胞數(shù)與對照樣品中的活細 胞數(shù)進行比較，與活性染料一起孵育后進行測定。另外，生長抑制 可通過能夠檢測體外或體內(nèi)細胞增殖減少的測定方法來檢測，例如 氮化氫摻入測定、BdU摻入測定、MTT分析、形成病灶的能力的改 變、貼壁依賴性或喪失無限增殖能力、喪失腫瘤特異性標(biāo)記、和/或 當(dāng)被注射進動物宿主體內(nèi)時不能形成或抑制腫瘤(Dorafshar等，2003, J Surg Res.， 114 : 179-186; Yang等，2004, Acta Pharmacol Sin., 25: 68-75)。
人體中從單個或幾個這種無限增殖化細胞發(fā)展為癌性腫瘤可能 要幾個月至幾年。但是通過實施本發(fā)明，癌癥能夠被預(yù)防，因為用 端粒酶抑制劑處理的致肺瘤端粒酶陽性細胞在有機會生長為腫瘤之 前就喪失了其增殖能力。而且，在有癌癥的臨床表現(xiàn)之前，給危險 人群定期預(yù)防性施用端粒酶抑制劑或拮抗劑以停止腫瘤的進展可以 有效地顯著降低新發(fā)癌癥病例的速度。
核普化合物可以通過任何給藥途徑(包括口服)單獨給藥或者與 不同類似物聯(lián)合給藥。核苷類似物ACV、 GCV或其L-valil酯纈更 昔洛韋(V-GCV)和伐昔洛韋(V-ACV)是優(yōu)選的核苷類似物。它
們都是可以購買到的，其制劑在大量專利和出版物中已有描述。
具有端粒酶活性的細胞應(yīng)當(dāng)被選擇性地耙向，因為這些細胞依賴 于端粒酶來延長或保持端粒，并且端粒的延長或保持需要核苷和/或其類似物與端粒酶相互作用。需要任何特定的靶向試劑來遞送類似 物，以實現(xiàn)抗癌效果，這里預(yù)期使用靶向ACV或GCV和/或其他類 似物。因此，在一些實施方案中，藥物組合物可能具有已經(jīng)連接到
靶向試劑(例如肽)上的活性化合物，在該情況下為ACV和GCV 或另 一種核苷類似物，用于專門遞送給特定的靶細胞或細胞內(nèi)的核部分。
特定端粒酶抑制劑或拮抗劑的劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員在進 行常規(guī)實驗后確定。在給患者給藥之前，其效力可以在標(biāo)準(zhǔn)實驗動 物模型中顯示。在這方面，可以使用本領(lǐng)域公知的任何端粒酶誘導(dǎo) 的癌癥的動物模型(Hahn等，1999， Nature Medicine, 5(10): 1164 - 1170; Yeager等，1999， Cancer Research, 59(17): 4175-4179)。將接受本發(fā)明方 法治療的受試者或患者優(yōu)選地是人，且可以是胎兒、兒童或成人。 可被治療的其他哺乳動物可以是小鼠、大鼠、兔子、猴子和豬。
抑制劑或拮抗劑可單獨施用，或與其他化學(xué)療法(即，基于非核 苷類似物的抗癌劑)包括放射療法聯(lián)合使用。例如，端粒酶誘導(dǎo)的 癌癥的治療可與化學(xué)和/或放射性療法相結(jié)合來治療由端粒酶或一些 其他因素誘導(dǎo)的癌癥。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化療劑的實例包括但 不限于抗癌藥物，例如博來霉素、絲裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、 5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿嘧啶脫氧核苷(5-FUdR)、曱氨喋呤(MTX)、 秋水仙堿和己歸雌酚(DES)。為了進行聯(lián)合治療，以在動物或患 者體內(nèi)有效導(dǎo)致其組合抗癌作用的方式給動物施用與另一種抗癌劑
(化學(xué)或放射)組合的本發(fā)明的抑制劑成分。因此應(yīng)以有效導(dǎo)致其 在輩巴細胞區(qū)域中組合存在的有效量和時間段來提供該藥劑。為了達 到這個目的，該藥劑可以同時給藥，在化療劑的情況下，在單一組 合物中或使用不同給藥途徑作為兩個不同的組合物同時給藥?；蛘?， 兩個治療可以先后進4于，例如間隔幾分鐘到幾小時或幾天。例如4旦 不限于，全身使用的GCV的平均每天劑量可以是，對成年人為每天 100mg/kg,對于小鼠和嬰兒是每天50mg/kg。
一定的劑量上的變化可依照被治療對象的狀況而進行。負責(zé)給藥
的內(nèi)科醫(yī)生將能確定用于患者個體的合適劑量，并且可依賴于多個 因素，例如，所述患者的年齡、狀況、病史等。
因此，本發(fā)明的方法能夠用于與端粒酶誘導(dǎo)的病理性細胞增殖有 關(guān)的狀況和疾病的治療應(yīng)用?？蓮谋景l(fā)明的治療應(yīng)用中受益的疾病 包括，以細胞高度增殖為特征的所有疾病，包括(例如)實體瘤和 白血病，以及非癌癥狀況。進一步預(yù)期本發(fā)明的方法不^f又在體內(nèi)背 景下，而且在離體(ex vivo)條件下，能夠用于抑制癌細胞的生長。 本發(fā)明的方法對于抑制病理性增殖的人細胞的離體生長尤其有用， 包括但不限于人癌細胞-骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺 皮質(zhì)癌、或黑素瘤。癌癥治療領(lǐng)域公知的骨髓凈化是用于抑制病理 性增殖人細胞生長的離體治療的實例。
本發(fā)明提供用于鑒定由細胞中端粒酶表達引起的不適當(dāng)?shù)?、病?性或非正常增殖的細胞的方法和試劑盒。該方法能夠用作篩選方法， 通過確定患者組織中端粒酶表達的存在(和/或水平)幫助診斷患者 中癌細胞或肺瘤的存在，其中端粒酶表達的存在指示患者體中有癌 細胞或病理性的細胞增殖。
例如，癌性腫瘤樣品能夠根據(jù)它們不能在本發(fā)明的無環(huán)核苷類似 物存在下增殖而得到診斷。該診斷可進一步包括通過多種方法測定
端粒酶特異性的mRNA表達，這些方法包括但不限于利用核酸的 雜交、Northern印跡法、原位雜交、RNA樣i陣列、RNA保護分析、 RT-PCR、實時RT-PCR，或通過多種方法測定端粒酶催化亞單位編 碼的蛋白質(zhì)的存在，該方法包括^旦不限于Western印跡法、免疫沉 淀或免疫組化、或端粒酶的酶活性(TRAP測定及其變型4'26'27)。
在優(yōu)選的實施方案中，針對端粒酶催化亞單位RNA的核酸探針 能夠被用來檢測經(jīng)歷快速增殖的組織中端粒酶催化亞單位RNA mRNA水平的存在和/或增加，所述組織例如是原發(fā)癌細胞，包括人 骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌或黑素瘤。因此， 本發(fā)明提供使用與端粒酶亞序列互補的核酸纟笨針來才企測和確定病理 性增殖的細胞(包括癌細胞)的方法。例如，確定病理性增殖的細
胞的方法可包括用針對hTERT mRNA的核酸纟笨針來將^r測細胞中 hTERT mRNA的表達水平與對照細胞中hTERT mRNA的表達水平 進行比較。當(dāng)觀察到hTERT的表達水平與對照細胞相同時，檢測細 胞就被確定為病理性增殖細胞。然而，本發(fā)明的方法中4吏用的核酸 探針也可以基本上互補于人、小鼠或其他哺乳動物的hTERT mRNA 序列。
對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的是，可以在核酸探針中進 行不會影響該探針有效檢測病理性增殖細胞(例如癌細胞)中hTERT mRNA的能力的取代，且因此這種取代是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。用 于本發(fā)明方法中的核酸探針可以是DNA探針、或修飾的探針，例如 肽核酸探針、硫代磷酸探針、或2'-0曱基探針。核酸探針的長度可 以是大約8或10個到50個核苷酸，優(yōu)選大約15到25個核苷酸長 度。本發(fā)明的方法可以在來自人、哺乳動物、或其他脊推動物的細 胞提取物、培養(yǎng)的細胞、或組織樣品中很容易地進行。
本發(fā)明的方法可用于檢測由于端粒酶在體外細胞、細胞培養(yǎng)物、 以及人細胞和組織例如實體瘤和癌(例如人骨肉瘤、乳腺癌、卵巢 癌、肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、或黑素瘤)中表達而引起的不恰當(dāng)?shù)摹?病理性或非正常增殖的細胞。
本發(fā)明也提供檢測和/或抑制高度增殖細胞或癌細胞的試劑盒。 該試劑盒可具有ACV、 GCV、纈更昔洛韋、伐昔洛韋、或其他無環(huán) 核苷類似物，和/或具有與hTERT mRNA的亞序列完全互補或基本互 補的核酸探針。
本發(fā)明的藥物組合物、抑制劑或拮抗劑能夠以多種方式給藥，包 括口服、局部、非腸道給藥，例如皮下、腹膜內(nèi)、通過病毒感染、 血管內(nèi)給藥等。根據(jù)導(dǎo)入的方式，化合物可以多種方式配制。適用 于口服給藥的制劑可以是液體溶液。適用于非腸道給藥(例如通過 關(guān)節(jié)內(nèi)、心室內(nèi)、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途 徑)的制劑包括含水和非含水的、等滲無菌注射溶液。在本發(fā)明的 實踐中，組合物能夠通過例如靜脈輸液、口服、局部、非腸胃或腹
膜內(nèi)給藥。口服和非腸胃給藥是優(yōu)選的給藥方法。配制和給藥的技
術(shù)是本領(lǐng)域常規(guī)的，進 一 步的細節(jié)可見于例如"Remington's Pharmaceutical Sciences (2000), Gennaro AR (ed)， 20th edition, Maack Publishing Company, Easton， PA。
治療有效量(或有效量)或藥理學(xué)有效量是本領(lǐng)域公知的措辭， 是指藥物產(chǎn)生預(yù)期藥理學(xué)效果的有效劑量。例如，治療有效量是足
以隨時間在患者中產(chǎn)生有益治療反應(yīng)(即，治療疾病或狀況或緩和 被治療患者中疾病的癥狀)的量。無環(huán)核苷類似物(或其組合物) 的治療有效量是在測定中與未處理細胞的水平相比有效重復(fù)地誘導(dǎo) 癌細胞中端?？s短、G2停滯和/或大規(guī)模凋亡的量。無環(huán)核苷類似物 (或其組合物)的治療有效量也指會降低、減少、抑制或以其他方 式消除癌細胞生長的無環(huán)核苷類似物的量。該量優(yōu)選地是獲得所需 效果且沒有明顯副作用的優(yōu)化劑量。如下文進一步詳細描述的，也 可根據(jù)所施用的特定抑制劑或拮抗劑的效果和患者的狀況，以及被 治療患者的體重或表面積來確定劑量。劑量的大小也可根據(jù)對特定 患者施用(例如)特定試劑、載體或轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞類型所伴隨的任何不 良副作用的存在、特性和程度來確定。
能夠防止、抑制或減少端粒酶介導(dǎo)的癌癥發(fā)病率的藥物的治療有 效量，利用來自在此公開的細胞培養(yǎng)分析和/或來自利用動物模型的 體內(nèi)分析所獲得的數(shù)據(jù)，是很容易確定的。也能夠利用動物模型來 評估對人體的合適劑量范圍和給藥途徑。在轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床環(huán)境之前， 荷有人源實體瘤的實驗動物(或本領(lǐng)域公認(rèn)的動物模型)經(jīng)常被用 來優(yōu)化合適的治療劑量。已知這些模型在預(yù)測有效的抗癌策略方面 是非?？煽康?。例如，荷有實體瘤的小鼠是本領(lǐng)域公認(rèn)的小鼠模型， 被廣泛用于臨床前試驗，以確定獲得有益抗腫瘤效果而毒性最小的 治療劑的工作范圍。由于在本領(lǐng)域公認(rèn)的模型中已經(jīng)證實了安全性， 至少對于在端粒酶介導(dǎo)的癌癥中使用的核苷類似物來說，本發(fā)明的 臨床前檢測主要是常規(guī)實驗。體內(nèi)效果可利用測量腫瘤形成(進展)、 腫瘤消退或轉(zhuǎn)移等的抑制的試驗來預(yù)測。
以下描述了利用從人HeLa癌細胞系生長的凈果鼠皮下(s.c.)胂瘤 (即，攜帶異種移植物的小鼠)作為模型測定ACV和/或GCV抗腫 瘤效力的示例性體內(nèi)測定。
體內(nèi)測定需要的人癌細胞例如可如下制備從公共來源獲得端粒 酶陽性HeLa人細胞系。細胞于37。C， 5% C02的潮濕空氣中保持在 補充有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。
對于體內(nèi)檢測，獲得合適的宿主，例如大約5-7周齡的棵鼠 (肌/mO ,保持于不含病原體的環(huán)境中。將包含在200(il無血清培 養(yǎng)液中的大約lx106個HeLa細胞通過體側(cè)皮下注射(s.c.)輸送給 用甲氧氟烷(Metofane)暫時麻醉的全部動物。之后小鼠被分為試驗 組和對照纟且。
在一個實施方案中，評估皮下肺瘤生長或進展時間的影響，而不 是已建立肺瘤的大小的縮減。在這個實施方案中，從第0天開始， 試驗組中的小鼠在飲用水中任意獲得GCV。水中GCV的濃度可以 是2mg/ml。每3天提供GCV的新鮮溶液。對照組中的小鼠只接受 飲用水。每2-3天測量腫瘤。當(dāng)腫瘤超過l cm3時，處死小鼠。月中 瘤體積用公式4/3兀一計算，其中r是腫瘤的半徑。對照組中的所有小 鼠均長出肺瘤，而試驗組中的全部小鼠保持沒有腫瘤。
體內(nèi)測定如下進行給棵鼠皮下注射HeLa細胞(3xl05)，以證 明體內(nèi)端粒酶陽性腫瘤發(fā)展的預(yù)防和治療。人癌HeLa細胞培養(yǎng)物購 自ATCC?？偣?2只CDl/-nu和12只NMRil/-nu棵鼠購自Charles River Laboratories, Charles River Deutschland GmbH。給這些棵鼠皮下 注射3><105個HeLa細胞。實驗組從第0天開始在飲用水中接受纈更 昔洛韋。具體地，實驗組小鼠(每抹6只小鼠)從第0天開始接受 飲用水中的Valcyte (纈更昔洛韋)(1 mg/ml)。對照組和治療組中 的所有小鼠都發(fā)生腫瘤。在大約14天時，所有小鼠都有腫瘤。經(jīng) Valcyte單一治療，治療組中有 一只小鼠的腫瘤開始消退，到大約第 30天，其腫瘤消失。治療組中的其他小鼠證明肺瘤生長緩慢(穩(wěn)定)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的試劑和方法可用于促進攜帶預(yù)先
已建立的腫瘤的免疫活性動物體內(nèi)肺瘤的消退；即，本發(fā)明的試劑 可用來治療具有預(yù)先存在的胂瘤的動物。在這種情況下，將癌性106 NuTu-19細胞皮下注射入Fisher大鼠的側(cè)腹來建立肺瘤。腫瘤細月包 植入后一旦肺瘤建立，即隨意給試驗組大鼠施用含有GCV(或ACV) 的組合物，例如在飲用水中的溶液，而對照組大鼠接受不含該藥物 的相同組合物(例如蒸餾水)。每2-3天監(jiān)測腫瘤生長。當(dāng)給這些 荷瘤動物施用GCV (或ACV) 21-28天時，觀察到腫瘤生長遲緩。 這種肺瘤細胞生長的抑制在對照組中未發(fā)現(xiàn)。治療開始幾周后，只 有用GCV處理的動物顯示100%的存活率。
在另一個實施方案中，也可使用測定凋亡增強的體內(nèi)分析。在這
個實施方案中，可檢測用治療性組合物治療的帶有異種移植物的動 物中凋亡灶的存在，并與未治療的帶有異種移植物的對照動物相比 較。在治療組動物的腫瘤中發(fā)現(xiàn)凋亡灶的程度提供了關(guān)于該組合物 治療效果的指示。
從上述示例性體內(nèi)測定顯然可以看出，使用基于非核苷類似物的 抗癌劑(例如博來霉素、絲裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶
(5-FU)等，如上列出)或放射治療的聯(lián)合治療不是本發(fā)明需要的。 無環(huán)核苦類似物的單獨使用或與不是無環(huán)的核苷類似物聯(lián)合使用足 以誘導(dǎo)癌細胞的端?？s短、G2停滯和/或大規(guī)模凋亡，因此足以實現(xiàn) 僅僅一周以上的肺瘤生長延遲(或者足以明顯減少肺瘤生長延遲)。 因此，在一些方面，本發(fā)明不涉及基于非核苷類似物的抗癌劑或放 射治療的應(yīng)用。另外，在本發(fā)明的一些方面(治療或預(yù)防胂瘤生長 的方法)，不包括或者不使用以下核苷類似物HPMPC [(S)-1-[3-羥基_2—(磷酸曱氧基)丙基]胞嘧啶];為腺嘌呤衍生物的HPMPA或 9-(2-[膦甲氧基乙基])(PMEA,阿德福韋)，它們是腺嘌呤或鳥嘌呤的 衍生物(PMEG) , 2-6二氨基噤呤(PMEDAP)、環(huán)丙基PMEDAP
(cPr-PMEDAP )。
本發(fā)明包括基于端粒酶抑制劑的癌癥治療在本領(lǐng)域公知的影響 皮膚、結(jié)締組織、脂肪、乳腺、肺小細胞肺癌和非小細胞肺癌
(NSCLC)、胃(胃癌)、胰腺、卵巢、子宮頸、子宮、腎、膀胱、
結(jié)腸、前列腺、肛門生殖器、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、視網(wǎng)膜和血 液和淋巴(在前體T細胞、前體B細胞、生殖中心細胞、活化T細 胞或里-施細胞中CDK9/CYCLIN Tl表達引起的淋巴瘤)、病毒相關(guān) 癌癥(HBV相關(guān)癌癥、EBV-相關(guān)癌癥、HCV-相關(guān)癌癥、HPV-相關(guān)
癌癥)的多種胂瘤和癌癥以及在本文其他部分才是到的其他癌癥中的 應(yīng)用。然而， 一方面，本發(fā)明不包括本領(lǐng)域7>知的病毒相關(guān)癌癥的
治療或預(yù)防。
在設(shè)計用于治療人端粒酶介導(dǎo)的癌癥(早期胂瘤和血管化的腫 瘤)的藥物的適當(dāng)劑量時，可從本文描述的動物研究外推而容易地 獲得臨床給藥的合適劑量。為了獲得這種轉(zhuǎn)換，需考慮每單位質(zhì)量 的實驗動物所施用的藥物質(zhì)量，優(yōu)選考慮實驗動物和人類患者之間 體表面積的差異。所有這些計算對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是已知 和常規(guī)的。因此，治療有效量的確定是本領(lǐng)域技術(shù)人員力所能及的。
例如，采用在細胞培養(yǎng)測定和小鼠研究中成功的GCV或ACV (V-GCV或V-ACV )劑量，以及基于質(zhì)量和表面積進行標(biāo)準(zhǔn)計算， 用于成人患者的有效劑量是每個患者每天大約1000 mg到大約 6000mg的GCV或ACV，優(yōu)選每個患者每天大約500 mg到大約1000 mg的V-GCV或V-ACV。因此，利用這些信息，在此預(yù)期用于人類 給藥的治療劑(例如阿昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋及相應(yīng)的前藥， 即，伐昔洛韋、纈更昔洛韋、泛昔洛韋)的低劑量可以是每個患者 每天大約l、 5、 10、 20、 25或大約30mg等；用于人類給藥的治療 劑的有用高劑量可以是每人每天大約250、 300、 400、 450、 500或 大約600 mg等。有用的中等劑量可以是每個患者大約40mg到大約 200mg。
盡管有這些提到的范圍，但是應(yīng)當(dāng)理解，考慮到這里所述的參數(shù) 和詳細指導(dǎo)，活性或最佳范圍的進一步變化也包括在本發(fā)明的范圍 內(nèi)。本發(fā)明的治療方案的目的總體上是產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效果，同 時仍然將劑量保持在與不可接受的毒性相關(guān)的水平以下。除了改變
劑量本身外，也可改變給藥方案以優(yōu)化治療策略。目前優(yōu)選的一種
治療策略是在大約60天的期限內(nèi)施用大約1 - 500mg、優(yōu)選大約 10-lOOmg的端粒酶抑制劑或拮抗劑或包含它們的治療性混合物，大 約4次。例如，可以在大約第1、 3、 4天和第6天或第7天給予劑 量?？赏ㄟ^口服單個或分開的劑量給藥，或例如直接向?qū)嶓w瘤部位 給藥，或以緩釋制劑形式給藥。負責(zé)給藥的醫(yī)師根據(jù)本發(fā)明所公開 的內(nèi)容，將能夠為受試個體確定合適的劑量、給藥的形式和途徑。 這種優(yōu)化和調(diào)整是本領(lǐng)域常規(guī)進行的，不需要過多的實驗。在施用 特定劑量本身時，根據(jù)關(guān)于無菌性、致熱原性、純度和對人類患者 全身性的 一般安全性的管理標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選提供藥物學(xué)上可接受的組合 物。當(dāng)然，身體檢查、胂瘤測量和實驗室檢測應(yīng)在治療前進行，并 且在治療后以最多l(xiāng)到幾個月的間隔進行，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 知道如何進行這種常規(guī)程序。臨床反應(yīng)可通過任何可接受的測量來 確定。例如，在治療后特定期間內(nèi)全部可測量的腫瘤均消失可以確 定為％全有效。
下列編號為1 -27的參考文獻在上述說明書中被引用(帶有相應(yīng) 的上標(biāo)號)，如此本領(lǐng)域的技術(shù)人員會將該參考文獻與上文中適當(dāng) 的上標(biāo)號相對應(yīng)。
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說明書中提到的全部出版物、專利和專利申請體現(xiàn)本發(fā)明所屬領(lǐng) 域的技術(shù)人員的水平。全部出版物、專利和專利申請在此引入作為 參考，其程度同于每個單獨的出版物或?qū)＠暾埦唧w且分別地引入 作為參考。盡管前述發(fā)明已經(jīng)為了清楚理解的目的通過舉例說明和
實施例進行了詳細描述，但是顯而易見的是可在所附權(quán)利要求書的 范圍內(nèi)實現(xiàn)某些變化和修改。
權(quán)利要求
1.一種在哺乳動物或人體中預(yù)防或治療由于存在不恰當(dāng)或病理性增殖的細胞或無限增殖細胞而引起的疾病或治療癌癥的方法，該方法包括向患有癌癥的人施用治療有效量的包含一種或多種無環(huán)核苷類似物或其藥學(xué)可接受的鹽的組合物，其中所述核苷類似物誘導(dǎo)所述細胞中的端?？s短。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述核苷類似物選自阿昔洛韋、 更昔洛韋和噴昔洛韋或其前藥。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥選自骨癌、乳腺癌、前 列腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、腦癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、 皮膚癌、白血病、黑素瘤、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、^L網(wǎng)膜癌、或 膀胱癌。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物通過口服、非腸道、皮 下、月幾肉內(nèi)或l爭月永內(nèi)施用。
5. 權(quán)利要求2的方法，其中施用包含兩種或多種所述核苷類似 物的組合物。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述核苷類似物之一的施用量為每 天大約10mg/kg體重到大約150mg/kg體重。
7. 權(quán)利要求l的方法，其中所述核苷類似物與不同類型的類似 物聯(lián)合施用，該不同類型的類似物選自3，-疊氮-2'，3，-雙脫氧胸苷(AZT ) 、 2', 3'-雙脫氧肌苷(ddl) 、 2',3'-雙脫氫-3'-脫氧胸苷(d4T ), 其中該不同類型的類似物以低劑量存在，其單獨時不足以治療癌癥。
8. —種減少端粒酶陽性癌細胞中端粒延長的方法，該方法包括 給細胞施用有效量的無環(huán)核苷類似物，其中所述核苷類似物誘導(dǎo)所 述細胞中的端?？s短。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述核苷類似物選自阿昔洛韋、 更昔洛韋和噴昔洛韋或其前藥。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述核苷類似物與不同類型的類似物聯(lián)合施用，該不同類型的類似物選自3，-疊氮-2',3，-雙脫氧胸苷 (AZT ) 、 2', 3'-雙脫氧肌苷(ddl) 、 2'，3'-雙脫氫-3'-脫氧胸普(d4T )，其中該不同類型的類似物以低劑量存在，其單獨時不足以終止端粒 的延長。
11. 權(quán)利要求8的方法，其中所述癌細胞是乳腺癌細胞、前列腺 癌細胞、肝癌細胞、骨癌細胞、胰腺癌細胞、肺癌細胞、腦癌細胞、 卵巢癌細胞、子宮癌細胞、睪丸癌細胞、皮膚癌細胞、白血病細胞、 食管癌細胞、胃癌細胞、結(jié)腸癌細胞、視網(wǎng)膜癌細胞、或膀胱癌細 胞或這些細胞的組合。
12. —種防止或抑制端粒酶陽性細胞生長的方法，該方法包括使 細胞接觸足量的無環(huán)核普類似物，從而實現(xiàn)所述細胞中端?？s短、 G2停滯和細胞凋亡的誘導(dǎo)。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中細胞與濃度為大約1.5pM至3.0)LiM 的核苷類似物接觸。
14. 權(quán)利要求12的方法，其中所述核苷類似物是阿昔洛韋、更 昔洛韋或噴昔洛韋或其前藥。
15. 權(quán)利要求12的方法，其中所述端粒酶陽性細胞是癌細胞， 其中該癌細胞選自骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、腎上腺皮質(zhì) 癌和黑素瘤。
16. —種對需要的人預(yù)防癌癥的方法，其中所述癌癥是由于該人 細胞中的端粒酶活性引起的，該方法包括給所述人施用治療有效量 的含有一種或多種無環(huán)核苷類似物或其藥學(xué)可接受的鹽的組合物， 其中所述核苷類似物削弱或阻止致腫瘤端粒酶陽性細胞有機會生長為癌。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述癌癥選自骨癌、乳腺癌、 前列腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、腦癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、 皮膚癌、白血病、黑素瘤、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、視網(wǎng)膜癌、或膀胱癌。
18. —種促進端粒酶陽性癌細胞中的細胞凋亡的方法，包括給所 述細胞施用治療有效量的含有一種或多種無環(huán)核苷類似物或其藥學(xué) 可接受的鹽的組合物，其中所述核苷類似物誘導(dǎo)所述細胞中的端?？s短。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述核苷類似物誘導(dǎo)G2停滯。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述癌細胞是乳腺癌細胞、前列 腺癌細月包、肝癌細月包、骨癌細月包、胰腺癌細月包、肺癌細胞、腦癌細 胞、卵巢癌細月包、子宮癌細胞、睪丸癌細月包、皮月夫癌細胞、白血病 細胞、食管癌細胞、胃癌細胞、結(jié)腸癌細胞、視網(wǎng)膜癌細胞、或膀 胱癌細胞或這些細胞的組合。
全文摘要
本發(fā)明公開了使用無環(huán)核苷類似物誘導(dǎo)端粒酶陽性癌細胞的端粒縮短、G2停滯和細胞凋亡。另外，還公開了削弱或防止致腫瘤端粒酶陽性細胞有機會生長為腫瘤的方法，以及使用無環(huán)核苷類似物促進腫瘤消退(形成的腫瘤的尺寸縮小)的方法。
文檔編號A61K31/685GK101193643SQ200680015221
公開日2008年6月4日 申請日期2006年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月25日
發(fā)明者I·E·博恩達爾耶夫 申請人:Alt解決方案公司