專利名稱：信號蛋白質(zhì)和肽的漸進修飾，超激動劑與拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的科學領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物活性蛋白質(zhì)和肽的化學修飾技術(shù)的領(lǐng)域。特別是關(guān)于應(yīng)用化學修飾以得到具有優(yōu)良的性質(zhì)或具有新的甚至拮抗性質(zhì)的蛋白質(zhì)或肽。且，本發(fā)明還涉及一種用漸進化學修飾，一種生物原則，作結(jié)構(gòu)-功能分析的新方法，也就是信號肽的催化活性及成功的消除導致為一種很有效的急性骨髓性白血病細胞的抑制劑。
如所說明，但并非作為局限，我們出示人類IL-3的化學修飾，一種經(jīng)修飾后也具實質(zhì)的治療價值的蛋白質(zhì)。本專利說明書也包括本發(fā)明治療范圍內(nèi)的特定實例。應(yīng)用的方面有兩個對一發(fā)明來說是重要的可能應(yīng)用方面一個方面是具有優(yōu)良性質(zhì)的IL-3(超激動劑)或另一方面是具有相反作用或新的性質(zhì)的IL-3(拮抗劑)。在本專利說明書中超激動劑為例如一種具有低抗原性和/或較高生物活性和/或較高穩(wěn)定性的IL-3。
IL-3超激動劑的可能應(yīng)用為-脊髓切除治療后，如骨髓移植誘導治療后或放射意外事故后的紅細胞相減少。
-具有IL-3受體的細胞同步細胞周期的誘導，例如白血病的化學治療。
-從細胞的數(shù)量和細胞的活性兩方面增強依賴IL-3的細胞后代的誘導，用于治療疾病如蠕蟲感染，結(jié)核病真菌感染和某些病毒感染。
-選擇性的向除淋巴細胞外的含核細胞派生骨髓，例如用于燒傷和非同源的皮膚移植。
一些，但非所有的，信號物質(zhì)拮抗劑(具有拮抗或細胞抑制活性)的應(yīng)用實例，特別是IL-3，為-骨髓移植中骨髓細胞的抑制和/或中和(neutralization)。
-自動免疫疾病，癌癥和造血器官中的髓抑制，如鐮刀細胞貧血和地中海貧血(thallisemia)。
-治療涉及具有IL-3受體細胞的所有癌癥，特別是幾乎所有類型的急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病，B-細胞淋巴癌，和被IL-3刺激的其他類型的癌，例如某些濾泡細胞癌。
-向自動免疫性疾病如關(guān)節(jié)炎，風濕性關(guān)節(jié)炎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的組織通過抑制或消除含有IL-3受體的淋巴細胞來誘導自身耐受性。這也能導致效應(yīng)器細胞如嗜酸性粒性白細胞的生成減少和消除。最后，與這些細胞的直接相互作用使其直接治療嗜酸性細胞綜合癥也是可能的。這在蠕蟲感染急性期和例如對醫(yī)藥的過敏性反應(yīng)也是非常重要的。
-例如用殺死效應(yīng)器細胞或抑制其數(shù)目治療嗜酸性細胞綜合癥如嗜酸性細胞胃炎和腸炎，肋膜炎，肉芽腫，竇炎，肺炎，哮喘，Churg Strauss綜合癥和其他脈管炎休克綜合癥的處治。
-消除或抑制具有IL-3受體的細胞，如淋巴細胞和/或效應(yīng)器細胞如嗜酸性粒性白細胞，以治療過敏癥。在這些情況下抑制過敏，和誘導對抗原的耐受性兩者都是可能的。
-其他涉及IL-3作用的過敏性反應(yīng)。
-處治以阻止由IL-3調(diào)節(jié)的粘連刺激的轉(zhuǎn)移。
-處治傳染性疾病，例如抑制在血流中有過量生長因子存在的急性期。
-由抑制B-細胞和B-細胞抗體的產(chǎn)生(它們保護HIV-病毒對抗宿主細胞的抵抗)治療HIV-感染和/或AIDS。
對其它生長因子，如其它白細胞介素1-8，GM-CSF，TNF和γ-IFN，上述這些應(yīng)用的一種或多種也可以提述，這些生長因子也是按照本發(fā)明修飾的良好候選物。以此“IL-3”將被其他信號物質(zhì)所代替。因為各種不同物質(zhì)在各種疾病中的相互作用模式可以因物質(zhì)而不同，也可發(fā)生一些協(xié)同的效應(yīng)。所以這些也包括在本發(fā)明中。最后，可以增加或特指下列的應(yīng)用。
-抑制IL-1以抑制IL-1刺激的黑素瘤的轉(zhuǎn)移和肺癌的形成。
-抑制IL-1以抑制阿爾茨海默疾病。
-抑制IL-2以抑制毛細血管破裂綜合癥。
-抑制IL-2以抑制牙周炎。
-抑制IL-4以抑制牙周炎。
-抑制IL-4以抑制IL-4刺激的病毒，例如小鼠的放射白血病病毒。
-抑制IL-5以抑制IL-5刺激的呼吸道感染。
-抑制IL-6以抑制風濕性關(guān)節(jié)炎。
-抑制IL-10抑制分枝桿菌感染。
體內(nèi)的實例表明存在有效地抑制AIDS-病毒感染的可能性。這種抑制是基于減低抗體水平，這是由抑制產(chǎn)生抗體的B-細胞而達到的。這種能導致有效的抑制AIDS的事實可歸因于下列的原因(1)HIV-病毒感染間質(zhì)(hystiocytic)細胞(巨噬細胞樣細胞)，這種感染優(yōu)選的是經(jīng)抗體的調(diào)理素作用。趨巨噬細胞性和這些間質(zhì)細胞感染的必要性以持續(xù)感染已在AIDS Res.and Human Retroviruses 9669(1993)和參考文獻中加以描述。減少抗體水平，這種類型的感染可被抑制。(2)拮抗體能夠保護HIV和/或HIV-感染的細胞，抵抗細胞的免疫性。這解釋了HIV感染無癥狀期的總體抵抗力的缺陷，盡管在體外中和抗體水平很高并顯示出細胞的抵抗力。如實例中所說明的，抗體水平的降低能造成有效的細胞免疫性以對抗病毒和病毒感染的細胞并甚至消除病毒。因此，例如以拮抗劑抑制B-細胞，能導致HIV感染的治療。
因為也可由分子生物學產(chǎn)生修飾的信號蛋白質(zhì)，因此這些突變的蛋白質(zhì)，DNA-組建和它們的用途也被認為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，應(yīng)是可以理解的。以此，可以包括含有這種肽和/或蛋白質(zhì)密碼組建的基因治療?；蛑委煹挠猛驹谟诋a(chǎn)生和排泄超激動劑或拮抗劑的細胞。所以，在一個實例中也有關(guān)于組建具有減低穩(wěn)定性的生長因子可能性的細致工作。這特別能夠用于與拮抗作用的聯(lián)合，形成一種選擇性給藥，因此，拮抗劑的高速降解能將作用限制在很局部的環(huán)境中。這在實體腫瘤的基因治療中特別有興趣，如果有這樣一個細胞在腫瘤中或靠近腫痛，特別是此腫瘤將經(jīng)受最大效應(yīng)的暴露。如果產(chǎn)生的信號肽有附加的不穩(wěn)定性，那么肽的效應(yīng)會非常受局限，則可期望其產(chǎn)生很少的副反應(yīng)。在實例中有一個是說明產(chǎn)生低穩(wěn)定性的信號肽是可能的。因為這種肽也能用缺失和/或取代突變產(chǎn)生，因此這種基因治療的應(yīng)用和基因治療組建也被認為是包括在本發(fā)明應(yīng)用的范圍之內(nèi)的。
本專利說明書在化學修飾的應(yīng)用，蛋白酶處理和質(zhì)譜法方面也詳細說明。這種方法可應(yīng)用于每一種肽或蛋白質(zhì)的每一個修飾，只要它能夠特異性地例如用蛋白酶斷裂。本說明書的定量的結(jié)構(gòu)-功能分析部分包括漸進化學修飾，蛋白酶處理，激光解吸質(zhì)譜法與生物測定成功的聯(lián)合應(yīng)用。所以，此方法應(yīng)用于任何能被修飾的，特異性斷裂的和具有生物活性的肽和/或蛋白質(zhì)的分析，也被認為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。也可能應(yīng)用其他的質(zhì)譜分析技術(shù)如電子噴射質(zhì)譜法，這種方法特別適合于例如用外蛋白酶(exoprotease)處理后。
最后，本發(fā)明的說明書也公開了帶有多于一價電荷的金屬離子，特別是鋅離子的重要性，其重要性特別表現(xiàn)在催化活性和隨之而來的效用方面。因此由控制(局部)金屬離子的濃度來影響生長因子的作用是可能的。因為一般金屬離子濃度的效應(yīng)有最適宜值，所以任何低于或超出此適宜值的濃度均導致生長因子效用的降低。這可以控制生長因子的效用。用這種方法也可用金屬，優(yōu)選的為鋅離子，達到間接治療的效果。這可用油膏的形式治療皮膚疾病，如Wrath′s。使用吸入噴霧劑型用于治療肺部疾患也是可能的。本發(fā)明的背景人類白細胞介素-3白細胞介素-3，首次由T-細胞中分離出來，為一種糖蛋白，表明作用于骨髓細胞。已經(jīng)表明在有或沒有其他生長因子的情況下，可以由這些骨髓細胞誘導各種血液細胞的形成。人類IL-3在1987年被Dorssers等人克隆，它們應(yīng)用人類cDNA庫并與小鼠DNA探針雜交(Gene 55115(1987))。人類白細胞介素-3的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系已經(jīng)發(fā)表了一些關(guān)于人類白細胞介素-3的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的文章(J.Biol.Chem.26621310(1991)；J.Clin.Invest.901879(1992)；J.Immunol.14683(1991)；EMBO J.102125(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8911842(1992))。
在他們的研究中，他們?nèi)际褂梅肿由飳W技術(shù)，如缺失和取代突變的生成。在應(yīng)用取代突變時，選擇是基于IL-3與其他種類(小鼠，羅猴，猴，長臂猿)氨基酸的同源性，或基于慎重改變極性或結(jié)構(gòu)。缺失突變時是通過除去蛋白質(zhì)的各部分，考察其生物活性的重要性。因為涉及突變蛋白質(zhì)(突變蛋白)精制的實際問題，這些突變蛋白質(zhì)均未核對其主結(jié)構(gòu)的變化。這是一個主要的問題，因為這些結(jié)構(gòu)的變化通常是會發(fā)生。如所描述的，有時它們甚至是有意引入的。結(jié)果，關(guān)于涉及各種氨基酸與生物活性的關(guān)系，只能在有最大的保留的情況下才能說明。
本發(fā)明用不同的途徑。天然的IL-3用為起始原料。使用逐步漸進地增加修飾，在化學反應(yīng)中引入超選擇性。與第一次生物活性變化同時發(fā)生的修飾可以用特異的蛋白酶和新形式的質(zhì)譜法容易地定域。結(jié)果，重要的氨基酸殘基可被快速的定位，同時最小的變化(因此最大的控制)可在引入或改變期望的性質(zhì)中達到。不需要純化修飾的物質(zhì)因此也沒有在精制中損失的問題。這也能使二級結(jié)構(gòu)的確認變得容易。因此本發(fā)明與分子生物技術(shù)比較是一種改進，這是因為本途徑比分子生物的途徑更方便，更好確認和更快。修飾的生長因子超激動劑經(jīng)過對各種生長因子的許多結(jié)構(gòu)-功能的研究，發(fā)現(xiàn)了具有改進活性的突變蛋白。例如在歐洲專利申請EP-131816中其敘述的目標為得到提高生物活性和/或低副反應(yīng)的β-干擾素。也提供了許多化學修飾的各種例子例如歐洲專利申請EP-236987敘述IL-2的修飾得到一種低毒性和低免疫性的并具有改進的體內(nèi)清除動力學的物質(zhì)。專利申請EP-0442724敘述PEG化的IL-6，其為一種具有較長半留存期和增強了生物活性的產(chǎn)物。專利申請W088/01511敘述IL-2琥珀酰化，由此成功地提高了溶解度。在這些專利應(yīng)用中除了使用誤差學試驗方法即隨機適度地修飾，得到一種或幾種分子的修飾外沒有任何的修飾策略。況且，會發(fā)生精制中實質(zhì)上的損失，在IL-6琥珀?；睦又幸灿羞@種情況，只得到10％收率的期望蛋白質(zhì)。在這些發(fā)明中沒有做過修飾定位的工作。
本發(fā)明中幾乎沒有損失并且能夠很好地進行修飾定位。更且，漸進化學修飾甚至使在分子中一個位置進行一個氨基酸殘基特定的修飾成為可能，正如實施例1和2所說明的。雖然大多數(shù)修飾是使用的非可逆的試劑，但也可以使用可逆的試劑，這也能進行其他殘基的很特異的修飾。拮抗劑在歐洲專利申請EP-0413383A1中敘述了人類IL-3拮抗作用的突變體。然而在這個案例中只涉及保留的活性與其受體結(jié)合能力的比較關(guān)系，而并未顯示真正的對天然IL-3的活性抑制。
在專利申請PCT/US93/11197和PCT/US93/11198中權(quán)利要求涉及所有種類的IL-3突變體，但在這些案例中也沒有真正抑制活性的支持內(nèi)容。加之，具有最低活性的突變體不可能也是最好的抑制劑，因為結(jié)構(gòu)變形的機遇要比特定地消除其催化活性的機遇高的多。
有其他受體的真正拮抗劑的報道牛生長激素(Endocrinology 1302284(1992))，小鼠白細胞介素-2(EMBO J.113905(1992))，人肝細胞生長因子(Biochemistry319555(1995))，IL-1(Scand J.Immunol.3627(1992))和IL-4(J.Exp.Med.1782213(1993))。在所有這些出版物中沒有敘述修飾的策略拮抗劑均為結(jié)構(gòu)-功能分析研究的副產(chǎn)物。更且，達到明顯抑制作用所需的抑制劑濃度平均要比天然生長因子的濃度高100倍。此濃度對這些拮抗劑的臨床價值是有害的。
生成生長因子拮抗劑的僅有策略曾應(yīng)用于人類的生長激素(Science2561677(1992))。這是基于破壞激素兩個受體結(jié)合部位中的一個部位。同樣，在此案例中受體結(jié)合能力降低系數(shù)為50，所以對比于生長因子需要使用成問題的過量抑制劑。
然而，用本發(fā)明可以得到可能應(yīng)用于臨床的抑制，甚至可能得到增強受體結(jié)合能力的抑制。這可用生長因子在與受體結(jié)合后顯示其某種催化活性的假說來加以解釋。此假設(shè)可由IL-3含有催化的鋅離子的事實加以支持(Biochem.Biophgs.Res.Commun.187859(1992))。生長因子不必含有完整的催化中心。只有在生長因子-受體結(jié)合中使催化中心成為完整是完全可能的。所以，有關(guān)的化學修飾應(yīng)盡可能特異性地指向那些直接或間接參與這種與鋅結(jié)合和/或催化的殘基而不使與受體的結(jié)合能力成為不正常。起始原料可以是任何含蛋白質(zhì)或肽的物質(zhì)?？墒?，因為鋅離子能保護蛋白質(zhì)不變性，或許需要使分子可逆地變性并加入螯合劑從分子中除去。做為一種說明，但不是作為對本發(fā)明的一種局限。敘述了IL-3用碘代-乙酸鹽修飾。在有關(guān)的pH下此修飾是指向His-殘基的烷基化。可是這中方法也可由本領(lǐng)域人員用其他的試劑容易地進行。關(guān)于其它參與催化活性和/或鋅結(jié)合的氨基酸的修飾也可同樣用所述的方法。這些殘基也可以用其他化學方法或分子生物學方法，例如用缺失或取代突變，容易地修飾。更且這個僅只限于IL-3。在各種細胞因子超家族受體中具有明顯的同源性例如白細胞介素2-7Epo和GM-CSF。在特異性鋅結(jié)合上也發(fā)現(xiàn)IL-2 IL-6 GM-CSF和γ-IFN具有相同的作用。本發(fā)明可應(yīng)用于更多的信號肽和/或蛋白質(zhì)也是可以想象的，因為例如胰島素，人類生長激素和催乳激素也具有特異的鋅結(jié)合性質(zhì)。更且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些細胞系的IL-3可被例如胰島素代替。最后，生長因子的烷基化在生成拮抗劑或細胞抑制劑方面也可能有其它的機制。所以，一般烷基化，優(yōu)選的為碘代-乙酸鹽被認為是本發(fā)明的獨立途徑。所以，所有上述的應(yīng)用和/或修飾的物質(zhì)和/或DNA-組建和它們的應(yīng)用也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。抗AIDS治療如已經(jīng)討論過的，本發(fā)明可能應(yīng)用于對抗AIDS。必須提供比現(xiàn)行可能性更好的與AIDS對抗的方法
在Csatary等人的專利USA 5215745中敘述了一種免疫治療抗AIDS的特異方法。在此案例中，鳥類副粘液病毒(avian paramyxovims)感染和/或鳥類輪狀病毒(avianrotavims)的特異病毒感染方法用來增加CD4正性細胞的數(shù)量。這能在最大限度的導致延緩疾病，因為新生成的CD4正性細胞在短時間后將被HIV感染。相反，我們的發(fā)明導致有效的細胞免疫-應(yīng)答，以對抗逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)。
Berzofsky等人的專利USA 5081226是以特異免疫一應(yīng)答對抗逆轉(zhuǎn)錄病毒進行治療。在此案例中，例如產(chǎn)生抗HIV糖蛋白160/120復合物的抗體。在我們的相當本發(fā)明的研究中，這種途徑可導致保護HIV和它在間質(zhì)細胞(histiocytic cells)中結(jié)合，因此甚至可促進疾病。結(jié)果此方法不能說明是有效的。
為此，專利USA 5256767敘述一種無包膜病毒亞單位疫苗。這種方法的倒退是基于這種事實，即親脂性的核部分不能在很低濃度下在MHC中最好地表達，所以不能提供有效的保護。
疫苗是基于結(jié)合上述兩個專利的目的的滅活病毒。
與上述問題相反，在我們的實施例7中我們敘述了在體內(nèi)HTL
(AIDS Researchand Reference Reagent Program Catalog，NIH Publication No．91-1536，Bethesda，MD，USA)在低水平的抗體下在體內(nèi)被消除。在正常條件下，已知寡克隆密集HTL
引起持續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。這也從John Moore組內(nèi)的一同工作的人因針意外事故被
感染來說明(AIDS.Res.Hum.Retrovir.6:307(1990)和J.Clin.Invest.91:1987(1992))。相反，從我們的例子可以推論如果抗體水平低，這些病毒能被消除。B-細胞的產(chǎn)生和隨之而來的抗體產(chǎn)生能被各種生長因子所刺激(例如IL-1-7和IL-11)。所以，用這些生長因子的拮抗劑來完成抗AIDS的治療是符合邏輯的。如此，AIDS的治療也被認為是本發(fā)明的一個應(yīng)用。化學修飾乙酸，二氧雜環(huán)己烷，賴氨酸鹽酸鹽和MES得自Sigma，修飾劑自Fluka得到。
緩沖劑乙酸鹽/NaOH用于pH5.0的修飾，MES/NaOH用于pH5.5，6.0和6.5的修飾。pH7.0用NaH2PO4/NaOH緩沖液。制備10倍濃度的貯備液，用0.22微米的過濾器直接過濾。
反應(yīng)混合物包括50mM緩沖液，2mg/ml hIL-3和分別為3mM的乙酸酐或琥珀酸酐。10倍濃度的貯備液在實驗當天新鮮配制。hIL-3的修飾在30℃進行過夜。修飾后用SDS-電泳測定，說明IL-3未被降解。生物活性的測定MO-7細胞為Dr.I.P.Touw(Erasmus University of Rotterdam，荷蘭)贈送的禮品，RPM1培養(yǎng)基得自Gibco(Paisly，UK)，補料小牛血清得自Hyclone(Logan，Utah，USA)。細胞培養(yǎng)基由帶10％牛血清的RPM1組成。在正常細胞組織培養(yǎng)中也加入100ng/ml的IL-3。
首先制備10倍的貯備液；在細胞培養(yǎng)基中含有從10μg/ml到1ng/ml范圍，以3倍連續(xù)稀釋制備，完全混勻后，25微升的貯備液加入到225微升的細胞培養(yǎng)基中，隨后在37℃培養(yǎng)。六天組織培養(yǎng)用2×105MO7細胞/ml，10天組織培養(yǎng)用4×103MO7細胞/ml。在組織培養(yǎng)后，過夜用氚標記胸苷摻入測定生物活性。從至少二個獨立的生長-應(yīng)答曲線測定出50％最大刺激濃度的平均值(和范圍)。修飾物的相對活性分別以修飾物的50％濃度和天然IL-3的50％濃度比值([IL-3修飾]50％/[IL-3天然]50％)測定。天然IL-3在第6天的標準活性為1.0百萬單位/mg蛋白質(zhì)(n＝10，σ(n-1)＝20％)。在第10天為0.2百萬單位/mg蛋白質(zhì)(n＝10，σ(n-1)＝30％)。結(jié)果關(guān)于按照組平均數(shù)的更精確特性的所有結(jié)果，特異性和在分子中修飾的位置將在本專利說書明的以后部分敘述。生物測定的結(jié)果如表1所示表1乙?；疘L-3的相對生的活性乙?；膒H 組織培養(yǎng)的平均相對活性(和活性范圍)6天后 10天后pH＝5.01.5(1.4-2.1)1.4(0.8-1.5)pH＝6.00.9(0.8-1.0)0.9(0.7-1.1)pH＝6.50.5(0.4-0.6)0.2(0.2-0.3)pH＝7.00.9(0.9-0.9)0.6(0.6-0.6)從上表可以得出結(jié)論，即在pH6.5和pH7.0修飾后6天與10天間相對活性有顯著的差別。所以可以設(shè)想，這表明產(chǎn)生了穩(wěn)定性顯著降低的物質(zhì)。在pH5時可能有增強的生物活性。更多的方面將在實施例5和6中討論。實施例2IL-3以琥珀酸酐的漸進化學修飾產(chǎn)生一種具有增強活性和穩(wěn)定性的改進IL-3?；瘜W修飾乙酸，二氧雜環(huán)己烷，賴氨酸鹽酸鹽和MES得自Sigma，修飾試劑得自Fluka。
緩沖劑乙酸鹽/NaOH用于pH5.0的修飾，MES/NaOH用于pH5.5，6.0和6.5的修飾，在pH7.0用NaH2PO4/NaOH緩沖液。制備10倍濃度貯備液，用0.22微米的過濾器直接過濾。
反應(yīng)混合物包含50mM緩沖液，2mg/ml hIL-3和分別為3mM的乙酸酐或琥珀酸酐。10倍濃度的貯備液是在實驗當天新鮮制備的。hIL-3的修飾在30℃進行過夜。修飾后用SDS-電泳測定說明IL-3來被降解。結(jié)果關(guān)于按照組平均數(shù)的更精確特性的所有結(jié)果，特異性和在分子中修飾的位置將在本專利說明書的以后部分敘述。生物測定的結(jié)果(按實施例1進行)如表2所示表2 琥珀?；疘L-3的相對活性琥珀?；膒H 組織培養(yǎng)的平均相對活性(和活性幅度)6天后 10天后pH＝5.01.7(1.6-2.0)1.6(1.3-2.5)pH＝6.01.4(1.2-1.8)1.3(1.3-1.4)pH＝6.50.4(0.4-0.5)0.4(0.4-0.5)pH＝7.00.3(0.3-0.3)0.3(0.2-0.3)從表2可以得出結(jié)論即在pH5琥珀?；瘜е禄钚缘娘@著增強同時在pH＝＞6琥珀?；瘜е螺^低的活性。實施例3生物活性肽或蛋白質(zhì)化學修飾生成蛋白質(zhì)或肽拮抗劑的方法。材料和方法尿素，EDTA，MES和NaOH得自Sigma，碘代乙酸鈉得自Fluka。緩沖液MES/NaOH用于pH6.0的修飾。10倍濃度貯備液制備成含8M尿素，并在此后直接用0.22微米過濾器過濾滅菌。反應(yīng)混合物含50mM緩沖液，5.5M尿素和50mM EDTA。由這些試劑配制的10倍濃度在8M尿素中的貯備液在實驗當天新鮮配制。1.hIL-3的適度化學修飾碘代乙酸鹽以3，10和30mM的濃度加入。IL-3的濃度為2mg/ml。修飾在37℃進行24，48和72小時，隨后以非變性電泳研究。2天后和30mM碘代乙酰鹽為最大的修飾，修飾的物質(zhì)沒有條帶的嚴重扭曲(分子嚴重變性的指示)。在這種情況下，留下的超始原料少于2％。因為在這種情況下期望得到?jīng)]有發(fā)生蛋白質(zhì)嚴重變性的最低的生物活性，此樣品用于進一步的實驗。隨后，SDS電泳用于說明修飾后分子沒有降解。2.部分化學修飾為了使修飾的hIL-3有適當?shù)囊种颇芰σ策M行部分修飾。為此目的1mg/ml IL-3用10，30和100mM碘代乙酸鹽在37℃修飾18小時。在非變性電泳后考巴斯染色，100mM樣品得到最大的修飾時，凝膠帶沒有過量的扭曲，大約仍存在5％的起始原料。因為只有這個樣品在活性測試中顯示出抑制活性，此樣品用于進一步的實驗。3.活性和抑制分析活性測試按實施例1敘述的進行。對照和烷基化的IL-3生長應(yīng)答曲線((n＞＝2)是從1000至1ng/ml的范圍以10倍連續(xù)稀釋做成的。烷基化的IL-3的抑制活性是以與對照IL-3相同的滴定進行的，但現(xiàn)在是在3ng/ml烷基化的IL-3存在下進行的。
為了測定具有最大受體結(jié)合能力部分修飾的IL-3在有3ng/ml天然IL-3存在下以連續(xù)7倍稀釋來滴定。滴定范圍為15μg/ml至0.1ng/ml，同時滴定僅在4000 MO7/細胞/ml下進行以排除饑餓現(xiàn)象。結(jié)果

圖1顯示修飾的IL-3能夠以10-100因數(shù)抑制對照的IL-3。更且3ng/ml的修飾IL-3能夠抑制30-100ng/ml對照IL-3胸苷摻入的80～90％。所以，修飾的IL-3不是只有抑制活性，它也具有增強的受體結(jié)合能力。這在部分修飾IL-3的滴定中也加以肯定(圖2)只需0.1ng的部分修飾的IL-3就足夠抑制3ng/ml天然IL-3活性的幾乎50％。實施例4為產(chǎn)生具有改變的穩(wěn)定性和/或活性的修飾IL-3使用的漸進酶性外蛋白酶處理的方法。材料和方法外蛋白酶處理是用得自Boehringer的組織蛋白酶-C(Cathepsine-C)和羧肽酶-Y(Carboxypeptidase-Y)進行的。1mg/ml的IL-3在37℃在蛋白酶存在下孵育18小時。組織蛋白酶-C是以1/2至1/128mg/ml的范圍連續(xù)兩倍稀釋加入。其他反應(yīng)條件如制造者所述。
生物活性按實施例1所述測定。結(jié)果此方法導致表3中的結(jié)果。表中未顯示修飾未導致生物活性的改變表3漸進外蛋白酶處理后活性的變化蛋白酶處理 [蛋白酶] 組織培養(yǎng)的平均相對活性(和范圍)(mg/m1) 6天后 10天后羧肽酶Y 1/40 0.6 (0.5-0.7)1.0 (0.7-1.5)1/20 0.08 (0.07-0.10) 0.2 (0.13-0.21)1/10 ＜0.05(＜0.05) ＜0.05(＜0.05)組織蛋白酶C 1/322(2-6)1.0 (0.7-1.5)1/165(3-6)1.0 (0.9-1.1)1/8 3(2-4)1.3 (0.9-1.7)1/4 3(2-4)1.3 (0.9-2.1)從此表可得出結(jié)論，即用羧肽酶Y處理，在濃度為1/40和1/20時生成一種具有在第6天的相對活性低于在第10天的物質(zhì)。所以這表明與天然IL-3比較，此物質(zhì)的穩(wěn)定性較高。
從表中也可以得出結(jié)論，即組織蛋白酶C在第6天顯著增強了活性而不是在第10天。所以此物質(zhì)也有較低的穩(wěn)定性。實施例5用蛋白酶處理和質(zhì)譜法結(jié)合在肽或蛋白質(zhì)的定位修飾。材料和方法蛋白酶處理對于修飾殘基的定位修飾的物質(zhì)用適當?shù)木彌_劑透析并隨后用Endo Glu-C或Endo-Lyy-C裂解，如制造者所述(Boehringer Mannheim，Germany)。2mg/ml hIL-3蛋白質(zhì)與蛋白酶的比例為30，在37℃孵育過液。激光解吸質(zhì)譜法(LDMS)預(yù)處理
2，5二羥基苯甲酸(DHB，Mr＝154.12；10g/l)溶于milli Q水的溶液是在每次實驗前新鮮配制的。修飾和未修飾的IL-3溶液和它們的消化液稀釋成0.1mg/ml。這些稀釋的溶液0.5μl與0.5μl DHB溶液在靶上混合。隨后此靶在室溫和慢的空氣流中干燥。質(zhì)譜法矩陣輔助的激光解吸質(zhì)譜法是在裝有脈沖氮氣激光(337nm，脈沖寬度3ns)的Finnegan MAT Vision 200激光解吸質(zhì)譜儀進行的。樣品在剛達到解離閾(106-107W/cm2)以上時即離去。加速電壓6.5kV。離子為了電子放大，在10kV的轉(zhuǎn)換倍增器電極進行后加速。標準精確度約為0.05％，但由于實驗條件此值可惡化到0.1-0.2％。結(jié)果盡管是較高的分子量，但因為LDMS的信號是足夠的，使所有修飾的定位成為可能。給出兩個例子1、以Endo Lys-C處理和LDMS用琥珀酸酐修飾(pH5.0)的定位在pH＝5.0琥珀酸酐修飾隨后Endo Lys-C消化，一個峰從1085d位移至1185d，1108d峰(1085+23L來自Na+)也位移至1208d?；诘鞍酌傅奶貙院桶被嵝蛄?，此1085d峰只能相當于Ala1-Lys10。因為若在Lys10上修飾則將使此氨基酸的消化成為不可能，也就是不會有任何的Ala1-Lys10片段。所以，被修飾的氨基酸殘基是末端Ala1的氨基。
2、用Endo Glu-C處理隨后用LDMS和Endo Lys-C處理隨后用LDMS兩者對以乙酸酐修飾Lys28的測定在pH7以乙酸酐修飾，隨后Endo Glu-C處理，1598d峰位移至1640d。此位移準確相當于1個乙酰基的質(zhì)量。同樣，在此情況下，氨基酸序列使其定位于Ile23-Asp36。因為Lys28是這個片段的唯一氨基殘基，可以推論這就是被修飾的殘基。這又被用Endo Lys消化所肯定，在此消化中出現(xiàn)了5815d片段。此片段只能解釋為若Lys28為修飾的殘基則使在此殘基后的消化成為不可能。
其他修飾已用相似方法分析，列于表4表4IL-3修飾的定位修飾的pH 修飾后被修飾基團的號數(shù)用乙酸酐用琥珀酸酐5.0Ala1 ＞90％ Ala1 ＞90％6.0Ala1 ＞90％ Ala1 ＞90％Lys28 ±45％ Lys18 ±45％Lys66 ±20％ Lys66 ±20％Lys100±40％ Lys100±25％Lys116±40％ Lys116±40％6.5Ala1 ＞90％ Ala1 ＞90％Lys28 ±70％ Lys28 ±55％Lys66 ±50％ Lys66 ±40％Lys100±65％ Lys100±50％Lys116±80％ Lys116±90％7.0Ala1 ＞90％ Ala1 ＞90％Lys10 ±20％Lys28 ±55％ Lys28 ±70％Lys66 ±35％ Lys66 ±40％Lys100±65％ Lys100±70％Lys116±40％ Lys116±90％此表說明兩種修飾在蛋白質(zhì)中具有胡同的靶殘基。僅有的不同為乙酸酐在pH＞＝5.5時修飾度稍高，同時在pH7時與琥珀酸酐修飾物相反，Lys10被部分地修飾。
表4也說明在pH 7時Lys116至少是部分被保護了的。因為在此pH時使用磷酸鹽緩沖液，磷酸基結(jié)合在這個位置以此屏蔽了Lys116的修飾的可能性是存在的。為證實此假設(shè)，hIL-3在50mM、由MES和磷酸鹽組成的緩沖物質(zhì)中被修飾。在pH6.8用乙酸酐(分別為1，2和3mM)修飾，此pH正好在兩種緩沖劑的緩沖范圍之間。在有10mM或以上的磷酸鹽存在時，有1個基團Lys116被保護。在磷酸鹽濃度低于1mM時此保護并不存在。因為10mM為生理磷酸鹽濃度，可以設(shè)想，現(xiàn)有的定位方法說明生物顯著的磷酸結(jié)合和定位是可能的。所以很可以想象使磷酸結(jié)合變形，可以產(chǎn)生拮抗性或細胞生長的抑制劑。因此，這也被認為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。也可以說明Lys28和Lys66殘基也有被磷酸輕微的保護，提示在3-D結(jié)構(gòu)中它們是緊密靠近的。因此，這種方法甚至可以提供結(jié)構(gòu)信息。
最后，也可以說明漸進化學修飾可以在這樣最低程度上進行，即可實現(xiàn)特異性，不只局限于一些類型的殘基，不只限于氨基殘基，甚至能在整個分子的一個氨基殘基，如Ala1上進行。所以此特異性也包括在權(quán)利要求之中。實施例6用漸進化學修飾蛋白酶處理和激光解吸質(zhì)譜法進行定量結(jié)構(gòu)功能分析研究。材料和方法QSAR策略此實施例用hIL-3賴氨酸修飾加以說明。此策略由5步組成，其中第一步是涉及蛋白質(zhì)的漸進化學修飾。雖然各種殘基在3-D結(jié)構(gòu)中的微環(huán)境是未知的，但可以預(yù)期僅在氨基酸序列中就有差別。其3-D結(jié)構(gòu)可預(yù)料差別更大。
我們研究了hIL-3的乙酰化反應(yīng)(步驟1)。由逐步增加修飾反應(yīng)的pH使?jié)u進化學修飾只發(fā)生在未帶電荷的Lys殘基上成為可能。
第二步是監(jiān)測修飾反應(yīng)。為了研究足夠數(shù)目的可能條件以得到適宜的條件，一種溫和和靈敏和監(jiān)測方法是需要的。此法為非變性電泳(Electrophoresis 15251(1994))。然而，電子噴射質(zhì)譜也能成為替代的方法。這可由圖3說明在pH5-7琥珀?；疘L-3的電子噴射質(zhì)譜。特別是兩者的結(jié)合可說明氨基殘基的完全特異性。
第三步是全部結(jié)構(gòu)整體的確定。圓二色散光譜法可用于此目的(Electrophoresis 15251(1994))。雖然用此方法不能看出小的差別，但實質(zhì)上的結(jié)構(gòu)改變?nèi)缱冃钥梢郧宄y出。
第四步是修飾殘基的特征和定位，為此使用以下的技術(shù)用特異蛋白酶非變性消化，電泳，電子噴射質(zhì)譜法，和LDMS。反應(yīng)的特異性由非變性電泳和電子噴射質(zhì)譜法聯(lián)合測定。定位化用內(nèi)蛋白酶和LDMS，如以前所述的例子進行。
第五步即最后一步是蛋白質(zhì)的各種修飾形式的生物活性的測試。在此活性測定以后可以推論真正涉及各種定位的殘基。結(jié)果化學修飾，結(jié)構(gòu)確定和反應(yīng)監(jiān)測hIL-3用琥珀酸酐或乙酸酐的化學修飾和監(jiān)測按以前敘述的方法進行。隨后，用圓二色散光譜法發(fā)現(xiàn)琥珀酸酐修飾，在pH大于7時導致整個結(jié)構(gòu)的改變(變性)。所以，在進一步的研究中只有pH或以下進行修飾。修飾的特性和定位見以前的例子。蛋白質(zhì)各種修飾形式的活性測試和生物學上重要的殘基的定位兩種方法和生物活性測試的結(jié)果在實施例1和2中已經(jīng)敘述。這些結(jié)果的配合和修飾殘基的定位結(jié)果(表1和表2和前面的實例)能夠說明一些殘基的參與。以此，從未修飾的到在pH5修飾的是重要的變化，它伴隨著活性的增強。其他重要的變化是從pH6到pH6.5(活性降低2個因數(shù))和從6.5到7(活性增加2個因數(shù))因為在pH5琥珀酸酐修飾時伴隨著僅1個基團的修飾，即末端氨基(Ala1)，可以得出結(jié)論，即這個基團有某種限制或調(diào)節(jié)作用?；钚缘脑鰪娫谟萌笔蛔兊慕Y(jié)構(gòu)一功能研究中也曾發(fā)現(xiàn)過(J.Biol.Chem.266，21310(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8911842(1992))，但從為指定只是第一個殘基。
從pH6至pH6.5之間的差別看，有更復雜的模式對乙酸酐，活性降低2-4個因數(shù)是伴隨以Lys28基團45％至70％的修飾，Lys66基團20％至50％的修飾和Lys100基團40％至65％的修飾。最后，發(fā)生在Lys116基團40％至80％的修飾，它與未修飾組對比活性降低60％至20差值為3個因數(shù)。因為這個差與活性的降低精確地相關(guān)，Lys116對生物活懷是最好的候選者。這被在pH7時修飾減低了因數(shù)3(與pH6.5比較)。而伴隨著活性增加因數(shù)3所肯定。所以Lys116對生物活性是重要的。這也被用琥珀酸酐修飾全部肯定。在這種情況，當與pH6.5修飾的物質(zhì)比較時，pH7修飾的物質(zhì)在修飾上沒有降低。伴隨這種現(xiàn)象，活性也沒有增強。
如此，已經(jīng)說明即Lys116殘基和末端氨基是生物顯著的，而末端氨基似乎具有抑制和調(diào)節(jié)影響，Lys116對生物活性似乎是重要的。更且，Lys116也被磷酸保護，提示磷酸被這個殘基結(jié)合。因為此殘基對白細胞介素的生物活性也是重要的，這提示磷酸結(jié)合對IL-3的作用方式是重要的，同時如果這個過程對IL-3是重要的，它對于其他的肽和蛋白質(zhì)也是重要的。
總結(jié)，本方法使生物重要的殘基的定位成為可能，同時表明磷酸結(jié)合也使一種可能的重要生理過程的建立的定位成為可能。所以，本發(fā)明也包含一種蛋白質(zhì)或肽的修飾，借助蛋白質(zhì)或肽的磷酸結(jié)合方法引入一種新的，優(yōu)選的是拮抗的活性。實施例7抗體的降低水平致體內(nèi)有效的細胞抵抗力。材料和方法試驗系統(tǒng)由人類嵌合的4周齡“X-連接免疫缺損(X-linked immunodeficient)”小鼠組成。嵌合是經(jīng)整體輻射(total bosy irradiation，TBI)誘導和移植4百萬人類外周血液淋巴細胞/克受體形成。CBA/N小鼠的TBI為9Gyγ射線。這些小鼠也接受0.5百萬自身骨髓細胞靜脈(iv)注射的血液支持處理。比較輻射，人血液和移植操作見Eur.J.Immunol 22197(1992)。小鼠每天腹腔注射(ip)10,000 I.U.的人類白細胞介素-2(Eurocetus，Amstelveen，Benelux)。感染是在移植人細胞后1小時以最低劑量的10倍經(jīng)ip進行，是在“感染中心試驗(infectious center test)”或ICT中的靜止感染(still infectious)。
經(jīng)處理的CBA/N小鼠以250微克單克隆抗體抗-HIV-1 GP13(抗CD4-結(jié)合部位)，或抗HTL VIIIBF58H3指向V3-環(huán)經(jīng)ip預(yù)處理。
ICT是以CB15細胞雙倍進行(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893116(1992))。每孔一萬細胞并在5-7天后對HIVp24蛋白(Organon Technica，Oss，荷蘭)進行ELISA。通常在移植后兩周處死動物以停止抗體的產(chǎn)生(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。在處死小鼠的這天細胞以含有肝素(Organon Technica，Oss，荷蘭)的介質(zhì)從腹腔中沖洗出來。對這些細胞在CB15細胞和100 I.U.人類白細胞介素-2/ml培養(yǎng)介質(zhì)存在下進行ICT。滴定是從2.5百萬至O的范圍以連續(xù)5倍稀釋雙倍進行。5-7天后培養(yǎng)基上清液中HIV-p24蛋白進行ELISA-試驗。CD4+細胞存在的對照FACScan分析是按Eur.J.Immunol.22197(1992)所述進行的。結(jié)果結(jié)果示于表5。表5 抗體對HIVIIIB病毒的保護抗體 1/IC×104移植后5天移植后8天平均值(范圍) 平均值(范圍)無 2(0.4-2) ＞200 ＞200GP13 4 (0.4-100)20 (2-50)F58H3 ＞200 (＞200)＝＞200 (0.5-＞200)表中所示HTLVIIIB在這些情況下持續(xù)5天。然而移植8天后甚至在豐富的CD4+細胞存在下似乎被消除了。這說明移植人T-細胞可消除病毒。然而，如果把任一特異的抗HIV-1抗體結(jié)藥至嵌合小鼠，病毒仍歸持續(xù)(表5)，說明HIV-感染的持續(xù)是由抗體造成的。
由此可以推論，降低HIV-感染的人的抗體水平可使T-細胞消除病毒。由此提供感染的治療?？捎梢种艬-細胞降低這些抗體的水平。所以B-細胞的抑制是生長因子拮抗劑的有關(guān)興趣的應(yīng)用領(lǐng)域。
尚有其他抑制HIV感染的可能性也能單獨使用1、血漿提出法(Plasmaphoresis)造成抗體水平的降低。通常的臨床實踐是血漿的完全取代。例如重癥肌無力的實驗治療是所謂的選擇性血漿復原。在這種情況下，病人的血漿在回到病人體內(nèi)之前經(jīng)過精制，除掉有害的抗體。在體外HIV-反應(yīng)也可選擇此法，特別是HIV-包膜活性受體。
2、白細胞除去法(Leukophoresis)，以降低B-細胞的數(shù)量。此法優(yōu)選除去HIV-活性的B-細胞。白細胞可從HIV感染的人體內(nèi)全部被除去。這種白細胞除去在臨床實踐中對其他疾病是常規(guī)的工作。然而對HIV感染的病人還從未敘述過。選擇性地返回沒有B-細胞的白細胞可以容易地做到。選擇性也能包括T-細胞的正選擇或其亞群。
3、體內(nèi)耗竭抗體。本發(fā)明也包括選擇性的，也可非選擇性的形成免疫復合物，在體內(nèi)耗竭抗體。非選擇性的移除，優(yōu)選的方法是經(jīng)抗體-特異的抗體來做到的。選擇性的移除優(yōu)選的方法是用病毒，滅活病毒，病毒亞單位和/或病毒樣或等同的蛋白質(zhì)或肽來做到的。這些物質(zhì)優(yōu)先地與促進從體內(nèi)清除的物質(zhì)結(jié)合。
4、體內(nèi)耗竭B-細胞。這種體內(nèi)耗竭優(yōu)選的方法是用B-細胞程序死亡誘導的抗體，非選擇性地移除B-細胞特異性抗體來進行。這也能用雙特異的抗體，優(yōu)選地是CD19/CD3反應(yīng)性組合來進行。此法已在Academic Hospital Utrecht(Utrecht，荷蘭)用于B-細胞腫瘤病人的I期臨床試驗。此治療導致B-細胞數(shù)量的很顯著的降低(私人通信F.A.van Houton Academic Hospital Utrecht，荷蘭)。選擇性的移除B-細胞方法，優(yōu)選的是以病毒，滅活病毒，病毒亞單位和/或病毒樣或等同的蛋白質(zhì)或肽，或者用抗體來達到。優(yōu)選的是這些物質(zhì)與促進B-細胞耗竭的物質(zhì)相結(jié)合。
5、抑制體內(nèi)抗體產(chǎn)生的其他方法。一個實例是用轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)。
HIV和其他病毒在宿主基因組中整合成原病毒。所以它能在這些細胞中以潛伏狀態(tài)存在一段較長的時間。因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選的是給宿主以IL-2，以活化這種原病毒。
HIV在間質(zhì)細胞中持續(xù)存在，同時能產(chǎn)生低濃度的病毒，它可能逃脫宿主免疫系統(tǒng)的識別。因此最好是延長處治的期限至少至這些細胞的生命期。更且，最好是同時進行被動免疫治療，優(yōu)選的是用未被HIV感染的物體的免疫球蛋白。所以，此被動免疫治療被認為是本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
雖然本發(fā)明是基于對遞轉(zhuǎn)錄病毒如HIV有限的知識的形式敘述的，它是很明顯可以做某些修改而不脫離本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種人類白細胞介素-3的修飾方法，優(yōu)選引入一種或多種的下列特點增強的生物活性，增強的穩(wěn)定性，抑制的抗原性，獲得的抵抗活性或細胞抑制活性。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中，修飾是漸進的修飾，優(yōu)選的是在逐漸變化的條件下進行，其中變化下列條件的一種或多種pH5.0和7.0之間，優(yōu)選的步長為0.5個pH單位，和/或時間，或試劑濃度。
3.一種按照前述權(quán)利要求的一項或多項的方法，其中，底物不是人類IL-3，而是一種或多種的下列優(yōu)選人類的蛋白質(zhì)或肽其他白細胞介素，造血生長因子，肽類激素或蛋白質(zhì)激素，信號肽或信號蛋白質(zhì)，生物活性蛋白質(zhì)或肽。
4.一種按照前述權(quán)利要求的一項或多項的方法，其中，是以屏蔽由抗原應(yīng)答誘導蛋白質(zhì)或肽中氨基酸的相互作用來降低抗原性。
5.一種按照前述權(quán)利要求的一項或我項的方法，其中，因為屏蔽了形成蛋白酶的結(jié)合部位氨基酸的可能相互作用而改變了穩(wěn)定性。
6.一種按照前述權(quán)利要求的一項或多項的方法，其中，通過屏蔽降低其受體結(jié)合的殘基，而使肽或蛋白質(zhì)的受體結(jié)合加強。
7.一種按照前述權(quán)利要求的一項或多項的方法，其中，通過引進一新的化學相互作用，優(yōu)選的為電荷，最好是負電荷，而使肽或蛋白質(zhì)的受體結(jié)合力加強。
8.一種按照前述權(quán)利要求的一項或多項的方法，其中，修飾特定于少數(shù)類型的氨基酸，一種形式的氨基酸，例如胺-殘基和/或甚至肽或蛋白質(zhì)中的一個胺-殘基，例如N-末端。
9.一種按照前述權(quán)利要求的一項或多項的方法，其中，修飾特定于涉及催化活性的一個或多個殘基，優(yōu)選的為His-殘基。
10.一種按照前述權(quán)利要求的一項或多項的方法，其中，修飾特定于涉及催化活性的一個或多個殘基，優(yōu)選的為His-殘基，以引入抵抗的和/或細胞抑制活性。
11.一種用于蛋白質(zhì)和肽的化學或非化學修飾方法，通過破壞磷酸結(jié)合以引入拮抗的和/或細胞抑制活性。
12.一種應(yīng)用漸進化學修飾和可逆試劑對肽或蛋白質(zhì)上選擇的氨基酸作特異性化學修飾的方法。
13.一種用非變性電泳來測定電荷的變化，蛋白酶處理和質(zhì)譜，優(yōu)選的為激光解吸質(zhì)譜法對化學修飾的氨基酸定位的方法。
14.一種用如前述權(quán)利要求所述的化學修飾，優(yōu)選的為漸進的方式，非變性電泳，活性測定和修飾殘基的定位來定位蛋白質(zhì)或肽上生物學上重要的殘基的方法。
15.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項中所敘述的生物活性蛋白質(zhì)或肽的漸進化學修飾方法，其中，修飾可用很特異的方式，通過用前述敘述的在蛋白質(zhì)或肽上定位涉及生物活性殘基的方法來進行。
16.僅在下列一個或多個殘基上進行修飾的人類白細胞介素-3，即Ala1，His26，Lys28，Lys66，His95，His98，Lys100或Lys116。
17.含有按前述權(quán)利要求的一項或多項制備的一種修飾的肽或蛋白質(zhì)(以混合形式或化學結(jié)合形式)的任何制劑。
18.一種修飾的信號物質(zhì)，優(yōu)選的為蛋白質(zhì)激素，肽類激素，生長因子，造血生長因子，干擾素，白細胞介素和/或克隆刺激因子，其中，修飾是處在或緊靠近部分的或全部活性中心。
19.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中，催化活性發(fā)生了改變。
20.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中，修飾是處于或緊靠近金屬結(jié)合中心，優(yōu)選的為鋅結(jié)合中心。
21.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中，金屬離子是處于或緊靠近催化中心。
22.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中，金屬離子在未修飾的物質(zhì)中具有催化功能。
23.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中，金屬結(jié)合性質(zhì)已被改變。
24.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中，信號物質(zhì)對受體的親和力沒有降低到大于因數(shù)10，保持相同的或甚至增加了親和力。
25.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中，其具有加強的生物活性，抵抗活性和/或細胞抑制活性。
26.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中，修飾是修飾一個氨基酸，這可以是化學修飾，更優(yōu)選的為烷基化和或?；蚴欠肿由飳W的修飾，如缺失突變和/或取代突變。
27.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中，修飾的氨基酸是涉及與金屬離子結(jié)合的，優(yōu)選的為組氨酸殘基。
28.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中信號肽為鋅結(jié)合信號肽，優(yōu)選的為下列的一種或多種IL-2，IL-3，IL-6，IFN-γ，生長激素，催乳素和/或胰島素。
29.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中，信號肽為生長因子，其受體來自相同的(細胞因子)超家族，作為IL-3的受體，優(yōu)選為IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，GM-CSF和/或Epo。
30.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中，該物質(zhì)的穩(wěn)定性得到改變，優(yōu)選的為增強穩(wěn)定性。
31.一種如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的物質(zhì)，其中，該物質(zhì)具有降低的穩(wěn)定性，優(yōu)選的是結(jié)合有拮抗活性。
32.含有如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的蛋白質(zhì)和/或肽的基因密碼的DNA-組建物。
33.含有如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的或是按前述權(quán)利要求的一項和多項制備的一種或多種物質(zhì)(混合形式或化學結(jié)合形式)的任何制劑。
34.如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的任何制劑的應(yīng)用。
35.如前述權(quán)利要求的一項或多項所敘述的任何制劑的應(yīng)用，優(yōu)選的為在本專利說明書中應(yīng)用領(lǐng)域所敘述的一種或多種應(yīng)用。
36.通過抑制由B-細胞產(chǎn)生的抗體和/或抑制B-細胞的產(chǎn)生和/或成熟，優(yōu)選的是用前述權(quán)利要求的一項或多項所述的一種制劑以抑制和/或治療HIV感染。
37.一種如前述權(quán)利要求一項或多項中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中優(yōu)選的是用血漿去除法，部分的或全部血漿復原或選擇性的血清返回以降低抗體的水平。
38.一種如前述權(quán)利要求一項或多項中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中在體外選擇性的通過移除抗體，優(yōu)選HIV-活性抗體，更優(yōu)選的是HIV-包膜活性抗體。
39.一種如前述權(quán)利要求一項或多項中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，進行白細胞除去。
40.一種如前述權(quán)利要求一項或多項中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，達到了B-細胞數(shù)量的降低，優(yōu)選的是抗HIV-抗體產(chǎn)生的B-細胞，更優(yōu)選的是抗HIV-包被抗體產(chǎn)生的B-細胞。
41.一種如前述權(quán)利要求一項或多項中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，優(yōu)選是在體內(nèi)耗竭抗體，優(yōu)選的是耗竭抗HIV抗體，更優(yōu)選的是耗竭抗HIV-包膜抗體。
43.一種如前述權(quán)利要求一項或多項中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，例如用其它抗體，達到了在體內(nèi)抗體的耗竭。
44.一種如前述權(quán)利要求一項或多項中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，雙-特異性抗體的應(yīng)用，優(yōu)選的是直接對抗CD19/CD3和或CD20/CD3的結(jié)合。
45.一種如前述權(quán)利要求多項中敘述的方法和/或產(chǎn)物，其中，其為誘導B-細胞程序死亡的物質(zhì)，優(yōu)選的是APO-1的應(yīng)用。
46.一種如前述權(quán)利要求一項或多項中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，其為其他B-細胞抗體產(chǎn)生抑制作用，優(yōu)選的是用TGF-β的應(yīng)用。
47.一種如前述權(quán)利要求一項或多項中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，以進行HIV感染的物體的原病毒的激活，優(yōu)選的是給以生長因子，較優(yōu)選的為細胞因子，更優(yōu)選的是以IL-2激活。
48.一種如前述權(quán)利要求一項或多項中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，包括被動免疫治療，優(yōu)選的是用HIV-未感染物體的免疫球蛋白。
49.一種如前述權(quán)利要求一項或多項中所述的，或是它們的聯(lián)合方法和/或產(chǎn)物，其中，其為金屬離子的應(yīng)用，優(yōu)選的是鋅，以得到如前述權(quán)利要求的一項或多項所述的效果和/或結(jié)果和/或應(yīng)用。
50.包含如前述權(quán)利要求的一項或多項敘述的一種或多種方法的任何治療。
51.按前述權(quán)利要求的一項或多項所述的任何制劑的應(yīng)用，包括刺激干細胞的復制。
52.按前述權(quán)利要求的一項或多項的任何制劑與其他信號蛋白質(zhì)和肽聯(lián)合的應(yīng)用。
53.任何前述權(quán)利要求的兩項或多項的可想到的無論是導致或不導致協(xié)同活性的聯(lián)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及信號蛋白質(zhì)和肽的特異的漸進修飾。以修飾及其定位，用蛋白酶處理和與新類型的質(zhì)譜法相結(jié)合，可以達到蛋白質(zhì)或肽的很特異修飾。這使得期望的生物活性變化，優(yōu)選的是增強的活性，拮抗活性和/或細胞抑制活性的引入成為可能。用化學修飾，即有特異性的對His殘基烷基化，這些殘基位于或靠近人類白細胞介素3催化的和/或Zn結(jié)合中心，可以實現(xiàn)拮抗的或細胞抑制活性。本領(lǐng)域人員也可以容易地應(yīng)用本發(fā)明來產(chǎn)生抑制劑和/或拮抗劑，優(yōu)選的方法為用分子生物修飾，化學修飾和/或烷基化反應(yīng)，優(yōu)選的為用碘代-乙酸鹽。優(yōu)選的是這些修飾是直接對His殘基，其它催化殘基和/或Zn結(jié)合殘基。從所附的結(jié)果和數(shù)據(jù)可以推論即本發(fā)明也可容易地應(yīng)用于其他信號物質(zhì)。此結(jié)果也可以DNA-組建很好的完成，其中也包括基因治療。如此，提出的方法，得到的物質(zhì)及其應(yīng)用均包括在本發(fā)明之中。
文檔編號A61K38/20GK1163620SQ95194849
公開日1997年10月29日 申請日期1995年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月30日
發(fā)明者維克托·斯米特, 威廉·胡佩斯 申請人:法瑪基公司