相關申請的交叉引用

本申請根據(jù)35u.s.c.§119(e)有權享有在2014年10月31日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/073,651的優(yōu)先權，所述臨時專利申請由此通過引用以其全部并入本文。

關于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明

本發(fā)明在美國國立衛(wèi)生研究院給予的ca120409下利用政府支持完成。政府擁有本發(fā)明中的某些權利。

背景技術：

使用嵌合抗原受體(car)修飾的t細胞的過繼細胞轉移(act)已經(jīng)顯示成為用于癌癥治療的有希望的策略(louis等，2011,blood118:6050-6056；kochenderfer等，2010,blood116:3875-3886和porter等，2011,nengljmed365:725-733)。

使用慢病毒或逆轉錄病毒載體的整合關聯(lián)的安全關注是對用于act的細胞修飾的主要關注。已經(jīng)取得一些進步以避免中靶(on-target)或脫靶(off-target)的有害的副作用，比如使用t細胞受體(tcr)或carrna電穿孔進行t細胞的rna轉染(zhao,2006,molther13:151-159；mitchell等，smits等，2004,leukemia18:1898-1902)。通過使rna和t細胞二者的劑量最小化，這樣的方法高效地允許將多種基因引入細胞。然而，對于car瞬時表達的主要約束是rna轉染的t細胞的亞適的效應物活性和功能。多種t細胞輸注和/或顯著使用低劑量化療已經(jīng)用于改進car功能(barrett等，2013,humgenether24(8):717-27)。

已經(jīng)做出多種嘗試以改進car的效應物活性和功能，同時以便避免對聯(lián)合療法和額外治療的需要。在轉染過程期間增加rna對t細胞功能——尤其是體內(nèi)抗腫瘤活性——形成負面影響(barrett等，2011,humgenether22:1575-1586)。也已經(jīng)在癌癥治療的臨床試驗中測試了將抗cd3抗原抗體片段與抗腫瘤抗原抗體片段融合的可選的構建體(bargou等，2008,science321:974-977；klinger等，2012,blood119:6226-6233.)。不幸地，這些構建體由于短的半衰期、差的靶細胞位點的可及性和缺乏適當?shù)拈L期信號傳導功能而在功能上嚴重地受限。

臨床tcr研究已經(jīng)受阻于轉導的tcr的低表達水平，以及α與β鏈的錯配。因為當t細胞轉錄兩種不同的tcr的鏈(天然的α/β、外源的α/β、和天然/外源的“錯配的”異二聚體)時，四種tcr可以潛在地在細胞表面處表達，所以對使用此方法的顯著阻礙是顯而易見的。在迄今為止進行的研究中，臨床前研究已經(jīng)清楚地展現(xiàn)出tcr錯配具有誘導自體抗原的有害識別的潛力。

雖然在治療癌癥中獲得的早期tcr和cart細胞臨床數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示了有希望的結果，但是對患者的風險較高，并且一些患者的t細胞甚至在tcr或car重定向后對有效治療也不是足夠有效的，這促使修飾同種異體的供體源t細胞。然而，輸注的同種異體t細胞上的內(nèi)源性αβt細胞受體可以識別接受者中的主要和次要組織相容性抗原，這導致了移植物抗宿主疾病(gvhd)。結果，使用自體cart細胞輸注的大多數(shù)當前的臨床試驗依賴于免疫耐受性以在過繼細胞轉移后防止tcr介導的正常組織的有害識別。此方法已經(jīng)取得了早期臨床成功，但是受限于制造患者特異性t細胞產(chǎn)物的時間和花費。因此，存在對修飾t細胞同時規(guī)避制造患者特異性t細胞產(chǎn)物的時間和花費的更安全的方法的需要。

技術實現(xiàn)要素：

如本文描述的，本發(fā)明涉及用于生成修飾t細胞的組合物和方法，所述修飾的t細胞具有能夠改變內(nèi)源基因——其選自tcrα鏈、tcrβ鏈、β-2微球蛋白、hla分子、ctla-4、pd1和fas——的基因表達的核酸，并且進一步包含編碼嵌合抗原受體(car)的核酸。

本發(fā)明的一個方面包括修飾的t細胞，其包含能夠下調(diào)內(nèi)源基因——其選自tcrα鏈、tcrβ鏈、β-2微球蛋白、hla分子、ctla-4、pd1和fas——的基因表達的核酸；和編碼嵌合抗原受體(car)的核酸，所述嵌合抗原受體(car)包括抗原結合結構域、跨膜結構域和共刺激分子的胞內(nèi)結構域。

在另一方面，本發(fā)明包括用于生成修飾的t細胞的方法，其包括將能夠下調(diào)內(nèi)源基因——其選自tcrα鏈、tcrβ鏈、β-2微球蛋白、hla分子、ctla-4、pd1和fas——的基因表達的核酸引入t細胞；和引入編碼嵌合抗原受體(car)的核酸，所述嵌合抗原受體(car)包括抗原結合結構域、跨膜結構域。

在又另一方面，本發(fā)明包括治療與對象中增強的免疫性相關聯(lián)的疾病或病癥的方法，其包括施用有效量的藥物組合物至需要其的對象，所述藥物組合物包括本文描述的修飾的t細胞。

在還另一方面，本發(fā)明包括治療對象中的病癥的方法，其包括給對象施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包括本文描述的修飾的t細胞。

在另一方面，本發(fā)明包括用于刺激對對象中的靶細胞或組織的t細胞-介導的免疫應答的方法，其包括給對象施用有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包括本文描述的修飾的t細胞。

在又另一方面，本發(fā)明包括用于過繼細胞轉移療法的方法，其包括施用有效量的藥物組合物至需要其的對象以預防或治療不利于對象的免疫反應，所述藥物組合物包括本文描述的修飾的t細胞。

在還另一方面，本發(fā)明包括本文描述的修飾的t細胞在制造用于治療需要其的對象中的免疫應答的藥物中的用途。

在另一方面，本發(fā)明包括組合物，其包括根據(jù)本文描述的方法生成的修飾的t細胞。

在又另一方面，本發(fā)明包括藥物組合物，其包括根據(jù)本文描述的方法生成的修飾的t細胞。

在本文描繪的本發(fā)明的上述方面或任何其它方面的多種實施方式中，能夠下調(diào)基因表達的核酸選自反義rna、antigomerrna、sirna、shrna、和crispr系統(tǒng)，比如pad5/f35-crispr載體。

在一個實施方式中，car的抗原結合結構域包括選自單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體、人抗體、人源化抗體、單結構域抗體、單鏈可變片段、和其抗原結合片段的抗體。在另一個實施方式中，car的抗原結合結構域特異性地結合靶細胞上的抗原。在還另一個實施方式中，car的胞內(nèi)結構域包括雙信號傳導結構域。

在另一個實施方式中，本文描述的修飾的t細胞進一步包括編碼共刺激分子比如cd3、cd27、cd28、cd83、cd86、cd127、4-1bb、4-1bbl、pd1和pd1l的外源性核酸。在一個實施方式中，本文描述的生成修飾的t細胞的方法進一步包括將編碼共刺激分子的rna電穿孔入t細胞。在其中共刺激分子是cd3的一些實施方式中，cd3包括至少兩條不同的cd3鏈，比如cd3ζ和cd3ε鏈。

在另一個實施方式中，t細胞獲得自外周血單核細胞、臍帶血細胞、純化的t細胞群和t細胞系。

在還另一個實施方式中，如本文描述的生成修飾的t細胞的方法進一步包括擴展t細胞。在一個實施方式中，擴展t細胞包括使用選自flt3-l、il-1、il-3和c-kit配體的因子培養(yǎng)t細胞。

在還另一個實施方式中，如本文描述的生成修飾的t細胞的方法進一步包括冷藏t細胞。在另一個實施方式中，本文描述的方法進一步包括在將核酸引入t細胞之前解凍冷藏的t細胞。

在一個實施方式中，引入核酸選自轉導擴展的t細胞、轉染擴展的t細胞和電穿孔擴展的t細胞。

在還另一個實施方式中，本文描述的方法進一步包括在t細胞中表達klf4、oct3/4和sox2以誘導t細胞的多能性。

在本文描繪的本發(fā)明的上述方面或任何其它方面的多種實施方式中，本發(fā)明包括施用修飾的t細胞至對象。在一個實施方式中，對象具有病癥，比如自身免疫性疾病。在一些實施方式中，自身免疫性疾病選自獲得性免疫缺陷綜合征(aids)、斑禿、強直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內(nèi)耳疾病(aied)、自身免疫性淋巴細胞增生綜合征(alps)、自身免疫性血小板減少性紫癜(atp)、貝切特氏病、心肌病、乳糜瀉(celiacsprue)-皰疹樣皮炎、慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(cfids)、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(cipd)、疤痕性類天皰瘡、冷凝集素疾病、crest綜合征、克羅恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎(dermatomyositis-juvenile)、盤狀狼瘡、特發(fā)性混合型冷沉淀球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維變性、特發(fā)性血小板減少性紫癜(itp)、iga腎病、胰島素依賴型糖尿病、青少年慢性關節(jié)炎(斯提耳氏病)、青少年型類風濕性關節(jié)炎、美尼爾氏病、混合結締組織病、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、惡性貧血(pernaciousanemia)、結節(jié)性多動炎癥、多軟骨炎、多腺體綜合征、風濕性多肌痛、多發(fā)性肌炎和皮肌炎、原發(fā)性無丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變、牛皮癬、牛皮癬性關節(jié)炎、雷諾氏現(xiàn)象、萊特爾綜合征、風濕熱、類風濕性關節(jié)炎、結節(jié)病、硬皮病(進行性全身性硬化癥(pss)，也稱為全身性硬化癥(ss))、斯耶格倫氏綜合征、僵體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、高安氏動脈炎、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、潰瘍性結腸炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韋格納氏肉芽腫病和其任意組合。

在另一個實施方式中，病癥是癌癥，比如選自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和其任意組合的癌癥。

在另一個實施方式中，本文描述的方法進一步包括誘導靶細胞或組織的裂解，比如抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(adcc)。

附圖說明

當結合附圖閱讀時，將更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的下列詳細描述。出于說明本發(fā)明的目的，在附圖中顯示了當前優(yōu)選的實施方式。然而，應當理解本發(fā)明不限于在附圖中顯示的實施方式的精確布置和手段。

圖1，包括圖1a-1c，是293t細胞中的tcrαβ-cd3復合體的crispr設計和靶向的圖示。圖1a顯示了tcr-α與β恒定區(qū)的基因組基因座內(nèi)的crisprgrna靶向位點。每個外顯子由塊顯示。黑色塊代表編碼區(qū)?；疑矸蔷幋a區(qū)。十三種grna被設計為靶向tcrα恒定區(qū)(trac)的外顯子1，10種grna靶向tcrβ恒定區(qū)1(trbc1)和2(trbc2)的外顯子1上的保守序列，并且10種grna靶向β-2微珠蛋白基因的外顯子1。圖1b顯示了典型的grna支架序列(scaffoldsequence)。grnapcr產(chǎn)物通過重疊pcr生成并且被克隆入具有t7啟動子的msgv載體。圖1c顯示了sanger測序結果，其顯示在將cas9mrna和grna轉染入細胞后，在293ttcrtrac和trbc基因組pcr產(chǎn)物中存在多個峰。

圖2，包括圖2a-2e，顯示了原代t細胞中tcrαβ-cd3復合體的破壞。圖2a是顯示用于利用btx830將cas9mrna和grna電穿孔入原代t細胞的參數(shù)的表格。360v1ms以及2mm小池產(chǎn)生用于電穿孔第3天珠刺激的原代t細胞的最好的平均熒光強度(mfi)和效率。圖2b是圖組，其顯示與正常的37℃5％co2條件相比，在32℃5％co2下培育的t細胞具有高得多的mfi。圖2c是crispr系統(tǒng)轉移入原代t細胞的示意圖。在珠刺激原代t細胞后三天，cas9mrna和grna被電轉移入t細胞。t細胞然后使用100iu/ml的il-2進行培養(yǎng)，并且一些細胞在32℃5％co2下培育1天并且然后持續(xù)另一個7至9天。在電穿孔后第7-9天通過流式細胞術分析cd3表達。圖2d是圖組，其顯示在37℃下的靶向效率比在32℃下高大約2.5倍。圖2e是圖組，其顯示了在電轉移不同量和比值的cas9與靶向tcrβ的grna后第6天cd3的下調(diào)。通過對cd3染色分析cd3表達。顯示了電穿孔后第6天時的代表性流式細胞術(flow)數(shù)據(jù)。象限代表cd3陰性細胞在t細胞群中的百分數(shù)。

圖3，包括圖3a-3d，顯示t細胞中的tcr^negα或β敲除可以通過耗減tcr^post細胞被富集。圖3a是圖組，其顯示了在t細胞中tcr^negα或β敲除的微珠耗減之前和之后的cd3表達。流式細胞術圖解了cd3的表達。右下象限中的數(shù)字代表cd3陰性細胞在t細胞群中的百分數(shù)。圖3b是測序圖組，其顯示在cd3^neg富集的t細胞基因組pcr產(chǎn)物中觀察到多個峰。圖3c是圖組，其顯示了在使用crispr修飾的單個α鏈、β鏈和αβ雙敲除t細胞中的cd3微珠富集后cd4和cd8t細胞所有組成成分分析。數(shù)據(jù)顯示cd8t細胞群的比值通過crispr修飾被富集，這表明cd8t細胞比cd4t細胞可能更容易被修飾。圖3d顯示了在crispr修飾后被引入至tcrα與β基因座的缺失和插入的測序結果。

圖4，包括圖4a-4c，顯示了多次電轉移grna極大地提高了crispr系統(tǒng)在原代t細胞中的靶向效率。圖4a是圖組，其顯示多次電穿孔grna極大地提高了靶向效率。在24小時內(nèi)電穿孔t細胞多至三次給出最高的靶向效率，幾乎80％。在初始實驗中，在t細胞中取得僅15％的tcr靶向效率。在將cas9mrna電轉移入t細胞后觀察到cas9的持續(xù)表達。低切割效率的可能原因可能是由于grna的快速降解。獲得了更高的cd3陰性群。圖4b是圖組，其顯示帽化損害grna的功能，同時第二輪中grna的早期引入產(chǎn)生更高的效率。圖4c是圖組，其顯示在nd221中多次電轉移靶向trac和trbc的grna分別給出大約64.5％和57.5％的切割率。

圖5，包括圖5a和5b，顯示tcr^negt細胞可以在不同的刺激條件下擴展。圖5a是圖組，其顯示在將tcrα與β鏈再引入tcr^negt細胞后，tcr^negt細胞恢復cd3表達。在將tcrα與β鏈電穿孔入tcr^negt細胞后檢測到cd3和vb13.1。cd3表達水平比得上tcr^post細胞。圖5b是圖組，其顯示了不同條件用于刺激tcr^negt細胞后的擴展倍數(shù)。pbmcrep產(chǎn)生大約500倍擴展，而cd3/cd28珠，或k562aapc再刺激產(chǎn)生大約25-58倍擴展。

圖6，包括圖6a和6b，顯示了在不同條件下擴展后的tcr^negt細胞特性。圖6a是圖組，其顯示了在不同條件下擴展后的tcr^negt細胞表型特性。圖6b是圖組，其顯示了在不同條件下擴展后的tcr^negt細胞表型特性。

圖7，包括圖7a-7c，顯示了在體外重定向后具有有效的抗腫瘤活性的擴展的tcr^negt細胞。圖7a是圖組，其顯示tcr^negt細胞可以通過在細胞中引入抗ny-eso1g4tcr被重定向。與cas9空白對照組(mockgroup)比較，當通過1g4tcr重定向時，tcr^negt細胞顯示了由于外源性和內(nèi)源性tcrα與β鏈的更少的錯配引起的更高水平的vb13.1表達。圖7b是圖組，其顯示了當與腫瘤(nalm6-eso)細胞系共培養(yǎng)時，使用1g4tcr重定向的tcr^negt細胞具有高的脫?；钚?。圖7c是顯示使用1g4tcr重定向的tcr^negt細胞具有針對腫瘤細胞系的高的細胞毒性的圖。

圖8是一組圖示，其顯示了定向的tcr^negt細胞在重定向后控制nsg小鼠中腫瘤的生長。

圖9，包括圖9a-9d，顯示通過β-2微珠蛋白的破壞獲得hla-i類(hla-classi)消除。圖9a顯示能夠破壞hek293細胞中的β-2微珠蛋白基因座的crispr的測序數(shù)據(jù)。圖9b是圖組，其顯示通過β-2微珠蛋白的破壞生成bhla-i類陰性t細胞群。圖9c是圖組，其顯示cifng提高原代t細胞中β-2微珠蛋白的靶向效率。圖9d是圖組，其顯示hla-i類^negt細胞通過微珠耗減被富集。

圖10是圖組，其顯示原代t細胞中的hla-i類和tcr的同時敲除。使用cd3/cd28免疫磁珠(dynabead)刺激cd4和cd8t細胞。刺激后三天，擴展的t細胞電穿孔有cas9mrna連同tcrβ恒定區(qū)(trbc)和靶向β-2微珠蛋白的grna。在電穿孔后六天，使用抗cd3單克隆抗體(mab)和抗β-2微珠蛋白mab評估tcr表達和β-2微珠蛋白表達二者。數(shù)字代表每個象限中群的百分數(shù)。

圖11，包括圖11a-11d，顯示了原代t細胞中hla-i類和tcrα與β鏈的三敲除。圖11a是圖組，其顯示使用cd3/cd28免疫磁珠刺激cd4和cd8t細胞。刺激后三天，擴展的t細胞電穿孔有cas9mrna，連同tcrα、β恒定區(qū)(trac、trbc)和靶向β-2微珠蛋白的grna。在電穿孔后六天，使用抗cd3單克隆抗體(mab)和抗β-2微珠蛋白mab評估tcr表達和hla-i類表達二者。數(shù)字代表每個象限中群的百分數(shù)。圖11b是圖解hla-i類與tcrα和β鏈三敲除t細胞的分離的示意圖。圖11c是圖組，其顯示了通過gfp表達測試的電穿孔效率。圖11d是圖組，其顯示了通過流式細胞術測量的將tcrα與β鏈再引入tcr^negt細胞。在總tcr^negt細胞中觀察到大約64％的α陰性和大約14％β陰性群。

圖12，包括圖12a-12d，顯示了293t細胞中fas的敲除。圖12a是顯示當fas在293t細胞中敲除時多個峰的sanger測序結果的圖像。圖12b是圖組，其顯示了facs數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)揭示fas蛋白的表面表達被crispr破壞。圖12c是圖像組，其顯示了在與crispr同源重組后fas蛋白被替換為gfp。圖12d是facs數(shù)據(jù)的圖組，其顯示了與crispr同源重組的百分數(shù)。

圖13顯示了原代t細胞中fas的敲除。facs數(shù)據(jù)圖解了表面fas蛋白表達被crispr廢除。

圖14，包括圖14a和14b，顯示了293t和原代t細胞中pd1的敲除。圖14a是顯示當pd1在293t細胞中被靶向時多個峰的sanger測序結果的圖像。圖14b是圖組，其顯示了被crispr破壞的pd1蛋白的表面表達的facs數(shù)據(jù)。

圖15，包括圖15a和15b，顯示了293t和原代細胞比如ccd1079-sk中ctla4的敲除。圖15a是顯示當ctla4在293t細胞中被靶向時多個峰的sanger測序結果的圖像。圖15b是顯示在有限稀釋和單細胞擴展后的序列數(shù)據(jù)的圖像。sanger測序結果確認了在ctla4基因組基因座處的缺失和插入。

圖16顯示了293t中ppp2r2d的敲除。sanger測序數(shù)據(jù)指示ppp2r2d通過crispr在293t細胞中被靶向。

圖17，包括圖17a和17b，顯示從fas敲除t細胞生成ipsc。圖17a是圖像組，其顯示了在將fas^negt細胞重編程至ipsc的過程期間的形態(tài)變化。典型的胚胎干細胞形態(tài)形成指示fas^negt細胞可以被誘導至多能狀態(tài)。圖17b是顯示fas^negt細胞以野生型對應體(counterpart)大約5倍的效率被重編程至ipsc的圖。p53缺陷細胞系已經(jīng)被報道為由于凋亡途徑的阻礙而易于重編程。fas敲除可以通過相似的機制促進重編程過程。

圖18，包括圖18a和18b，顯示從cd3^negt細胞生成ipsc。圖18a是圖像組，其顯示了在限定的重編程條件下由cd3^negtcrα或β鏈敲除t細胞形成的es樣形態(tài)。形態(tài)在數(shù)次傳代后保持恒定。圖18b是一系列圖，其顯示與野生型對應體相比，重編程cd3^negt細胞高效大約5倍，這表明tcr敲除可以在t細胞重編程的過程中發(fā)揮作用或在仙臺病毒感染后影響細胞生存力。

圖19是顯示使用sirna敲除內(nèi)源性t細胞受體(tcr)并且添加第二二硫鍵和去-n-糖基化至β鏈的圖。

圖20，包括圖20a和20b，顯示了通過cas9rna和grna的tcr敲除。電穿孔后六天，通過評價cd3分析細胞的tcr表達。

圖21是顯示cd3微珠耗減后的pcr測序結果的圖示。

圖22是圖組，其顯示了cd3在ny-eso-1tcrrna電穿孔后四小時的重表達。

圖23，包括圖23a-23d，是圖組，其顯示敲落內(nèi)源性tcr增強電穿孔tcrrna的t細胞的轉基因表達和功能二者。圖23a顯示了電穿孔有tcrsirna(實線空心柱形圖)、對照sirna(虛線空心柱形圖)的t細胞和沒有任何sirna的t細胞(實心柱形圖)的tcr表達。圖23b顯示了具有tcrsirna、對照sirna或沒有sirna的電穿孔野生型ny-eso-1tcr(wt)或修飾的tcr(sd)rna的t細胞的轉基因(tcrvb13.1)表達。圖23c顯示了具有tcrsirna、對照sirna或沒有sirna的電穿孔野生型ny-eso-1tcr(wt)或修飾的tcr(sd)rna的t細胞的ny-eso-1四聚體染色。圖23d顯示了hla-a2/ny-eso-1陽性腫瘤系通過tcrsirna敲落的電穿孔野生型ny-eso-1tcrrna的t細胞的特異性裂解。

圖24是顯示在將t細胞注入小鼠模型后腫瘤細胞的熒光的圖。表達ny-eso-1和gfp二者的一千萬個nalm6-cbg-eso-gfp(叩頭蟲綠)腫瘤細胞被靜脈內(nèi)注射入nod/scid小鼠。在腫瘤接種后五天，如不同組中指示的注射轉導cbr和電穿孔rna的t細胞，并且通過熒光檢測腫瘤細胞。

圖25是圖像組，其顯示了小鼠模型中注射的腫瘤和雜合tcrt細胞隨著時間的熒光。

圖26是圖像組，其顯示了通用car19t細胞的生成。圖的頂部是生成通用car19t細胞的方案的圖示。左側的圖顯示了慢病毒-car19基因轉導后car19陽性t細胞的百分數(shù)。右圖組顯示了分選之前和之后tcr單陰性和tcr/hla-a雙陰性t細胞的百分數(shù)。

圖27是圖組和表格，其顯示了使用照射的cd19呈遞k562細胞刺激后cd19陽性細胞的擴展倍數(shù)。

圖28a是圖組，其顯示了k562-cd19擴展的細胞的內(nèi)源性基因表達和轉基因表達。

圖28b是圖組，其顯示在k562-cd19刺激的擴展后，內(nèi)源性tcr表達在tcr單陰性細胞中保持陰性，同時tcr和hla-a表達在tcr/hla-a雙陰性t細胞中保持陰性。

圖29a是圖組，其顯示大多數(shù)擴展的通用car19t細胞是cd45ro陽性的并且表達中等水平的cd28表達。

圖29b是圖組，其顯示大多數(shù)擴展的通用car19t細胞保留高水平的cd62l表達和低水平的ccr7表達。

圖30a是顯示crispr基因編輯不影響通用car19t細胞的體外抗腫瘤活性的圖。

圖30b是圖組，其顯示當使用nalm6腫瘤細胞攻擊時，tcr單陰性和tcr/hla-a雙陰性car19t細胞顯示出強健的裂解能力。

圖30c是圖組，其顯示了作為這些細胞的有效的抗腫瘤活性的一部分的細胞因子分泌。

圖30d是圖組，其顯示了在使用nalm6腫瘤細胞攻擊后展示出類似的增殖動力學的car19t細胞中的tcr單消融(ablation)或tcr與hla-a雙消融。

圖31是圖像組，其顯示crispr基因編輯在體內(nèi)不影響通用car19t細胞的抗腫瘤活。所有接受未操縱的t細胞的小鼠和輸注有轉導慢病毒gfp的野生型t細胞的小鼠在腫瘤細胞輸注后3周內(nèi)死亡。接受car19t細胞的小鼠觀察到目標腫瘤消退。crispr編輯的tcr單陰性或tcr/hla-a雙陰性通用car19t細胞顯示了相同的抗腫瘤活性。

圖32a是圖組，其顯示t細胞中的tcr單消融或tcr與hla-a雙消融急劇地降低同種異體反應性。

圖32b是圖組，其顯示使用長時期的共培養(yǎng)(5天)消除hla-a分子活化的nk細胞。

圖32c是顯示當細胞在ifnreispot測定中被同種異體全血pbmc攻擊24小時時沒有觀察到脫靶活性的圖。

圖33是圖組，其顯示了fas消融增強car19t細胞的抗腫瘤活性。生成了fas陰性car19t細胞。通過流式細胞術分析確認fas消融。fasnegt細胞的car19基因表達比得上野生型。甚至在使用nalm6腫瘤細胞培育4小時的短時期后，與野生型對應體相比，cd107a表達在fasnegcar19t細胞中被極大地增強。

圖34a是顯示car19t細胞中的fas消融在體外抗原條件下增強cart細胞存活和增殖的圖。當使用高水平的cd19+k562細胞刺激細胞時，fasnegcar19t細胞比野生型car19t細胞更快地擴展。

圖34b是圖組，其顯示fasnegcar19t細胞具有降低的凋亡水平，如通過膜聯(lián)蛋白v染色測量的。

圖35a是顯示car19t細胞中的fas消融增強動物模型中的cart細胞功能的圖。如在體外已經(jīng)觀察到的，與野生型t細胞相比，fasnegt細胞顯示了增強的增殖。

圖35b是圖像組，其顯示當與野生型組相比時，fasnegcar19組展現(xiàn)出更優(yōu)異的抗腫瘤活性。

圖35c是顯示fasnegcar19組和野生型組之間的生物發(fā)光數(shù)據(jù)中的顯著差異的圖。

圖36是圖組，其顯示了pd1陰性psca-cart細胞的生成。通過流式細胞術分析確認pd1消融。通過微珠耗減富集pd1陰性細胞。通過使用照射的psca抗原呈遞pc3腫瘤細胞進行刺激擴展野生型或pd1陰性psca-cart細胞。psca-car陽性細胞在擴展后被富集。

圖37是圖組，其顯示psca-cart細胞中的pd1消融和cd137表達在體外抗原條件下增強cart細胞活化。

圖38a是圖像組，其顯示了體內(nèi)pc3-psca-pdl1nsg模型中的pd1消融。與野生型組相比，psca-cart細胞展現(xiàn)了增強的cart細胞體內(nèi)抗腫瘤活性。

圖38b是顯示pd1陰性和野生型組之間的腫瘤負荷中的差異的圖。

圖39是組織學圖像組，其顯示了t細胞在tcr或tcr/hla-i被消融的情況下不引起移植物抗宿主疾病(gvhd)。使用雙敲除或三敲除cart細胞處理的小鼠不發(fā)展出gvhd的任何征兆。相比之下，來自野生型cd19cart組的4只小鼠中的3只到第65天發(fā)展出gvhd，其通過不同器官的組織學檢查確認。

圖40a是顯示注射有t細胞——tcr或tcr/hla-i被消融——的動物的存活百分比的圖。小鼠被亞致死地照射和注射。在60天研究期間，接受野生型t細胞的5只小鼠中的四只死于gvhd。pbs處理組、tcr單消融和tcr/hla-i雙消融的t細胞處理組不顯示gvhd的任何征兆。

圖40b是圖組，其顯示了接受野生型t細胞、pbs處理的、tcr單消融或tcr/hla-i雙消融的t細胞的小鼠的體重。

圖41a是圖像組，其顯示了在使用crispr/cas9阻斷pd1和fas途徑后通用cart細胞的提高的抗腫瘤活性。當被注入荷載nalm6-pdl1的小鼠時，在pd1敲除通用cd19-cart細胞中檢測到更優(yōu)異的抗腫瘤活性。

圖41b是顯示接受不同的crispr/cas9編輯的t細胞的小鼠的定量生物發(fā)光數(shù)據(jù)的圖。

圖42是圖示組，其顯示了生成通用cart細胞的一步(one-shot)系統(tǒng)。由于grna易于降解，研發(fā)簡化的一步法以在單個慢病毒載體中組成型地表達grna連同car。

圖43是圖組，其顯示了使用一步系統(tǒng)的高效的基因消融。在電轉移cas9mrna后觀察到不同量的cd3消融。

圖44a是圖像組，其顯示了從fas敲除t細胞重編程ipsc的過程期間的形態(tài)變化。典型的胚胎干細胞形態(tài)形成指示fasnegt細胞可以被誘導至多能狀態(tài)。

圖44b是顯示fasnegt細胞以野生型對應體的大約5倍的效率被重編程至ipsc的圖。p53缺陷細胞系已經(jīng)被報道為由于凋亡途徑的阻礙而易于重編程。fas敲除可以使用相似的機制促進重編程過程。

圖45a是圖像組，其顯示了在限定的重編程條件下來自cd3negtcrα或β鏈敲除t細胞的ipsc的es樣形態(tài)。形態(tài)在幾次傳代后保持恒定。

圖45b是顯示cd3negt細胞的重編程比野生型對應體大約5倍低效的圖，這表明tcr敲除可以在t細胞重編程的過程中發(fā)揮作用或在仙臺病毒感染后影響細胞生存力。

圖45c是圖像組，其顯示了cd3negipsc細胞的磷酸酶染色。

圖46是圖組，其顯示了不同t-ipsc細胞系中的內(nèi)源多能干細胞基因的誘導。

圖47a是圖像組，其顯示了tra-1-60和ssea4表達的免疫染色。

圖47b是顯示通過sanger測序確認t-ipsc的fas敲除的圖像。

圖48a是圖組，其顯示了使用不同版本的cas9的幼稚t細胞中的基因消融。cd3使用dcas9和foki-cas9進行敲除。

圖48b是圖組，其顯示dcas9和foki-cas9的基因消融需要兩種grna。

圖48c是顯示使用crispr/cas9的基因修飾的t細胞中罕見的脫靶事件的圖像。

圖49是圖像組，其顯示了將crispr/cas9引入t細胞的策略。在左側顯示了由t7啟動子驅(qū)動的grna的示意圖。在右側顯示了使用crispr系統(tǒng)生成基因編輯的抗原特異性t細胞的示意圖。在cd3/cd28珠刺激后3天，t細胞電穿孔有cas9mrna和靶向特定基因的grna，并且然后在存在il2的情況下在32℃下培養(yǎng)24小時，接著返回至正常的37℃培養(yǎng)條件。在第8天分選特定基因-破壞的t細胞，并且通過慢病毒轉導或mrna電穿孔基因轉移使用car或tcr進行重定向。

圖50a是圖組，其顯示了t細胞中crispr/cas9介導的高效的tcr破壞。顯示了在37℃或32℃下培養(yǎng)的crispr/cas9編輯的t細胞的cd3表達。

圖50b是圖組，其顯示了在連續(xù)的crisprrna電穿孔后培養(yǎng)的crispr/cas9編輯的t細胞的cd3表達。

圖51a是圖組，其顯示了在t細胞中發(fā)生的高效的crispr基因破壞。顯示了使用不同的cas9:grna比值(上組和中組)和總crisprrna的量(下組)轉移有crispr的t細胞的cd3表達。

圖51b是顯示通過流式細胞術和克隆測序二者計算的靶向效率的表格。

圖52是顯示通過對由細胞擴增的dna進行錯配選擇性t7surveyor核酸酶測定測量的tcr-靶向的基因破壞的量的圖像。在底部顯示了trac和trbc中靶向的基因破壞的計算量。箭頭指示期望的條帶。

圖53a是在crispr-介導的tcrα與β基因座的重組后通過pcr擴增子的克隆序列分析觀察到的插入/缺失(在基因破壞中)的圖像。

圖53b是編碼tcrα與β恒定區(qū)的基因組基因座內(nèi)的tcrα與βcrisprgrna靶向位點的人基因座的圖表的圖像。每個外顯子由塊顯示。箭頭：有義鏈grna靶向位點；藍色箭頭：反義鏈grna靶向位點。sanger測序結果中的多個峰顯示了trac和trbc基因組基因座處的crispr-介導的nhej的事件。

圖54是圖組，其顯示了純化的tcr^neg細胞中的cd3表達。

圖55是圖組，其顯示經(jīng)由1g4tcr(α與β)或car19mrna的電轉移重定向tcr/cd3^neg細胞。

圖56是顯示使用不同的刺激條件10天后的tcr/cd3^neg細胞擴展的圖。

圖57是圖組，其顯示了crispr/cas9編輯不損害原代t細胞的抗腫瘤功效。顯示了tcr/cd3^neg細胞在四種不同擴展技術后的表型。

圖58是圖組，其顯示了在將cd19-carrna電轉移入cas9空白對照和tcr/cd3^neg細胞后的相對cd19-car表達。

圖59a是圖組，其顯示在cd19-car重定向的cas9空白對照和tcr/cd3^neg細胞之間沒有觀察到顯著的功能性差異，如在使用nalm6靶細胞培育后通過cd107釋放測定確認的。顯示了來自3個獨立實驗的代表性數(shù)據(jù)。誤差線(bar)，標準誤差。

圖59b是顯示在cd19-car重定向的cas9空白對照和tcr/cd3^neg細胞之間沒有觀察到顯著的功能性差異——如在使用nalm6靶細胞培育后通過細胞毒性測定確認的——的圖。顯示了來自3個獨立實驗的代表性數(shù)據(jù)。誤差線，se＝標準誤差。

圖59c是圖組，其顯示在cd19-car重定向的cas9空白對照和tcr/cd3^neg細胞之間沒有觀察到顯著的功能性差異，如在使用nalm6靶細胞培育后通過il2和ifnγ分泌確認的。顯示了來自3個獨立實驗的代表性數(shù)據(jù)。誤差線，se＝標準誤差。

圖59d是注射有1×10⁶個nalm6腫瘤細胞(i.v.)的nod/scid/γc(-/-)小鼠(n＝12)的圖像組，小鼠被隨機地分選為三組。在電穿孔后，每4天靜脈內(nèi)注射表達cd19-car的cas9空白對照和tcr/cd3^negt細胞(10×10⁶個)，持續(xù)總計三次注射(箭頭)。使用未電穿孔有rna的t細胞處理的小鼠充當對照。如指示的，從存活的動物獲得圖像。在開始t細胞處理前1天開始成像。誤差線，se＝標準誤差，ep＝電穿孔；e:t＝效應物：腫瘤比值；箭頭，t細胞輸注的時間點；ns，不顯著。****p<0.0001，ns通過雙因素方差分析加bonferroni事后檢驗。

圖59e是顯示熒光細胞的輻射率的圖。

圖60是圖組，其顯示了通過crispr/cas9的雙基因消融和三基因消融以生成通用效應細胞。使用靶向b2m的grna進行hla-i破壞。

圖61是生成如本文描述的通用效應細胞的方案的流程圖。

圖62是圖組，其顯示tcr消融廢除了非特異性殺傷活性。使用t細胞——使用或不使用pha進行預處理——在20:1的效應物：靶比值下培育624mel-cbg和pc3-cbg腫瘤細胞系24小時，并且基于熒光素酶測定計算細胞毒性。數(shù)據(jù)是平均值±sd；n＝3。

圖63是圖組，其顯示了ifnγelispot測定以測量tcr和tcr/hla破壞的同種異體反應性——其通過使用照射的同種異體pbmc攻擊基因消融的t細胞(左組)或使用照射的基因消融的t細胞共培養(yǎng)同種異體pbmc進行。具體的點在y軸上顯示為在存在刺激物的情況下產(chǎn)生的點減去由單獨的效應物產(chǎn)生的點。通過曼-惠特尼檢驗，**p<0.01。

圖64是圖組，其顯示了通過crispr/cas9的內(nèi)源性tcr的破壞改進tcr-重定向的t細胞功能。在電穿孔有ny-eso-1tcrα(1g4α，2μg)、β(1g4β，2μg)或α+βrna(1g4α+β，2+2μg)rna的轉染有單獨的cas9mrna的t細胞(cas9空白對照)或cd3^negt細胞——其具有破壞的單獨的內(nèi)源性tcrα(αko)、單獨的β(βko)、α與β二者(α+βko)——中顯示了vb13.1和cd3表達。

圖65a是圖組，其顯示了使用hla-a2/ny-eso-1-陽性細胞系(nalm6-eso)或?qū)φ占毎祅alm6刺激的電穿孔tcr(1g4)α/βrna的tcrα或β單敲除或α+β雙敲除t細胞的cd107a上調(diào)。

圖65b是顯示電穿孔tcrα+βrna(1g4tcr)的tcrα或β單敲除或α+β雙敲除t細胞的裂解能力的圖，其在針對nalm6-eso的基于熒光素酶的ctl測定顯示。

圖66是圖組，其顯示了與對照cas9空白對照t細胞相比，電穿孔有兩種不同的ny-eso-1tcrrna(1g4tcr，10μg或8ftcr，10μg)的tcrα+β雙重破壞的t細胞(tcr^negt細胞)中的vβ和cd3表達。

圖67a是圖組，其顯示了使用hla-a2/ny-eso-1-陽性細胞系nalm6-eso、624-mel或u266刺激的電穿孔ny-eso-1tcr(1g4tcr或8ftcr)rna的tcr雙敲除cd8⁺t細胞中的cd107a上調(diào)。nalm6被用作陰性對照。

圖67b是圖組，其顯示了在使用hla-a2/ny-eso-1-陽性細胞系nalm6-eso或u266進行刺激后，電穿孔ny-eso-1tcr(1g4tcr或8ftcr)rna的tcr雙敲除t細胞的細胞因子產(chǎn)生(il-2和tnf-α)；888mel黑素瘤細胞被用作陰性對照。*p<0.05，**p<0.01****p<0.0001，通過雙因素方差分析加bonferroni事后檢驗。

圖68是圖像組，其顯示使用慢病毒基因轉移和crispr/cas9電穿孔的組合生成通用cart細胞。顯示了生成通用cd19-cart細胞的流程圖。t細胞在刺激后第1天轉導有慢病毒cd19-car，并且cas9mrna以及靶向tcrα與tcrβ鏈和b2m的grna在2天后電穿孔在t細胞中。tcr和hla-i雙陰性細胞群在再刺激進行擴展前被富集。

圖69是圖組，其顯示了在1g4tcr電穿孔后通過cd3/cd28珠刺激擴展的基因修飾的慢病毒-cd19-cart細胞中的cd19-car表達。

圖70是圖組，其顯示了cd19-cart細胞的表型。

圖71是顯示tcr-陰性和tcr/hla-i雙陰性cd19-cart細胞中的cd107a釋放的圖。顯示了來自3個獨立實驗的代表性數(shù)據(jù)。誤差線，se＝標準誤差。

圖72是圖組，其顯示了tcr-陰性和tcr/hla-i雙陰性cd19-cart細胞的細胞因子分泌。顯示了來自3個獨立實驗的代表性數(shù)據(jù)。誤差線，se＝標準誤差。

圖73是顯示tcr-陰性和tcr/hla-i雙陰性cd19-cart細胞的腫瘤裂解能力的圖。顯示了來自3個獨立實驗的代表性數(shù)據(jù)。誤差線，se＝標準誤差。

圖74是圖組，其顯示了使用1：10的比值下的k562和靶標k562-cd19腫瘤細胞培育72小時的cfse-標記的cd19-car和未轉導的t細胞。

圖75a是顯示來自在第7天使用單注射處理的小鼠——其使用慢病毒載體表達cd19-car和gfp——的bli的圖。ns，無差異，通過雙因素方差分析加bonferroni事后檢驗。通過靜脈內(nèi)注射1×10⁶個nalm6細胞在nsg小鼠(n＝4/組)中建立腫瘤。在第7天開始，使用單注射輸注表達慢病毒(lv)轉導的cd19-car的t細胞(1×10⁷個)。表達lvgfp蛋白的t細胞作為對照被注射。

圖75b是顯示接受lv-gfp、lv-cd19-car、lv-cd19-car-tcr/cd3^neg和lv-cd19-car-tcr/hla-i^negt細胞的小鼠的總存活的圖。ns，無差異，通過時序mantel-cox檢驗。

圖76是圖像組，其顯示基因修飾的cart細胞保留抗腫瘤功效并且不誘導gvhd。通過靜脈內(nèi)注射1×10⁶個nalm6細胞在nsg小鼠(n＝4/組)中建立腫瘤。在第7天開始，使用單注射輸注表達lv-cd19-car的t細胞(2×10⁷個)。表達lvgfp蛋白的t細胞作為對照被注射。在t細胞處理前1天開始成像。在第65天收集來自不同處理組的隨機選擇的小鼠的器官并且用于cd3免疫組織化學染色。圖77是一系列載體的示意圖，其顯示了靶向pd1、fas和tcrα鏈的pad5f35-crispr的設計。

圖78是顯示具有抗cd3scfv的五鄰體修飾的pad5f35-crispr的設計，和在體外和體內(nèi)示意性地遞送用于敲入/敲除嵌合抗原受體的pad5f35-crispr進入t細胞的圖示。

圖79a是顯示側接pd1-grna靶向位點的pcr產(chǎn)物的sanger測序的圖。腺病毒-pad5f35-crispr-pd1病毒被轉導入md231細胞。3天后，提取基因組dna并且進行pcr。

圖79b顯示了腺病毒-crispr操縱后mda231細胞中的靶向事件(event)的序列。pd1pcr產(chǎn)物被克隆入topo載體并且被測序。

圖80是顯示grna使用的減少提高t細胞擴展倍數(shù)和僅輕微地降低敲除效率的圖表。

圖81是顯示用于優(yōu)化電穿孔條件以獲得高的cd3/b2m敲除效率以及提高的t細胞擴展倍數(shù)的參數(shù)的圖表。與2mm小池(ep#10-13)或4mm小池中標準的電穿孔(ep)條件進行比較。觀察到高的cd3/b2m敲除效率，伴隨提高的t細胞擴展倍數(shù)(ep#1和5)。

圖82是顯示優(yōu)化ep條件以取得最大擴展倍數(shù)以及可容許的敲除效率的圖表。

圖83是顯示另外優(yōu)化ep條件以取得最大擴展倍數(shù)以及可容許的敲除效率的圖表。

圖84圖示了t細胞刺激、慢病毒轉導和crispr電穿孔程序。

圖85是顯示電穿孔和培養(yǎng)程序后的t細胞數(shù)目(上圖表)和擴展倍數(shù)(下圖表)的圖表。

圖86是圖組，其顯示了t細胞的平均擴展。顯示了轉導有單獨的cd19car(單獨的td)或轉導有cd19car并且使用crispr(td/ko)編輯(左圖)的t細胞的擴展倍數(shù)。t細胞在第10天的擴展倍數(shù)在右圖中顯示。

圖87是流式細胞術圖組，其顯示了擴展的t細胞在第8天時的cd3/b2m/car表達。

圖88是圖組，其顯示了cd3+t細胞耗減后的cd3/b2m表達。

圖89是圖組，其顯示了在cd19cartd(轉導的)/電穿孔crispr的、耗減cd3的t細胞；cd19cartd/電穿孔crispr的t細胞；和cd19cartdt細胞中第11天的cd3/b2m表達。未轉導的nd463(notd)被用作陰性對照。圖90是圖組，其顯示了在cd19cartd(轉導的)/電穿孔crispr的、耗減cd3的t細胞；cd19cartd/電穿孔crispr的t細胞；和cd19cartdt細胞中第11天的cd19car表達。未轉導的nd463(notd)被用作陰性對照。

圖91是圖組，其顯示了在cd19cartd(轉導的)/電穿孔crispr的、耗減cd3的t細胞；cd19cartd/電穿孔crispr的t細胞；和cd19cartdt細胞中第11天的cd3/b2m/car表達。未轉導的nd463(notd)被用作陰性對照。

圖92是概述在cd19cartd(轉導的)/電穿孔crispr的、耗減cd3的t細胞；cd19cartd/電穿孔crispr的t細胞；和cd19cartdt細胞中的cd3/b2m/car表達的圖表。

圖93是圖組，其顯示了在cd19cartd(轉導的)/電穿孔crispr的、耗減cd3的t細胞；cd19cartd/電穿孔crispr的t細胞；和cd19cartdt細胞中的cd107a上調(diào)。

圖94是圖組，其顯示了t細胞在第11天的裂解活性。

圖95是圖組，其顯示了t細胞在第11天的細胞因子產(chǎn)生。

圖96是圖組，其顯示了t細胞擴展。沒有觀察到異常的t細胞生長。

具體實施方式

定義

除非另外定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的相同的含義。雖然可以在測試本發(fā)明的實踐中使用與本文描述的那些類似或等價的任何方法和材料，但是本文描述了優(yōu)選的材料和方法。在描述和要求保護本發(fā)明中，將使用下列術語。

也理解本文使用的術語僅出于描述具體實施方式的目的，并且不意欲是限制性的。

本文使用冠詞“一個”和“一種”，指的是一個或多于一個(即，至少一個)該冠詞的語法對象。舉例而言，“一個要素”意思是一個要素或多于一個要素。

如本文使用的“大約”，當指的是可測量的值比如量、時間期間等時，意思是包括從規(guī)定值的±20％或±10％、更優(yōu)選地±5％、甚至更優(yōu)選地±1％、和還更優(yōu)選地±0.1％的變化，因為這樣的變化適于進行公開的方法。

如本文使用的“活化”指的是已經(jīng)被充分地刺激以誘導可檢測的細胞增殖的t細胞的狀態(tài)。活化也可以與誘導的細胞因子產(chǎn)生和可檢測的效應物功能相關聯(lián)。術語“活化的t細胞”指的是經(jīng)歷細胞分裂的t細胞等。

如本文使用的術語“抗體”指的是與抗原特異性地結合的免疫球蛋白分子?？贵w可以是源自自然來源或重組來源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反應性部分。抗體通常是免疫球蛋白分子的四聚體。本發(fā)明中的抗體可以以多種形式存在，包括，例如，多克隆抗體、單克隆抗體、fv、fab和f(ab)2，以及單鏈抗體(scfv)和人源化抗體(harlow等，1999,in:usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,ny；harlow等，1989in:antibodies:alaboratorymanual,coldspringharbor,newyork；houston等，1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；bird等，1988,science242:423-426)。

術語“抗體片段”指的是完整抗體的一部分，并且指的是完整抗體的抗原決定可變區(qū)?？贵w片段的實例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、和fv片段、線性抗體、scfv抗體、和由抗體片段形成的多特異性的抗體。

如本文使用的“抗體重鏈”指的是以它們自然存在的構象存在于所有抗體分子中的兩種類型的多肽鏈中的較大的鏈。

如本文使用的“抗體輕鏈”指的是以它們自然存在的構象存在于所有抗體分子中的兩種類型的多肽鏈中的較小的鏈。α和β輕鏈指的是兩種主要的抗體輕鏈同種型。

如本文使用的術語“合成抗體”的意思是使用重組dna技術生成的抗體，比如，例如，如本文描述的由噬菌體表達的抗體。該術語也應當解釋為意思是已經(jīng)由dna分子——其編碼抗體并且該dna分子表達抗體蛋白或規(guī)定抗體的氨基酸序列——的合成生成的抗體，其中dna或氨基酸序列已經(jīng)使用本領域可獲得和熟知的合成dna或氨基酸序列技術獲得。

如本文使用的術語“抗原”或“ag”定義為激發(fā)免疫應答的分子。此免疫應答可以包括抗體產(chǎn)生，或特異性免疫活性細胞的活化，或二者。技術人員將理解任何大分子——實際上包括所有蛋白質(zhì)或肽——可以充當抗原。另外，抗原可以衍生自重組或基因組dna。技術人員將理解任何dna——其包括編碼引起免疫應答的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或部分核苷酸序列——因此編碼如本文使用的術語“抗原”。另外，本領域技術人員將理解抗原不必僅僅由基因的全長核苷酸序列編碼。容易顯而易見的是本發(fā)明包括但不限于多于一種基因的部分核苷酸序列的用途，并且這些核苷酸序列以不同的組合布置以引起期望的免疫應答。而且，技術人員將理解抗原根本不必由“基因”編碼。容易顯而易見的是抗原可以被生成、合成或可以衍生自生物學樣品。這樣的生物學樣品可以包括但不限于組織樣品、腫瘤樣品、細胞或生物學流體。

如本文使用的術語“抗腫瘤效應”指的是生物學效應，其可由腫瘤體積的減小、腫瘤細胞數(shù)目的減少、轉移數(shù)目的減少、預期壽命的增加、或與癌性病癥相關聯(lián)的各種生理學癥狀的改善顯現(xiàn)。“抗腫瘤效應”也可以由本發(fā)明的肽、多核苷酸、細胞和抗體在預防腫瘤在第一位置發(fā)生的能力顯現(xiàn)。

根據(jù)本發(fā)明，術語“自身抗原”意思是由免疫系統(tǒng)識別為異物(foreign)的任何自體抗原。自身抗原包括但不限于細胞蛋白、磷蛋白、細胞表面蛋白、細胞脂質(zhì)、核酸、糖蛋白，其包括細胞表面受體。

如本文使用的，術語“自身免疫疾病”定義為由自身免疫反應導致的障礙。自身免疫疾病是對自體抗原的不適當和過度應答的結果。自身免疫疾病的實例包括但不限于阿狄森氏病、斑禿、強直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克羅恩病、糖尿病(i型)、營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解、附睪炎、腎小球性腎炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏綜合征、橋本氏病、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、尋常天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關節(jié)炎、結節(jié)病、硬皮病、斯耶格倫氏綜合征、脊椎關節(jié)病、甲狀腺炎、血管炎、白斑病、粘液性水腫、惡性貧血、潰瘍性結腸炎等。

如本文使用的術語“自體的”意思是指衍生自相同個體的任何物質(zhì)，其隨后被再引入該個體。

“同種異體的”指的是衍生自相同物種的不同動物的移植物。

“異種的”指的是衍生自不同物種的動物的移植物。

如本文使用的術語“癌癥”定義為以畸變細胞的快速和失控生長表征的疾病。癌細胞可以局部地擴散或通過血流和淋巴系統(tǒng)擴散至身體的其它部分。多種癌癥的實例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在某些實施方式中，癌癥是甲狀腺髓樣癌。

如本文使用的術語“嵌合抗原受體”或“car”指的是被工程化以在免疫效應細胞上表達和特異性地結合抗原的人工t細胞受體。car可以被用作使用過繼細胞轉移的療法。t細胞從患者移出并且進行修飾，使得它們表達特異于具體形式的抗原的受體。例如，在一些實施方式中，已經(jīng)以對腫瘤相關抗原的特異性表達car。car還可以包括胞內(nèi)活化結構域、跨膜結構域和胞外結構域——其包括腫瘤相關抗原結合區(qū)。在一些方面，car包括融合單鏈可變片段(scfv)衍生的單克隆抗體，其被融合至cd3-ζ跨膜和胞內(nèi)結構域。car設計的特異性可以源自受體的配體(例如，肽)。在一些實施方式中，通過重定向表達特異于腫瘤相關抗原的car的t細胞的特異性，car可以靶向癌癥。

術語“切割”指的是共價鍵的斷裂，比如在核酸分子的主鏈中?？梢酝ㄟ^各種方法起始切割，其包括但不限于磷酸二酯鍵的酶促或化學水解。單鏈切割和雙鏈切割二者都是可能的?？梢杂捎趦蓚€不同的單鏈切割事件而發(fā)生雙鏈切割。dna切割可以導致產(chǎn)生平頭末端或交錯末端。在某些實施方式中，融合多肽可以用于靶向切割的雙鏈dna。

如本文使用的，術語“保守序列修飾”意欲指的是如此氨基酸修飾，其不顯著地影響或改變包含該氨基酸序列的抗體的結合特性。這樣的保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失。修飾可以通過本領域已知的標準技術比如定點誘變和pcr-介導的誘變引入本發(fā)明的抗體。保守氨基酸置換是其中氨基酸殘基被替換為具有類似側鏈的氨基酸殘基的置換。本領域已經(jīng)定義了具有類似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支化側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因而，抗體的cdr區(qū)內(nèi)的一種或多種氨基酸殘基可以被替換為來自相同側鏈家族的其它氨基酸殘基，并且可以使用本文描述的功能性測定測試改變的抗體結合抗原的能力。

如本文使用的術語“共刺激配體”包括特異性地結合t細胞上的關聯(lián)共刺激分子的抗原呈遞細胞(例如，aapc、樹突細胞、b細胞等)上的分子，由此除了通過例如將tcr/cd3復合體與負載有肽的mhc分子結合提供的初級信號之外，還提供了介導t細胞應答的信號，所述t細胞應答包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配體可以包括但不限于cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、可誘導的共刺激配體(icos-l)、細胞間粘附分子(icam)、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、micb、hvem、淋巴毒素β受體、3/tr6、ilt3、ilt4、hvem、結合toll配體受體的激動劑或抗體和與b7-h3特異性地結合的配體。共刺激配體也包括，特別是與存在于t細胞上的共刺激分子特異性地結合的抗體，所述共刺激分子比如，但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細胞功能相關抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和與cd83特異性地結合的配體。

“共刺激分子”指的是t細胞上的關聯(lián)結合配偶體，其與共刺激配體特異性地結合，由此介導通過t細胞的共刺激應答，比如，但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于mhci類分子、btla和toll配體受體。

如本文使用的“共刺激信號”指的是與初級信號比如tcr/cd3連接組合導致t細胞增殖和/或關鍵分子的上調(diào)或下調(diào)的信號。

術語“crispr/cas”、“成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)系統(tǒng)”或“crispr”指的是包含堿基序列的短重復的dna基因座。每個重復接著先前暴露于病毒的間隔dna的短區(qū)段。細菌和古細菌已經(jīng)進化出被稱為crispr-crispr相關(cas)系統(tǒng)的適應性免疫防御，其使用短rna指導外源核酸的降解。在細菌中，crispr系統(tǒng)經(jīng)由rna-引導的dna切割提供了針對侵入的外源dna的獲得性免疫。

在ii型crispr/cas系統(tǒng)中，稱為“間隔區(qū)”的外源dna的短區(qū)段被整合在crispr基因組基因座內(nèi)并且轉錄和加工為短的crisprrna(crrna)。使這些crrna與反式激活的crrna(tracrrna)退火并且通過cas蛋白指導致病dna的序列特異性切割和沉默。近來的工作已經(jīng)顯示通過cas9蛋白的靶標識別需要crrna內(nèi)的“種子”序列和crrna-結合區(qū)上游的包含保守的二核苷酸的前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列。

為了指導cas9切割感興趣的序列，可以從人u6聚合酶iii啟動子設計crrna-tracrrna融合轉錄物，下文稱為“引導rna”或“grna”。crispr/cas介導的基因組編輯和調(diào)控突顯出其用于基礎科學、細胞工程和治療的變革性潛力。

術語“crispri”指的是用于基因表達的序列特異性基因阻遏或抑制的crispr系統(tǒng)，比如在轉錄水平下。

“疾病”是動物的健康狀態(tài)，其中動物不能維持穩(wěn)態(tài)，并且其中如果不改善疾病，則動物的健康繼續(xù)惡化。相比之下，動物中的“障礙”是健康狀態(tài)，其中動物能夠維持穩(wěn)態(tài)，但是其中動物的健康狀態(tài)與它沒有該障礙時相比不太有利。保持不治療，障礙不必然引起動物健康狀態(tài)的進一步降低。

如本文使用的術語“下調(diào)”指的是一種或多種基因的基因表達的降低或消除。

“有效量”或“治療有效量”在本文可交換地使用，并且指的是對實現(xiàn)具體的生物學結果或提供治療或預防益處有效的如本文描述的化合物、制劑、材料或組合物的量。這樣的結果可以包括但不限于抗腫瘤活性，如通過本領域適合的任何手段測定的。

“編碼”指的是多核苷酸比如基因、cdna或mrna中的核苷酸的特定序列充當模板來合成生物學過程中的其它多聚體和大分子的固有性質(zhì)，所述多聚體和大分子具有核苷酸(即，rrna、trna和mrna)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一種和由其產(chǎn)生的生物學性質(zhì)。因而，如果對應于基因的mrna的轉錄和翻譯在細胞或其它生物學系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)，則該基因編碼蛋白質(zhì)。其核苷酸序列與mrna序列具有同一性并且通常在序列表中提供的編碼鏈，和用作基因或cdna轉錄的模板的非編碼鏈兩者，都可以被稱為編碼該基因或cdna的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。

如本文使用的“內(nèi)源的”指的是來自生物體、細胞、組織或系統(tǒng)的或在生物體、細胞、組織或系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的任何物質(zhì)。

如本文使用的，術語“外源的”指的是從生物體、細胞、組織或系統(tǒng)引入的或在生物體、細胞、組織或系統(tǒng)外產(chǎn)生的任何物質(zhì)。

如本文使用的術語“擴展”指的是數(shù)目的增加，如t細胞數(shù)目的增加。在一個實施方式中，離體擴展的t細胞的數(shù)目相對于培養(yǎng)物中原始存在的數(shù)目增加。在另一個實施方式中，離體擴展的t細胞的數(shù)目相對于培養(yǎng)物中的其它細胞類型的數(shù)目增加。如本文使用的術語“離體”指的是已經(jīng)從活的生物體(例如，人)移出，并且在生物體外(例如，在培養(yǎng)皿、試管或生物反應器中)繁殖的細胞。

如本文使用的術語“表達”定義為由它的啟動子驅(qū)動的特定核苷酸序列的轉錄和/或翻譯。

“表達載體”指的是包括重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包括可操作地連接至待表達的核苷酸序列的表達控制序列。表達載體包括足夠的用于表達的順式作用元件；用于表達的其它元件可以由宿主細胞供應或在體外表達系統(tǒng)中供應。表達載體包括所有本領域已知的并入重組多核苷酸的那些，比如粘粒、質(zhì)粒(例如，裸露或包含在脂質(zhì)體中)和病毒(例如，仙臺病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。

如本文使用的，“同源的”指的是兩個聚合物分子之間，例如，兩個核酸分子——比如兩個dna分子或兩個rna分子——之間，或兩個多肽分子之間的亞基序列同一性。當兩個分子的二者中的亞基位置被相同的單體亞基占據(jù)時；例如，如果兩個dna分子的每個中的位置被腺嘌呤占據(jù)，則它們在該位置處是同源的。兩個序列之間的同源性是匹配或同源位置的數(shù)目的直接函數(shù)；例如，如果兩個序列中的一半位置(例如，長度為十個亞基的聚合物中的五個位置)是同源的，則兩個序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10個中的9個)是匹配的或同源的，則兩個序列是90％同源的。

“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(比如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗體的其它抗原-結合子序列)，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。就大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者的互補決定區(qū)(cdr)的殘基被來自非人物種(供體抗體)比如小鼠、大鼠或兔的cdr的殘基——其具有期望的特異性、親和力和能力——替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的fv框架區(qū)(fr)殘基被對應的非人殘基替換。另外，人源化抗體可以包括既沒有在接受者抗體中也沒有在輸入的cdr或框架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。做出這些修飾以進一步改進和優(yōu)化抗體性能。一般而言，人源化抗體將包括基本上所有至少一種和通常兩種可變結構域，其中所有或基本上所有cdr區(qū)對應于非人免疫球蛋白的那些并且所有或基本上所有fr區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體最佳地還將包括免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。進一步的細節(jié)參見jones等，nature,321:522-525,1986；reichmann等，nature,332:323-329,1988；presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596,1992。

“全人(fullyhuman)”指的是免疫球蛋白，比如抗體，其中整個分子具有人起源或由與人形式的抗體具有同一性的氨基酸序列構成。

如本文使用的“同一性”指的是兩個聚合物分子之間，特別是兩個氨基酸分子之間，比如，兩個多肽分子之間的亞基序列同一性。當兩個氨基酸序列在相同位置具有相同殘基時；例如，如果兩個多肽分子中的每個中的位置均被精氨酸占據(jù)，則它們在該位置是同一的。在比對中，兩個氨基酸序列在相同位置具有相同殘基的同一性或程度經(jīng)常表達為百分數(shù)。兩個氨基酸序列之間的同一性是匹配或同一位置的數(shù)目的直接函數(shù)；例如，如果兩個序列中的一半位置(例如，十個氨基酸長度的聚合物中的五個位置)是同一的，則兩個序列是50％同一的；如果90％的位置(例如，10個中的9個)是匹配的或同一的，則兩個氨基酸序列是90％同一的。

如本文使用的術語“免疫球蛋白”或“ig”定義為起抗體作用的一類蛋白質(zhì)。由b細胞表達的抗體有時被稱為bcr(b細胞受體)或抗原受體。包括在此類蛋白質(zhì)中的五個成員是iga、igg、igm、igd和ige。iga是存在于身體分泌物，比如唾液、淚液、母乳、胃腸分泌物和呼吸道與生殖泌尿道的粘液分泌物中的初次抗體。igg是最常見的循環(huán)抗體。igm是在大多數(shù)對象中的初次免疫應答中產(chǎn)生的主要免疫球蛋白。它在凝集、補體結合和其它抗體應答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御細菌和病毒方面是重要的。igd是不具有已知抗體功能的免疫球蛋白，但是可以充當抗原受體。ige是在暴露于過敏原之后，通過引起從肥大細胞和嗜堿性粒細胞釋放介體，介導速發(fā)過敏性的免疫球蛋白。

如本文使用的術語“免疫應答”定義為當淋巴細胞將抗原分子識別為異物并誘發(fā)形成抗體和/或活化淋巴細胞以移除抗原時發(fā)生的對抗原的細胞應答。

如本文使用的，“誘導多能干細胞”或“ips細胞”指的是由成人細胞比如t細胞生成的多能干細胞。成人細胞中重編程因子——比如klf4、oct3/4和sox2——的表達將細胞轉化為能夠繁殖和分化為多種細胞類型的多能細胞。

如本文使用的“指導材料”包括出版物、記錄、圖表或任何其它可以用于傳達本發(fā)明的組合物和方法的有用性的表達媒介。本發(fā)明的試劑盒的指導材料可以例如被附加至包含本發(fā)明的核酸、肽和/或組合物的容器，或與包含核酸、肽和/或組合物的容器一起運送?？蛇x地，指導材料可以與容器分開地運送，目的是指導材料和化合物由接受者配合使用。

“分離的”意思是從自然狀態(tài)改變或移出。例如，天然存在于活動物中的核酸或肽不是“分離的”，但是部分或完全與它的自然狀態(tài)的共存物質(zhì)分開的相同的核酸或肽是“分離的”。分離的核酸或蛋白質(zhì)可以以基本上純化的形式存在，或可以存在于非自然環(huán)境，比如，例如，宿主細胞中。

如本文使用的術語“敲落”指的是一種或多種基因的基因表達的降低。

如本文使用的術語“敲除”指的是一種或多種基因的基因表達的消融。

如本文使用的“慢病毒”指的是逆轉錄病毒科家族的屬。在逆轉錄病毒中慢病毒是唯一能夠感染非分裂細胞的；它們可以遞送顯著量的遺傳信息進入宿主細胞的dna，以便它們是基因遞送載體的最有效的方法之一。hiv、siv和fiv都是慢病毒的實例。衍生自慢病毒的載體提供了實現(xiàn)顯著水平的體內(nèi)基因轉移的工具。

如本文使用的術語“修飾的”意思是本發(fā)明的分子或細胞的改變的狀態(tài)或結構。分子可以以許多方式被修飾，包括化學地、結構地和功能地。細胞可以通過引入核酸進行修飾。

如本文使用的術語“調(diào)節(jié)”意思是與缺少治療或化合物的對象中的應答水平相比，和/或與在其它方面相同但未治療的對象中的應答水平相比，介導對象中的應答水平中的可檢測的增加或減少。該術語包括擾亂和/或影響天然信號或應答，從而介導對象——優(yōu)選地，人——中的有益的治療性應答。

在本發(fā)明的背景下，使用常見核酸堿基的下列縮寫?！癮”指的是腺苷，“c”指的是胞嘧啶，“g”指的是鳥苷，“t”指的是胸苷，和“u”指的是尿苷。

除非另外規(guī)定，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的簡并形式并且編碼相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短語編碼蛋白質(zhì)或rna的核苷酸序列還可以包括內(nèi)含子，其程度為編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以在一些形式中包含內(nèi)含子(一個或多個)。

術語“可操作地連接”指的是調(diào)控序列和異源核酸序列之間的功能連接，其導致異源核酸序列的表達。例如，當?shù)谝缓怂嵝蛄刑幱谂c第二核酸序列的功能關系中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，則啟動子可操作地連接至編碼序列。通常地，可操作地連接的dna序列是鄰近的，并且在必要時在同一的閱讀框中接合兩個蛋白編碼區(qū)。

術語“過表達的”腫瘤抗原或腫瘤抗原的“過表達”意欲指示相對于來自組織或器官的正常細胞的表達水平，來自疾病區(qū)如患者的特定組織或器官內(nèi)的實體瘤的細胞中的腫瘤抗原表達的異常水平?；加幸阅[瘤抗原過表達表征的實體瘤或血液學惡性腫瘤的患者可以由本領域已知的標準測定來確定。

免疫原性組合物的“腸胃外”施用包括，例如，皮下(s.c.)、靜脈內(nèi)(i.v.)、肌肉內(nèi)(i.m.)或胸骨內(nèi)注射，或注入技術。

如本文使用的術語“多核苷酸”定義為核苷酸鏈。另外，核酸是核苷酸的聚合物。因而，如本文使用的核酸和多核苷酸是可交換的。本領域技術人員具有核酸是可以被水解為單體“核苷酸”的多核苷酸的一般知識。單體核苷酸可以被水解為核苷。如本文使用的多核苷酸包括但不限于通過本領域可獲得的任何手段獲得的所有的核酸序列，所述手段非限制性地包括重組手段，即，使用普通克隆技術和pcr^tm等從重組文庫或細胞基因組克隆核酸序列，和通過合成手段。

如本文使用的，術語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可交換地使用，并且指的是由肽鍵共價連接的氨基酸殘基組成的化合物。蛋白或肽必須包含至少兩個氨基酸，并且對可以構成蛋白質(zhì)或肽的序列的氨基酸的最大數(shù)目沒有限制。多肽包括任何肽或蛋白質(zhì)，所述肽或蛋白質(zhì)包括通過肽鍵相互接合的兩個或更多個氨基酸。如本文使用的，該術語指的是短鏈，其在本領域中也通常被稱為例如肽、寡肽和寡聚物；和較長鏈二者，其在本領域中通常被稱為蛋白質(zhì)，其具有許多類型?！岸嚯摹卑ɡ缟飳W活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽的變體、修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。

如本文使用的術語“啟動子”定義為起始多核苷酸序列的特異性轉錄需要的，由細胞的合成機器識別，或合成機器(machinery)引入的dna序列。

如本文使用的，術語“啟動子/調(diào)控序列”意思是對于可操作地連接至啟動子/調(diào)控序列的基因產(chǎn)物的表達需要的核酸序列。在一些情況下，此序列可以是核心啟動子序列，并且在其它情況下，此序列還可以包括對于基因產(chǎn)物的表達需要的增強子序列和其它調(diào)控元件。例如，啟動子/調(diào)控序列可以是以組織特異性方式表達基因產(chǎn)物的序列。

“組成型”啟動子是如下核苷酸序列，當其與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時，引起在細胞的大多數(shù)或所有生理學條件下在細胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。

“誘導型”啟動子是如下核苷酸序列，當其與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時，引起在基本上僅當對應于啟動子的誘導物存在于細胞中時，在細胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。

“組織-特異性”啟動子是如下核苷酸序列，當其與編碼基因或由基因規(guī)定的多核苷酸可操作地連接時，引起基本上僅如果細胞是對應于啟動子的組織類型的細胞，則在細胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。

“仙臺病毒”指的是副粘病毒科的屬。仙臺病毒是不整合入宿主基因組或改變宿主細胞的遺傳信息的負、單鏈rna病毒。仙臺病毒具有異常廣泛的宿主范圍并且對人不具有致病性。作為重組病毒載體使用時，仙臺病毒能夠瞬時但強烈的基因表達。

“信號轉導途徑”指的是多種信號轉導分子——其在將信號從細胞的一部分傳遞至細胞的另一部分中發(fā)揮作用——之間的生物化學關系。短語“細胞表面受體”包括分子和分子的復合體，其能夠跨越細胞的質(zhì)膜接收信號和傳遞信號。

“單鏈抗體”指的是通過重組dna技術形成的抗體，其中免疫球蛋白重鏈和輕鏈片段經(jīng)由工程化跨度的氨基酸連接至fv區(qū)。生成單鏈抗體的多種方法是已知的，包括在美國專利號4,694,778；bird(1988)science242:423-442；huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；ward等(1989)nature334:54454；skerra等(1988)science242:1038-1041中描述的那些。

如本文使用的關于抗體的術語“特異性地結合”意思是抗體識別特異性抗原但基本上不識別或結合樣品中的其它分子。例如，特異性地結合至來自一個物種的抗原的抗體也可以結合至來自一個或多個物種的抗原。但是，這樣的跨物種反應性本身不將抗體的類別改變?yōu)樘禺愋缘?。在另一個實例中，特異性地結合至抗原的抗體也可以結合至不同等位基因形式的抗原。然而，這樣的交叉反應性本身不將抗體的類別改變?yōu)樘禺愋缘?。在一些情況下，術語“特異性結合”或“特異性地結合”可以參考抗體、蛋白質(zhì)或肽與第二化學種類的相互作用使用，意思是該相互作用依賴化學種類上特定結構(例如，抗原決定簇或表位)的存在；例如，抗體識別和結合至特定蛋白結構，而不是一般地識別和結合至蛋白質(zhì)。如果抗體特異于表位“a”，則在包含標記的“a”和抗體的反應中存在包含表位a(或游離的、未標記的a)的分子將降低結合至抗體的標記的a的量。

術語“刺激”意思是通過結合刺激分子(例如，tcr/cd3復合體)與其關聯(lián)配體，從而介導信號轉導事件——比如，但不限于經(jīng)tcr/cd3復合體的信號轉導——誘導的初次應答。刺激可以介導某些分子的改變的表達，比如tgf-β的下調(diào)、和/或細胞骨架結構的重組等。

“刺激分子”，作為本文使用的術語，意思是與存在于抗原呈遞細胞上的關聯(lián)刺激配體特異性地結合的t細胞上的分子。

如本文使用的“刺激配體”意思是如下配體：其當存在于抗原呈遞細胞(例如，aapc、樹突細胞、b-細胞等)上時，可以與t細胞上的關聯(lián)結合配偶體(在本文稱為“刺激分子”)特異性地結合，從而介導t細胞的初次應答，其包括但不限于活化、免疫應答的起始、增殖等。刺激配體在本領域是熟知的，并且包括，特別是mhci類分子——負載有肽、抗cd3抗體、超激動劑抗cd28抗體和超激動劑抗cd2抗體。

術語“對象”意欲包括其中可以引發(fā)免疫應答的活的生物體(例如，哺乳動物)。如其中使用的“對象”或“患者”可以是人或非人哺乳動物。非人哺乳動物包括，例如，家畜和寵物，比如綿羊、?？苿游铩⒇i科動物、犬科動物、貓科動物和鼠科哺乳動物。優(yōu)選地，對象是人。

如本文使用的“基本上純化的”細胞是大體上不含其它細胞類型的細胞。基本上純化的細胞也指的是已經(jīng)與其它細胞類型——在其天然存在狀態(tài)中與該其它細胞類型正常相關聯(lián)——分開的細胞。在一些情況下，基本上純化的細胞群指的是均質(zhì)細胞群。在其它情況下，此術語簡單地指的是已經(jīng)與在其天然狀態(tài)中與該細胞正常相關聯(lián)的細胞分開的細胞。在一些實施方式中，在體外培養(yǎng)細胞。在其它實施方式中，不在體外培養(yǎng)細胞。

“靶位點”或“靶序列”指的是基因組核酸序列，其限定了在足以發(fā)生結合的條件下可以與結合分子特異性地結合的核酸部分。

如本文使用的，術語“t細胞受體”或“tcr”指的是響應于抗原的呈遞參與t細胞的活化的膜蛋白的復合體。tcr負責識別結合至主要組織相容性復合體分子的抗原。tcr由alpha(a)和beta(β)鏈的異二聚體組成，但是在一些細胞中，tcr由γ和δ(γ/δ)鏈構成。tcr可以以α/β和γ/δ形式存在，其是結構上相似的，但是具有不同的解剖學位置和功能。每個鏈由兩個胞外結構域——可變和恒定結構域——組成。在一些實施方式中，tcr可以在包括tcr的任何細胞上被修飾，包括，例如，輔助性t細胞、細胞毒性t細胞、記憶t細胞、調(diào)節(jié)性t細胞、天然殺傷t細胞和γδt細胞。

如本文使用的術語“治療性的”意思是治療和/或預防。治療性效果通過疾病狀態(tài)的阻抑、緩解或根除獲得。

如本文使用的術語“轉染的”或“轉化的”或“轉導的”指的是如下過程：通過該過程外源性核酸被轉移或引入宿主細胞?！稗D染的”或“轉化的”或“轉導的”細胞是已經(jīng)被轉染、轉化或轉導有外源性核酸的細胞。細胞包括原代對象細胞和其子代。

“治療”疾病，作為本文使用的術語，意思是降低對象經(jīng)歷的疾病或障礙的至少一種跡象或癥狀的頻率或嚴重度。

如本文使用的短語“在轉錄控制下”或“可操作地連接的”意思是啟動子處于與多核苷酸有關的正確的位置和取向，以控制通過rna聚合酶的轉錄的起始和多核苷酸的表達。

“載體”是物質(zhì)組合物，其包括分離的核酸，并且其可以用于遞送分離的核酸至細胞內(nèi)部。眾多載體在本領域是已知的，包括但不限于線性多核苷酸、與離子或兩親性化合物相關聯(lián)的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因而，術語“載體”包括自主復制的質(zhì)粒或病毒。該術語也應當解釋為包括便于將核酸轉移入細胞的非質(zhì)粒和非病毒化合物，比如，例如，聚賴氨酸化合物、脂質(zhì)體等。病毒載體的實例包括但不限于仙臺病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體等。

范圍：遍及本公開內(nèi)容，本發(fā)明的多個方面可以以范圍格式呈現(xiàn)。應當理解范圍格式的描述僅僅出于方便和簡潔，并且不應當解釋為對本發(fā)明的范圍的僵硬限制。因此，范圍的描述應當被考慮已經(jīng)具體地公開了所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的單個數(shù)值。例如，比如1至6的范圍的描述應當被考慮已經(jīng)具體地公開了子范圍比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及該范圍內(nèi)的單個數(shù)字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范圍的寬度如何，這均適用。

描述

避免移植物抗宿主疾病(gvhd)的通用t細胞在臨床環(huán)境中是高度期望的。然而，由于通過識別hla-a分子被宿主免疫系統(tǒng)排斥，同種異體t細胞的使用是有風險的。操縱多種基因的靶向策略是復雜的并且努力已經(jīng)在t細胞中產(chǎn)生低效率，而沒有同時預防gvhd和宿主抗移植物反應。

fas受體/fas配體(fas/fasl)凋亡信號傳導途徑負調(diào)控t細胞功能。pd1和ctla4是t細胞中兩種主要的抑制性信號傳導途徑。由抗體-介導的ctla-4、pd-1或pd-l1的阻斷造成的增強的抗腫瘤免疫表明通過抑制這些途徑提高免疫療法的效率的可能性。本發(fā)明包括生成修飾的t細胞，其中作為一種手段，tcrα與β鏈、β-2微球蛋白、hla分子、ctla-4、pd-1和/或fas被耗減，以生成具有降低的免疫原性的修飾的t細胞。

本發(fā)明包括通過敲落內(nèi)源基因表達和表達修飾的t細胞受體或嵌合抗原受體來生成修飾的t細胞的方法和組合物。在一些實施方式中，本發(fā)明包括用于生成修飾的t細胞的方法。這樣的修飾的t細胞可以包括在治療組合物中并且被施用至需要其的患者。

內(nèi)源基因表達的敲落

本發(fā)明包括t細胞中內(nèi)源基因表達的下調(diào)，比如下調(diào)t細胞受體(tcr)的α和/或β鏈、β-2微球蛋白、ctla-4、fas、pd1或主要組織相容性復合體蛋白比如hla分子。在一個實施方式中，具有下調(diào)的基因表達的t細胞在同種異體環(huán)境中具有降低的免疫原性。在另一個實施方式中，具有降低的免疫原性的t細胞表達修飾的tcr或car用于靶向的效應物活性。

在一方面，本發(fā)明包括用于生成修飾的t細胞的方法，其包括將核酸引入能夠下調(diào)內(nèi)源基因表達的t細胞，其中基因選自tcrα鏈、tcrβ鏈、β-2微球蛋白、hla分子、ctla-4、pd1和fas。下調(diào)參與對細胞產(chǎn)生免疫應答的內(nèi)源基因——比如tcrα鏈、tcrβ鏈、β-2微球蛋白或hla分子——的表達減少免疫-介導的修飾的t細胞的排斥。例如，下調(diào)內(nèi)源tcr、mhc或β-2微球蛋白基因的表達移除t細胞上同種異體抗原的表面呈遞——其可能引起宿主免疫系統(tǒng)的排斥。而且，當暴露于免疫抑制性微環(huán)境時，下調(diào)調(diào)控t細胞中的抑制性信號傳導途徑的內(nèi)源基因，比如ctla-4、pd1和/或fas，增強修飾的t細胞的抗腫瘤功效。

在一方面，能夠下調(diào)內(nèi)源基因表達的核酸，比如通過電穿孔、轉染、或慢病毒或其它病毒轉導，被引入t細胞。在另一方面，本發(fā)明包括修飾的t細胞，其包括能夠下調(diào)內(nèi)源基因表達的電穿孔的核酸。在又另一方面，修飾的t細胞包括能夠下調(diào)內(nèi)源tcr基因表達的電穿孔的核酸。在另一方面，根據(jù)本文描述的方法生成包括修飾的t細胞的組合物。在又另一方面，本發(fā)明包括藥物組合物，其包括修飾的t細胞或根據(jù)本文描述的方法生成的修飾的t細胞和藥學上可接受的載體。

能夠調(diào)控內(nèi)源基因表達的核酸可以下調(diào)內(nèi)源基因表達。在一個實施方式中，能夠下調(diào)內(nèi)源基因表達的核酸選自反義rna、antigomerrna、sirna、shrna和crispr系統(tǒng)。內(nèi)源基因表達可以通過例如反義rna、antigomerrna、sirna、shrna、crispr系統(tǒng)等被下調(diào)、敲落、降低和/或抑制。

crispr/cas

crispr/cas系統(tǒng)是用于誘導靶向的遺傳改變的簡便和高效系統(tǒng)。通過cas9蛋白的靶標識別需要引導rna(grna)內(nèi)的‘種子’序列和grna-結合區(qū)上游的包含保守的二核苷酸的前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列。從而可以通過重設計細胞系(比如293t細胞)、原代細胞和cart細胞中的grna，crispr/cas系統(tǒng)被工程化以切割幾乎任何dna序列。crispr/cas系統(tǒng)可以通過共表達單個cas9蛋白與兩種或更多種grna同時靶向多個基因組基因座，使得此系統(tǒng)獨特地適用于靶基因的多重基因編輯或協(xié)同活化。

用于抑制基因表達的crispr/cas系統(tǒng)的一個實例——crispri——在美國公布號：2014/0068797中描述。crispri誘導永久性基因破壞，其利用rna-引導的cas9核酸內(nèi)切酶引入dna雙鏈斷裂——其引發(fā)易錯修復途徑以導致移碼突變。無催化活性的(catalyticallydead)cas9缺乏核酸內(nèi)切酶活性。當與引導rna共表達時，生成特異性地干擾轉錄延伸、rna聚合酶結合、或轉錄因子結合的dna識別復合體。此crispri系統(tǒng)高效地阻遏靶基因的表達。

當特異于靶基因的引導核酸序列和cas核酸內(nèi)切酶被引入細胞并且形成復合體——其使得cas核酸內(nèi)切酶能夠在靶基因處引入雙鏈斷裂——時，發(fā)生crispr/cas基因破壞。在一個實施方式中，crispr系統(tǒng)包括表達載體，比如，但不限于pad5f35-crispr載體。在一個實施方式中，通過將cas表達載體和特異于基因的引導核酸序列引入t細胞生成修飾的t細胞。在另一個實施方式中，cas表達載體誘導cas9核酸內(nèi)切酶的表達。還可以使用其它核酸內(nèi)切酶，包括但不限于t7、cas3、cas8a、cas8b、cas10d、cse1、csy1、csn2、cas4、cas10、csm2、cmr5、fok1、本領域已知的其它核酸酶和其任意組合。

在一個實施方式中，誘導cas表達載體包括將t細胞暴露于激活cas表達載體中的誘導型啟動子的試劑。在這樣的實施方式中，cas表達載體包括誘導型啟動子，比如通過暴露于抗生素(例如，四環(huán)素或四環(huán)素的衍生物，例如多西環(huán)素)可誘導的啟動子。然而，應當領會可以使用其它誘導型啟動子。誘導劑可以是導致誘導型啟動子的誘導的選擇性條件(例如，暴露于試劑，例如抗生素)。這導致cas表達載體的表達。

引導核酸序列特異于基因并且靶向該基因進行cas核酸內(nèi)切酶-誘導的雙鏈斷裂。引導核酸序列的序列可以在基因的基因座內(nèi)。在一個實施方式中，引導核酸序列的長度是至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個或更多個核苷酸。

引導核酸序列可以特異于任何基因，比如將降低免疫原性或降低對免疫抑制性微環(huán)境的敏感性的基因。在一個實施方式中，基因可以包括特異于t細胞受體(tcr)鏈(比如α、β、γ和/或δ鏈)、β-2微球蛋白、fas、pd1、主要組織相容性復合體蛋白(比如hlai類分子和/或hlaii類分子)、ctla-4或其任意組合的序列。

引導核酸序列包括rna序列、dna序列、其組合(rna-dna組合序列)、或具有合成核苷酸的序列。引導核酸序列可以是單分子或雙分子。在一個實施方式中，引導核酸序列包括單個引導rna。

t細胞受體

使用聚藏(harbor)抗原特異性tcr的t細胞的過繼免疫療法在癌癥和某些慢性病毒感染的治療中具有治療潛力。使用特異性tcr基因工程化t細胞具有將t細胞重定向至胞內(nèi)抗原的優(yōu)勢?？紤]到大部分致癌蛋白是胞內(nèi)的，研發(fā)特異于致癌驅(qū)動蛋白的一組tcr具有極大的吸引力。

本發(fā)明還包括修飾的t細胞，其具有如本文描述的下調(diào)的基因表達和外源性t細胞受體(tcr)。在一方面，本發(fā)明包括用于生成修飾的t細胞的方法，其包括將編碼修飾的t細胞受體(tcr)——其包括對靶細胞上的表面抗原的親和力——的核酸引入t細胞和引入能夠調(diào)控內(nèi)源基因表達——其選自tcrα鏈、tcrβ鏈、β-2微球蛋白、pd1和fas——的核酸，其中t細胞能夠表達修飾的tcr。

在另一方面，本發(fā)明包括修飾的t細胞，其包括編碼修飾的t細胞受體(tcr)——其包括對靶細胞上的表面抗原的親和力——的外源性核酸和能夠下調(diào)內(nèi)源基因表達——其選自tcrα鏈、tcrβ鏈、β-2微球蛋白、pd1和fas——的核酸，其中t細胞表達修飾的tcr并且其中內(nèi)源基因表達在t細胞中被下調(diào)。本發(fā)明還包括含有本文描述的修飾的t細胞的細胞群。

t細胞受體是響應于抗原的呈遞參與t細胞的活化的膜蛋白的復合體。tcr的刺激由抗原呈遞細胞上的主要組織相容性復合體分子(mhc)觸發(fā)，所述抗原呈遞細胞將抗原肽呈遞至t細胞并且結合至tcr復合體以誘發(fā)一系列胞內(nèi)信號傳導級聯(lián)。

tcr通常由六種不同的膜結合鏈——其形成負責配體識別的tcr異二聚體——組成。tcr以α/β和γ/δ形式存在，其是結構上相似的，但是具有不同的解剖學位置和功能。在一個實施方式中，tcr包括tcrα鏈和tcrβ鏈，比如編碼tcr的核酸包括編碼tcrα鏈和tcrβ鏈的核酸。在另一個實施方式中，tcrα鏈或tcrβ鏈或兩條鏈包括至少一個n-去糖基化。

每個鏈由兩個胞外結構域——可變和恒定結構域——組成。在一個實施方式中，tcr包括至少一個鼠恒定區(qū)。恒定結構域靠近細胞膜，接著是跨膜結構域和短胞質(zhì)尾。在一個實施方式中，修飾的tcr包括胞質(zhì)結構域，其包括共刺激信號傳導結構域，比如4-1bb共刺激信號傳導結構域。可變結構域有助于確定tcr對其具有結合特異性的特定的抗原和mhc分子。轉而，t細胞對獨特的抗原-mhc復合體的特異性保留在由t細胞表達的特定的tcr中。

恒定和可變結構域中的每個可以包括鏈內(nèi)二硫鍵。在一個實施方式中，tcr包括至少一個二硫鍵?？勺兘Y構域包括類似于抗體的互補決定區(qū)(cdr)的高度多態(tài)性的環(huán)。tcr序列的多樣性經(jīng)由連接的v基因(v)、d基因(d)、j基因(j)、和c基因的體細胞重排生成。

功能性α和γ鏈多肽由重排的v-j-c區(qū)形成，而β和δ鏈由v-d-j-c區(qū)組成。胞外恒定結構域包括近膜區(qū)和免疫球蛋白區(qū)。

在一個實施方式中，tcr包括野生型tcr、高親和力tcr和嵌合tcr。當tcr被修飾時，與對野生型tcr相比，它可以具有更高的對靶細胞表面抗原的親和力。在其中tcr是嵌合tcr的實施方式中，tcr可以包括嵌合結構域，比如tcr在至少一個鏈的c’端處包括共刺激信號傳導結構域。在其它實施方式中，tcr可以包括修飾的鏈，比如修飾的α或β鏈。這樣的修飾可以包括但不限于n-去糖基化，改變的結構域(比如工程化的可變區(qū)以靶向特異性的抗原或增加親和力)、添加一個或多個二硫鍵，源自不同物種的整個鏈或鏈的片段、和其任意組合。

在一個實施方式中，tcr包括對靶細胞抗原的特異性。靶細胞表面抗原可以包括限定靶細胞的表面的任何類型的配體。例如，靶細胞表面抗原可以被選擇以識別充當與具體疾病狀態(tài)相關聯(lián)的靶細胞上的細胞表面標志物的配體。因而，可以充當tcr的抗原結合結構域的配體的細胞表面標志物的實例包括與病毒、細菌和寄生蟲感染、自身免疫性疾病和癌細胞相關聯(lián)的那些。在一個實施方式中，靶細胞表面抗原包括任何腫瘤相關抗原(taa)和病毒抗原、疾病細胞相關抗原或其任意片段。

靶細胞抗原可以包括可以通過主要組織相容性復合體加工和呈遞的任何蛋白質(zhì)。例如，靶抗原可以與具體疾病狀態(tài)相關聯(lián)。因而，可以充當tcr的靶標的細胞標志物的實例包括與病毒、細菌和寄生蟲感染、自身免疫性疾病和癌細胞相關聯(lián)的那些。在一個實施方式中，靶抗原包括任何腫瘤相關抗原(taa)和病毒抗原、或其任意片段。

在一方面，本發(fā)明包括修飾的t細胞群，其包括編碼修飾的t細胞受體(tcr)——其包括對靶細胞上的表面抗原的親和力——的核酸和能夠下調(diào)內(nèi)源基因表達——其選自tcrα鏈、tcrβ鏈、β-2微球蛋白、hla分子、ctla-4、pd1和fas——的核酸，其中t細胞能夠表達修飾的tcr。

用于工程化和表達t細胞受體的技術包括但不限于產(chǎn)生tcr異二聚體，其包括連接各自的亞基的天然的二硫橋(garboczi,等，(1996),nature384(6605):134-41；garboczi,等，(1996),jimmunol157(12):5403-10；chang等，(1994),pnasusa91:11408-11412；davodeau等，(1993),j.biol.chem.268(21):15455-15460；golden等，(1997),j.imm.meth.206:163-169；美國專利號6,080,840)。

嵌合抗原受體(car)

本發(fā)明還包括修飾的t細胞，其具有如本文描述的下調(diào)的基因表達和car。因而，本發(fā)明涵蓋修飾的t細胞，其包括car或編碼car的核酸，其中car包括抗原結合結構域、跨膜結構域和胞內(nèi)結構域。

在一方面，本發(fā)明包括生成修飾的t細胞的方法，其包括將能夠下調(diào)內(nèi)源基因表達——其選自tcrα鏈、tcrβ鏈、β-2微球蛋白、hla分子、ctla-4、pd1和fas——的核酸引入t細胞，并且將編碼嵌合抗原受體(car)的核酸引入t細胞，其中car包括抗原結合結構域、跨膜結構域和共刺激分子的胞內(nèi)結構域。

在另一方面，本發(fā)明包括修飾的t細胞，其包括能夠下調(diào)內(nèi)源基因表達的核酸和編碼嵌合抗原受體(car)的核酸，其中下調(diào)的基因表達選自tcrα鏈、tcrβ鏈、β-2微球蛋白、hla分子、ctla-4、pd1和fas，并且其中car包括抗原結合結構域、跨膜結構域和共刺激分子的胞內(nèi)結構域。在一個實施方式中，如本文其它地方描述的，修飾的t細胞進一步包括編碼修飾的tcr——其包括對靶細胞上的表面抗原的親和力——的外源性核酸。本發(fā)明還包括含有本文描述的修飾的t細胞的細胞群。

car的一個或多個結構域或結構域的片段可以是人的。在一個實施方式中，本發(fā)明包括全人car?？梢允褂帽绢I域已知的重組方法獲得編碼期望的結構域的核酸序列，比如，例如使用標準技術通過從表達該基因的細胞的文庫篩選，通過從已知包括其的載體衍生該基因，或通過從包含其的細胞和組織直接分離?？蛇x地，可以合成地產(chǎn)生感興趣的基因，而不是作為克隆的分子。

在美國專利號：8,911,993、8,906,682、8,975,071、8,916,381、9,102,760、9,101,584和9,102,761中描述了car的實例，全部專利通過引用以其全部并入本文。

抗原結合結構域

在一個實施方式中，car包括與靶細胞上的抗原結合的抗原結合結構域?？梢猿洚斀Y合至car的抗原結合結構域的抗原的細胞表面標志物的實例包括與病毒、細菌和寄生蟲感染、自身免疫性疾病和癌細胞相關聯(lián)的那些。

抗原結合結構域的選擇取決于在靶細胞的表面上存在的抗原的類型和數(shù)目。例如，可以選擇抗原結合結構域以識別充當與具體疾病狀態(tài)相關聯(lián)的靶細胞上的細胞表面標志物的抗原。

在一個實施方式中，抗原結合結構域結合至腫瘤抗原，比如特異于感興趣的腫瘤或癌癥的抗原。在一個實施方式中，本發(fā)明的腫瘤抗原包括一種或多種癌癥抗原表位。

抗原結合結構域可以包括結合至抗原的任何結構域并且可以包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體、人抗體、人源化抗體、非人抗體和其任意片段。因而，在一個實施方式中，抗原結合結構域部分包括哺乳動物抗體或其片段。

抗原結合結構域可以結合一種或多種抗原，比如，但不限于cd19；cd123；cd22；cd30；cd171；cs-1(也稱為cd2子集1、cracc、slamf7、cd319和19a24)；c型凝集素樣分子-1(cll-1或clecl1)；cd33；表皮生長因子受體變體iii(egfrviii)；神經(jīng)節(jié)苷脂g2(gd2)；神經(jīng)節(jié)苷脂gd3(aneu5ac(2-8)aneu5ac(2-3)bdgalp(1-4)bdglcp(1-1)cer)；tnf受體家族成員b細胞成熟(bcma)；tn抗原((tnag)或(galnacα-ser/thr))；前列腺特異性膜抗原(psma)；受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(ror1)；fms樣酪氨酸激酶3(flt3)；腫瘤相關糖蛋白72(tag72)；cd38；cd44v6；癌胚抗原(cea)；上皮細胞粘附分子(epcam)；b7h3(cd276)；kit(cd117)；白介素-13受體亞基α-2(il-13ra2或cd213a2)；間皮素；白介素11受體α(il-11ra)；前列腺干細胞抗原(psca)；絲氨酸蛋白酶21(睪蛋白(testisin)或prss21)；血管內(nèi)皮生長因子受體2(vegfr2)；lewis(y)抗原；cd24；血小板源生長因子受體β(pdgfr-β)；階段特異性胚胎抗原-4(ssea-4)；cd20；葉酸受體α；受體酪氨酸-蛋白激酶erbb2(her2/neu)；細胞表面相關粘蛋白1(muc1)；表皮生長因子受體(egfr)；神經(jīng)細胞粘附分子(ncam)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(pap)；突變的延伸因子2(elf2m)；肝配蛋白b2；成纖維細胞活化蛋白α(fap)；胰島素樣生長因子1受體(igf-i受體)；碳酸酐酶ix(caix)；蛋白酶體(前體，巨蛋白因子(macropain))亞基，β型，9(lmp2)；糖蛋白100(gp100)；由斷裂點簇區(qū)(bcr)和abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(abl)構成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白a型受體2(epha2)；巖藻糖基gm1；唾液酸化lewis粘附分子(sle)；神經(jīng)節(jié)苷脂gm3(aneu5ac(2-3)bdgalp(1-4)bdglcp(1-1)cer)；轉谷氨酰胺酶5(tgs5)；高分子量-黑素瘤-相關抗原(hmwmaa)；鄰乙?；?gd2神經(jīng)節(jié)苷脂(oacgd2)；葉酸受體β；腫瘤內(nèi)皮標志物1(tem1/cd248)；腫瘤內(nèi)皮標志物7-相關的(tem7r)；密蛋白6(cldn6)；促甲狀腺激素受體(tshr)；g蛋白偶聯(lián)受體c類5組，成員d(gprc5d)；染色體x開放閱讀框61(cxorf61)；cd97；cd179a；退行發(fā)育淋巴瘤激酶(alk)；多聚唾液酸；胎盤特異性1(plac1)；globohglycoceramide的己糖部分(globoh)；乳腺分化抗原(ny-br-1)；尿路上皮特異蛋白(uroplakin)2(upk2)；甲型肝炎病毒細胞受體1(havcr1)；腎上腺素受體β3(adrb3)；泛連接蛋白(pannexin)3(panx3)；g蛋白偶聯(lián)受體20(gpr20)；淋巴細胞抗原6復合物，基因座k9(ly6k)；嗅覺受體51e2(or51e2)；tcrγ交替閱讀框蛋白(tarp)；維爾姆斯腫瘤蛋白(wt1)；癌癥/睪丸抗原1(ny-eso-1)；癌癥/睪丸抗原2(lage-1a)；黑素瘤相關抗原1(mage-a1)；ets易位變異基因6，位于染色體12p(etv6-aml)上；精子蛋白17(spa17)；x抗原家族，成員1a(xage1)；血管生成素結合細胞表面受體2(tie2)；黑素瘤癌癥睪丸抗原-1(mad-ct-1)；黑素瘤癌癥睪丸抗原-2(mad-ct-2)；fos相關抗原1；腫瘤蛋白p53(p53)；p53突變體；prostein；存活蛋白(surviving)；端粒酶；前列腺癌腫瘤抗原-1(pcta-1或半乳凝素8)；由t細胞識別的黑素瘤抗原1(melana或mart1)；大鼠肉瘤(ras)突變體；人端粒酶逆轉錄酶(htert)；肉瘤易位斷點；凋亡的黑素瘤抑制劑(ml-iap)；erg(跨膜蛋白酶，絲氨酸2(tmprss2)ets融合基因)；n-乙酰葡糖胺基轉移酶v(na17)；配對盒蛋白pax-3(pax3)；雄激素受體；細胞周期蛋白b1；v-myc鳥髓細胞瘤病病毒癌基因成神經(jīng)細胞瘤衍生的同源物(mycn)；ras同源物家族成員c(rhoc)；酪氨酸酶相關蛋白2(trp-2)；細胞色素p4501b1(cyp1b1)；ccctc結合因子(鋅指蛋白)樣(boris或印記位點調(diào)節(jié)因子樣蛋白(brotheroftheregulatorofimprintedsites))；由t細胞識別的鱗狀細胞癌抗原3(sart3)；配對盒蛋白pax-5(pax5)；前頂體素(proacrosin)結合蛋白sp32(oy-tes1)；淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶(lck)；a型激酶錨定蛋白4(akap-4)；滑膜肉瘤，x斷點2(ssx2)；高級糖化終產(chǎn)物的受體(rage-1)；腎遍在蛋白(renalubiquitous)1(ru1)；腎遍在蛋白2(ru2)；豆莢蛋白(legumain)；人類乳頭瘤病毒e6(hpve6)；人類乳頭瘤病毒e7(hpve7)；腸羧基酯酶；突變的熱休克蛋白70-2(muthosp70-2)；cd79a；cd79b；cd72；白細胞相關免疫球蛋白樣受體1(lair1)；iga受體的fc片段(fcar或cd89)；白細胞免疫球蛋白樣受體亞家族a成員2(lilra2)；cd300分子樣家族成員f(cd300lf)；c型凝集素結構域家族12成員a(clec12a)；骨髓基質(zhì)細胞抗原2(bst2)；包含egf樣模塊(module)的粘蛋白樣激素受體樣2(emr2)；淋巴細胞抗原75(ly75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)；fc受體樣5(fcrl5)；和免疫球蛋白λ樣多肽1(igll1)。

在一些情況下，抗原結合結構域衍生自car將最終用于其中的相同的物種是有利的。例如，對于用于人，可能有利的是，car的抗原結合結構域包括人抗體、如本文其它地方描述的人源化抗體、或其片段。

還有利的是，抗原結合結構域可操作地連接至car的另一個結構域，比如跨膜結構域或胞內(nèi)結構域——其均在本文其它地方描述，用于在細胞中表達。在一個實施方式中，編碼抗原結合結構域的核酸可操作地連接至編碼跨膜結構域的核酸和編碼胞內(nèi)結構域的核酸。

跨膜結構域

對于跨膜結構域，car可以被設計以包括將car的抗原結合結構域連接至胞內(nèi)結構域的跨膜結構域。在一個實施方式中，跨膜結構域天然地與car中的結構域中的一個或多個相關聯(lián)。在一些情況下，可以選擇跨膜結構域，或通過氨基酸置換修飾跨膜結構域，以避免將這樣的結構域結合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜結構域，從而最小化與受體復合體的其它成員的相互作用。

跨膜結構域可以衍生自天然來源或合成來源。當來源是天然的時，結構域可以衍生自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。具體用于本發(fā)明的跨膜區(qū)可以衍生自t細胞受體的α、β或ζ鏈、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154(即至少包括上述中的跨膜區(qū)(一個或多個))。在一些情況下，也可以采用各種人鉸鏈，其包括人ig(免疫球蛋白)鉸鏈。

在一個實施方式中，跨膜結構域可以是合成的，在該情況下，它將包括占主導的疏水殘基比如亮氨酸和纈氨酸。優(yōu)選地，將在合成跨膜結構域的每個末端處發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的三聯(lián)體。

胞內(nèi)結構域

car的胞內(nèi)結構域或另外的胞質(zhì)結構域負責活化其中表達car的細胞。術語“胞內(nèi)結構域”因而意思是包括足以轉導激活信號的胞內(nèi)結構域的任何部分。在一個實施方式中，胞內(nèi)結構域包括負責效應物功能的結構域。術語“效應物功能”指的是細胞的專有功能。例如，t細胞的效應物功能可以是包括分泌細胞因子在內(nèi)的細胞溶解活性或輔助活性。

在一個實施方式中，car的胞內(nèi)結構域包括負責信號激活和/或轉導的結構域。胞內(nèi)結構域可以經(jīng)由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、生物化學變化或其它應答發(fā)送信號激活以改變細胞的代謝、形狀、基因表達或?qū)罨逗习麅?nèi)信號傳導分子的其它細胞應答。

用于本發(fā)明的胞內(nèi)結構域的實例包括但不限于t細胞受體(tcr)和任何共刺激分子——其一起作用以在抗原受體接合之后起始信號轉導——的胞質(zhì)部分，以及這些元件和具有相同的功能性能力的任何合成序列的任何衍生物或變體。在一個實施方式中，car的胞內(nèi)結構域包括雙信號傳導結構域。雙信號傳導結構域可以包括來自本文描述的任何分子的片段或結構域。

胞內(nèi)結構域的實例包括來自一種或多種分子或受體的片段或結構域，其包括但不限于tcr、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd86、常見的fcrγ、fcrβ(fcεr1b)、cd79a、cd79b、fcγriia、dap10、dap12、t細胞受體(tcr)、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細胞功能相關抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、與cd83特異性結合的配體、cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd127、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(觸覺的)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d、本文描述的其它共刺激分子、其任何衍生物、變體或片段，具有相同的功能性能力的共刺激分子的任何合成序列，和其任意組合。

在一個實施方式中，car的胞內(nèi)結構域包括共刺激分子的任何部分，比如來自cd3、cd27、cd28、icos、4-1bb、pd-1、t細胞受體(tcr)、其任何衍生物或變體的至少一個信號傳導結構域，具有相同的功能性能力的任何其合成序列，和其任意組合。

在car的抗原結合結構域和跨膜結構域之間，或在car的胞內(nèi)結構域和跨膜結構域之間，可以并入間隔結構域。如本文使用的，術語“間隔結構域”通常意思是起將跨膜結構域連接至多肽鏈中的抗原結合結構域或胞內(nèi)結構域作用的任何寡肽或多肽。在一個實施方式中，間隔結構域可以包括多至300個氨基酸，優(yōu)選地10至100個氨基酸，和更優(yōu)選地25至50個氨基酸。在另一個實施方式中，短的寡肽或多肽連接體，優(yōu)選地長度在2和10個氨基酸之間，可以在car的跨膜結構域和胞內(nèi)結構域之間形成連接。連接體的實例包括甘氨酸-絲氨酸雙聯(lián)體。

人抗體

當使用雙特異性抗體或car的抗原結合結構域時，可以優(yōu)選地使用人抗體或其片段。完全人抗體對于人對象的治療性處理是特別期望的。人抗體可以通過各種本領域已知的方法制造，所述方法包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗體文庫的噬菌體展示方法，其包括對這些技術的改進。還參見美國專利號4,444,887和4,716,111；和pct公布wo98/46645、wo98/50433、wo98/24893、wo98/16654、wo96/34096、wo96/33735和wo91/10741；其每篇通過引用以其全部并入本文。雙特異性抗體還可以包括其中重鏈和輕鏈由源自一種或多種人dna來源的核苷酸序列編碼的抗體。

人抗體還可以使用不能表達功能性內(nèi)源免疫球蛋白但可以表達人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠來產(chǎn)生。例如，人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復合體可以被隨機地或通過同源重組引入小鼠胚胎干細胞?？蛇x地，除人重鏈和輕鏈基因之外，人可變區(qū)、恒定區(qū)和多變區(qū)也可以被引入小鼠胚胎干細胞。通過同源重組，可以與引入人免疫球蛋白基因座分開地或同時地，使小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因非功能性。例如，已經(jīng)描述了在嵌合和種系突變小鼠中純合缺失抗體重鏈j區(qū)(jh)基因?qū)е聝?nèi)源性抗體產(chǎn)生的完全抑制。修飾的胚胎干細胞被擴展并且顯微注射入胚泡以產(chǎn)生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以產(chǎn)生表達人抗體的純合后代。轉基因小鼠以正常的方式使用選擇的抗原——例如本發(fā)明的多肽的全部或部分——進行免疫。針對選擇的靶標的抗體可以使用常規(guī)的雜交瘤技術從免疫的轉基因小鼠獲得。由轉基因小鼠聚藏(harbor)的人免疫球蛋白轉基因在b細胞分化期間重排，并且隨后經(jīng)歷類別轉換和體細胞突變。因而，使用這樣的技術可能產(chǎn)生治療上有用的igg、iga、igm和ige抗體，包括但不限于igg1(γ1)和igg3。對于此技術用于產(chǎn)生人抗體的綜述，參見lonberg和huszar(int.rev.immunol.,13:65-93(1995))。對于此技術用于產(chǎn)生人抗體和人單克隆抗體以及用于生產(chǎn)這樣的抗體的方案的詳細討論，參見，例如，pct公布號wo98/24893、wo96/34096和wo96/33735；和美國專利號5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598，其每篇通過引用以其全部并入本文。此外，可以與公司比如abgenix,inc.(freemont,calif.)和genpharm(sanjose,calif.)簽訂合同以使用與上面描述的類似的技術提供針對選擇的抗原的人抗體。對于在種系突變小鼠中轉移人類種系免疫球蛋白基因陣列在抗原攻擊之后將導致產(chǎn)生人抗體的具體討論，參見，例如，jakobovits等，proc.natl.acad.sci.usa,90:2551(1993)；jakobovits等，nature,362:255-258(1993)；bruggermann等，yearinimmunol.,7:33(1993)；和duchosal等，nature,355:258(1992)。

人抗體也可以源自噬菌體展示文庫(hoogenboom等，j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等，j.mol.biol.,222:581-597(1991)；vaughan等，naturebiotech.,14:309(1996))。噬菌體展示技術(mccafferty等，nature,348:552-553(1990))可以用于從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(v)結構域基因所有組成成分在體外產(chǎn)生人抗體和抗體片段。根據(jù)此技術，將抗體v結構域基因符合讀框地克隆入絲狀噬菌體比如m13或fd的主要或次要外殼蛋白基因，并且在噬菌體顆粒的表面上作為功能性抗體片段展示。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈dna拷貝，所以基于抗體的功能性質(zhì)的選擇也導致選擇編碼展示那些性質(zhì)的抗體的基因。因而，噬菌體模擬了b細胞的一些性質(zhì)。噬菌體展示可以以各種形式進行；對于其綜述，參見，例如，johnson,kevins,和chiswell,davidj.,currentopinioninstructuralbiology3:564-571(1993)。數(shù)種來源的v基因片段可以用于噬菌體展示。clackson等，nature,352:624-628(1991)從源自未免疫小鼠脾臟的v基因的小的隨機組合文庫分離了抗唑酮抗體的多樣化陣列。可以構建來自未免疫人供體的v基因所有組成成分，并且抗原(包括自體抗原)的多樣化陣列的抗體可以大體上遵循下列描述的技術進行分離：marks等，j.mol.biol.,222:581-597(1991)或griffith等，emboj.,12:725-734(1993)。還參見美國專利號5,565,332和5,573,905，其每篇通過引用以其全部并入本文。

人抗體也可以通過體外活化的b細胞生成(參見，美國專利號5,567,610和5,229,275，其每篇通過引用以其全部并入本文)。人抗體也可以使用雜交瘤技術體外生成，比如，但不限于roder等(methodsenzymol.,121:140-167(1986))描述的。

人源化抗體

可選地，在一些實施方式中，非人抗體可以是人源化的，其中抗體的特異性序列或區(qū)域被修飾以增加與人中天然產(chǎn)生的抗體的相似性。例如，在本發(fā)明中，抗體或其片段可以包括非人哺乳動物scfv。在一個實施方式中，抗原結合結構域部分是人源化的。

人源化抗體可以使用本領域已知的各種技術產(chǎn)生，其包括但不限于cdr-移植(參見，例如，歐洲專利號ep239,400；國際公布號wo91/09967；和美國專利號5,225,539、5,530,101和5,585,089，其每篇通過引用以其全部并入本文)、貼面(veneering)或表面重建(resurfacing)(參見，例如，歐洲專利號ep592,106和ep519,596；padlan,1991,molecularimmunology,28(4/5):489-498；studnicka等，1994,proteinengineering,7(6):805-814；和roguska等，1994,pnas,91:969-973，其每篇通過引用以其全部并入本文)、鏈改組(參見，例如，美國專利號5,565,332，其通過引用以其全部并入本文)、和在如下中公開的技術，例如，美國專利申請公布號us2005/0042664、美國專利申請公布號us2005/0048617、美國專利號6,407,213、美國專利號5,766,886、國際公布號wo9317105、tan等，j.immunol.,169:1119-25(2002)、caldas等，proteineng.,13(5):353-60(2000)、morea等，methods,20(3):267-79(2000)、baca等，j.biol.chem.,272(16):10678-84(1997)、roguska等，proteineng.,9(10):895-904(1996)、couto等，cancerres.,55(23supp):5973s-5977s(1995)、couto等，cancerres.,55(8):1717-22(1995)、sandhujs,gene,150(2):409-10(1994)、和pedersen等，j.mol.biol.,235(3):959-73(1994)，其每篇通過引用以其全部并入本文。通常，框架區(qū)中的框架殘基將被置換為來自cdr供體抗體的相應殘基以改變，優(yōu)選地改進，抗原結合。這些框架置換通過本領域熟知的方法鑒定，例如，通過建模cdr和框架殘基的相互作用以鑒定對抗原結合重要的框架殘基和通過序列比較鑒定特定位置處的不常見的框架殘基(參見，例如，queen等，美國專利號5,585,089；和riechmann等，1988,nature,332:323，其通過引用以其全部并入本文)。

人源化抗體具有從非人來源引入其的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，其通常取自“輸入”可變結構域。因而，人源化抗體包括來自非人免疫球蛋白分子的一個或多個cdr和來自人的框架區(qū)?？贵w的人源化是本領域熟知的，并且可以大體上遵循winter與合作者的方法進行(jones等，nature,321:522-525(1986)；riechmann等，nature,332:323-327(1988)；verhoeyen等，science,239:1534-1536(1988))，其通過將嚙齒動物cdr或cdr序列置換為相應的人抗體序列，即cdr-移植(ep239,400；pct公布號wo91/09967；和美國專利號4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其內(nèi)容通過引用以其全部并入本文)。在這樣的人源化嵌合抗體中，實質(zhì)上小于完整人可變結構域已經(jīng)被來自非人物種的相應的序列置換。實際上，人源化抗體通常是其中一些cdr殘基和可能的一些框架(fr)殘基被來自嚙齒動物抗體中的類似位點的殘基置換的人抗體?？贵w的人源化也可以通過貼面或表面重建(ep592,106；ep519,596；padlan,1991,molecularimmunology,28(4/5):489-498；studnicka等，proteinengineering,7(6):805-814(1994)；和roguska等，pnas,91:969-973(1994))或鏈改組(美國專利號5,565,332)實現(xiàn)，其內(nèi)容通過引用以其全部并入本文。

用于制造人源化抗體的人可變結構域——輕和重二者——的選擇是為了降低抗原性。根據(jù)所謂的“最佳擬合”方法，嚙齒動物抗體的可變結構域的序列針對已知的人可變結構域序列的整個文庫進行篩選。最接近于嚙齒動物的人序列然后被接受為用于人源化抗體的人框架(fr)(sims等，j.immunol.,151:2296(1993)；chothia等，j.mol.biol.,196:901(1987)，其內(nèi)容通過引用以其全部并入本文)。另一種方法使用源自特定的輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于數(shù)種不同的人源化抗體(carter等，proc.natl.acad.sci.usa,89:4285(1992)；presta等，j.immunol.,151:2623(1993)，其內(nèi)容通過引用以其全部并入本文)。

抗體可以被人源化，且保留對靶抗原的高親和力以及其它有利的生物學性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，人源化抗體通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和多種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備。三維免疫球蛋白模型是一般可獲得的并且是本領域技術人員熟悉的。圖解和展示選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構象結構的計算機程序是可獲得的。檢查這些展示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影響候選免疫球蛋白結合靶抗原的能力的殘基。以此方式，fr殘基可以從接受者和輸入序列選擇并組合，使得實現(xiàn)期望的抗體特性，比如對靶抗原的增加的親和力。一般而言，cdr殘基直接地和最實質(zhì)性地參與影響抗原結合。

人源化抗體保留與原始抗體相似的抗原特異性。然而，使用人源化的某些方法，可以使用“定向進化”的方法增加抗體對靶抗原的結合親和力和/或特異性，如由wu等，j.mol.biol.,294:151(1999)描述的，其內(nèi)容通過引用以其全部并入本文。

其它分子

本發(fā)明還包括本文描述的修飾的t細胞，其進一步包括共刺激分子或編碼共刺激分子的核酸。在一個實施方式中，本發(fā)明的修飾的t細胞進一步包括編碼共刺激分子的外源性核酸，以便修飾的t細胞表達共刺激分子。核酸可以通過轉導t細胞、轉染t細胞或電穿孔t細胞被引入t細胞。在另一個實施方式中，共刺激分子選自cd3、cd27、cd28、cd83、cd86、cd127、4-1bb、4-1bbl、pd1和pd1l。在另一個實施方式中，共刺激分子包括cd3并且包括至少兩種不同的cd3鏈，比如cd3ζ鏈和cd3ε鏈。

在另一個實施方式中，修飾的t細胞進一步包括klf4、oct3/4和/或sox2或編碼klf4、oct3/4和/或sox2的核酸以誘導t細胞的多能性。t細胞可以通過表達klf4、oct3/4和sox2被誘導至多能性。klf4、oct3/4和sox2可以從核酸、病毒載體(一種或多種)或rna分子(一種或多種)表達。在一個實施方式中，編碼klf4、oct3/4和sox2的病毒載體被引入t細胞以誘導多能性。在另一個實施方式中，仙臺病毒載體被引入t細胞以誘導多能性，其中仙臺病毒載體編碼klf4、oct3/4和sox2。

引入核酸

將核酸引入細胞的方法包括物理、生物和化學方法。用于將多核苷酸比如rna引入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等。rna可以使用商業(yè)上可獲得的方法被引入靶細胞，所述方法包括電穿孔(amaxanucleofector-ii(amaxabiosystems,cologne,germany))、ecm830(btx)(harvardinstruments,boston,mass.)或genepulserii(biorad,denver,colo.)、multiporator(eppendort,hamburggermany)。rna還可以通過如下方法被引入細胞：使用陽離子脂質(zhì)體介導的轉染、使用脂質(zhì)轉染、使用聚合物封裝、使用肽介導的轉染、或使用生物射彈粒子遞送系統(tǒng)比如“基因槍”(參見，例如，nishikawa等humgenether.,12(8):861-70(2001))。

用于將感興趣的多核苷酸引入宿主細胞的生物學方法包括使用dna和rna載體。病毒載體，尤其是逆轉錄病毒載體，已經(jīng)成為最廣泛使用的方法，其用于將基因插入哺乳動物，例如，人細胞。其它病毒載體可以衍生自慢病毒、痘病毒、i型單純皰疹病毒、腺病毒和腺伴隨病毒等。參見，例如，美國專利號5,350,674和5,585,362。

用于將多核苷酸引入宿主細胞的化學手段包括膠體分散系統(tǒng)，比如大分子復合體、納米膠囊、微球、珠、和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)——其包括水包油型乳劑、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。用作體外和體內(nèi)遞送媒介物的示例性膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體(例如，人工膜囊泡)。

適于使用的脂質(zhì)可以從商業(yè)來源獲得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(“dmpc”)可以從sigma,st.louis,mo獲得；磷酸二鯨蠟酯(“dcp”)可以從k&klaboratories(plainview,ny)獲得；膽固醇(“choi”)可以從calbiochem-behring獲得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“dmpg”)和其它脂質(zhì)可以從avantipolarlipids,inc.(birmingham,al)獲得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂質(zhì)的原液可以被保存在大約-20℃下。氯仿被用作唯一的溶劑，因為它比甲醇更容易蒸發(fā)?！爸|(zhì)體”是通用術語，其包括通過生成封閉的脂雙層或聚集體而形成的多種單層和多層脂質(zhì)媒介物。脂質(zhì)體可以表征為具有囊泡結構，其具有磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)。多層脂質(zhì)體具有由水性介質(zhì)分開的多個脂質(zhì)層。當磷脂懸浮在過量的水性溶液中時，它們自發(fā)形成。在形成封閉的結構和使水與溶解的溶質(zhì)陷入脂雙層之間前，脂質(zhì)組分經(jīng)歷自我重排(ghosh等，1991glycobiology5:505-10)。然而，也包括與正常的囊泡結構相比溶液中具有不同結構的組合物。例如，脂質(zhì)可以呈現(xiàn)膠束結構或僅僅作為脂質(zhì)分子的非均一聚集體存在。同樣考慮的是脂質(zhì)轉染胺-核酸復合體。

不管用于將外源性核酸引入宿主細胞或以其它方式使細胞暴露于本發(fā)明的抑制劑的方法如何，為了確認核酸在宿主細胞中的存在，可以進行多種測定。這樣的測定包括，例如，本領域技術人員熟知的“分子生物學”測定，比如dna印跡和rna印跡、rt-pcr和pcr；“生物化學”測定，比如檢測特定肽的存在或不存在，例如，通過免疫學手段(ellsa和蛋白質(zhì)印跡)或通過本文描述的鑒定試劑的測定，其落入本發(fā)明范圍內(nèi)。

在一個實施方式中，編碼t細胞受體(tcr)——其包括對靶細胞上的表面抗原的親和力——的核酸被引入擴展的t細胞。編碼tcr的核酸可以是能夠下調(diào)內(nèi)源tcr基因表達的相同的或分開的核酸。編碼tcr的核酸可以與能夠下調(diào)內(nèi)源tcr基因表達的核酸同時或順序地引入t細胞。在一個實施方式中，在能夠下調(diào)內(nèi)源tcr基因表達的核酸之前引入編碼tcr的核酸。

而且，核酸可以通過任何手段被引入，比如轉導擴展的t細胞、轉染擴展的t細胞和電穿孔擴展的t細胞。一種核酸可以通過一種方法被引入t細胞并且另一種核酸可以通過不同的方法被引入t細胞。

rna

在一個實施方式中，被引入t細胞的核酸是rna。在另一個實施方式中，rna是包括體外轉錄的rna或合成rna的mrna。使用聚合酶鏈式反應(pcr)-生成的模板通過體外轉錄產(chǎn)生rna。來自任何來源的感興趣的dna可以通過pcr直接轉化為使用適當?shù)囊锖蛂na聚合酶的體外mrna合成的模板。dna的來源可以是，例如，基因組dna、質(zhì)粒dna、噬菌體dna、cdna、合成的dna序列或任何其它適當?shù)膁na來源。體外轉錄的期望的模板是嵌合膜蛋白。舉例而言，模板編碼抗體、抗體的片段或抗體的一部分。又舉例而言，模板包括胞外結構域——其包括抗體比如抗cd3的單鏈可變結構域；和共刺激分子的胞內(nèi)結構域。在一個實施方式中，rna嵌合膜蛋白的模板編碼嵌合膜蛋白，其包括胞外結構域——其包括衍生自共刺激分子的抗體的抗原結合結構域；和衍生自cd28和4-1bb的胞內(nèi)結構域的一部分的胞內(nèi)結構域。

pcr可以用于生成體外轉錄mrna——其隨后被引入細胞——的模板。用于進行pcr的方法是本領域熟知的。用于pcr的引物設計為具有與待用作pcr的模板的dna的區(qū)域基本上互補的區(qū)域。如本文使用的“基本上互補”指的是其中引物序列中大部分或所有的堿基是互補的，或一個或多個堿基是非互補的或錯配的核苷酸的序列?；旧匣パa的序列能夠與預期dna靶標在用于pcr的退火條件下退火或雜交。引物可以設計為與dna模板的任何部分基本上互補。例如，引物可以設計為擴增在細胞中正常轉錄的基因部分(開放閱讀框)，其包括5'和3'utr。引物也可以設計為擴增編碼感興趣的具體結構域的基因部分。在一個實施方式中，引物設計為擴增包括所有或部分的5'和3'utr的人cdna的編碼區(qū)。通過本領域熟知的合成方法生成可用于pcr的引物?！罢蛞铩笔前c待擴增的dna序列上游的dna模板上的核苷酸基本上互補的核苷酸區(qū)域的引物。本文使用的“上游”指的是待擴增的dna序列相對于編碼鏈的5'位置?！胺聪蛞铩笔前c待擴增的dna序列下游的雙鏈dna模板基本上互補的核苷酸區(qū)域的引物。本文使用的“下游”指的是待擴增的dna序列相對于編碼鏈的3'位置。

還可以使用具有促進rna的穩(wěn)定性和/或翻譯效率的能力的化學結構。rna優(yōu)選地具有5'和3'utr。在一個實施方式中，5'utr的長度在零和3000個核苷酸之間。待添加至編碼區(qū)的5'和3'utr序列的長度可以通過不同的方法改變，包括但不限于設計用于pcr的引物，其退火至utr的不同區(qū)域。使用此方法，本領域普通技術人員可以修改實現(xiàn)轉染轉錄的rna之后最佳翻譯效率所需要的5'和3'utr長度。

5'和3'utr可以是感興趣的基因的天然存在的內(nèi)源性5'和3'utr?？蛇x地，可以通過將utr序列并入正向和反向引物或通過模板的任何其它修飾添加對感興趣的基因非內(nèi)源性的utr序列。使用對感興趣的基因非內(nèi)源性的utr序列可以有用于修改rna的穩(wěn)定性和/或翻譯效率。例如，已知3'utr序列中的富au元件可以降低mrna的穩(wěn)定性。因此，3'utr可以被選擇或設計以基于本領域熟知的utr的性質(zhì)增加轉錄的rna的穩(wěn)定性。

在一個實施方式中，5'utr可以包含內(nèi)源基因的kozak序列。可選地，當正通過如上面描述的pcr添加對感興趣的基因非內(nèi)源性的5'utr時，可以通過添加5'utr序列重新設計共有的kozak序列。kozak序列可以增加一些rna轉錄物的翻譯效率，但是似乎不是所有rna高效翻譯所需要的。對于許多mrna的kozak序列的要求是本領域已知的。在其它實施方式中，5'utr可以源自rna基因組在細胞中穩(wěn)定的rna病毒。在其它實施方式中，多種核苷酸類似物可以用于3'或5'utr以阻礙mrna的核酸外切酶降解。

為了能夠?qū)崿F(xiàn)從dna模板合成rna而不需要基因克隆，轉錄的啟動子應當附加至待轉錄的序列上游的dna模板。當作為rna聚合酶的啟動子起作用的序列被添加至正向引物的5'末端時，rna聚合酶啟動子并入待轉錄的開放閱讀框上游的pcr產(chǎn)物。在一個實施方式中，啟動子是t7聚合酶啟動子，如本文其它地方描述的。其它有用的啟動子包括但不限于t3和sp6rna聚合酶啟動子。t7、t3和sp6啟動子的共有的核苷酸序列是本領域已知的。

在一個實施方式中，mrna具有5'末端上的帽和3'聚腺苷酸尾，其決定核糖體結合、翻譯的起始和mrna在細胞中的穩(wěn)定性。在環(huán)狀dna模板，例如，質(zhì)粒dna上，rna聚合酶產(chǎn)生不適于在真核細胞中表達的長的多聯(lián)體產(chǎn)物(concatamericproduct)。在3'utr的末端處線性化的質(zhì)粒dna的轉錄產(chǎn)生正常大小的mrna，其在真核轉染中無效，即使其在轉錄之后被聚腺苷酸化。

在線性dna模板上，噬菌體t7rna聚合酶可以使轉錄物的3'末端延伸超過模板的最后一個堿基(schenborn和mierendorf,nucacidsres.,13:6223-36(1985)；nacheva和berzal-herranz,eur.j.biochem.,270:1485-65(2003))。

將聚a/t一段序列(stretch)整合入dna模板的常規(guī)方法是分子克隆。然而，整合入質(zhì)粒dna的聚a/t序列可以引起質(zhì)粒不穩(wěn)定，這就是為什么從細菌細胞獲得的質(zhì)粒dna模板經(jīng)常被缺失和其它畸變高度污染。這使得克隆程序不僅費力且耗時，而且經(jīng)常不可靠。這就是為什么允許構建具有聚a/t3'一段序列的dna模板而沒有克隆的方法是高度期望的。

轉錄的dna模板的聚a/t區(qū)段可以在pcr期間通過使用包含聚t尾——比如100個t尾(大小可以是50-5000個t)——的反向引物產(chǎn)生，或在pcr后通過任何其它方法產(chǎn)生，所述方法包括但不限于dna連接或體外重組。聚腺苷酸尾也為rna提供穩(wěn)定性并且減少它們的降解。通常，聚腺苷酸尾的長度與轉錄的rna的穩(wěn)定性正相關。在一個實施方式中，聚腺苷酸尾在100和5000個腺苷之間。

rna的聚腺苷酸尾可以在體外轉錄之后使用聚腺苷酸聚合酶——比如大腸桿菌聚腺苷酸聚合酶(e-pap)——進一步延伸。在一個實施方式中，使聚腺苷酸尾的長度從100個核苷酸增加至300和400個核苷酸之間導致rna的翻譯效率增加大約兩倍。額外地，不同的化學基團附加至3'末端可以增加mrna穩(wěn)定性。這樣的附加可以包含修飾的/人工的核苷酸、適配體和其它化合物。例如，atp類似物可以使用聚腺苷酸聚合酶并入聚腺苷酸尾。atp類似物可以進一步增加rna的穩(wěn)定性。

5'帽也為rna分子提供穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實施方式中，通過本文公開的方法產(chǎn)生的rna包括5'帽。使用本領域已知的和本文描述的技術提供5'帽(cougot,等，trendsinbiochem.sci.,29:436-444(2001)；stepinski,等，rna,7:1468-95(2001)；elango,等，biochim.biophys.res.commun.,330:958-966(2005))。

通過本文公開的方法產(chǎn)生的rna還可以包含內(nèi)部核糖體進入位點(ires)序列。ires序列可以是起始帽-獨立性核糖體結合至mrna并且促進翻譯起始的任何病毒序列、染色體序列或人工設計的序列?？梢园ㄟm于細胞電穿孔的任何溶質(zhì)，其可以包含促進細胞通透性和生存力的因子，比如糖、肽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、抗氧化劑和表面活性劑。

rna轉染

在一些實施方式中，編碼tcr的rna被電穿孔入細胞。在一個實施方式中，編碼tcr的rna是體外轉錄的rna。

公開的方法可以在癌癥、干細胞、急性和慢性感染、和自身免疫性疾病領域中的基礎研究和療法中應用于調(diào)節(jié)t細胞活性，其包括評估基因修飾的t細胞殺傷靶癌細胞的能力。

方法還提供了通過改變例如啟動子或輸入rna的量在寬的范圍內(nèi)控制表達水平的能力，其使得可能單獨地調(diào)控表達水平。另外，基于pcr的mrna生產(chǎn)技術極大地促進具有不同結構和它們的結構域組合的mrna的設計。

本發(fā)明的rna轉染方法的一個優(yōu)勢是rna轉染大體上是瞬時和無載體的。rna轉基因可以在簡短的體外細胞活化之后被遞送至淋巴細胞并且在其中表達，其作為最小的表達盒而不需要任何額外的病毒序列。在這些條件下，轉基因整合入宿主細胞基因組是不可能的。由于rna的轉染效率和其均勻修飾整個淋巴細胞群的能力，細胞的克隆不是必需的。

使用體外-轉錄的rna(ivt-rna)的t細胞的基因修飾利用均已經(jīng)成功在多種動物模型中測試的兩種不同的策略。借助脂質(zhì)轉染或電穿孔，使用體外-轉錄的rna轉染細胞。使用各種修飾穩(wěn)定ivt-rna是期望的，以便實現(xiàn)轉移的ivt-rna的延長表達。

一些ivt載體在文獻中是已知的，其以標準化方式用作體外轉錄的模板并且其已經(jīng)被基因修飾為使得產(chǎn)生穩(wěn)定的rna轉錄物。用于本領域的目前的方案基于具有下列結構的質(zhì)粒載體：使得能夠rna轉錄的5'rna聚合酶啟動子，接著是由非翻譯區(qū)域(utr)在3'和/或5'為側翼的感興趣的基因，和包含50-70個a核苷酸的3'聚腺嘌呤基盒。體外轉錄之前，環(huán)狀質(zhì)粒在聚腺嘌呤基盒下游通過ii型限制酶(對應于切割位點的識別序列)線性化。聚腺嘌呤基盒因而對應于轉錄物中的后面的聚腺苷酸序列。作為此程序的結果，在線性化后一些核苷酸仍作為部分酶切割位點并且延伸或掩蓋3'末端處的聚腺苷酸序列。尚不清楚此非生理學突出端是否影響從這樣的構建體細胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。

rna具有優(yōu)于更傳統(tǒng)的質(zhì)?；虿《痉椒ǖ脑S多優(yōu)勢。來自rna來源的基因表達不需要轉錄并且在轉染后快速地產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物。進一步，由于rna必須僅接近細胞質(zhì)而不是細胞核，并且因此典型的轉染方法導致極高的轉染率。此外，基于質(zhì)粒的方法需要驅(qū)動感興趣的基因表達的啟動子在研究的細胞中是活性的。

在另一方面，rna構建體通過電穿孔遞送入細胞。參見，例如，如在us2004/0014645、us2005/0052630a1、us2005/0070841a1、us2004/0059285a1、us2004/0092907a1中教導的將核酸構建體電穿孔入哺乳動物細胞的制劑和方法。包括電穿孔任何已知的細胞類型所需要的電場強度在內(nèi)的多個參數(shù)在相關研究文獻以及領域中的眾多專利和申請中通常是已知的。參見例如，美國專利號6,678,556、美國專利號7,171,264和美國專利號7,173,116。用于電穿孔的治療性應用的設備是商業(yè)上可獲得的，例如，medpulser^tmdna電穿孔治療系統(tǒng)(inovio/genetronics,sandiego,calif.)，并且描述在專利比如美國專利號6,567,694；美國專利號6,516,223、美國專利號5,993,434、美國專利號6,181,964、美國專利號6,241,701和美國專利號6,233,482中；電穿孔也可以用于體外細胞轉染，例如，如在us20070128708a1中描述的。電穿孔也可以用于將核酸體外遞送入細胞。因此，利用本領域技術人員已知的任何的許多可用的裝置和電穿孔系統(tǒng)將包括核酸的表達構建體電穿孔-介導施用入細胞提供了令人激動的遞送感興趣的rna至靶細胞的新手段。

在一個實施方式中，方法包括電穿孔編碼tcrα和β鏈的rna。tcrα和β鏈可以在相同的或分開的rna上編碼。當α和β由分開的rna編碼時，rna可以被共電穿孔。

在另一個實施方式中，方法可以進一步包括電穿孔編碼共刺激分子的核酸。共刺激分子核酸可以與tcrrna共電穿孔。

t細胞的來源

在擴展之前，從對象獲得t細胞的來源。對象的非限制性實例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠和其轉基因物種。優(yōu)選地，對象是人。t細胞可以從大量來源獲得，包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、脾臟組織、臍帶和腫瘤。在某些實施方式中，可以使用本領域可獲得的任意數(shù)目的t細胞系。在某些實施方式中，t細胞可以使用技術人員已知的任意數(shù)目的技術比如ficoll分離從自對象收集的血液單位獲得。在一個實施方式中，來自個體的循環(huán)血的細胞通過單采血液成分術或白細胞提取法獲得。單采血液成分術產(chǎn)物通常包含淋巴細胞，其包括t細胞、單核細胞、粒細胞、b細胞、其它成核的白細胞、紅細胞和血小板?？梢郧逑从蓡尾裳撼煞中g收集的細胞以移除血漿級分并將細胞放置在適當?shù)木彌_液或培養(yǎng)基中，用于隨后的處理步驟，所述緩沖液或培養(yǎng)基比如磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)或清洗溶液，其缺少鈣并且可以缺少鎂或可以缺少許多——如果不是全部的話——二價陽離子。在清洗后，細胞可以重懸在各種生物相容性緩沖液中，比如，例如，無ca、無mg的pbs。可選地，可以移除單采血液成分術樣品的非期望的組分，并且將細胞直接重懸在培養(yǎng)基中。

在另一個實施方式中，t細胞通過裂解紅細胞和耗減單核細胞，例如，通過經(jīng)過percoll^tm梯度的離心，從外周血分離?？蛇x地，t細胞可以從臍帶分離。無論如何，t細胞的特定亞群可以進一步通過陽性或陰性選擇技術分離。

這樣分離的臍帶血單核細胞中可以耗減表達某些抗原——其包括但不限于cd34、cd8、cd14、cd19和cd56——的細胞。這些細胞的耗減可以使用分離的抗體、包括抗體的生物學樣品比如腹水、結合至物理載體的抗體和細胞結合抗體完成。

通過陰性選擇富集t細胞群可以使用針對表面標志物——其對陰性選擇的細胞獨特——的抗體的組合完成。優(yōu)選的方法是細胞分選和/或選擇，其經(jīng)由陰性磁性免疫粘附或使用針對在陰性選擇的細胞上存在的細胞表面標志物的單克隆抗體的混合物的流式細胞術。例如，為了通過陰性選擇富集cd4+細胞，單克隆抗體混合物通常包括對cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗體。

對于通過陽性或陰性選擇分離期望的細胞群，可以改變細胞和表面(例如，顆粒比如珠)的濃度。在某些實施方式中，可以期望顯著地減小珠和細胞混合在一起的體積(即，增加細胞的濃度)，以確保細胞和珠的最大接觸。例如，在一個實施方式中，使用20億個細胞/ml的濃度。在一個實施方式中，使用10億個細胞/ml的濃度。在進一步的實施方式中，使用多于1億個細胞/ml。在進一步的實施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×10⁶個細胞/ml的細胞濃度。在又另一個實施方式中，使用75、80、85、90、95或100×10⁶個細胞/ml的細胞濃度。在進一步的實施方式中，可使用125或150×10⁶個細胞/ml的濃度。使用高濃度可以導致增加的細胞產(chǎn)量、細胞活化和細胞擴展。

在清洗步驟后，t細胞也可以被冷凍，其不需要單核細胞移除步驟。盡管不希望被理論所束縛，但通過移除細胞群中的粒細胞和一定程度的單核細胞，冷凍和隨后的解凍步驟提供了更均一的產(chǎn)物。在移除血漿和血小板的清洗步驟后，細胞可以被懸浮在冷凍溶液中。雖然很多冷凍溶液和參數(shù)是本領域已知的，并且將在此背景下是有用的，但是在非限制性實例中，一個方法包括使用包含20％dmso和8％人血清白蛋白的pbs，或其它合適的細胞冷凍培養(yǎng)基。細胞然后以每分鐘1℃的速率冷凍至-80℃，并且儲存在液氮儲罐的蒸汽相中?？梢允褂檬芸乩鋬龅钠渌椒ㄒ约霸?20℃下或液氮中即刻不受控的冷凍。

在一個實施方式中，t細胞群包含在細胞比如外周血單核細胞、臍帶血細胞、純化的t細胞群和t細胞系內(nèi)。在另一個實施方式中，外周血單核細胞包括t細胞群。在又另一個實施方式中，純化的t細胞包括t細胞群。

嵌合膜蛋白

通常，t細胞通過與表面接觸被擴展，所述表面具有附加至其的刺激cd3/tcr復合體相關信號的試劑和刺激t細胞表面上的共刺激分子的配體。本發(fā)明包括擴展t細胞群的新方法，其包括使t細胞電穿孔有編碼嵌合膜蛋白的rna，和培養(yǎng)電穿孔的t細胞，其中該群內(nèi)的電穿孔的t細胞擴展至少10倍。本發(fā)明的嵌合膜蛋白包括胞外和胞內(nèi)結構域。胞外結構域包括靶特異性結合元件，比如抗體。在一個實施方式中，嵌合膜蛋白包括抗cd3的單鏈可變片段(scfv)和衍生自cd28和4-1bb的胞內(nèi)結構域的一部分的胞內(nèi)結構域。

嵌合膜蛋白的表達允許與群中的其它細胞——比如表達cd3的細胞——相互作用以刺激和激活電穿孔的t細胞的擴展。不希望固執(zhí)于任何具體理論，表達cd3的細胞可以與嵌合膜蛋白——其在電穿孔的t細胞的表面上表達——接觸和結合。表達嵌合膜蛋白的至少一種t細胞與表達cd3的另一種細胞相互作用。此相互作用刺激電穿孔的t細胞的擴展。

在一個實施方式中，t細胞在下調(diào)內(nèi)源基因之前被擴展。在另一個實施方式中，修飾的t細胞被擴展。

胞外結構域

本發(fā)明包括含有抗原結合結構域的胞外結構域，所述抗原結合結構域源自針對共刺激分子的抗體。共刺激分子可以包括共刺激t細胞的任何分子，比如，但不限于cd3、cd28或其組合。在一個實施方式中，胞外結構域可以包括抗原結合結構域，其源自抗cd3、抗cd28或其組合。在另一個實施方式中，胞外結構域包括抗cd3的單鏈可變片段(scfv)。

在另一個實施方式中，胞外結構域可以包括結合至抗原的抗體的任何部分，其包括但不限于合成抗體、人抗體、人源化抗體、單結構域抗體、單鏈可變片段、和其片段的抗原結合結構域。在一些情況下，胞外結構域源自相同的物種——嵌合膜蛋白將最終用于其中——是有利的。例如，對于用于人，嵌合膜蛋白的胞外結構域包括人抗體或其片段可以是有利的。因而，在一個實施方式中，胞外結構域部分包括人抗體或其片段，如本文其它地方描述的。可選地，在一些實施方式中，胞外結構域部分包括人源化的非人抗體，如本文其它地方描述的。

胞內(nèi)結構域

胞內(nèi)結構域或胞質(zhì)結構域包括共刺激信號傳導區(qū)。共刺激信號傳導區(qū)指的是共刺激分子的胞內(nèi)結構域。共刺激分子是除抗原受體或其配體之外的細胞表面分子，其是淋巴細胞對抗原高效應答所需要的。

嵌合膜蛋白的胞質(zhì)結構域或胞內(nèi)信號傳導結構域負責活化t細胞的效應物功能中的至少一種。雖然經(jīng)?？梢圆捎谜麄€胞內(nèi)信號傳導結構域，但是在很多情況下，不必需使用整個鏈。就使用胞內(nèi)信號傳導結構域的截短部分而言，這樣的截短部分可以用于替代完整的鏈，只要它轉導效應物功能信號。胞內(nèi)信號傳導結構域包括足以轉導效應物功能信號的胞內(nèi)信號傳導結構域的任何截短部分。

用于嵌合膜蛋白的胞內(nèi)信號傳導結構域的非限制性實例包括cd28、4-1bb、t細胞受體(tcr)、共刺激分子的胞內(nèi)結構域的任何部分，這些序列的任何衍生物或變體，具有相同功能性能力的任何合成序列，和其任意組合。在一個實施方式中，胞內(nèi)結構域包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結構域的一部分。

嵌合膜蛋白的其它結構域

在嵌合膜蛋白的胞外結構域和跨膜結構域之間，或在嵌合膜蛋白的胞質(zhì)結構域和跨膜結構域之間，可以并入間隔結構域，比如起將跨膜結構域連接至多肽鏈中的胞外結構域或胞質(zhì)結構域作用的寡肽或多肽。間隔結構域可以包括多至300個氨基酸，優(yōu)選地10至100個氨基酸和最優(yōu)選地25至50個氨基酸。

在一些實施方式中，嵌合膜蛋白進一步包括跨膜結構域。在一些實施方式中，嵌合膜蛋白進一步包括鉸鏈結構域。在一個實施方式中，編碼嵌合膜蛋白的rna進一步包括跨膜和鉸鏈結構域，比如cd28跨膜結構域和cd8-α鉸鏈結構域。

t細胞的擴展

如本文公開的數(shù)據(jù)所展現(xiàn)的，通過本文公開的方法擴展t細胞可以增加大約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、或更大，和其之間的任何和所有全部或部分整數(shù)。在一個實施方式中，t細胞擴展大約20倍至大約50倍的范圍。

在培養(yǎng)之后，在將細胞傳代至另一個培養(yǎng)設備前，t細胞可以在培養(yǎng)設備中的細胞培養(yǎng)基中培育一段時間或直到細胞達到用于最佳傳代的匯合或高細胞密度。培養(yǎng)設備可以具有一般用于體外培養(yǎng)細胞的任何培養(yǎng)設備。優(yōu)選地，在將細胞傳代至另一個培養(yǎng)設備之前，匯合的水平是70％或更大。更優(yōu)選地，匯合的水平是90％或更大。一段時間可以是適于細胞體外培養(yǎng)的任何時間。t細胞培養(yǎng)基可以在t細胞培養(yǎng)期間的任何時間被更換。優(yōu)選地，t細胞培養(yǎng)基大約每2至3天更換一次。然后從培養(yǎng)設備收獲t細胞，于是t細胞可以被立即使用或冷藏儲存以備后用。在一個實施方式中，本發(fā)明包括冷藏擴展的t細胞。冷藏的t細胞在將核酸引入t細胞之前被解凍。

在另一個實施方式中，方法包括分離t細胞和擴展t細胞。在另一個實施方式中，本發(fā)明進一步包括在擴展之前冷藏t細胞。在還另一個實施方式中，冷藏的t細胞被解凍，以便電穿孔有編碼嵌合膜蛋白的rna。

在美國專利號5,199,942(通過引用并入本文)中描述了用于離體擴展細胞的另一種程序。擴展，比如美國專利號5,199,942中描述的，可以是本文描述的其它擴展方法的替代方案或除本文描述的其它擴展方法之外的方法。簡言之，t細胞的離體培養(yǎng)和擴展包括添加細胞生長因子，比如在美國專利號5,199,942中描述的那些，或其它因子，比如flt3-l、il-1、il-3和c-kit配體。在一個實施方式中，擴展t細胞包括使用選自flt3-l、il-1、il-3和c-kit配體的因子培養(yǎng)t細胞。

如本文描述的培養(yǎng)步驟(與如本文描述的試劑接觸或在電穿孔后)可以非常短，例如少于24小時比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小時。如本文進一步描述的培養(yǎng)步驟(與如本文描述的試劑接觸)可以較長，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。

多種術語用于描述培養(yǎng)中的細胞。細胞培養(yǎng)物通常指的是取自活的生物體并且在受控條件下生長的細胞。原代細胞培養(yǎng)物是直接取自生物體的細胞、組織或器官并且是在第一次傳代培養(yǎng)前的培養(yǎng)物。當它們在促進細胞生長和/或分裂的條件下被放置在生長培養(yǎng)基中時，細胞在培養(yǎng)中被擴展，產(chǎn)生更大的細胞群。當細胞在培養(yǎng)中被擴展時，通常通過細胞數(shù)目加倍需要的時間量——另外稱為倍增時間——測量細胞增殖速率。

每一輪傳代培養(yǎng)被稱為傳代。當細胞被傳代培養(yǎng)時，它們被稱為已經(jīng)被傳代。特異性細胞群或細胞系有時稱為或表征為其已經(jīng)被傳代的次數(shù)。例如，已經(jīng)被傳代十次的培養(yǎng)的細胞群可以被稱為p10培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)物，即，從組織分離細胞之后的第一次培養(yǎng)物被指定為p0。在第一次傳代培養(yǎng)之后，細胞被描述為繼代培養(yǎng)物(p1或第1代)。在第二次傳代培養(yǎng)后，細胞成為三級培養(yǎng)物(tertiaryculture)(p2或第2代)，以此類推。本領域技術人員將理解在傳代的時期期間可以存在許多群倍增；因此培養(yǎng)物的群倍增數(shù)大于傳代數(shù)。在傳代之間的時期期間的細胞擴展(即，群倍增數(shù))取決于許多因素，包括但不限于接種密度、基質(zhì)、培養(yǎng)基、和傳代之間的時間。

在一個實施方式中，細胞可以被培養(yǎng)數(shù)小時(大約3小時)至大約14天或其之間的任何小時的整數(shù)值。適于t細胞培養(yǎng)的條件包括適當?shù)呐囵B(yǎng)基(例如，最小必需培養(yǎng)基或rpmi培養(yǎng)基1640或x-vivo15，(lonza))，其可以包含增殖和生存必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白細胞介素-2(il-2)、胰島素、ifn-γ、il-4、il-7、gm-csf、il-10、il-12、il-15、tgfβ、和tnf-α、或技術人員已知的用于細胞生長的任何其它添加劑。用于細胞生長的其它添加劑包括但不限于表面活性劑、人血漿蛋白粉(plasmanate)和還原劑比如n-乙酰半胱氨酸和2-巰基乙醇。培養(yǎng)基可以包括rpmi1640、aim-v、dmem、mem、α-mem、f-12、x-vivo15、和x-vivo20、optimizer，具有添加的氨基酸、丙酮酸鈉和維生素，無血清或補充有適當量的血清(或血漿)或限定的激素組、和/或足夠t細胞生長和擴展的量的細胞因子(一種或多種)。抗生素，例如青霉素和鏈霉素，僅被包括在實驗培養(yǎng)物中，而不在被注入對象的細胞培養(yǎng)物中。靶細胞被維持在支持生長必需的條件下，例如，適當?shù)臏囟?例如，37℃)和氣氛(例如，空氣加5％co2)。

用于培養(yǎng)t細胞的培養(yǎng)基可以包括可以共刺激t細胞的試劑。例如，可以刺激cd3的試劑是cd3的抗體，并且可以刺激cd28的試劑是cd28的抗體。這是因為，如由本文公開的數(shù)據(jù)所展現(xiàn)的，通過本文公開的方法分離的細胞可以擴展大約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大。在一個實施方式中，通過培養(yǎng)電穿孔的群，t細胞擴展大約20倍至大約50倍或更多的范圍。

在一個實施方式中，方法包括將編碼t細胞受體(tcr)——其包括對靶細胞上的表面抗原的親和力——的核酸引入擴展的t細胞，和將編碼共刺激分子的rna電穿孔入t細胞，其中電穿孔的t細胞能夠表達tcr和共刺激分子。

在另一個實施方式中，方法進一步包括使用選自cd3、cd27、cd28、cd83、cd86、cd127、4-1bb、4-1bbl、pd1和pd1l的至少一種共刺激分子刺激擴展的t細胞。刺激可以包括用編碼共刺激分子的rna共電穿孔。在這樣的實施方式中，擴展的t細胞進一步用編碼cd3的rna電穿孔或共電穿孔。cd3包括至少兩種不同的cd3鏈，比如cd3ζ鏈和cd3ε鏈。

在另一個實施方式中，擴展t細胞的方法可以進一步包括分離擴展的t細胞用于進一步的應用。在又另一個實施方式中，擴展的方法可以進一步包括隨后電穿孔擴展的t細胞，接著培養(yǎng)。隨后的電穿孔可以包括將編碼試劑的核酸引入擴展的t細胞群，比如用編碼tcr的核酸轉導擴展的t細胞、轉染擴展的t細胞或電穿孔擴展的t細胞，其中試劑進一步刺激t細胞。試劑可以刺激t細胞，比如通過刺激進一步的擴展、效應物功能、或另一種t細胞功能。在一個實施方式中，試劑核酸與嵌合膜蛋白rna被共電穿孔。在另一個實施方式中，試劑核酸，比如tcrrna在培養(yǎng)電穿孔的群后被電穿孔。在進一步的實施方式中，試劑核酸，比如tcrrna被電穿孔入被冷藏的擴展的t細胞。

療法

本文描述的修飾的t細胞可以包括在用于治療的組合物中。組合物可以包括藥物組合物并且進一步包括藥學上可接受的載體?？梢允┯冒ㄐ揎椀膖細胞的治療有效量的藥物組合物。

在一方面，本發(fā)明包括用于刺激針對對象中的靶細胞或組織的t細胞-介導的免疫應答的方法，其包括給對象施用有效量的修飾的t細胞。在此實施方式中，t細胞是修飾的，如本文其它地方描述的。修飾的t細胞可以被施用以誘導靶細胞或組織的裂解，比如，其中誘導的裂解是抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(adcc)。

在另一方面，本發(fā)明包括用于過繼細胞轉移療法的方法，其包括施用有效量的藥物組合物至需要其的對象以預防或治療不利于對象的免疫反應，所述的藥物組合物包括本文描述的修飾的t細胞。

在還另一個實施方式中，治療與對象中增強的免疫性相關聯(lián)的疾病或病癥的方法包括施用有效量的藥物組合物至需要其的對象，所述的藥物組合物包括本文描述的修飾的t細胞。

如本文描述生成的修飾的t細胞可以是一致的并且具備t細胞功能。進一步，修飾的t細胞可以被施用至動物，優(yōu)選地哺乳動物，甚至更優(yōu)選地人，以阻抑免疫反應，比如自身免疫性疾病比如糖尿病、牛皮癬、類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、gvhd、增強性同種異體移植耐受誘導(enhancingallografttoleranceinduction)、移植排斥等共有的那些免疫反應。此外，本發(fā)明的細胞可以用于任何病癥的治療，其中減弱的或以其他方式抑制的免疫應答，尤其是細胞-介導的免疫應答，對于治療或減輕疾病是期望的。在一方面，本發(fā)明包括治療對象中的病癥，比如自身免疫性疾病，其包括給對象施用治療有效量的包括本文描述的修飾的t細胞的藥物組合物。

自身免疫性疾病的實例包括但不限于獲得性免疫缺陷綜合征(aids，其是具有自身免疫組分的病毒性疾病)、斑禿、強直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內(nèi)耳疾病(aied)、自身免疫性淋巴細胞增生綜合征(alps)、自身免疫性血小板減少性紫癜(atp)、貝切特氏病、心肌病、乳糜瀉-皰疹樣皮炎、慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(cfids)、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(cipd)、疤痕性類天皰瘡、冷凝集素疾病、crest綜合征、克羅恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盤狀狼瘡、特發(fā)性混合型冷沉淀球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維變性、特發(fā)性血小板減少性紫癜(itp)、iga腎病、胰島素依賴型糖尿病、青少年慢性關節(jié)炎(斯提耳氏病)、青少年型類風濕性關節(jié)炎、美尼爾氏病、混合結締組織病、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、惡性貧血、結節(jié)性多動炎癥、多軟骨炎、多腺體綜合征、風濕性多肌痛、多發(fā)性肌炎和皮肌炎、原發(fā)性無丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變、牛皮癬、牛皮癬性關節(jié)炎、雷諾氏現(xiàn)象、萊特爾綜合征、風濕熱、類風濕性關節(jié)炎、結節(jié)病、硬皮病(進行性全身性硬化癥(pss)，還稱為全身性硬化癥(ss))、斯耶格倫氏綜合征、僵體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、高安氏動脈炎、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、潰瘍性結腸炎、眼葡萄膜炎、白斑病和韋格納氏肉芽腫病。

如本文描述生成的t細胞還可以被修飾并且用于治療炎性障礙。炎性障礙的實例包括但不限于慢性和急性炎性障礙。炎性障礙的實例包括阿爾茨海默病、哮喘、特異性變態(tài)反應、變態(tài)反應、動脈粥樣硬化、支氣管哮喘、濕疹、腎小球性腎炎、移植物抗宿主疾病、溶血性貧血、骨關節(jié)炎、敗血癥、中風、組織和器官移植、血管炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病和呼吸機所致肺損傷(ventilatorinducedlunginjury)。

在另一個實施方式中，本文描述的修飾的t細胞可以用于制造用于治療需要其的對象中的免疫應答的藥物。

本發(fā)明的細胞可以以劑量和途徑施用，并且有時在適當?shù)呐R床前和臨床實驗和試驗中確定。細胞組合物可以在這些范圍內(nèi)的劑量下被施用多次。本發(fā)明的細胞的施用可以與如本領域技術人員確定的可用于治療期望的疾病或病癥的其它方法組合。

待施用的本發(fā)明的細胞可以對于經(jīng)歷治療的對象是自體的、同種異體的或異種的。

本發(fā)明的細胞的施用可以以本領域技術人員已知的任何常規(guī)方式實施。本發(fā)明的細胞可以通過氣溶膠吸入、注射、吞咽、輸注、植入或移植施用至對象。本文描述的組合物可以被經(jīng)動脈地、皮下地、皮內(nèi)地、瘤內(nèi)地、結內(nèi)地、髓內(nèi)地、肌肉內(nèi)地、通過靜脈內(nèi)(i.v.)注射、或腹膜內(nèi)地施用至患者。在其它情況下，本發(fā)明的細胞被直接注入對象中的炎癥部位、對象中的局部疾病部位、淋巴結、器官、腫瘤等。

還可以使用任意數(shù)目的基體施用本文描述的細胞。本發(fā)明利用這樣的基體——在充當人工淋巴器官的新背景內(nèi)——支持、維持或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，其通常通過t細胞的調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明可以利用那些基體組合物和制劑，其已經(jīng)展現(xiàn)了在組織工程化中的實用性。因此，可以用于本發(fā)明的組合物、裝置和方法的基體的類型事實上是無限制的并且可以包括生物學和合成基體二者。在一個具體的實例中，利用由美國專利號5,980,889；5,913,998；5,902,745；5,843,069；5,787,900；或5,626,561陳述的組合物和裝置，如同這些專利通過引用以其全部并入本文一樣?；w包括一般與如下相關聯(lián)的特征：當施用至哺乳動物宿主時是相容性的?；w可以由天然和/或合成材料形成。基體可以是不可生物降解的——在期望在動物的體內(nèi)留下永久性結構或可移動結構比如植入物的情況下；或可生物降解的?；w可以采用海綿、植入物、管、telfa墊、纖維、中空纖維、凍干組分、凝膠、粉末、多孔組合物、或納米顆粒的形式。此外，基體可以被設計以允許持續(xù)釋放接種的細胞或產(chǎn)生的細胞因子或其它活性劑。在某些實施方式中，本發(fā)明的基體是柔性的和彈性的，并且可以被描述為半固體支架，其對物質(zhì)比如無機鹽、水性流體和包括氧的溶解的氣體試劑(gaseousagent)是可透過的。

基體在本文被用作生物相容性物質(zhì)的實例。然而，本發(fā)明不限于基體，并且因而，無論術語基體(一種或多種)在什么地方出現(xiàn)，這些術語應當被解讀為包括如下裝置和其它物質(zhì)：其允許細胞滯留或細胞穿越；是生物相容性的；和能夠允許大分子穿越直接通過物質(zhì)，以便物質(zhì)自身是半透膜或與具體的半透性物質(zhì)協(xié)同使用。

藥物組合物

本發(fā)明的藥物組合物可以包括如本文描述的修飾的t細胞，與一種或多種藥學或生理學上可接受載體、稀釋劑或賦形劑組合。這樣的組合物可以包括緩沖液比如中性緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等；碳水化合物比如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸比如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑比如edta或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選地配制用于靜脈內(nèi)施用。

本發(fā)明的藥物組合物可以以適于待治療(或預防)的疾病的方式施用。施用的數(shù)量和頻率將由如下因素確定，比如患者的病癥、和患者疾病的類型和嚴重度，但是可以由臨床試驗確定適當?shù)膭┝俊?/p>

當指示“免疫學有效量”、“抗免疫應答有效量”、“免疫應答-抑制有效量”或“治療量”時，待施用的本發(fā)明的組合物的準確量可以由醫(yī)師考慮個體在年齡、重量、免疫應答、和患者(對象)的狀況中的差異來確定。通?？梢砸?guī)定包括本文描述的修飾的t細胞的藥物組合物可以以10⁴至10⁹個細胞/kg體重的劑量，優(yōu)選地10⁵至10⁶個細胞/kg體重的劑量——包括在那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值——施用。t細胞組合物也可以以這些劑量施用多次。細胞可以通過使用免疫療法中公知的注入技術(參見，例如rosenberg等，neweng.j.ofmed.319:1676,1988)施用。具體患者的最佳劑量和治療方案可以通過監(jiān)測患者的疾病跡象和相應地調(diào)節(jié)治療而由醫(yī)學領域技術人員容易地確定。

在某些實施方式中，可以期望給對象施用活化的t細胞，并且隨后重新抽取(redraw)血液(或進行單采血液成分術)，根據(jù)本發(fā)明活化來自其的t細胞，并且將這些活化和擴展的t細胞再注入患者。此過程可以每幾周實施多次。在某些實施方式中，來自10ml至400ml的血液抽取物的t細胞可以被活化。在某些實施方式中，來自20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或100ml的血液抽取物的t細胞被活化。不被理論所束縛，使用此多重血液抽取/多重再輸注方案，可以選擇出某些t細胞群。

在本發(fā)明的某些實施方式中，使用本文描述的方法或本領域已知的將t細胞擴展至治療性水平的其它方法擴展和修飾的細胞，協(xié)同任意數(shù)目的相關治療形式(例如，之前、同時或之后)被施用至患者，所述治療形式包括但不限于使用如下藥劑的治療：比如抗病毒療法、用于ms患者的西多福韋和白細胞介素-2、阿糖胞苷(也稱為ara-c)或那他珠單抗(natalizumab)治療，或用于牛皮癬患者的依法利珠單抗(efalizumab)治療，或用于pml患者的其它治療。在進一步的實施方式中，本發(fā)明的t細胞可以與如下組合使用：化療，輻射，免疫抑制劑，比如，環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麥考酚酯和fk506，抗體，或其它免疫燒蝕劑(immunoablativeagent)比如campath、抗cd3抗體或其它抗體療法、細胞毒素、氟達拉濱、環(huán)孢菌素、fk506、雷帕霉素、麥考酚酸、類固醇類、fr901228、細胞因子和照射。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶——神經(jīng)鈣蛋白(環(huán)孢菌素和fk506)或抑制對生長因子誘導的信號傳導重要的p70s6激酶(雷帕霉素)。(liu等，cell66:807-815,1991；henderson等，immun.73:316-321,1991；bierer等，curr.opin.immun.5:763-773,1993)。在進一步的實施方式中，本發(fā)明的細胞組合物協(xié)同(例如，之前、同時或之后)骨髓移植、t細胞燒蝕療法——使用化療劑比如氟達拉濱、外部光束放射療法(xrt)、環(huán)磷酰胺，或抗體比如okt3或campath——被施用至患者。在另一個實施方式中，本發(fā)明的細胞組合物在b細胞燒蝕療法——比如與cd20反應的藥劑，例如，利妥昔單抗——之后被施用。例如，在一個實施方式中，對象可以經(jīng)歷高劑量化療的標準治療，接著進行外周血干細胞移植。在某些實施方式中，在移植之后，對象接受本發(fā)明的擴展的免疫細胞的注入。在額外的實施方式中，擴展的細胞在外科手術之前或之后施用。

施用至患者的上面治療的劑量將隨著正在治療的病癥的精確性質(zhì)和治療的接受者而變化。人施用的劑量比例可以根據(jù)本領域接受的實踐進行。例如，campath的劑量對于成年患者將一般在1至大約100mg的范圍中，通常每天施用，持續(xù)1和30天之間的時期。雖然在一些情況下可以使用多至40mg每天的較大的劑量(在美國專利號6,120,766中描述)，但是優(yōu)選的日劑量是1至10mg每天。

應當理解將在本發(fā)明中有用的方法和組合物不限于在實施例中陳述的具體的制劑。下列實施例被提出以便于為本領域普通技術人員提供如何制造和使用細胞，擴展和培養(yǎng)方法，本發(fā)明的治療方法的完整的公開內(nèi)容和描述，并且不意欲限制本發(fā)明人視為其發(fā)明的范圍。

除非另外指示，本發(fā)明的實踐采用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規(guī)技術，其充分地在技術人員的見識內(nèi)。這樣的技術在如下文獻中充分地說明，比如，“molecularcloning:alaboratorymanual”,第四版(sambrook,2012)；“oligonucleotidesynthesis”(gait,1984)；“cultureofanimalcell”(freshney,2010)；“methodsinenzymology”“handbookofexperimentalimmunology”(weir,1997)；“genetransfervectorsformammaliancells”(miller和calos,1987)；“shortprotocolsinmolecularbiology”(ausubel,2002)；“polymerasechainreaction:principles,applicationsandtroubleshooting”,(babar,2011)；“currentprotocolsinimmunology”(coligan,2002)。這些技術適用于產(chǎn)生本發(fā)明的多核苷酸和多肽，并且因此，可以在進行和實踐本發(fā)明中考慮。將在下列部分中討論具體實施方式的特別有用的技術。

實驗實施例

通過參考下列實驗實施例進一步詳細地描述本發(fā)明。除非另外規(guī)定，這些實施例僅出于說明目的提供，并且不意欲是限制性的。因而，本發(fā)明決不應當解釋為限制于下列實施例，而是應當解釋為包括由于本文提供的教導而變得顯而易見的任何和所有的變化。

在沒有進一步描述的情況下，相信使用在先的描述和下列說明性實施例，本領域普通技術人員可以制造和利用本發(fā)明的化合物，并且實踐要求保護的方法。下列工作實施例因此具體地指出本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，并且不解釋為以任何方式限制本公開內(nèi)容的其余部分。

現(xiàn)在描述在這些實驗中采用的材料和方法。

原代人淋巴細胞。如描述的，使用包被有cd3和cd28刺激抗體的微珠(lifetechnologies,grandisland,ny,catalog)刺激原代淋巴細胞(humangenetherapy2011,22(12):1575-1586)。t細胞在第10天以1×10⁸細胞/小瓶被冷藏在90％胎牛血清和10％二甲基亞砜(dmso)的溶液中。

nalm-6購自德國微生物菌種保藏中心(germandsmzcellcollection)(dsmz目錄代碼：acc128)。k562和pc3購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection)。624mel黑素瘤細胞系(melanomaline)獲得自surgerybranch(nci/nih)。所有細胞系如指導的培養(yǎng)并且例行地進行支原體污染的測試，并且確認為是陰性的。

用于mrna電穿孔和慢病毒轉導的tcr構建體的生成。基于由相關出版物(thejournalofexperimentalmedicine2005,201(8):1243-1255；jimmunol2008,180(9):6116-6131)提供的測序信息，通過pcr合成和/或擴增具有不同突變(1g4和8f)的1g4ny-eso-1tcr和car(psca或cd19)，并且將其亞克隆入基于pgem.64arna的載體或ptrpe慢病毒載體。

人原代t細胞制備。使用rosettesep試劑盒(stemcelltechnologies,vancouverbc,canada)通過陰性選擇在白細胞提取法之后從健康的志愿者供體分離原代人cd4和cd8t細胞。在universityinstitutionalreviewboard批準的方案下收集所有樣本，并且從每個供體獲得書面的知情同意書。

crispr的設計和構建。cas9dna通過pcr被合成，然后被插入pgem載體。通過具有nggpam位點的gn19選擇grna，而一些選自具有nggpam位點的n20。所有grna包含由多于13個堿基對錯配構成的互補序列，其中排除潛在的脫靶mrna位點(表1)。如圖1a中顯示的設計grna，并且通過重疊pcr進行合成。所有grnapcr產(chǎn)物被連接入msgv載體。體外轉錄的cas9和grna靶向tcrα、β鏈和β-2微珠蛋白的恒定區(qū)。grna被設計以靶向tcrα恒定區(qū)的外顯子1內(nèi)的序列、tcrβ恒定區(qū)1和2二者的外顯子1共有的共有序列、β-2微球蛋白或pd1。編碼grna的序列使用重疊pcr進行組裝并且被克隆入包含t7啟動子的msgv載體。使用ecori使這些質(zhì)粒線性化。grna被體外轉錄。使用mmessagemmachinet7ultra試劑盒(lifetechnologies,carlsbad,ca)體外轉錄cas9mrna。mrna在-80℃下儲存在無核酸酶的小瓶中用于單次使用。用于動物研究的grna靶向序列如下：

trac-grna：tgtgctagacatgaggtcta，seqidno:1

trbc-grna：gcagtatctggagtcattga，seqidno:2

b2m-grna：cgcgagcacagctaaggcca，seqidno:3

pd1-grna：ggcgccctggccagtcgtct，seqidno:4

fas-grna：gagggtccagatgcccagca，seqidno:5

流式細胞術。下列單克隆抗體和試劑與指示的特異性和適當?shù)耐N型對照一起使用。來自bdbiosciences(sanjose,ca)：apc-綴合的抗cd3(555335)、fitc-抗cd8(555366)、pe-抗cd8(555635)、fitc-抗cd27(555440)、pe-抗cd107(555801)、pe-抗β-2微珠蛋白(551337)、fitc-抗hla(555552)；biolegend(sandiego,ca)：fitc-抗cd45ro(304204)、apc-抗cd62l(304814)、apc-抗ccr7(353214)；和beckmancoulter(pasadena,ca)：pe-抗vb13.1(im2021u)。使用cellquest版本3.3(bdbiosciences,sanjose,ca)在facsaccuri(bdbiosciences,sanjose,ca)上取得數(shù)據(jù)，并且通過fcsexpress版本3.00(denovosoftware,losangeles,ca)或flowjo版本7.6.1(treestar,inc.ashland,or)進行分析。

原代t細胞的繁殖。原代人t細胞在補充有10％fcs、100-u/ml青霉素、100-g/ml硫酸鏈霉素、10-mmhepes的rpmi1640中培養(yǎng)，并且在1:3的細胞：珠比值下使用涂覆有抗cd3/抗cd28的磁珠進行刺激。每2天進行細胞計數(shù)和喂養(yǎng)，并且一旦t細胞似乎休眠(restdown)——如通過減小的生長動力學和細胞大小二者所測定的，t細胞被用于功能性測定或被冷藏。

cd3^negt細胞的生成。dna超螺旋質(zhì)粒分別通過spei和ecori被線性化。通過t7mscript^tm標準mrna生產(chǎn)系統(tǒng)(cambio,c-msc100625,cambridge,england)體外轉錄grna。使用mmessagemmachinet7ultra試劑盒(lifetechnologies,am1345,carlsbad,ca)體外轉錄所有mrna(cas9、tcrα、tcrβ和car)。t細胞在電穿孔之前被cd3/cd28免疫磁珠刺激三天。在通過btx830使用360v，1ms參數(shù)電轉移20μgcas9，10μggrna種類進入細胞之前，一千萬個原代t細胞被去珠(de-beaded)，接著是第二次和/或第三次電轉移10μggrna。而且，t細胞使用opti-mem清洗三次并且以1-3×10⁸個細胞/ml的終濃度重懸在opti-mem(invitrogen)中。隨后，0.1ml的細胞與10μg的ivtrna(或如指示的)混合，并且在2mm小池中被電穿孔。在使用btx830(harvardapparatusbtx)在360v和1ms下電轉移20μg的cas9和10μg的grna種類進入細胞之前，一千萬個原代t細胞被去珠；此過程接著是12至24小時后第二次和第三次電轉移5μg的grna。

在電穿孔之后，細胞被立即放置在2ml的預熱培養(yǎng)基中并且在37℃、5％co2下培養(yǎng)或在32℃、5％co2下培養(yǎng)1天，然后返回至37℃、5％co2。

tcrα與β雙重破壞或trac、trbc和b2m三重破壞。為了生成tcrα與β雙敲除t細胞，cas9mrna與靶向tcrα鏈(trac)和tcrβ鏈(trbc)的兩種不同的grna被共電穿孔。tcrα與β雙敲除t細胞可以以2個步驟進行純化：1)在電穿孔1g4tcrα鏈rna后使用抗cd3微珠耗減tcr-陽性和α鏈單敲除細胞，和2)在電穿孔tcrβ鏈rna后使用抗cd3微珠耗減tcrβ鏈單敲除細胞。對于trac、trbc和b2m三重破壞，t細胞在抗cd3/cd28珠刺激后3天電穿孔有cas9mrna和靶向tcrα與β鏈和β-2微球蛋白的grna。hla-i-陰性細胞群在第9天被富集并且電穿孔有tcrα鏈rna。tcr-陰性群在第10天被富集。五天后，這些細胞電穿孔有tcrβ鏈rna，并且tcr-陰性細胞群在次日被分選以獲得通用t細胞。在第18天，tcr或carrna被電穿孔入通用t細胞以生成通用效應細胞。在每個步驟確認tcr和hla-i分子表達。

通用cart細胞的生成。通過組合cd19或pscacar的慢病毒轉導與crispr/grna的rna電穿孔生成通用cart細胞。在抗cd3/cd28珠刺激后1天，t細胞轉導有慢病毒-cd19或pscacar。2天后，cas9和靶向tcrα、β鏈、b2m、pd1的grna通過電穿孔被轉移入t細胞。crispr遞送后6天，通過微珠耗減分選cd3、hla-i、pd1陰性的t細胞。

cd3^negt細胞的富集。使用automacs緩沖液清洗的細胞在4℃下使用cd3微珠(miltenyibiotec,130-050-101,auburn,ca)培育30分鐘。在清洗兩次后，細胞穿過ld柱(miltenyibiotec,130-042-901,auburn,ca)，并且收集流過的(flow-through)級分以備進一步使用。cd3^negt細胞的cd3表達通過共電穿孔1g4tcrα與βmrna被復原，并且使用單個快速擴展方案(rep)、cd3/cd28免疫磁珠或基于k562的aapc擴展細胞。

cd3^negt細胞的生成和繁殖。cd3^negt細胞具有通過電轉移外源性1g4tcrα鏈和tcrβ鏈體外轉錄的mrna(每條鏈5μg)復原的cd3表達。這些細胞使用單個快速擴展方案(rep)進行擴展。來自三種不同的供體nd052105×10⁶個、nd40583×10⁶個、nd410136×10⁶個的pbmc被照射，然后混合在一起以獲得總計324×10⁶個pbmc。pbmc被重懸在90ml的終體積中，然后添加r10至300ml，混合，并且分為兩個t150ml燒瓶。okt被添加至30ng/ml的終濃度。在第2天，il-2被添加至50cu/ml。從第5天，每2天進行細胞計數(shù)和喂養(yǎng)，并且一旦t細胞似乎休眠——如通過減小的生長動力學和細胞大小二者測定的，t細胞被用于功能性測定或被冷藏。

sanger測序。通過surveyor核酸酶測定(transgenomics,omaha,ne)確定t細胞中tcrα鏈(trac)、tcrβ鏈1(trbc1)和tcrβ鏈2(trbc2)的基因組破壞水平。通過光密度測定法定量靶標破壞百分比。用于靶基因座擴增的pcr引物是：

trac正向，5'-tcatgtcctaaccctgatcctctt-3'seqidno:6

trac反向，5'-ttggacttttcccagctgacaga-3'seqidno:7

trbc總正向，5'-taccaggaccagacagctcttaga-3'seqidno:8

trbc總反向，5'-tctcacctaatctcctccaggcat-3'seqidno:9

pcr產(chǎn)物被純化并且連接至topo克隆載體(invitrogen)，然后在大腸桿菌中轉化。挑取并且測序單克隆以計算插入/缺失。

用于電穿孔的sirna和crispri的生成。使用定制rnai設計工具(integrateddnatechnologies,coralville,ia)設計靶向α(5'-rargrgrargrgrarururcrgrgrararcrcrcrararurcrarcrurgrarc-3'seqidno:10和5'-rcrargrurgrarururgrgrgrururcrcrgrararurcrcrurcct-3'seqidno:11)或β(5'-rarcrcrurcrcrururcrcrcrarururcrarcrcrcrarcrcrargrcrurc-3'seqidno:12和5'-rgrcrurgrgrurgrgrgrurgrararurgrgrgrarargrgrarggt-3'seqidno:13)的tcr恒定區(qū)的rna雙鏈體，并且合成sirna(integrateddnatechnologies,coralville,ia)。tcrα與β二者的sirna被混合和電穿孔入刺激的t細胞用于內(nèi)源性tcr敲落。

mrna體外轉錄和t細胞電穿孔。t7mscript系統(tǒng)試劑盒(cellscript)被用于生成體外轉錄的(ivt)rna。如先前描述的，cd3/cd28珠刺激的t細胞使用btxem830(harvardapparatusbtx)電穿孔有ivtrna(cancerresearch2010,70(22):9053-9061)。簡言之，t細胞被清洗三次并且以1-3×10⁸個細胞/ml的終濃度重懸在opti-mem(invitrogen)中。隨后，0.1ml的細胞與10μgivtrna(或如指示的)混合并且在2mm小池中進行電穿孔。

elisa測定。靶細胞，表達cd19的不同的腫瘤細胞系，被清洗和以1×10⁶個細胞/ml懸浮在r10培養(yǎng)基(補充有10％胎牛血清的rpmi1640；invitrogen)中。100μl的每種靶細胞類型一式兩份添加至96孔圓底板(corning)。清洗效應t細胞，并且以1×10⁶個細胞/ml重懸在r10培養(yǎng)基中，并且然后100μl的t細胞與指示的孔中的靶細胞組合。此外，包含單獨的t細胞的孔被準備作為對照。平板在37℃下培育18至20小時。在培育后，上清液被收獲并且經(jīng)受elisa測定(ebioscience)。

cd107a染色。細胞以1:1的效應細胞：t細胞比值(1×10⁵效應物比1×10⁵靶標)平板接種在96孔板中的160μl的完全rpmi培養(yǎng)基中。添加20μl的藻紅蛋白-標記的抗cd107a抗體(bdbiosciences,555801)，并且平板在37℃下培育1小時，然后添加golgistop(3mlrpmi培養(yǎng)基中2μlgolgistop，20μl/孔；bdbiosciences,51-2092kz)并且培育平板持續(xù)另外的2.5小時。然后添加5μlfitc-抗cd8和5μlapc-抗cd3并且在37℃下培育30min。在培育后，使用facs緩沖液清洗樣品并且通過流式細胞術進行分析。

基于熒光素酶的ctl測定。生成naml6-cbg腫瘤細胞并且在基于熒光素酶的細胞毒性t淋巴細胞測定的修改版本中采用。簡言之，叩頭蟲綠熒光素酶(cbg)被克隆入pelns載體，包裝入慢病毒，轉導入naml6腫瘤細胞并且進行cbg表達分選。得到的naml6-cbg細胞被清洗并且以1×10⁵個細胞/ml重懸在r10培養(yǎng)基中，并且100μl的cbg-標記的細胞與不同比值的t細胞(例如30:1、15:1等)在37℃下過夜培育。100μl的混合物被轉移至96孔白色酶標板。100μl的底物被添加至細胞并且立即測定發(fā)光。結果報道為基于具有腫瘤細胞而沒有t細胞的孔中的熒光素酶活性的殺傷百分比(％殺傷＝100-((來自具有效應物和靶細胞共培養(yǎng)物的孔的rlu)/(來自具有靶細胞的孔的rlu)×100))。

小鼠異種移植研究。如先前描述的，利用某些修改進行研究(humangenetherapy2011,22(12):1575-1586；proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica2009,106(9):3360-3365)。簡言之，6-10周齡nod/scidγ(nsg)小鼠在第0天在右脅上被皮下注射1×10⁶個pc3-cbg腫瘤細胞，并且相同的小鼠在第5天在左脅上被給予sk-ov3-cbg腫瘤細胞(5×10⁶個細胞/小鼠，皮下地)。在pc3-cbg腫瘤接種之后第23天，小鼠經(jīng)由尾靜脈使用t細胞進行處理，使得兩個腫瘤的體積都是大約200mm³。以1×10⁷個細胞/小鼠(10m)或3×10⁶個細胞/小鼠(3m)給予慢病毒轉導的t細胞。簡言之，對于nalm6腫瘤模型，6至10周齡nod/scidγ(nsg)小鼠在第0天通過尾靜脈注射1×10⁶個叩頭蟲綠(cbg)轉導的nalm6(nalm6-cbg)細胞。在腫瘤接種后第7天開始t細胞處理。對于pc3-pdl1實體瘤模型，6至10周齡nod/scidγ(nsg)小鼠在第0天在右脅中皮下注射1×10⁶個psca、pd-l1和cbg轉導的pc3(pc3-psca-pdl1-cbg)腫瘤細胞。小鼠在pc3-pdl1-cbg腫瘤接種之后第22天經(jīng)由尾靜脈使用t細胞進行處理，以便腫瘤的體積是大約200mm³。以2×10⁶個/小鼠(2m)給予t細胞。動物基于基線腫瘤大小被隨機化并分組。所有動物包括在實驗中，并且對實施的所有動物實驗完成不知情的腫瘤評價。

t細胞刺激、慢病毒轉導和crispr電穿孔程序。圖84顯示了用于刺激、慢病毒轉導和crispr電穿孔t細胞的程序。在第0天，從3個供體獲得t細胞(100×10⁶個細胞/供體)。在1:3的t細胞:珠比值下使用抗cd3/抗cd28珠刺激細胞。細胞的濃度被調(diào)節(jié)至0.5×10⁶個/ml以及100ml/燒瓶。在第1天，刺激的t細胞在2的感染復數(shù)(moi)下轉導有cd19car慢病毒。50ml(25×10⁶個細胞)的t細胞被保留為未修飾的t細胞(第9組)。在第3天，移除珠，細胞在opti-mem培養(yǎng)基中清洗兩次，并且來自每個供體的轉導的t細胞被分為兩組，cart/空白對照ep(10ml，50×10⁶個/ml)和cart/crispr(10ml，50×10⁶個/ml)。然后，細胞在500v/1ms以及120μg的cas9rna/400μl的t細胞下電穿孔有cas9rna(第一次ep)。在電穿孔后，第1、3、5和7組細胞然后通過在一半新培養(yǎng)基和一半舊培養(yǎng)基(culturedmedium)中培養(yǎng)t細胞而被分割。在第4天，細胞被清洗兩次并且以50×10⁶個/ml重懸在opti-mem中。20μgtrbc4和b2mgrna被電穿孔入400μl的t細胞。在電穿孔后，細胞以1×10⁶個細胞/ml在一半新培養(yǎng)基和一半舊培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第5和7天，細胞被分割和重懸在一半新培養(yǎng)基和一半舊培養(yǎng)基中。在第8天，經(jīng)由低密度柱從第2、4和6組移出cd3+細胞。cd3-t細胞以0.5-1×10⁶個細胞/ml重懸在一半新培養(yǎng)基和一半舊培養(yǎng)基中并且被培養(yǎng)以擴展細胞。在第11天，采集t細胞并且來自三個供體的25×10⁵個細胞被發(fā)送用于核型分析。剩余的細胞被等分并冷凍。

現(xiàn)在描述實驗的結果。

實施例1：使用crispr破壞t細胞上的tcr-cd3復合體。

研發(fā)靶向tcrα鏈的恒定區(qū)的十三種grna，靶向tcrβ鏈的恒定區(qū)的10種grna，和靶向β-2微珠蛋白基因的10種grna(圖1a-1c和圖9a-9d)并且在293t細胞中測試。原代人t細胞離體繁殖三天——使用抗cd3/抗cd28免疫磁珠三天。由于crispr的瞬時表達足以介導基因敲除，研發(fā)了“一打即跑”遞送策略以通過利用體外轉錄的編碼cas9的rna和grna的電轉移瞬時地表達crispr(圖2c)。

為了測量tcr表達，使用特異于cd3的mab，當tcr抗體表達時所述mab僅存在于細胞表面上。電轉移后六天，流式細胞分析揭示了靶向trbc的crispr在供體nd147中在13.7的水平下消除原代t細胞上的cd3表達(圖2d)。tcr敲除的效率與電轉移的mrna的量相關聯(lián)(圖2d)。雖然原代t細胞中rna的電轉移是良好耐受的，但觀察到與增加量的引入的rna相關聯(lián)的細胞生存力的輕微降低。zfn和talen介導的基因破壞已經(jīng)報道當細胞瞬時地暴露于輕度低溫時是更高效的。利用此crispr系統(tǒng)也觀察到相同的現(xiàn)象。

t細胞在電轉移后在32℃下培養(yǎng)1天。當在32℃對37℃下培養(yǎng)電穿孔的t細胞時，crispr-介導的cd3的破壞是高至2.5倍更好的。使用此方法，分別使用靶向trac和trbc的crispr，5.43％和16.7％的電穿孔的t-細胞丟失cd3的表達(圖2d，下組)。沒有觀察到cas9空白對照樣品中cd3陰性細胞水平的變化，并且沒有觀察到生存力的可察知的降低(通過錐蟲藍測量的)。

當grna被電轉移第二次和第三次時，以某些水平消除原代t細胞上的cd3表達的效率被極大的提高。

·靶向trac：在grna的三次電轉移后達到77％的水平下(圖4a)，

·靶向trac或trbc：在伴隨輕微降低的生存力的grna的第二次電轉移后，在分別達到64.5％或57.5％的水平下(圖4c)。

為了確認電穿孔的t細胞已經(jīng)在預期的grna靶位點(tcrα或β基因座)處被遺傳修飾，使用側接trac、trbc1或trbc2內(nèi)的靶位點的特異性寡核苷酸引物進行sanger測序。從靶位點開始的指示的pcr產(chǎn)物處的多個峰僅在crispr的電轉移后存在，并且破壞百分比與細胞表面cd3表達的損失相關聯(lián)(圖1c和3b)。這些原代t細胞中的實驗確認了設計為靶向trac或trbc的crispr導致αβtcr表達的永久性破壞，如通過sanger測序評價和通過cd3的流式細胞分析確認的。

實施例2：tcrαβ陰性t細胞的富集。

對于未來的臨床應用，可以利用用于分離tcr破壞的群的來源的快速和穩(wěn)健的方法。為了開始處理此問題，使用臨床上批準的順磁珠和耗減柱，通過陰性選擇富集tcr/cd3^neg群。利用單一耗減步驟，cd3^neg群增強至超過99％(圖3a)。cd3^neg群不能由未轉染的對照細胞富集。背靠背(back-to-back)耗減步驟導致了>99％富集，而沒有偏斜cd4或cd8t細胞子集(圖3c)。測序結果還顯示了耗減和插入在crispr修飾后被引至tcrα與β基因座(圖3d)。

實施例3：通過crispr生成hla-i類^negt細胞。

為了測試crispr敲除來自同種異體t細胞的hla-i類表達的能力，設計了靶向β-2微珠蛋白的grna。β-2微珠蛋白基因座可以在293t細胞中被crispr操縱(圖9a)。證據(jù)顯示β-2微珠蛋白的破壞廢除了t細胞表面hla-i類表達(圖9b)。

ifn-γ極大地提高——大約10倍——t細胞中β-2微珠蛋白的靶向效率(圖9c)。β-2微珠蛋白grna的多次電轉移給予了66％β-2微珠蛋白陰性群(圖11a)。

對于未來的同種異體移植臨床應用，將需要用于分離hla-i類無效群(nullpopulation)的來源的快速和穩(wěn)健的方法。為了開始處理此問題，細胞標記有pe-抗β-2微珠蛋白抗體，并且使用臨床上批準的順磁性抗pe微珠和耗減柱，通過陰性選擇富集hla-i類^neg群。利用單一耗減步驟，hla-i類^neg群增強至超過99％。hla-i類^neg群不能由未轉染的對照細胞富集。經(jīng)由流式細胞術的富集的hla-i類^negt細胞中hla-i類所有組成成分的分析驗證了從細胞表面消除hla-i類表達(圖9d)。

實施例4：可以通過不同方法繁殖cd3^negt細胞。

cd3^negt細胞在電轉移外源性1g4-tcrα與β鏈體外轉錄的mrna(每個5μg)后復原cd3表達。這些細胞通過如下被擴展：(1)單個快速擴展方案(rep)，然后測試活性和特異性。pbmc獲得自三種不同的供體：nd052105×10⁶個、nd40583×10⁶個、nd410136×10⁶個。細胞被照射，然后混合在一起，并且獲得總計324×10⁶個pbmc。2×10⁶個細胞電轉移有rna。cd3^negt被重懸在90ml的終體積中，并且添加r10培養(yǎng)基，總體積為300ml。細胞被分至2個t150ml燒瓶。okt被添加至30ng/ml的終濃度。在第2天，il-2被添加至50cu/ml。從第5天，每2天進行細胞計數(shù)和喂養(yǎng)，并且一旦t細胞似乎休眠——如通過減小的生長動力學和細胞大小二者測定的，它們被用于功能性測定或被冷藏。

在單個rep后，cd3^negt細胞被擴展以便數(shù)目增加500倍。這些細胞通過如下被擴展：(2)在1:3細胞：珠比值下使用涂覆有抗cd3/抗cd28的磁珠進行刺激。

在單個rep后，cd3^negt細胞被擴展以便數(shù)目增加500倍。這些細胞通過如下被擴展：(3)與1×10⁶/ml的濃度下的相等混合物中的照射的k562-cd19和k562/86/64/a2(2d11)共培養(yǎng)。

在單個rep后，cd3^negt細胞被擴展以便數(shù)目增加500倍。這些細胞通過如下被擴展：(4)與1×10⁶/ml的濃度下的相等混合物中的照射的k562-cd19和k562/86/64/a2(2d11)以及30ng/mlokt共培養(yǎng)。

在單個rep后，cd3^negt細胞被擴展以便數(shù)目增加500倍。這些細胞通過如下被擴展：(5)與1×10⁶/ml的濃度下的相等混合物中的照射的k562-cd19和k562/86/64/a2(2d11)以及1mg/mlny-eso肽共培養(yǎng)。

實施例5：通過tcr的電轉移重定向tcr^negt細胞。

為了測試tcr^negt細胞的功能，這些細胞通過tcr的電轉移被重定向。通過引入tcrα鏈和tcrβ鏈，這些細胞表達高水平的tcr。與cas9空白對照相比，vb13.1的表達在電轉移的tcr^negt細胞中高得多(圖7a)。當細胞與nalm-6ny-eso白血病細胞系——對hla-a2和ny-eso二者陽性——共培養(yǎng)時，細胞顯示出高水平的107a，其指示升高的脫粒活性(圖7b)。殺傷測定還顯示了對此細胞系的強有力的毒性(圖7c)。這指示這些細胞比使用表達car和tcr的t細胞的傳統(tǒng)的臨床試驗潛在地更安全，這是由于這些細胞將不引發(fā)gvhd并且與利用tcr處理的正常t細胞相比具有更小的錯配毒性。

一些報道已經(jīng)顯示t細胞可以通過zfn或talen被遺傳編輯以消除內(nèi)源性αβtcr的表達。選擇性地耗減表達非期望的αβtcr的t細胞的本文描述的方法和組合物還包括內(nèi)源性tcr的不完全敲除以治療gvhd和抑制內(nèi)源性tcr免于不利地影響car功能(例如，通過競爭轉錄因子)。因此，使用設計者zfn設計遺傳方法以永久地破壞t細胞中的α與β恒定區(qū)序列，從而消除tcr表達。

zfn和talen是通過將dna結合結構域融合至dna切割結構域(cleavagedomain)生成的人工限制酶。當zfn和talen不高效地工作時，通常難以確定原因。失敗可能反映關于設計、靶序列的可接近性的問題，或遞送問題。同時，zfn靶向效率在t細胞中通常低，使得它難以同時操縱多個基因。

與zfn和talen不同，crispr/cas系統(tǒng)近來已經(jīng)作為用于誘導靶向的遺傳改變的zfn和talen的潛在簡便和高效的替代方案出現(xiàn)。近來的工作已經(jīng)顯示通過cas9蛋白的靶標識別需要crrna內(nèi)的‘種子’序列和crrna-結合區(qū)上游的包含保守的二核苷酸的前間區(qū)序列鄰近基序(pam)序列。從而，可以通過重設計crrna，將crispr/cas系統(tǒng)重靶向以切割幾乎任何dna序列。本文公開的數(shù)據(jù)顯示了通過293t細胞和原代t細胞中的crispr/cas進行基因編輯的潛力。crispr/cas系統(tǒng)可以通過共表達單個cas9蛋白與兩種或更多種grna同時靶向多個基因組基因座，使得此系統(tǒng)獨特地適用于靶基因的多重基因編輯或協(xié)同活化。通過施用不同的grna連同cas9，多種基因可以在t細胞中被同時破壞。

實施例6：通過crispr的hlai類和tcrα、β鏈三敲除。

為了致力于用于惡性腫瘤和感染性疾病的“現(xiàn)成的(off-the-shelf)”同種異體t細胞療法，通過輸注t細胞的細胞療法被設計以針對病原體和惡性腫瘤重建免疫力。離體制造具有期望性質(zhì)和足夠數(shù)目的t細胞需要的時間量通常與患者的治療窗口不相容。此外，來自患有晚期疾病的患者的自體t細胞可能具有受損的功能并且對期望的抗原是耐受的。

為了處理此問題，患者可以輸注同種異體t細胞以避免通過識別輸注的細胞上不同的主要或次要組織相容性抗原的宿主t細胞引起的免疫-介導的排斥。為了擴大t細胞療法的應用，并且為了進一步的同種異體移植，可以生成用于分離tcr和hla-i類破壞的群的來源的快速和穩(wěn)健的方法。

zfn和talen包括設計為結合特異性dna序列——其融合至fokl核酸內(nèi)切酶的切割結構域——的鋅指dna-結合結構域。因為基因必須被單獨靶向，所以如果存在多于一種待操縱的基因，則zfn和talen的設計和構建非常復雜和耗時。利用在本文描述的crispr系統(tǒng)，可以獲得基因破壞的功效和縮短的時程。

為了處理此問題，cas9與靶向trac、trbc和β-2微珠蛋白的三種不同grna一起電轉移。細胞標記有pe-抗β-2微珠蛋白抗體并且使用臨床上批準的順磁性抗pe微珠和耗減柱，通過陰性選擇富集hla-i類^neg群。利用單一耗減步驟，hla-i類^neg群增強至超過99％(圖9d)。然后，細胞重引入有tcrα鏈，并且hla-i類^negcd3^neg群通過微珠被富集(圖11)。五天后，tcrβ鏈被重引入細胞，并且hla-i類^negcd3^neg群通過微珠被再次富集。兩天后，tcr被電轉移入這些三敲除細胞。在電轉化后一天，細胞使用cd3/cd28免疫磁珠進行刺激。然后，細胞次日經(jīng)歷抗原特異性tcr的慢病毒遞送和培養(yǎng)物擴展。

實施例7：通過crispr的fas、pd1、ctla4、ppp2r2d敲除。

fas受體/fas配體(fas/fasl)凋亡信號傳導途徑已經(jīng)被廣泛地研究并且在t細胞中良好地表征。pd1和ctla4是也已經(jīng)被普遍研究的t細胞中的兩個主要的抑制性信號傳導途徑。靶向這些途徑的潛在治療影響的直接證據(jù)來自臨床前鼠腫瘤模型中的研究，其展現(xiàn)了抗體-介導的ctla-4、pd-1或pd-l1的阻斷后增強的抗腫瘤免疫力。已經(jīng)研發(fā)了用于人的類似抗體，并且早期臨床數(shù)據(jù)顯示了有希望的結果。ppp2r2d敲落還可以抑制t細胞凋亡和增強t細胞增殖，以及細胞因子產(chǎn)生。ppp2r2d具有作為靶標改進人t細胞功能的潛力。

為了處理此問題，cas9和靶向fas、pd1、ctla4、ppp2r2d的三種不同grna被電轉移入t細胞。sanger測序數(shù)據(jù)顯示fas、pd1、ctla4、ppp2r2d的指示的基因座已經(jīng)通過crispr被修飾。fas還使用通過crispr引發(fā)的同源重組被gfp替換。facs數(shù)據(jù)顯示fas和pd1的表面表達被廢除。

實施例8：使用基因修飾的原代細胞和t細胞生成ips細胞。

用于癌癥和感染性疾病的過繼t細胞療法的進展被缺乏可容易獲得的和抗原-特異性人t淋巴細胞所阻礙。多能干細胞可以提供t淋巴細胞的無限制的來源。為了處理此問題，在原代細胞和t細胞中破壞fas、pd1、ctla4、ppp2r2d的表達。

仙臺病毒被用于重編程原代細胞和t細胞。存在多種方法生成ipsc，包括病毒-介導的基因轉導和化學誘導。雖然慢病毒和逆轉錄病毒載體需要整合入宿主染色體以表達重編程基因，但是基于dna的載體——比如腺病毒、腺伴隨病毒和質(zhì)粒載體——游離地(episomally)存在并且不需要整合。然而，它們?nèi)钥梢砸阅承╊l率被整合入宿主染色體，并且重編程效率相對低。同樣，基于mrna的重編程復雜并且顯示是極度低效的。

與這些方法不同，仙臺病毒不整合入宿主基因組或改變宿主細胞的遺傳信息。仙臺病毒也具有比得上基于慢病毒和逆轉錄病毒的基因轉導的重編程潛力。

24孔板中的每個孔接種十萬個野生型、fas^neg、cd3^negtcrα鏈和tcrβ鏈敲除t細胞。細胞使用cd3/cd28珠進行刺激。在刺激之后第3天，移除珠，細胞重懸在1ml的預熱的t細胞完全培養(yǎng)基中，并且然后使用計算體積的cytotune仙臺病毒——其包括用于在細胞中表達hklf4、hoct3/4和hsox2的多順反子載體(lifetechnologies,carlsbad,ca)——進行培育。處理的t細胞被接種在24孔板中，并且在室溫下、在2250rpm下離心90分鐘。另外的1ml的完全t細胞培養(yǎng)基被添加至每個孔，并且平板在5％co2的潮濕氣氛中在37℃下培育過夜。

在轉導后次日，通過使用新鮮的完全培養(yǎng)基清洗t細胞和培養(yǎng)細胞2天來移除仙臺病毒。每天更換一半培養(yǎng)基。在感染后第3天，細胞被轉移至mef飼養(yǎng)平板(feederplate)并且在不含任何細胞因子的t細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。感染后四天，細胞在標準hes培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。每天更換培養(yǎng)基。在第7天前后觀察到es樣集落。細胞從第15天在條件性hes培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并且培養(yǎng)持續(xù)另外的10天。在轉導后25至30天前后挑取集落。

在第4天前后，在飼養(yǎng)細胞上形成細胞團(cellclump)，其指示重編程過程的起始。t細胞在重編程至ipsc的過程期間經(jīng)歷劇烈的形態(tài)變化。在第12天前后，開始出現(xiàn)具有松散邊緣的大的細胞團。在第18天前后，t細胞被轉化至具有良好限定邊緣的典型的es樣集落。觀察到典型的胚胎干細胞形態(tài)，其指示fas^neg、cd3^negtcrα鏈和tcrβ鏈敲除t細胞在限定的重編程條件下被誘導至多能狀態(tài)(圖17a和18a)。

fas^negt細胞以其野生型對應體的大約5倍的效率更易于重編程至ipsc(圖17b)。同樣，重編程cd3^negt細胞比野生型對應體大約高效5倍(圖18b)。p53缺陷細胞系已經(jīng)被報道由于凋亡途徑被阻礙而更易于重編程。fas敲除進一步誘導凋亡抗性。雖然損失tcr表達使得t細胞較不健康，但是指示凋亡在重編程的過程中發(fā)揮重要作用。

實施例9：使用sirna敲落t細胞中的tcr。

圖19是顯示野生型ny-eso-1tcr(wt)或具有第二二硫鍵和對β鏈去-n-糖基化(s/sd)的修飾的ny-eso-1tcr的ifn-γ產(chǎn)生的圖。rna被電穿孔入具有使用sirna敲落的內(nèi)源性t細胞受體(tcr)的t細胞。在使用hla-a2陽性細胞系——其使用ny-eso-1特異性肽p156-165進行脈沖處理——刺激t細胞18h后通過elisa檢測ifn-γ。

圖20，包括圖20a和20b，顯示了通過cas9rna和grna共電穿孔的tcrα敲落。電穿孔后六天，通過評價cd3分析細胞的tcr表達。

圖21顯示了sanger測序。結果顯示了cd3陰性富集的t細胞中的多個峰，其中cas9mrna和grna被電穿孔以敲落tcrα(trac-5)或tcrβ(trbc-7)。

圖22是圖組，其顯示了具有內(nèi)源性tcrβ(trb-7)敲落的cd3陰性t細胞在ny-eso-1tcrα與β(1g4ly95tcr)rna電穿孔后四小時重表達cd3。正常的t細胞(nd424珠)被用作對照，其顯示了幾乎100％cd3陽性與5.25％內(nèi)源性tcrvb13.1表達。

圖23，包括圖23a-23d，是圖組，其顯示敲落內(nèi)源性tcr增強電穿孔tcrrna的t細胞的轉基因表達和功能二者。圖23a顯示了電穿孔有tcrsirna(實線空心柱形圖)、對照sirna(虛線空心柱形圖)的t細胞和沒有任何sirna的t細胞(實心柱形圖)的tcr表達。圖23b顯示了具有tcrsirna、對照sirna或沒有sirna的電穿孔野生型ny-eso-1tcr(wt)或修飾的tcr(sd)rna的t細胞的轉基因(tcrvb13.1)表達。圖23c顯示了具有tcrsirna、對照sirna或沒有sirna的電穿孔野生型ny-eso-1tcr(wt)或修飾的tcr(sd)rna的t細胞的ny-eso-1四聚體染色。圖23d顯示了hla-a2/ny-eso-1陽性腫瘤系通過tcrsirna敲落的電穿孔野生型ny-eso-1tcrrna的t細胞的特異性裂解。

圖24是顯示在將t細胞注入小鼠模型后腫瘤細胞的熒光的圖。表達ny-eso-1和gfp二者的一千萬個nalm6-cbg-eso-gfp(叩頭蟲綠)腫瘤細胞被靜脈內(nèi)注射入nod/scid小鼠。在腫瘤接種后五天，如不同組中指示的注射轉導cbr(叩頭蟲綠)和電穿孔rna的t細胞，并且通過生物發(fā)光圖像(bli)監(jiān)測腫瘤生長。

圖25顯示了來自兩個組的小鼠在不同時間點的生物發(fā)光圖像，所述兩個組已經(jīng)通過cd19bbzcarrnat細胞或修飾的ny-eso-1tcrrna處理。

實施例10：使用crispr通過慢病毒轉導和t細胞上tcr-cd3復合體的破壞的組合生成的通用car19t細胞。

如圖26中顯示的，原代t細胞在第0天使用抗cd3/抗cd28珠進行刺激，并且然后轉導有慢病毒-car19。如通過流式細胞術檢測的，超過70％的細胞是car19陽性的。由于crispr的瞬時表達足以介導基因敲除，研發(fā)了“一打即跑”遞送策略以在第3天通過利用體外轉錄的編碼cas9的rna和靶向tcrα鏈、tcrβ鏈和β-2微球蛋白基因的恒定區(qū)的grna的電轉移瞬時地表達crispr(圖2c)。t細胞在電轉移后在32℃下培養(yǎng)24小時，然后返回正常條件。

為了測量tcr表達，使用特異于cd3的單克隆抗體。因為當表達tcr時僅在細胞表面上存在cd3，所以cd3被選擇。crispr構建體被電穿孔入原代t細胞(圖26)。tcr單陰性和tcr/hla-a雙陰性細胞通過暴露于cd19呈遞k562細胞被擴展，其導致>100倍的擴展(圖27)。

在擴展后，細胞保持tcr單陰性或tcr/hla-a雙陰性，并且car19陽性群被富集。在k562-cd19刺激的擴展后，內(nèi)源性tcr表達在tcr單陰性細胞中保持陰性，同時tcr和hla-a表達在tcr/hla-a雙陰性t細胞中保持陰性(圖28a)。car19陽性細胞通過k562-cd19刺激的擴展被富集(圖28b)。

大多數(shù)擴展的通用t細胞是cd45ro陽性的(圖29a)并且保留高水平的cd62l表達(圖29b)，中等水平的cd28表達(圖29a)和低水平的ccr7表達(圖29b)。

crispr基因編輯不影響通用car19t細胞的體外抗腫瘤活性(圖30a)。tcr或tcr/hla-a的耗減對car19表達和抗腫瘤活性具有最低影響(圖30b和30c)。當使用nalm6腫瘤細胞攻擊時，tcr單陰性和tcr/hla-a雙陰性car19t顯示出強健的裂解能力(圖30b)。cd107a釋放和細胞因子分泌還顯示了通用細胞中有效的抗腫瘤活性(圖30c)。在使用表達cd19的細胞攻擊后，tcr單消融或tcr與hla-a雙消融car19t細胞展示出類似的增殖動力學(圖30d)。

為了測試crispr/cas9編輯的car19t細胞的抗腫瘤活性，tcr單陰性、tcr與hla-a雙陰性car19t被輸注入荷載nalm6腫瘤細胞的nsg小鼠。所有接受未操縱的t細胞的小鼠和輸注有轉導慢病毒gfp的野生型t細胞的小鼠在腫瘤細胞輸注后3周內(nèi)死亡。對于接受car19t細胞的小鼠，觀察到目標腫瘤消退(圖6)。發(fā)現(xiàn)crispr/cas9不影響car19t細胞的體內(nèi)腫瘤殺傷活性，因而，確認了組合慢病毒基因轉移與crispr/cas9用于t細胞治療的優(yōu)勢。

當使用hla不匹配的腫瘤細胞系攻擊細胞時，t細胞上tcrα與β鏈和hla-a分子的完全消融完全地廢除非特異性殺傷(圖32a)。在長時期的共培養(yǎng)(5天)后，消除hla-a分子活化的nk細胞。當這些細胞在ifnrelispot測定中被同種異體全血pbmc攻擊24小時時沒有觀察到脫靶活性。缺少脫靶活性表明t細胞可以在遭遇同種異體細胞后在急性免疫應答中發(fā)揮主要作用。所有結果表明crispr/cas9編輯的tcrα與β鏈和hla-a分子(三陰性)t細胞可以充當通用效應供體細胞的來源。

cas9和靶向fas的不同grna被電轉移入t細胞。fasneg細胞被分選并且然后轉導有慢病毒car19。流式細胞術和sanger測序數(shù)據(jù)顯示fas已經(jīng)被crispr修飾(圖33)。fasnegt細胞的car19基因表達比得上野生型。甚至在使用nalm6腫瘤細胞培育短時期后，與野生型對應體細胞相比，cd107a表達甚至在4小時的共培養(yǎng)內(nèi)在fasnegcar19t細胞中被極大地增強。

一些報道顯示甚至弱的抗原刺激可以引發(fā)fas活化以促進t細胞增殖(rethi，等，blood,vol.112(4):1195-1204,2008)。有趣地，當通過高水平的cd19+k562細胞刺激細胞時，fasnegcar19t細胞比野生型car19t細胞快得多地擴展。這表明fas/fasl在高水平抗原條件下引發(fā)凋亡而不是活化(圖34a)。fasnegcar19t細胞進一步顯示了降低的凋亡水平，如通過膜聯(lián)蛋白v染色測量的(圖34b)。

如在體外已經(jīng)觀察到的，fasnegt細胞顯示了與野生型t細胞相比增強的增殖。當在將細胞輸注入荷載nalm6的小鼠后進行car19t細胞的真實計數(shù)測定(truecountassay)時，觀察到類似的增殖結果。當與野生型組相比時，fasnegcar19組展現(xiàn)出更優(yōu)異的抗腫瘤活性(圖35b)。此差異圖解在圖35c的圖中，其顯示了那兩組之間的生物發(fā)光數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)指示cart細胞中的fas消融增強其抗腫瘤活性。

cas9和靶向pd1的不同grna在慢病毒轉導有psca-car后被電轉移入t細胞。通過cd3/cd28珠刺激后的表面pd1表達確認了pd1敲除細胞(圖36)。通過微珠耗減富集pd1陰性細胞，并且然后使用psca抗原呈遞pc3腫瘤細胞進行刺激。在野生型和pd1陰性組二者中都富集psca-car陽性細胞。在使用pc3-psca-pdl1腫瘤細胞培育后，pd1表達在野生型psca-cart細胞的表面上被快速地上調(diào)，而且在pd1陰性psca-cart細胞上檢測到非常低水平的pd1表達(圖37)。pd1陰性psca-cart細胞還顯示了極大增強的和持續(xù)的高水平的cd137表達(圖37)——t細胞活化的標記物，其指示pd1/pdl1抑制性信號傳導途徑被阻斷。

當在體內(nèi)pc3-psca-pdl1nsg模型中測試時，與野生型組相比，在pd1陰性psca-cart細胞組中檢測到顯著增強的抗腫瘤活性(圖38a和38b)，這表明pd1消融用于cart細胞療法的治療價值。

為了測試crispr工程化通用cart細胞的移植物抗宿主疾病(gvhd)影響，高的t細胞劑量被給予至患有nalm6白血病的nsg小鼠。小鼠使用雙敲除或三敲除cart細胞進行處理，并且不顯示發(fā)展gvhd的任何征兆。相比之下，來自野生型cd19cart組的4只小鼠中的3只到第65天發(fā)展出gvhd，其通過不同器官的組織學檢查確認(圖39)。

在另一個實驗中，細胞重懸在fbs中并且在亞致死照射后靜脈內(nèi)地輸注入小鼠。臨床gvhd每周監(jiān)測2至3次。在60天研究期間，接受野生型t細胞的5只小鼠中的四只死亡，而pbs處理組、tcr單消融和tcr/hla-i雙消融的t細胞處理組不顯示gvhd的任何征兆。接受野生型t細胞的小鼠經(jīng)歷重量減輕。然而，pbs處理組、tcr單消融或tcr/hla-i雙消融的t細胞處理組在研究期間輕微地增加重量(圖40a和40b)。

在慢病毒cd19-car轉導后，使用cas9和靶向cd3、b2m和pd1或fas的grna處理t細胞。三敲除通用cart細胞被注入荷載nalm6-pdl1腫瘤的小鼠。與cd3/hla-i雙敲除細胞相比，在接受pd1/cd3/hla-i三敲除細胞的小鼠中觀察到更優(yōu)異的抗腫瘤活性，這進一步指示了阻斷pd1信號傳導途徑的治療價值(圖41a和41b)。這些數(shù)據(jù)提供了使用crispr/cas9增強通用cart細胞的治療的方法。

由于grna易于降解，研發(fā)簡化的一步法以生成通用cart細胞。grna連同car在單個慢病毒載體中組成型地表達。在使用cd3/cd28免疫磁珠進行刺激后一天，通過編碼grna和car的慢病毒轉導幼稚t細胞。細胞在第3天電穿孔有cas9mrna(圖42)。此系統(tǒng)允許使用一個載體操縱多個基因(圖42)。在第6天通過流式細胞術確認cd3表達。使用一步系統(tǒng)處理的t細胞在不同的cas9mrna組中的每個中顯示了高達90％的一致的基因消融(圖43)。

用于癌癥和感染性疾病的過繼t細胞療法的進展已經(jīng)被缺乏可容易獲得的抗原-特異性人t淋巴細胞所阻礙。多能干細胞可以提供t淋巴細胞的無限制的來源。為了處理此問題，在原代細胞和t細胞中破壞fas、pd1、ctla4和ppp2r2d的表達。

仙臺病毒被用于重編程原代細胞和t細胞。存在可用于生成ipsc的多種方法，包括病毒-介導的基因轉導和化學誘導。雖然慢病毒和逆轉錄病毒載體需要整合入宿主染色體以表達重編程基因，但是基于dna的載體——比如腺病毒、腺伴隨病毒和質(zhì)粒載體——游離地存在并且不需要整合，然而，它們?nèi)钥梢砸阅承╊l率被整合入宿主染色體，并且重編程效率相對低。同樣，基于mrna的重編程復雜并且已經(jīng)證明是極度低效的。

相比之下，仙臺病毒不整合入宿主基因組或改變宿主細胞的遺傳信息。仙臺病毒也具有比得上基于慢病毒和逆轉錄病毒的基因轉導的重編程潛力。

24孔板中的每個孔接種十萬個野生型、fasneg、cd3negtcrα與β鏈敲除t細胞。細胞使用cd3/cd28珠進行刺激。在刺激之后第3天，移除珠，細胞重懸在1ml的預熱的t細胞完全培養(yǎng)基中，并且然后使用計算體積的cytotune仙臺病毒——其包括用于在細胞中表達hklf4、hoct3/4和hsox2的多順反子載體(lifetechnologies,carlsbad,ca)——進行培育。處理的t細胞被接種在24孔板中，并且在室溫下、在2250rpm下離心90分鐘。另外的1ml的完全t細胞培養(yǎng)基被添加至每個孔，并且平板在5％co2的潮濕氣氛中在37℃下培育過夜。

在轉導后次日，通過使用新鮮的完全培養(yǎng)基清洗t細胞和培養(yǎng)細胞2天來移除仙臺病毒。每天更換一半培養(yǎng)基。在感染后第3天，細胞被轉移至mef飼養(yǎng)平板并且在不含任何細胞因子的t細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。感染后四天，細胞在標準hes培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。每天更換培養(yǎng)基。在第7天前后觀察到es樣集落。細胞從第15天在條件性hes培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并且培養(yǎng)持續(xù)另外的10天。在轉導后25至30天前后挑取集落。

在第4天前后，在飼養(yǎng)細胞上形成細胞團，其指示重編程過程的起始。t細胞在至ipsc的重編程過程期間經(jīng)歷劇烈的形態(tài)變化(圖44a)。在第12天前后，開始出現(xiàn)具有松散邊緣的大的細胞團。在第18天前后，t細胞被轉化至具有良好限定邊緣的典型的es樣集落。fasnegt細胞以大約5倍的野生型對應體的效率被重編程至ipsc(圖44b)。p53缺陷細胞系已經(jīng)被報道為由于凋亡途徑的阻礙而更易于重編程。fas敲除可以使用相似的機制促進重編程過程。

觀察到由cd3negtcrα或β鏈敲除t細胞重編程的ipsc的es樣形態(tài)(圖45a)。該形態(tài)在數(shù)次傳代后保持恒定。cd3negt細胞的重編程比野生型對應體大約5倍低效(圖45b)，這表明tcr敲除可以在t細胞重編程的過程中發(fā)揮作用或在仙臺病毒感染后影響細胞生存力。圖45c是圖像組，其顯示了cd3negipsc細胞的磷酸酶染色。

觀察到了典型的胚胎干細胞形態(tài)，其指示fasneg、cd3negtcrα與β鏈敲除t細胞在限定的重編程條件下被誘導至多能狀態(tài)。雖然損失tcr表達使得t細胞較不健康，但是本文描述的數(shù)據(jù)表明凋亡在重編程的過程中發(fā)揮重要作用。

還在不同的t-ipsc細胞系中檢測到內(nèi)源多能干細胞基因的誘導(圖46)。tra-1-60和ssea4表達的免疫染色進一步指示了t-ipsc細胞的干細胞表型(圖47a)。通過sanger測序確認了t-ipsc中的fas敲除(圖47b)。

dcas9和foki-cas9被報道具有較小的脫靶活性。如果t細胞可以通過改進版本的crispr/dcas9和crispr/foki-cas9系統(tǒng)編輯，則對t細胞進行評估(圖48a)。流式細胞術數(shù)據(jù)顯示了原代t細胞通過crispr/dcas9和crispr/foki-cas9二者被編輯(圖48b)。crispr/dcas9基因敲除系統(tǒng)展示了使用至少一對grna的增強的特異性，其致使敲除事件更精確和更特異性。

為了測試t細胞中crispr/cas9的脫靶事件，在脫靶位點處進行surveyor測定。對于測試的基因，在基因組基因座處沒有觀察到明顯的切割(圖48c)。

實施例11：多重基因組編輯。

通過使用crispr/cas9系統(tǒng)同時地破壞多個基因組基因座來生成cart細胞。cart細胞缺乏內(nèi)源性tcr和hlai類(hla-i)分子的表達，以便用作同種異體通用cart細胞。通過共電穿孔編碼cas9的mrna與靶向這些基因的grna，以高效率破壞t細胞受體(tcr)α鏈、tcrβ鏈和β-2微球蛋白(b2m)基因。通過組合慢病毒(lv)遞送car與crisprrna電穿孔以同時地破壞內(nèi)源tcr和b2m基因來生成通用tcr或cart細胞。此外，內(nèi)源性pd1的破壞增強car療法在實體瘤模型中的功效。

grna的多重遞送以高效率破壞人原代t細胞中的基因而不損害效應物功能

生成缺乏tcr、hla和其它基因的通用t細胞需要高效的多重基因組編輯。crispr/grnarna電穿孔被優(yōu)化以在t細胞中實現(xiàn)高效的基因破壞。首先，以使用體外轉錄系統(tǒng)生成的rna共電穿孔cas9和grna(圖49，左)，并且研發(fā)了“一打即跑”遞送策略以通過電穿孔瞬時地遞送cas9mrna和grna至t細胞(圖49，右)。

使用單電穿孔的靶向tcrα恒定區(qū)(trac)或β恒定區(qū)(trbc)的初始實驗分別導致1％至3％cd3-陰性(cd3^neg)t細胞(圖50a，上圖)。為了測定瞬時暴露于輕度低溫是否導致更高效的基因破壞，在37℃或32℃下編輯細胞。當t細胞在cas9/grna共電穿孔后在32℃下培養(yǎng)24h時，crispr-介導的trac和trb的破壞增加上至4倍(圖50a，下圖)。用于最大破壞效率的cas9:grna的最佳分子比是1:1至2:1，并且基因破壞效率與電轉移的mrna的量相關聯(lián)(圖51a)。

與mrna相比，grna更易于快速降解，其潛在地限制靶向效率。因而，在初次cas9/grna電穿孔后測試grna的多次連續(xù)電穿孔。在蛋白質(zhì)水平下的破壞頻率中存在顯著增加，這是由于82.4％的細胞在第三次grna電穿孔后是cd3^neg(圖50b)。克隆測序顯示基因組靶向效率在第三次grna電穿孔后達到89.4％(圖51b)。在grna的第三次電穿孔后，surveyor測定確認了在trac和trbc的基因組基因座處分別81.7％和49.3％的切割率(圖52)。側接trac和trbc靶位點的sanger測序數(shù)據(jù)中的多個峰確認了基因組閱讀框在靶位點的下游移位(圖53a)。通過克隆測序確認了通過由crispr/cas9介導的nhej引起的插入或缺失(插入/缺失)的發(fā)生(圖53b)。tcr破壞的tcr/cd3^neg群通過單個步驟的cd3陰性選擇被富集至超過99％(99.70±0.20％)(圖54)。

為了研發(fā)擴展tcr/cd3^negt細胞的方法，tcr/cd3^negt細胞共電穿孔有hla-a2限制的1g4ny-eso-1tcr(α+β)rna以復原cd3表達(圖55，左圖)。在t細胞刺激/擴展方法之后，對下列進行比較：1)使用pbmc作為飼養(yǎng)細胞的快速t細胞擴展方案(rep)，2)抗cd3/cd28免疫磁珠(珠)，或3)表達cd28和4-1bb的配體的荷載okt3的基于k562的人工抗原-呈遞細胞(k562aapc)。tcr/cd3^negt細胞還電穿孔有cd19carrna(圖55，右圖)并且然后通過表達cd19(k562-cd19)的照射的k562aapc進行刺激。在單個刺激10天后，對于rep、珠、k562aapc和k562-cd19分別取得751.0±217.1、35.7±9.3、46.3±8.5和57.5±5.0的擴展倍數(shù)值(圖56)。

為了測試crispr/cas9基因編輯是否將影響t細胞的表型和功能，檢查通過不同方法擴展的tcr/cd3^negt細胞的表型，并且顯示所有擴展的細胞保持cd3陰性并且大部分保留高水平的cd27(79.8％至93.4％)，其與中央記憶細胞表型一致(圖57)。擴展的tcr/cd3^negt細胞第二次電穿孔有cd19carmrna以測試它們的抗腫瘤活性。tcr/cd3^negt細胞的表面car表達與對照組的表面car表達相等(圖58)。當tcr/cd3^negcd19cart細胞使用cd19⁺nalm6白血病細胞進行刺激時，cd19car⁺tcr/cd3^negt細胞的cd107a上調(diào)(圖59a)、細胞因子分泌(圖59c)和殺傷活性(圖59b)等同于野生型對照細胞的那些。cd19cartcr/cd3^negt細胞被輸注入荷載nalm6的nsg小鼠以測試它們的體內(nèi)抗腫瘤活性。腫瘤消退是明顯的，其功效等同于cart19野生型對應體細胞(圖59d和59e)。該結果指示內(nèi)源性tcr的crispr/cas9編輯沒有不利地影響原代t細胞用于過繼免疫療法的功能。

tcrα、β和b2m三重破壞的t細胞的降低的同種異體反應性。

需要破壞tcrα與β鏈二者以防止tcr-重定向的t細胞過繼免疫療法的tcr錯配相關毒性，并且b2m對hla-i復合體的裝配和表達是必不可少的。鑒于此，研發(fā)了tcrα與β鏈和b2m三重破壞以生成通用t細胞。首先，測試了通過破壞b2m消除t細胞上的hla-i表達的能力。t細胞電穿孔有靶向b2m的cas9/grnarna。這導致79.9％的b2m和hla-i雙-陰性群。hla-i^neg群可以通過陰性選擇被進一步富集(圖60)。

為了生成缺少tcrα、β鏈和b2m的三敲除t細胞，cas9mrna與靶向trac、trbc和b2m的三種不同grna被共電穿孔。結果，cd3和hla-i雙-陰性細胞群是65.4％(圖61)。在富集雙敲除和三敲除細胞后，tcrα與β鏈和b2m三敲除t細胞廢除hla不匹配的腫瘤細胞系的非特異性殺傷(圖62)。當這些細胞在ifnγelispot測定中被同種異體全血照射的pbmc攻擊時沒有觀察到應答(圖63，左組)。hla-i分子的消融還急劇地降低同種異體反應性，如通過共培養(yǎng)同種異體pbmc與照射的b2m-破壞的細胞確認的(圖63，右組)。上面的結果表明缺少tcrα與β鏈和b2m的三-陰性t細胞可以潛在地充當用于過繼免疫療法的通用t細胞的來源，其抵抗宿主免疫系統(tǒng)的排斥同時不會引起移植物抗宿主疾病。

tcr重定向的內(nèi)源性tcr-破壞的t細胞的提高的抗腫瘤活性。

在使用ny-eso-1tcr(1g4)重定向后，具有crispr/cas9-破壞的tcrα與β鏈的t細胞在細胞表面上顯示了升高的轉基因tcr表達。與野生型t細胞的46.8％相比，對于tcrα或β鏈單敲除或α/β雙敲除，轉基因tcr表達分別是67.6％、78.8％或94.3％。提高的轉基因tcr表達導致增強的t細胞功能，如通過增加的抗原-特異性cd107a表達(圖65a)和增強的細胞毒性(圖65b)證明的——尤其是對于α/β雙敲除t細胞。

在分開的實驗中，α/β雙敲除t細胞轉染有不同的ny-eso-1tcr(8f)。相對于1g4tcr，此8ftcr展示了在轉基因tcr表達(圖66；tcr/cd3^neg的60.1％對野生型t細胞(cas9空白對照t細胞)的44.7％(具有～5％內(nèi)源性tcrvβ8背景))和功能(圖67a中的cd107a表達，和圖67b中的細胞因子產(chǎn)生)二者中更高的顯著改進。這些結果突出了內(nèi)源性tcr對轉基因tcr表達和功能的差別影響。

通用cart細胞保留抗腫瘤功效并且不引起gvhd。

通過組合lv轉導cd19car與rna電穿孔cas9/grna生成通用cd19cart細胞(圖68)。細胞被擴展并且剩余的cd3^neg細胞具有高水平的cd19car表達(圖69)。大多數(shù)擴展的t細胞是cd45ro陽性的并且保留高水平的cd62l表達和中等水平的cd28表達，其與中央記憶細胞情形一致(圖70)。擴展的tcr/hla-i雙-陰性cd19cart顯示了穩(wěn)健的體外抗腫瘤活性，比如cd107a釋放(圖71)、細胞因子分泌(圖72)、裂解能力(圖73)和增殖(圖74)，其與野生型cd19cart細胞一樣有效。

t細胞被輸注入荷載播散性nalm6白血病的nsg小鼠。使用cart細胞——其具有破壞的內(nèi)源性tcr(lv-cd19cartcr^neg)或具有同時破壞的tcr和hla-i(lv-cd19cartcr/hla-i^neg)——處理的小鼠展示出與使用野生型cd19cart細胞(lv-cd19car)處理的小鼠類似的腫瘤消退(圖75a和75b)，這表明破壞單獨的tcr或連同b2m不影響cart細胞抗腫瘤活性。

為了測試工程化t細胞的gvhd影響，高的t細胞劑量(20×10⁶個/小鼠)被給予至患有nalm6白血病的nsg小鼠。如圖76中顯示的，使用cd19cart細胞——其具有單獨的tcr破壞(lv-cd19cartcr/cd3^neg)或同時破壞的tcr和b2m(lv-cd19cartcr/hla-i^neg)——處理的小鼠展示出與野生型cd19cart細胞(lv-cd19car)相比類似的腫瘤消退。使用雙敲除或三敲除cart細胞處理的小鼠不發(fā)展gvhd的任何征兆。相比之下，來自野生型cd19cart(lv-cd19car)組的4只小鼠中的3只在第65天發(fā)展出gvhd，其通過不同器官的組織學檢查確認。因而，破壞單獨的tcr或tcr連同hla-i不影響cart細胞的體內(nèi)抗腫瘤活性，同時消除同種異體反應性。

腺病毒crispr遞送入原代t細胞。

crispr/cas9系統(tǒng)正被快速地利用，用于模式生物和細胞系中的基因調(diào)控和基因編輯目的。病毒載體可以特別適應于擴大crispr的適用性至其它細胞類型，包括分裂細胞和休眠原代細胞。腺病毒，即編碼cas9和單個引導rna(grna)分子的第二代纖維-修飾的腺病毒，被用于將cas9核酸酶攜帶至pd1、fas和trac基因座(圖77)。腺病毒-介導的crispr轉導入腫瘤細胞(圖78)產(chǎn)生高至大約71％的靶向誘變的高比率(圖79a和79b)。腺病毒似乎構成用于將crispr引入人t細胞——不管它們的休眠情形——的有價值的平臺。此方法將幫助調(diào)查crispr基因調(diào)控和在眾多實驗情況中編輯的潛力。

電穿孔優(yōu)化。

在4mm小池和2mm小池中的cas9和grna電穿孔(ep)后評價cd3和b2m敲除效率和t細胞擴展。利用2mm小池的標準ep條件(360v/1ms，第一次ep–20μgcas9rna+10μggrna/100μlt細胞，第二次ep5μggrna/100μlt細胞)顯示了分別最高的cd3和b2m敲除百分數(shù)81.8％和88.6％，以及大約2.7倍的t細胞擴展(ep#1)，與之相比，對照ept細胞的大約18.8倍擴展(ep#12)。降低grna劑量(ep#2-5)劇烈地增加t細胞擴展，但是僅輕微地影響cd3和b2m敲除效率。參見圖80。利用4mm小池的標準ep條件導致劇烈降低的cd3和b2m敲除效率(ep#8)，這表明ep條件(電壓或/和脈沖長度)需要被進一步優(yōu)化以便用于4mm小池。

與2mm小池(ep#10-13)或4mm小池中的標準電穿孔(ep)條件相比較。觀察到高的cd3/b2m敲除效率(ep#1和5)，伴隨提高的t細胞擴展倍數(shù)。參見圖81。

為了進一步優(yōu)化ep條件以實現(xiàn)最大t細胞擴展倍數(shù)以及超過60％的cd3/b2m敲除效率，測試了不同的ep條件和rna量。結果顯示對于ep#4、對于ep#1(400v/2ms/120μgcas9rna)和對于ep#2(500v/1ms/20μggrna)，擴展倍數(shù)被提高，具有相對高的cd3/b2m敲除效率(cd3的63.5％和b2m的84.8％)。參見圖82。

進行另外的實驗優(yōu)化ep條件。結果顯示與測試的最有利的調(diào)節(jié)相比(圖82中的ep#1)，使用500v/1ms/120μgcas9rna(ep#1)和500v/1ms/20μggrna(ep#2)產(chǎn)生增加的cd3/b2m敲除效率和t細胞擴展(ep#3)。參見圖83。

大規(guī)模電穿孔和擴展。

進行實驗以測定大規(guī)模電穿孔是否可以產(chǎn)生高的敲除和擴展效率。在第0天，抗cd3/抗cd28珠被用于刺激從3個供體獲得的t細胞(100×10⁶個細胞/供體，濃縮至0.5×10⁶個/ml)。在第1天，刺激的t細胞被轉導有cd19car慢病毒。50ml(25×10⁶個細胞)的t細胞被保留為未修飾的t細胞(第9組)。在第3天，移除珠并且將來自每個供體的轉導的t細胞分為兩組，cart/空白對照ep(10ml，50×10⁶個/ml)和cart/crispr(10ml，50×10⁶個/ml)。細胞然后電穿孔有cas9rna(第一次ep)，并且第1、3、5和7組細胞被分割。在第4天，grna被電穿孔入t細胞，并且細胞以1×10⁶個細胞/ml被培養(yǎng)。在第5和7天，細胞被分割。在第8天，從第2、4和6組移除cd3+細胞。在第11天，采集t細胞并且來自三個供體的25×10⁵個細胞被發(fā)送用于核型分析。

表1：實驗組。

在電穿孔和培養(yǎng)程序后評價t細胞數(shù)目(圖85的上圖表)和擴展倍數(shù)(圖85的下圖表)。轉導有單獨的cd19car(單獨的td)或轉導有cd19car并且使用crispr編輯(td/ko)的t細胞的擴展倍數(shù)顯示在圖86的左圖中，并且t細胞在第10天的擴展倍數(shù)顯示在圖86的右圖中。通過優(yōu)化電穿孔條件和cas9/grna劑量，在10天后觀察到大約60-70％cd3/b2m敲落效率和大約30倍t細胞擴展(圖87顯示了第10天時的cd3/b2m/car表達)。

在cd3/cd28珠刺激和crisprrna電穿孔后八天，移出cd3陽性t細胞。圖88顯示了第8天時三個供體群中的cd3/b2m表達。在第11天，t細胞經(jīng)受facs染色以檢測cd3、b2m和car表達。未轉導的nd463(notd)被用作陰性對照。圖89顯示了cd19cartd(轉導的)/電穿孔crispr的、耗減cd3的t細胞；cd19cartd/電穿孔crispr的t細胞；和cd19cartdt細胞中的cd3和b2m表達。圖90顯示了cd19cartd/電穿孔crispr的、耗減cd3的t細胞；cd19cartd/電穿孔crispr的t細胞；和cd19cartdt細胞中的car表達。圖91顯示了在cd19cartd(轉導的)/電穿孔crispr的、耗減cd3的t細胞；cd19cartd/電穿孔crispr的t細胞；和cd19cartdt細胞中第11天的cd3/b2m/car表達。圖92概述了在不同的t細胞組中的cd3/b2m/car表達。

在第11天，不同的t細胞組——如圖93中指示的，被cd19陽性細胞系raji或nalm6刺激。k562被用作cd19陰性對照。在4h的共培養(yǎng)后，除陰性對照之外，在t細胞組的每個中均檢測到cd107a上調(diào)。

在第11天，t細胞的殺傷能力——如圖94中指示的——在共培養(yǎng)t細胞與cd19陽性靶細胞nalm6-cbg后使用發(fā)光細胞毒性淋巴細胞(ctl)測定進行測試。也在第11天，通過使用nalm6靶細胞刺激t細胞組來分析t細胞的細胞因子產(chǎn)生，參見圖95。

t細胞在包含100u/ml的il-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多至26天。圖96中顯示的結果指示對于來自三個供體的crispr編輯的t細胞，沒有觀察到異常的t細胞生長。

作為crispr/cas9系統(tǒng)的最吸引人的應用之一，多重基因組編輯對推進基于t細胞的過繼免疫療法持有極大希望。然而，dna轉染的低的靶向效率限制了多重基因組工程在原代t細胞中的使用。研發(fā)“一打即跑”遞送策略以經(jīng)由共電穿孔cas9mrna和grna將crispr引入t細胞。通過多至三輪的grna電穿孔與瞬時暴露于輕度低溫的組合，對于單基因破壞，常規(guī)地取得蛋白質(zhì)水平下>80％的靶向效率。更鼓舞地，trac、trbc和b2m的三重基因破壞產(chǎn)生大約65％的雙陰性cd3和hla-i，而不需要任何純化和選擇。結果還展現(xiàn)了基因破壞的t細胞富集至>99％純度是使用臨床上批準的順磁珠容易取得的，并且純化的t細胞在10天內(nèi)被擴展高至500倍。擴展的t細胞維持它們的基因破壞表型并且展示與中央記憶t細胞一致的特征。破壞的t細胞不引起gvhd，這表明它們可以被用作同種異體cart細胞。重要地是，基因-編輯的t細胞在體外和不同的腫瘤小鼠模型二者中都顯示了抗腫瘤活性，其與未編輯的t細胞相比一樣有效或更有效。因而，本文描述的生成合成細胞的過程可以容易地轉化為當前的符合gmp的制造程序。

本文描述的數(shù)據(jù)展現(xiàn)了crispr/cas9是原代人t細胞中強大的多重基因組編輯工具。先前的報道已經(jīng)顯示t細胞可以被zfn或talen遺傳編輯以消除內(nèi)源性tcrα與β鏈的表達，從而避免gvhd。由于在t細胞中通過鋅指核酸酶(zfn)和tal效應物核酸酶talen操縱多個基因的靶向策略的復雜性，先前的研究不能在臨床前動物模型中同時防止gvhd和宿主抗移植物反應。通過crispr/cas9消融刺激性nk配體或通過表達非典型的hlai類分子比如hla-e，nk細胞活化可以被中止，其可以潛在地防止通用t細胞免受nk細胞-介導的排斥。

總之，使用多重crispr技術可以高效地生成具有有效的抗腫瘤活性和降低的同種異體反應性的臨床規(guī)模的通用cart細胞?？紤]到成功轉化使用zfn的過繼轉移療法用于hiv/aids，此方法可以并入當前的符合gmp的制造程序并且具有高的轉化潛力。可能的是，通用car和tcrt細胞將提供自體t細胞的替代方案。事實上，可以想到的是，與使用自體t細胞抵抗癌癥和感染性疾病的當前的cart療法相比，具有無效的限制點分子的通用car和tcrt細胞可以是更有效的并且具有更廣的用途。

其它實施方式

本文對變量的任何定義中一系列要素的敘述包括將該變量定義為任何單個要素或列舉的要素的組合(或子組合)。本文對實施方式的敘述包括該實施方式作為任何單個實施方式或與任何其它實施方式或其部分組合。

本文引用的每個和每種專利、專利申請和出版物的公開內(nèi)容由此通過引用以其全部并入本文。雖然已經(jīng)參照具體的實施方式公開了本發(fā)明，但是明顯的是，本領域技術人員可以設計本發(fā)明的其它實施方式和變型而不背離本發(fā)明的真實精神和范圍。所附權利要求意欲解釋為包括所有這樣的實施方式和等價變型。

序列表

<110>賓夕法尼亞大學董事會

趙陽兵

j·任

x·劉

c·h·瓊

<120>改變cart細胞中的基因表達及其用途

<130>046483-7100wo1(01041)

<150>62/073,651

<151>2014-10-31

<160>13

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