本發(fā)明屬于免疫學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種擴(kuò)增γδt細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

γδt細(xì)胞是生物體內(nèi)執(zhí)行固有免疫功能的t細(xì)胞，其tcr(tcellreceptor)由γ和δ鏈組成。γδt細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)具有非hla限制性特點(diǎn)，其主要的效應(yīng)是溶解靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性和分泌不同種類(lèi)的細(xì)胞因子和趨化因子。此外，作為一種特殊的apc細(xì)胞，γδt細(xì)胞也可呈遞抗原給αβt細(xì)胞，γδt細(xì)胞其他重要的生物學(xué)效應(yīng)還有參與募集巨噬細(xì)胞、產(chǎn)生維持上皮組織完整性的生長(zhǎng)因子等。通過(guò)這些生物效應(yīng)，γδt細(xì)胞可產(chǎn)生抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)損傷等功能。vδ1、vδ2是γδt細(xì)胞的兩個(gè)主要亞群，vδ1γδt細(xì)胞主要分布于胸腺和黏膜上皮組織，在外周血中也有少量存在，是黏膜表面最豐富的群落。vδ1γδt細(xì)胞被認(rèn)為參與組成人體的第一道防線，在固有免疫抗感染中發(fā)揮重要作用。vδ2γδt細(xì)胞則是存在于外周血中的主要的γδt細(xì)胞，主要參與胞內(nèi)病原體感染，抵抗細(xì)胞癌變發(fā)生等。目前，γδt細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)方法有多種，有一些方法有效但復(fù)雜，增加了細(xì)胞培養(yǎng)感染的風(fēng)險(xiǎn)，有一些簡(jiǎn)便但擴(kuò)增的細(xì)胞數(shù)量少，亞型單一，周期較長(zhǎng)。培養(yǎng)中一些細(xì)胞分選儀器的使用以及胎牛血清等的使用也增加了臨床應(yīng)用安全性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，為了更好的將γδt細(xì)胞用于臨床治療應(yīng)用，如何在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)擴(kuò)增大量的γδt細(xì)胞，如何提高培養(yǎng)過(guò)程及使用藥品的安全性，以及如何有效的擴(kuò)增γδt細(xì)胞的多種亞群，提高γδt細(xì)胞免疫治療效果，具有重要的臨床應(yīng)用意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種短期內(nèi)高效誘導(dǎo)擴(kuò)增大量γδt細(xì)胞的培養(yǎng)方法，并且此方法安全性高，所獲γδt細(xì)胞亞型均衡，能為γδt細(xì)胞的臨床治療應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

本發(fā)明的γδt細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)方法，是在培養(yǎng)孔用tcr的pan-γ/δ單抗進(jìn)行包被后，將外周血單個(gè)核細(xì)胞加入培養(yǎng)孔中，使用添加il-2因子(重組人白細(xì)胞介素2)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)第5d起，在培養(yǎng)基中添加殼寡糖(cos)，并在培養(yǎng)第9d時(shí)，在培養(yǎng)基中添加唑來(lái)膦酸(zol)，繼續(xù)培養(yǎng)第15d時(shí)收獲細(xì)胞。

其中是使用的培養(yǎng)基為無(wú)血清的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基；

其中il-2因子在培養(yǎng)基中的添加濃度為200u/ml；

其中殼寡糖、唑來(lái)膦酸的添加濃度分別為0.1mg/ml、10μm；

所述的殼寡糖，是分子量為1000，脫乙酰度不小于80％的殼寡糖。

本發(fā)明的培養(yǎng)方法是通過(guò)tcrpan-γ/δ單抗并聯(lián)合因子il-2、cos、zol誘導(dǎo)人外周血來(lái)源的γδt細(xì)胞增殖，檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，數(shù)量含量等。誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單易行，周期短，安全高效。增殖后細(xì)胞活力好，數(shù)量高，能為γδt細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1：細(xì)胞總體生長(zhǎng)增殖曲線圖，

圖2：γδt細(xì)胞分泌tnf-a和ifn-r因子水平檢測(cè)圖，

圖3：tcrpan-γ/δ聯(lián)合il-2、cos、zol培養(yǎng)γδt細(xì)胞對(duì)其殺傷腫瘤細(xì)胞k562能力的影響圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明

本發(fā)明實(shí)施例中所用流式細(xì)胞單克隆熒光抗體購(gòu)自beckman公司，ldh細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天牌)，pbs(takara)，淋巴細(xì)胞分離液(tbd)，elisa檢測(cè)試劑盒(abcam)；無(wú)血清的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(takara,gt-t551h3)；但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選用其它來(lái)源的同樣功效的產(chǎn)品來(lái)替代實(shí)施例的具體產(chǎn)品。

實(shí)施例1:外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離和γδt細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3名正常志愿者的外周血標(biāo)本，

采集正常志愿者外周血15ml，加入一支50ml

離心管，肝素鈉抗凝；

將含血液的離心管離心沉降，700g，12min。分為三層:上層為血漿層，中層為單個(gè)核細(xì)胞層，下層為紅細(xì)胞層；

吸出上層血漿層，58℃，40min滅活，待用；

繼續(xù)收集中間白膜狀的單個(gè)核細(xì)胞層，加入pbs緩沖液調(diào)整體積為18ml，并平均分成2份，加入到預(yù)先加有5ml淋巴細(xì)胞分離液的15ml離心管中，離心700g，15min；

收集中間云霧層，用pbs緩沖液清洗2次，1200rpm離心7min，棄上清，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量；

1200rpm離心7min后，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×10⁶/ml，并添加il-2200u/ml，自體血漿5％；

單克隆抗體tcrpanγ/δ包被24孔板(1ug/ml)，每孔加入0.5ml，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h；

將細(xì)胞接種于包被的24孔板，1.0ml/孔，每個(gè)志愿者分別設(shè)立4個(gè)復(fù)孔，其中一個(gè)孔為對(duì)照組，其余3孔再添加殼寡糖0.1mg/ml。起始培養(yǎng)記第1天；

培養(yǎng)第5、7、9、11、13天時(shí)，依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)補(bǔ)加適量新鮮培養(yǎng)基，并加入il-2200u/ml和自體血漿5％，實(shí)驗(yàn)組再補(bǔ)加適量cos(0.1mg/ml)，并且在第9天時(shí)加入zol10μm；

接種細(xì)胞在37℃，5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)15天。

在倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞在第5-9天時(shí)增殖速度快，細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，增殖團(tuán)大，增殖旺盛，第10天后增殖變慢，細(xì)胞形態(tài)多圓形，透亮度好，第13天后形態(tài)多樣性開(kāi)始增多，在第15天時(shí)，收獲細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)量，細(xì)胞活率。第15天時(shí)，混勻細(xì)胞，每個(gè)樣品取20μl，becmancounter檢測(cè)其細(xì)胞濃度和活率。檢測(cè)結(jié)果表明，第1天時(shí)，細(xì)胞總數(shù)為2×10⁶，培養(yǎng)第15天時(shí)，細(xì)胞總數(shù)達(dá)到5.8×10⁷，明顯高于對(duì)照組。圖1為細(xì)胞總體生長(zhǎng)增殖曲線。

實(shí)施例2：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γδt細(xì)胞的含量和亞群

分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組第1、15天的細(xì)胞，每管細(xì)胞10⁶，300g離心3min，用pbs洗滌二次，棄去上清后用濾紙吸干管口液體；

用pbs重懸細(xì)胞，加入pe-conjugatedanti-cd3單克隆抗體和fitc-conjugatedanti-γδtcr單克隆抗體各5ul，充分混勻，4℃避光孵育30分鐘；

另取兩管15天的細(xì)胞，一管加入pe-conjugatedanti-cd3和fitc-conjugatedanti-tcrvδ2各5ul，另一管加入pe-conjugatedanti-cd3和fitc-conjugatedtcrvδ1各5ul，充分混勻，4℃避光孵育30分鐘；

用pbs洗滌，4℃，300g離心3min分鐘，洗滌后傾倒用濾紙吸干管口液體，加入400ulpbs重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)；

流式細(xì)胞儀檢測(cè)：應(yīng)用facsdiva軟件，每管至少獲取10000個(gè)細(xì)胞，以cd3和γδtcr雙陽(yáng)性作為γδt細(xì)胞的表型特征，計(jì)算γδt細(xì)胞占總細(xì)胞的比例；以cd3、tcrvδ1和cd3、tcrvδ2雙陽(yáng)性分別作為vδ1和vδ2細(xì)胞亞群的表型特征，計(jì)算γδt細(xì)胞兩種亞群的含量。

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明：培養(yǎng)第一天，分離得到的單個(gè)核細(xì)胞中，γδt細(xì)胞所占的比例為4.9％，培養(yǎng)第15天時(shí)，γδt細(xì)胞所占的比例已經(jīng)達(dá)到92％，γδt細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量擴(kuò)增達(dá)500倍以上。γδt細(xì)胞亞型檢測(cè)結(jié)果表明，γδt細(xì)胞的兩個(gè)亞型vδ1和vδ2均能被有效擴(kuò)增，vδ2亞群占有較大比例。表明，單克隆抗體tcrpanγ/δ聯(lián)合il-2、cos和zol能有效的誘導(dǎo)擴(kuò)增γδt細(xì)胞，并在短時(shí)間內(nèi)獲得大量γδt細(xì)胞，而且，γδt細(xì)胞的兩個(gè)亞群可以同時(shí)被有效均衡的擴(kuò)增。目前，利用tcrpanγ/δ或者利用ipp、zol等抗原擴(kuò)增γδt細(xì)胞的技術(shù)，一般能使γδt細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量增加200～300倍左右，而本發(fā)明方法的效果可達(dá)到同類(lèi)技術(shù)的2倍左右。

實(shí)施例3：γδt細(xì)胞分泌tnf-α和ifn-γ因子檢測(cè)

分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組第15天的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度2×10⁶，300g離心3min，取上清液待用；室溫下平衡所有elisa試劑，準(zhǔn)備倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照；取96孔板，依次吸取50μl樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入微孔中；依次吸取50μl抗體混合物加入微孔中，密封，室溫下，輕輕搖晃混勻，孵育1h；

將微孔液體倒出，甩干，加350μl洗滌液/孔，洗板3次，最后一次甩干，倒置板子，用紙吸干殘液；加100μltmb底物/孔，避光，搖晃混勻10min；加100μl終止液/孔，搖床混勻1min，酶標(biāo)儀od450nm處檢測(cè)讀數(shù)。

結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組，聯(lián)合zol和cos不僅能更加有效的誘導(dǎo)擴(kuò)增γδt細(xì)胞的增殖，還可以顯著提高tnf-α和ifn-γ因子的分泌，從而有助于提高培養(yǎng)γδt細(xì)胞對(duì)病原體的抵抗能力，促進(jìn)γδt細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，提高細(xì)胞毒性。圖2為γδt細(xì)胞分泌tnf-α和ifn-γ因子檢測(cè)結(jié)果。

實(shí)施例4：誘導(dǎo)擴(kuò)增γδt細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將k562細(xì)胞作為靶細(xì)胞接種至96孔板中，5×10⁴/孔；將第15天收獲的γδt細(xì)胞按不同的效靶比(5：1、10：1、20：1)直接加入k562細(xì)胞中，并設(shè)置對(duì)照，37℃培養(yǎng)箱中孵育4h；將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min，盡量吸除上清，加入150μl用pbs稀釋10倍的試劑盒提供的ldh釋放試劑，適當(dāng)搖晃培養(yǎng)板混勻，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中孵育1h；

將細(xì)胞培養(yǎng)板400g離心5min，分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定；各孔分別加入60μlldh檢測(cè)工作液；混勻，室溫避光孵育30min，然后在490nm處測(cè)定吸光度；測(cè)得的各組吸光度均應(yīng)減去背景空白對(duì)照孔吸光度。

細(xì)胞毒性(％)＝(處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性的吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)×100％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組，聯(lián)合zol和cos不僅能更加有效的誘導(dǎo)擴(kuò)增γδt細(xì)胞的增殖，還可以提高t細(xì)胞的殺傷活性，在效靶比為5：1，10：1，20：1時(shí)，對(duì)照組殺傷率分別為15.21％，25.67％，41.03％，而實(shí)驗(yàn)組殺傷率則提高為20.36％，36.38％和57.36％(圖3)，與對(duì)照組相比，anti-tcrpanγδ聯(lián)合il-2、zol、cos因子能有效提高γδt細(xì)胞的溶瘤活性，提高γδt細(xì)胞的臨床應(yīng)用意義。