本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增（loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP）技術(shù)進行菌樣快速檢測的試劑盒，具體涉及一種運動發(fā)酵單胞菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

近幾年隨著人口和工業(yè)的快速連續(xù)增長大大加速了能源消耗，導(dǎo)致全球面臨潛在的能源危機。同時伴隨著燃料價格的不斷提高和化石燃料的急劇縮減，這就促使了全球?qū)ふ铱商娲目稍偕茉础Ｆ渲猩锶剂媳徽J(rèn)為是傳統(tǒng)化石燃料最主要的替代品。生物乙醇是一種可再生能源，它的消費過程不僅解決了傳統(tǒng)燃料的環(huán)境污染問題，解決了農(nóng)林產(chǎn)品的下腳料給環(huán)境帶來的巨大污染，而且還大大降低了獲得礦物質(zhì)能源的成本。生物發(fā)酵法生產(chǎn)乙醇在一些國家和地區(qū)被廣泛使用，巴西每年以甘蔗作為原料，生產(chǎn)1100萬噸燃料乙醇；美國則每年大約生產(chǎn)550萬噸以上的燃料乙醇；目前我國生物乙醇年產(chǎn)量為300多萬噸，僅次于巴西、美國列世界第三。

運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis,Zm）為兼性厭氧的革蘭氏陰性細(xì)菌，主要通過 Entner-Doudoroff（ED）途徑代謝葡萄糖、果糖和蔗糖等，其獨特的代謝途徑和高效的乙醇發(fā)酵特性使得該菌株在食品、醫(yī)藥、化工和生物能源等領(lǐng)域存在巨大的應(yīng)用潛力，因而對運動發(fā)酵單胞菌的研究也在不斷深入。運動發(fā)酵單胞菌有快速高產(chǎn)的將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇、可以耐受高溫、乙醇濃度和糖濃度、非耦聯(lián)的生長和發(fā)酵即醇生產(chǎn)過程與生長不相關(guān)等特點，使其在產(chǎn)醇方面的應(yīng)用尤其得到重視。

目前針對運動發(fā)酵單胞菌有多種檢測方法。傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)方法一般需要10天以上，周期較長，并且需要使用實驗動物，成本較高；免疫學(xué)檢測（Immunoassay，IA）是一種根據(jù)抗原、抗體反應(yīng)的原理，利用已知的抗原檢測未知抗體或利用已知的抗體檢測未知抗原的技術(shù)，主要包括酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）、放射免疫（RIA）、反向間接血凝法（RPHA）和反向乳膠凝集實驗（RPLA）等，此類方法周期短，一次可檢測大量樣本，并且不需實驗動物，但其缺點是必須有高親和性的抗體；實時熒光定量PCR方法能夠用于病原菌的檢測，但對儀器設(shè)備和人員的專業(yè)技術(shù)水平要求較高，并且操作復(fù)雜，耗時較長，限制了該技術(shù)的推廣。

DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴增技術(shù)（LAMP）是一種新型的恒溫核酸擴增方法，此技術(shù)克服了以往基因擴增方法的不足，能夠在恒溫條件下進行核酸的擴增，具有簡單、快速、成本低和特異性強等優(yōu)點，適于現(xiàn)場檢測，有較好的應(yīng)用性。目前，還沒有專門針對運動發(fā)酵單胞菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法的相關(guān)記載。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種快速靈敏準(zhǔn)確的運動發(fā)酵單胞菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法。

本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的采用如下技術(shù)方案：運動發(fā)酵單胞菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，其特征在于包括：

（1）反應(yīng)液1：由10mmol/L脫氧核苷三磷酸、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液、150mmol/L硫酸鎂、5mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水組成；

（2）反應(yīng)液2：由10μmol/L外引物1、10μmol/L外引物2、40μmol/L內(nèi)引物1和40μmol/L內(nèi)引物2組成，引物序列如下：

外引物1：GTGCAAGATGCGTTGGAAAC，

外引物2：GGCGTTGATATCGTGATGGA，

內(nèi)引物1：GCGATGTTGATCGCACCGTTGT-CTTGTCATCTGCGGTCAGG，

內(nèi)引物2：AGCCGGAGCAGAAATCAGAACC-CGGGTATCTTCACCAACACC；

（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；

（4）顯色劑：質(zhì)量濃度為10%的SYBR Green I熒光染料；

上述環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒中反應(yīng)液1折合每樣品19μL，其組成為：10mmol/L脫氧核苷三磷酸4μL、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液2.5μL、150mmol/L硫酸鎂1μL、5mol/L甜菜堿5μL和滅菌雙蒸水6.5μL；反應(yīng)液2折合每樣品3μL，其組成為：10μmol/L外引物1 0.5μL、10μmol/L外引物2 0.5μL、40μmol/L內(nèi)引物1 1μL和40μmol/L內(nèi)引物2 1μL。

本發(fā)明所述的運動發(fā)酵單胞菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于具體步驟為：

步驟（1），提取待檢樣品的基因組DNA；

步驟（2），環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增反應(yīng)，取2μL待檢樣品DNA溶液，加入19μL反應(yīng)液1、3μL反應(yīng)液2和1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶，將配置好的反應(yīng)體系在65℃擴增反應(yīng)50-70min后取出待檢；

步驟（3），分析判斷反應(yīng)結(jié)果，在反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μL顯色劑，混勻，靜置2min，若反應(yīng)液顯現(xiàn)綠色即為陽性，橙色則為陰性。

本發(fā)明根據(jù)運動發(fā)酵單胞菌的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因gap設(shè)計了四條特異性引物，該基因序列為運動發(fā)酵單胞菌所共有，以保證檢測不同來源的運動發(fā)酵單胞菌的可靠性。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，針對運動發(fā)酵單胞菌建立了快速靈敏準(zhǔn)確的檢測方法，并構(gòu)建用于該方法的快速檢測試劑盒。使用本發(fā)明的快速檢測試劑盒和檢測方法，在反應(yīng)后可通過肉眼觀察鑒定，無需電泳等其它任何分析設(shè)備，具有檢測時間短、特異性強、儀器設(shè)備要求低和操作簡便等優(yōu)點，可用于運動發(fā)酵單胞菌的快速檢測。

附圖說明

圖1是不同菌株的陽性擴增結(jié)果對比圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明中試劑盒及檢測方法的建立和應(yīng)用作進一步說明，但并不以任何形式限制本發(fā)明的內(nèi)容。

實施例1

運動發(fā)酵單胞菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法的建立

步驟（1），引物的設(shè)計、合成試劑盒的組裝

本實施例確定用于檢測的引物序列如下：

外引物1：GTGCAAGATGCGTTGGAAAC，

外引物2：GGCGTTGATATCGTGATGGA，

內(nèi)引物1：GCGATGTTGATCGCACCGTTGT-CTTGTCATCTGCGGTCAGG，

內(nèi)引物2：AGCCGGAGCAGAAATCAGAACC-CGGGTATCTTCACCAACACC；

在此基礎(chǔ)上設(shè)計用于運動發(fā)酵單胞菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，該試劑盒包括以下試劑：

（1）反應(yīng)液1：由10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液、150mmol/L硫酸鎂（MgSO₄）、5 mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水（ddH₂O）組成；

（2）反應(yīng)液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L內(nèi)引物1（FIP）和40μmol/L內(nèi)引物2（BIP）組成；

（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；

（4）顯色劑：質(zhì)量濃度為10%的SYBR Green I熒光染料；

上述環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒中反應(yīng)液1折合每樣品19μL，其組成為：10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液2.5μL、150mmol/L硫酸鎂（MgSO₄）1μL、5mol/L甜菜堿5μL和滅菌雙蒸水（ddH₂O）6.5μL；反應(yīng)液2折合每樣品3μL，其組成為：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L內(nèi)引物1（FIP）1μL和40μmol/L內(nèi)引物2（BIP）1μL。

步驟（2），待檢樣品的制備

采用試劑盒提取法制備待檢樣品基因組DNA

檢測菌種運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis，Zm）來源于河南師范大學(xué)應(yīng)用微生物實驗室保藏的菌種。使用北京天根生物工程公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取樣品基因組DNA。

步驟（3），進行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增反應(yīng)

（1）取2μL待檢樣品DNA溶液，加入19μL反應(yīng)液1、3μL反應(yīng)液2和1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶；

（2）將配制好的反應(yīng)體系在65℃擴增反應(yīng)50min后取出待檢。

步驟（4），分析判斷反應(yīng)結(jié)果

在反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μL顯色劑，混勻，靜置2min，肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，說明待檢菌株為運動發(fā)酵單胞菌。

實施例2

陰性對照

步驟（1），引物的設(shè)計、合成試劑盒的組裝

本實施例確定用于檢測的引物序列同實施例1。

在此基礎(chǔ)上設(shè)計用于運動發(fā)酵單胞菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒，該試劑盒包括以下試劑：

（1）反應(yīng)液1：由10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液、150mmol/L硫酸鎂（MgSO₄）、5mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水（ddH₂O）組成；

（2）反應(yīng)液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L內(nèi)引物1（FIP）和40μmol/L內(nèi)引物2（BIP）組成；

（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；

（4）顯色劑：質(zhì)量濃度為10%的SYBR Green I熒光染料；

上述環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒中反應(yīng)液1折合每樣品19μL，其組成為：10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液2.5μL、150mmol/L硫酸鎂（MgSO₄）1μL、5mol/L甜菜堿5μL和滅菌雙蒸水（ddH₂O）6.5μL；反應(yīng)液2折合每樣品3μL，其組成為：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L內(nèi)引物1（FIP）1μL和40μmol/L內(nèi)引物2（BIP）1μL。

步驟（2），待檢樣品的制備

采用試劑盒提取法制備待檢樣品基因組DNA

使用北京天根生物工程公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取銅綠假單胞菌、綠色魏斯氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和腸炎沙門氏菌等7種細(xì)菌的基因組DNA。

步驟（3），進行環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增反應(yīng)

（1）取2μL待檢樣品DNA溶液，加入19μL反應(yīng)液1、3μL反應(yīng)液2、1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶；

（2）將配制好的反應(yīng)體系在65℃擴增反應(yīng)50min后取出待檢。

步驟（4），分析判斷反應(yīng)結(jié)果

在反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μL顯色劑，混勻，靜置2min，肉眼觀察顏色變化，若反應(yīng)液顯現(xiàn)綠色即為陽性，橙色則為陰性。

如圖1所示，編號為1-8的反應(yīng)管分別對應(yīng)銅綠假單胞菌、運動發(fā)酵單胞菌、綠色魏斯氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和腸炎沙門氏菌。

所述的實施例1與實施例2中各陰性對照組比較，實施例1中產(chǎn)生陽性擴增結(jié)果，如圖1中2號反應(yīng)管，而不攜帶gap基因的實施例2陰性對照菌株沒有產(chǎn)生陽性擴增結(jié)果，如圖1中1號、3-8號反應(yīng)管，從而證明本試劑盒及檢測方法具有較強的特異性，對不攜帶gap基因的其它菌株不會產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理，主要特征和優(yōu)點，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南師范大學(xué)

<120> 運動發(fā)酵單胞菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴增快速檢測試劑盒及檢測方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgcaagatg cgttggaaac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcgttgata tcgtgatgga 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgatgttga tcgcaccgtt gtcttgtcat ctgcggtcagg 41

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agccggagca gaaatcagaa cccgggtatc ttcaccaacacc 42