本申請涉及轉(zhuǎn)基因玉米檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5定量檢測方法和試劑。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物自1996年商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積迅猛發(fā)展。截止2013年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)到約1.75億公頃，比2012年增長3％。按照種植面積統(tǒng)計，全球約81％的大豆、35％的玉米、30％的油菜和81％的棉花都是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。轉(zhuǎn)基因作物種植面積排在前6位的國家是美國、巴西、阿根廷、加拿大、印度和中國。伴隨轉(zhuǎn)基因作物高速發(fā)展的同時，轉(zhuǎn)基因作物的食品安全問題也一直是多年來討論的熱點，并直接影響到國際貿(mào)易和公眾對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的接受程度。目前關(guān)注的焦點已從“是否是轉(zhuǎn)基因”轉(zhuǎn)移到“含有哪些轉(zhuǎn)基因成分及各自的含量”，為滿足公眾知情權(quán)、管理水平和檢測技術(shù)能力的需求，許多國家紛紛出臺了轉(zhuǎn)基因限量規(guī)定，如歐盟規(guī)定轉(zhuǎn)基因作物的成分超過0.9％，必須進(jìn)行標(biāo)識；而日本的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為5％。我國目前的標(biāo)準(zhǔn)最為嚴(yán)格，對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實行“零容忍”，只要在產(chǎn)品中檢出轉(zhuǎn)基因成分就需要進(jìn)行標(biāo)識。考慮到轉(zhuǎn)基因低水平混雜等客觀實際，目前這一“零容忍”政策在技術(shù)執(zhí)法角度來講過于苛刻，因此，從我國各口岸轉(zhuǎn)基因檢測水平的實際出發(fā)，為國家政策部門提出合理的轉(zhuǎn)基因閾值迫在眉睫；首當(dāng)其沖的便是開發(fā)轉(zhuǎn)基因成分的精準(zhǔn)定量檢測方法。轉(zhuǎn)基因玉米VCO-01981-5是最新的耐草甘膦除草劑新品系，由總部設(shè)在巴黎的公司GenectiveS.A..(GroupLIMAGRAIN與GroupKWS的合資企業(yè))開發(fā)，并于2013和2014年分別在美國和加拿大獲準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)和利用。該品系未獲我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，國際、國內(nèi)也無相應(yīng)的品系特異性定性或定量檢測方法。因此，亟需研究一種有效的轉(zhuǎn)基因玉米VCO-01981-5檢測方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本申請的目的是提供一種轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5檢測方法和試劑。為了實現(xiàn)上述目的，本申請采用了以下技術(shù)方案：本申請公開了一種轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的檢測方法，包括在PCR反應(yīng)體系中加入礦物油，混勻后，將其轉(zhuǎn)移到微滴發(fā)生器上，自動產(chǎn)生微滴，然后將微滴全部轉(zhuǎn)移到反應(yīng)管中進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)結(jié)束后，讀取每個微滴的擴(kuò)增信號，并采用QuantaSoftV1.3.2軟件計算待測樣品的靶標(biāo)DNA分子數(shù)；PCR反應(yīng)體系為雙重實時熒光PCR擴(kuò)增體系，包括PCR反應(yīng)液、品系VCO-01981-5特異引物組、品系VCO-01981-5特異探針、HMG基因特異引物組、HMG基因特異探針和待測樣品的DNA；品系VCO-01981-5特異引物組的正向引物為SeqIDNo.1所示序列，品系VCO-01981-5特異引物組的反向引物為SeqIDNo.2所示序列，品系VCO-01981-5特異探針為SeqIDNo.3所示序列，HMG基因特異引物組的正向引物為SeqIDNo.4所示序列，HMG基因特異引物組的反向引物為SeqIDNo.5所示序列，HMG基因特異探針為SeqIDNo.6所示序列；SeqIDNo.1：5’-aaggccttcagtctactcctcggg-3’SeqIDNo.2：5’-ctagcggccgctactcgagggattt-3’SeqIDNo.3：5’-cgtcaccaagaagatcagtactcaaacac-3’SeqIDNo.4：5’-TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3’SeqIDNo.5：5’-GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3’SeqIDNo.6：5’-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-3’其中，SeqIDNo.3所示序列的品系VCO-01981-5特異探針中，5’末端具有FAM熒光基團(tuán)，3’末端具有BHQ-1淬滅基團(tuán)；SeqIDNo.6所示序列的HMG基因特異探針中，5’末端具有HEX熒光基團(tuán)，3’末端具有BHQ-1淬滅基團(tuán)。需要說明的是，本申請的轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的定量檢測方法，實際上就是微滴式數(shù)字PCR。其原理是，在一個PCR反應(yīng)管中油水反應(yīng)體系被微滴發(fā)生器制備成近20000個油包水小微滴，當(dāng)待測DNA模板分子數(shù)低于一定的數(shù)目，微滴只含有一個分子的DNA模板和足夠量的用于熒光PCR反應(yīng)所需的所有其它組分如dNTP、TaqDNA聚合酶以及探針和引物等。待所有微滴實時熒光PCR反應(yīng)結(jié)束后，逐一檢查每個微滴，只要微滴有熒光信號檢出，就被認(rèn)為有實時熒光PCR反應(yīng)發(fā)生，記有一個分子的待測模板被檢出，統(tǒng)計所有陽性微滴數(shù)，就可得出樣品中待測DNA模板的分子數(shù)。本申請采用雙通道法，即分別對玉米品系VCO-01981-5特異性探針，以及玉米內(nèi)源基因特異性探針，采用不同的熒光標(biāo)記，在同一個PCR反應(yīng)體系中同時測定內(nèi)源基因和品系特異序列的分子數(shù)。其中，本申請檢測的內(nèi)源基因HMG在玉米基因組中僅一個拷貝，并且玉米品系VCO-01981-5特異性序列也僅有一個拷貝；因此，通過計算樣品中品系特異性序列和HMG序列分子數(shù)的比值就可計算得出轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的絕對含量。因此，本申請的檢測方法中，還包括，采用QuantaSoftV1.3.2軟件分別計算出轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的分子數(shù)和HMG基因分子數(shù)后，根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5分子數(shù)和HMG基因分子數(shù)的比值，計算轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的絕對含量。本申請的另一面公開了一種轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5定量檢測的試劑，該試劑包括第一引物探針組合和第二引物探針組合，所述第一引物探針組合用于品系VCO-01981-5特異性檢測，所述第二引物探針組合用于HMG基因特異性檢測；第一引物探針組合中，正向引物為SeqIDNo.1所示序列，反向引物為SeqIDNo.2所示序列，探針為SeqIDNo.3所示序列，并且探針的5’末端具有FAM熒光基團(tuán)，3’末端具有BHQ-1淬滅基團(tuán)；第二引物探針組合中，正向引物為SeqIDNo.4所示序列，反向引物為SeqIDNo.5所示序列，探針為SeqIDNo.6所示序列，并且探針的5’末端具有HEX熒光基團(tuán)，3’末端具有BHQ-1淬滅基團(tuán)。需要說明的是，本申請的試劑，實際上就是轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的定量檢測方法中所采用的品系VCO-01981-5特異性檢測引物探針，和HMG基因特異性檢測引物和探針?？梢岳斫猓旧暾埖囊锖吞结樖轻槍ξ⒌问綌?shù)字PCR而設(shè)計的，當(dāng)然可以單獨制備成相應(yīng)的品系VCO-01981-5檢測試劑使用。本申請的另一面公開了本申請的試劑在制備轉(zhuǎn)基因玉米檢測試劑盒或檢測設(shè)備中的應(yīng)用。本申請的再一面公開了一種轉(zhuǎn)基因玉米檢測試劑盒，該試劑盒中含有本申請的試劑。優(yōu)選的，本申請的試劑盒采用本申請的定量檢測方法對轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5進(jìn)行定量檢測。由于采用以上技術(shù)方案，本申請的有益效果在于：本申請的轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的檢測方法，設(shè)計了配套使用的內(nèi)源基因HMG特異性引物探針和品系VCO-01981-5特異性引物探針，兩者配套使用，采用雙通道法，分別定量出兩者在玉米基因組中的分子數(shù)，最終計算出轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的絕對含量。本申請的定量檢測方法，不同于常規(guī)的實時熒光PCR的相對定量，能夠?qū)Υ龣z樣品中轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5成分進(jìn)行精準(zhǔn)定量，對轉(zhuǎn)基因成分的研究和我國口岸轉(zhuǎn)基因檢測具有重要意義。附圖說明圖1是本申請實施例中特異性檢測FAM通道的輸出結(jié)果圖；圖2是本申請實施例中特異性檢測HEX通道的輸出結(jié)果圖；圖3是本申請實施例中穩(wěn)定性試驗FAM通道的輸出結(jié)果圖；圖4是本申請實施例中穩(wěn)定性試驗HEX通道的輸出結(jié)果圖；圖5是本申請實施例中梯度稀釋檢測的HEX通道數(shù)據(jù)的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖6是本申請實施例中梯度稀釋檢測的FAM通道數(shù)據(jù)的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實施方式轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5，是近些年新研發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米品系，目前尚沒有相應(yīng)的定性或定量檢測方法。因此，本申請率先研究并提出了一種轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的檢測方法，本申請的檢測方法不僅可以定性檢測品系VCO-01981-5，而且可以對其進(jìn)行準(zhǔn)確的絕對定量。本申請的檢測方法與現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因玉米品系檢測中常規(guī)使用的一般PCR、實時熒光PCR、PCR-DHPLC等方法不同；一般PCR只能定性檢測，實時熒光PCR雖然可以通過對梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對定量；但是也無法做到絕對定量檢測。隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物越來越普遍，我國本著轉(zhuǎn)基因“零容忍”的政策，現(xiàn)有的相對定量的檢測方法已經(jīng)不能滿足我國口岸轉(zhuǎn)基因檢測的使用需求。因此，本申請利用先進(jìn)的數(shù)字PCR檢測技術(shù)，率先研究并提出了轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的定量檢測方法。并且，在本申請的定量檢測方法中，同時設(shè)計了內(nèi)源基因和品系基因兩套配套使用的引物探針，通過雙重數(shù)字PCR擴(kuò)增，用兩個熒光通道分別統(tǒng)計分析內(nèi)源基因HMG和品系VCO-01981-5特異性序列的分子數(shù)，根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5分子數(shù)和HMG基因分子數(shù)的比值，計算轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的絕對含量。下面通過具體實施例和附圖對本申請作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實施例和附圖僅對本申請進(jìn)行進(jìn)一步說明，不應(yīng)理解為對本申請的限制。實施例一、材料和方法1.供試材料本例分別采用了轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5、MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604和ES3272的DNA樣品進(jìn)行試驗。以上DNA樣品均由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心提供和保藏。2.引物和探針設(shè)計本例分別根據(jù)玉米內(nèi)源基因HMG，和轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5特異性序列設(shè)計了特異性檢測引物和探針，兩條探針分別進(jìn)行不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成與修飾。本例設(shè)計的引物和探針序列詳見表1。表1內(nèi)源基因和品系VCO-01981-5特異性引物和探針名稱序列(5’-3’)SeqIDNo.VCO-01981-5-Faaggccttcagtctactcctcggg1VCO-01981-5-Rctagcggccgctactcgagggattt2VCO-01981-5-Pcgtcaccaagaagatcagtactcaaacac3HMG-FTTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA4HMG-RGCTACATAGGGAGCCTTGTCCT5HMG-PCAATCCACACAAACGCACGCGTA6其中，VCO-01981-5-P探針5’末端進(jìn)行FAM熒光基團(tuán)，3’末端進(jìn)行BHQ-1淬滅基團(tuán)；HMG-P探針5’末端進(jìn)行HEX熒光基團(tuán)，3’末端進(jìn)行BHQ-1淬滅基團(tuán)。3.雙重數(shù)字PCR反應(yīng)體系和條件本例的PCR反應(yīng)體系總計20μL，包括：2×ddPCRSuperMix10μL、3.6μmol/L的玉米品系特異性探針VCO-01981-5-P1μL、6μmol/L的玉米品系正向引物VCO-01981-5-F1μL、6μmol/L的玉米品系反向引物VCO-01981-5-R1μL、3.6μmol/L的內(nèi)源基因探針HMG-P1μL、6μmol/L內(nèi)源基因正向引物HMG-F1μL、6μmol/L內(nèi)源基因反向引物HMG-R1μL、約15ng/μL的DNA模板2μL，補充ddH2O至20μL。配制好20μL的反應(yīng)液后，將其與70μL的礦物油混勻，轉(zhuǎn)移到微滴發(fā)生器上自動產(chǎn)生微滴；將產(chǎn)生的微滴仔細(xì)全部轉(zhuǎn)移到96孔反應(yīng)板PCR反應(yīng)管中；再將96孔反應(yīng)板在封膜儀上封膜，并置于普通PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min；然后進(jìn)入40個循環(huán)：95℃變性15s、55.7℃退火1min；循環(huán)結(jié)束后98℃10min使酶熱失活。擴(kuò)增結(jié)束。擴(kuò)增結(jié)束后，將96孔板置入微滴讀取儀中讀取信號，并使用QuantaSoftV1.3.2軟件分析實驗數(shù)據(jù)。具體的，打開微滴熒光檢測器應(yīng)用軟件，將PCR反應(yīng)結(jié)束后的96孔反應(yīng)板直接插入熒光檢測儀中，設(shè)備自動檢測每PCR反應(yīng)管中所有微滴的熒光情況，即PCR反應(yīng)情況，最后軟件根據(jù)珀松分布定律直接給出待測DNA序列分子數(shù)。本例具體的，根據(jù)FAM熒光通道可以得到轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的分子數(shù)，根據(jù)HEX熒光通道可以得到內(nèi)源基因HMG的分子數(shù)。根據(jù)品系VCO-01981-5分子數(shù)與內(nèi)源基因HMG分子數(shù)的比值可以計算出轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的絕對含量。4.質(zhì)量控制每批(次)定量檢測實驗需設(shè)置對照，對照的設(shè)置應(yīng)符合GB/T19495.2-2004中的規(guī)定。每PCR反應(yīng)管微滴數(shù)不少于12000個；加入玉米基因組的分子數(shù)不高于微滴數(shù)的5倍，每個玉米基因組DNA分子約2.5pg，因此，加入玉米基因組的量不高于12000×5×2.5＝150000pg，即150ng。非轉(zhuǎn)基因樣品核酸提取對照、PCR空白對照和陰性對照理論檢測結(jié)果應(yīng)為零。但考慮到數(shù)字PCR的超靈敏性，特別是非轉(zhuǎn)基因樣品核酸提取對照的檢查結(jié)果為零有時難以實現(xiàn)，因而允許有極少量陽性微滴數(shù)出現(xiàn)，但陽性微滴數(shù)應(yīng)低于1/4000，基于經(jīng)驗，12000個微滴不能多于三個陽性微滴，有效陽性檢測結(jié)果至少是對照陽性微滴數(shù)的三倍，即至少9個陽性微滴。二次提取DNA樣品的測試結(jié)果，其轉(zhuǎn)基因成分含量的相對相差應(yīng)小于或等于25％。其中，a為第一次提取DNA樣品的檢測結(jié)果；b為第二次提取DNA樣品的檢測結(jié)果；m為a和b的平均數(shù)。對同一批次提取的DNA樣品，其三次重復(fù)PCR測試結(jié)果的偏差應(yīng)小于或等于15％。以上質(zhì)控條件中有一項不符合者，試驗結(jié)果應(yīng)放棄，并應(yīng)從制備測試樣品開始重做實驗。5.特異性檢測本例以轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的DNA樣品為陽性樣品，以轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604和ES3272的DNA樣品為陰性樣品，并設(shè)置一個水空白對照，進(jìn)行特異性檢測。6.穩(wěn)定性試驗本例采用轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的DNA樣品，將其稀釋至20ng/μL的工作濃度，采用本例的雙重數(shù)字PCR反應(yīng)體系和條件，設(shè)置3個重復(fù)反應(yīng)，對其進(jìn)行檢測，并設(shè)置一個轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的DNA樣品作為陰性對照，設(shè)置一個水空白對照。本例的DNA樣品上樣量為50ng，其余與“3.雙重數(shù)字PCR反應(yīng)體系和條件”相同。7.檢測線性范圍試驗本例的線性范圍是指數(shù)字PCR檢測體系可以進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分絕對定量檢測的范圍。由于本例是基于數(shù)字PCR的絕對定量檢測，所以確定檢測方法的線性范圍對界定檢測方法的適用范圍具有重要意義。本例將轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5的DNA樣品進(jìn)行7個梯度稀釋，分別將其稀釋至25ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.04ng/μL、0.008ng/μL和0.0016ng/μL，以2μL上樣量，按照本例的“3.雙重數(shù)字PCR反應(yīng)體系和條件”進(jìn)行檢測，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)試驗，并設(shè)置一個品系MIR162的DNA樣品作為陰性對照，設(shè)置一個水空白對照。8.玉米VCO-01981-5數(shù)字PCR的定量檢測限和檢測限驗證在本例的檢測方法中，定量檢測限(LimitOfQuantitation,LOQ)和檢測限(LimitOfDetection,LOD)分別被定義為可以進(jìn)行穩(wěn)定定量檢測或者檢測的最低拷貝數(shù)。取“7.檢測線性范圍試驗”的檢測下限梯度稀釋DNA樣品進(jìn)行LOQ的驗證。具體的，將該DNA樣品進(jìn)行十個重復(fù)的數(shù)字PCR驗證，計算每個重復(fù)試驗的單位體積的內(nèi)源基因HMG和品系VCO-01981-5特異性序列的拷貝數(shù)，計算平均值和RSD值。同樣的，取“7.檢測線性范圍試驗”的檢測下限梯度稀釋DNA樣品進(jìn)行LOD的驗證。具體的，將該DNA樣品進(jìn)行10個重復(fù)的數(shù)字PCR驗證，計算每個重復(fù)試驗的單位體積的內(nèi)源基因HMG和品系VCO-01981-5特異性序列的拷貝數(shù)及其平均值。9.玉米VCO-01981-5數(shù)字PCR的精密度實驗精密度是指在重復(fù)性的條件下，用相同的方法，相同的測試項目，在同一實驗室，由同一人員在很短的時間間隔內(nèi)，使用相同的儀器設(shè)備得到的檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差。本例具體，采用外源基因LOQ臨界值和LOQ臨界值10倍濃度的DNA樣品進(jìn)行精密度驗證，每個樣品做6個重復(fù)，計算每個重復(fù)試驗的單位體積的內(nèi)源基因HMG和品系VCO-01981-5特異性序列的拷貝數(shù)，計算平均值和RSD值。10.玉米VCO-01981-5數(shù)字PCR的準(zhǔn)確度實驗準(zhǔn)確度的定義為檢測結(jié)果與該組公定值之間的相符程度。本例的實驗取LOQ值、LOQ5倍、LOQ值25倍的3組陽性DNA樣品進(jìn)行準(zhǔn)確度的驗證。對以上3組DNA樣品進(jìn)行三個重復(fù)的數(shù)字PCR實驗。計算品系VCO-01981-5特異性序列拷貝數(shù)與內(nèi)源基因HMG拷貝數(shù)的比值，將測定的比值與理論比值進(jìn)行比較，計算其偏差，分析檢測方法的準(zhǔn)確度。二、結(jié)果及分析1.特異性檢測結(jié)果特異性檢測結(jié)果如圖1和圖2所示，其中，圖1為FAM通道檢測到的熒光信號，即品系特異探針VCO-01981-5-P的擴(kuò)增信號；圖2為HEX通道檢測到的熒光信號，即內(nèi)源基因特異探針HMG-P的擴(kuò)增信號；圖1和圖2中，反應(yīng)孔A01-B02分別為轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、MON89034、Bt176、Bt11、MON88017、MON810、MON863、T25、MIR604和ES3272的檢測結(jié)果，反應(yīng)孔E02為VCO-01981-5的檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，本例的檢測方法中，F(xiàn)AM通道的11個轉(zhuǎn)基因玉米品系，僅品系VCO-01981-5有擴(kuò)增信號，其它10個轉(zhuǎn)基因玉米品系陰性樣品均沒有擴(kuò)增信號。而HEX通道中，11個轉(zhuǎn)基因玉米品系都有擴(kuò)增信號。以上結(jié)果說明品系VCO-01981-5引物和探針特異性結(jié)果良好。2.穩(wěn)定性試驗濃度20ng/μL的品系VCO-01981-5的DNA樣品，其3個重復(fù)反應(yīng)的穩(wěn)定性檢測熱點圖如圖3和圖4所示，實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)分析如表2所示。圖3是FAM通道的結(jié)果圖，圖4是通道HEX的結(jié)果圖，根據(jù)反應(yīng)所得熱點圖，圖3所示，數(shù)字PCR所獲得的陰性點與陽性點之間有明顯的熒光信號差距，拖尾現(xiàn)象不嚴(yán)重，可以通過設(shè)置統(tǒng)一的閾值限進(jìn)行陰性反應(yīng)點和陽性反應(yīng)點的區(qū)分。該步反應(yīng)最終結(jié)果如表2所示，內(nèi)源基因探針的三個重復(fù)反應(yīng)的實際檢測拷貝數(shù)分別為13160、13500和137200，平均檢測拷貝數(shù)為13460，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RelativeStandardDeviation,縮寫RSD)為2.09％，處于可接受的范圍內(nèi)；外源基因三個重復(fù)反應(yīng)的實際檢測拷貝數(shù)分別為4660、4480和4740，平均檢測拷貝數(shù)為4626，RSD為2.87％，處于可接受的范圍內(nèi)。因此，本例的內(nèi)源基因和外源基因的引物探針擴(kuò)增穩(wěn)定性良好，并且該陽性樣品穩(wěn)定可用。需要說明的是，RSD小于等于10％均屬于可接受范圍，而本例遠(yuǎn)小于該數(shù)值。表2品系VCO-01981-5穩(wěn)定性檢測結(jié)果表2中，檢測通道FAM為品系VCO-01981-5特異性探針的檢測結(jié)果，檢測通道HEX為內(nèi)源基因HMG特異性探針的檢測結(jié)果。3.檢測線性范圍試驗本例的7個梯度稀釋25ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.04ng/μL、0.008ng/μL和0.0016ng/μL，在上樣量為2μL的情況下，分別對應(yīng)19002、3800、760、152、30、6、1.2個拷貝的玉米基因組DNA。將以上梯度稀釋組的DNA模板進(jìn)行數(shù)字PCR檢測，每個濃度梯度組設(shè)置3個平行，實驗檢測結(jié)果如表3所示，線性范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5和圖6所示。圖5是DNA樣品用量與所測品系特異序列拷貝數(shù)之間的關(guān)系圖，發(fā)現(xiàn)在DNA樣品用量50ng-0.08ng范圍內(nèi)本例方法測定品系特異序列的拷貝數(shù)與DNA樣品用量呈高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.99以上，其擬合曲線方程為y＝4.673x-0.6313,表明本例方法品系特異序列的定量線性范圍在4.8-4666.6拷貝之間，跨越了三個數(shù)量級。圖6是DNA樣品用量與所測內(nèi)源基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系圖，發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因拷貝數(shù)在3.8-13646.6區(qū)間與DNA樣品用量呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.99以上，其擬合曲線方程為y＝13.669x-2.3115，表明本例方法內(nèi)源基因序列的定量線性范圍在3.8-13646.6拷貝之間，跨越了四個數(shù)量級。以上研究結(jié)果表明本例建立的數(shù)字PCR方法定量范圍廣，定量精度高，結(jié)果重復(fù)性好。表3品系VCO-01981-5數(shù)字PCR的線性范圍驗證結(jié)果4.玉米VCO-01981-5數(shù)字PCR的定量檢測限和檢測限驗證結(jié)果本例具體采用0.08ng的DNA樣品上樣量進(jìn)行LOQ的驗證，采用0.016ng的DNA樣品上樣量進(jìn)行LOD驗證。表4品系VCO-01981-5數(shù)字PCR的LOQ驗證結(jié)果表5品系VCO-01981-5數(shù)字PCR的LOD驗證結(jié)果LOQ的驗證的DNA樣品進(jìn)行十個重復(fù)的數(shù)字PCR檢測結(jié)果見表4，結(jié)果顯示，該DNA樣品的10個平行的檢測結(jié)果RSD為24％，符合小于25％的要求，說明本例檢測方法可以對單位體積外源基因拷貝數(shù)為5的樣品進(jìn)行穩(wěn)定的定量檢測。LOD的驗證的DNA樣品進(jìn)行十個重復(fù)的數(shù)字PCR檢測結(jié)果見表5，結(jié)果顯示，十個平行中，內(nèi)源基因陽性檢出率為10個，符合LOD質(zhì)控的不低于9個的要求，說明本例方法可以對單位體積內(nèi)源基因拷貝數(shù)為4的樣品進(jìn)行穩(wěn)定檢測。5.玉米VCO-01981-5數(shù)字PCR的精密度實驗結(jié)果本例分別采用0.08ng和0.8ng的DNA樣品上樣量進(jìn)行6個重復(fù)試驗。檢測結(jié)果如表6所示，可見，綜合分析LOQ臨界點和臨界點10倍的DNA樣品的檢測結(jié)果，兩組濃度的DNA樣品所得到的組內(nèi)RSD值分別為22.78％和10.29％，符合整個檢測方法對于精密度的要求，即要求RSD小于25％。表6品系VCO-01981-5數(shù)字PCR的精密度結(jié)果6.玉米VCO-01981-5數(shù)字PCR的準(zhǔn)確度實驗結(jié)果本例分別采用0.016ng、0.08ng和0.4ng的DNA樣品上樣量進(jìn)行三個重復(fù)試驗，試驗結(jié)果如表7所示。表7玉米VCO-01981-5數(shù)字PCR準(zhǔn)確度實驗結(jié)果結(jié)果顯示，對于上樣量0.016ng、0.08ng和0.4ng的DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品，所測得拷貝數(shù)百分比的平均值分別問50％、56.6％和50％，DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品理論拷貝數(shù)百分比為50％，計算得到的檢測偏差分別為0.00％，13.20％和0.00％，三組偏差均符合小于25％的要求。因此本方法可以比較準(zhǔn)確的對BVLA430101品系進(jìn)行絕對定量檢測。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本申請所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本申請的具體實施只局限于這些說明。對于本申請所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本申請構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本申請的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心<120>轉(zhuǎn)基因玉米品系VCO-01981-5檢測方法和試劑<130>16I22568<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1aaggccttcagtctactcctcggg24<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>2ctagcggccgctactcgagggattt25<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3cgtcaccaagaagatcagtactcaaacac29<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4ttggactagaaatctcgtgctga23<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5gctacatagggagccttgtcct22<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6caatccacacaaacgcacgcgta23當(dāng)前第1頁1 2 3