本申請是以下申請的分案申請：申請日：2007年5月24日；申請?zhí)枺?00780027882.9(pct/us2007/069662)；發(fā)明名稱：同上。
相關(guān)申請的交叉參考
本申請要求保護2006年5月26日申請的美國臨時申請序號60/808,834的優(yōu)先權(quán)權(quán)益。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因玉米事件(transgeniccornevent)mon89034及其植物部分和種子。該事件表現(xiàn)出對鱗翅目昆蟲的昆蟲侵襲的抗性。本發(fā)明還涉及含有某種dna的植物和種子的使用方法，所述dna在探測轉(zhuǎn)基因事件獨有的核苷酸序列的存在情況時診斷轉(zhuǎn)基因事件的存在情況，以及通過檢測轉(zhuǎn)基因事件獨有的特異性核苷酸序列檢測所述玉米事件在生物樣品中的存在情況的方法。本發(fā)明提供所述事件獨有的核苷酸序列。
發(fā)明背景
本發(fā)明涉及本文稱為事件mon89034的鱗翅類抗性轉(zhuǎn)基因玉米(zeamays)植物品種，并涉及存在的獨特dna序列，其在任何玉米樣品或品種中檢測時診斷該樣品或品種中轉(zhuǎn)基因玉米植物事件mon89034的存在情況，還涉及玉米mon89034中轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)的檢測，以及由其獲得的子代植物和種子。
玉米植物事件mon89034尤其抗鱗翅科的昆蟲，例如秋天行軍蟲(spodopterafrugiperda)、歐洲玉米螟(ostrinianubilalis)、谷實夜蛾(helicoverpazea)、西南玉米螟(diatraeagrandiosella)和小地老虎(agrotisipsilon)等，所有這些都是農(nóng)業(yè)上重要的害蟲。
玉米是一種重要的作物，在世界上很多地區(qū)都是主要的食物來源。已將生物技術(shù)方法應(yīng)用于玉米，用以改進產(chǎn)品的農(nóng)學(xué)性狀和品質(zhì)。一種這樣的農(nóng)學(xué)性狀是昆蟲抗性，例如遺傳工程過的對鱗翅類和鞘翅類昆蟲的抗性，該抗性出現(xiàn)在遺傳工程后的玉米植物中，所述玉米被遺傳工程為含有一種或多種編碼殺蟲劑的基因(參見例如美國專利6,489,542和美國專利6,620,988)。有利之處在于檢測特定轉(zhuǎn)基因事件在生物樣品中的存在情況，以便確定有性雜交的一個或多個子代是否含有轉(zhuǎn)基因物質(zhì)。例如，檢測樣品中的事件對于許可用途、建立和保持純度標準很重要，對遵照管理機構(gòu)、遵照食品成分標準、按法定程序用于確定一個或多個具體個人或機構(gòu)已使用特定事件而沒有得到針對該轉(zhuǎn)基因事件的任何專利的所有人或被許可人的許可、確保遵照多個政府法規(guī)和/或法律很重要。
另外，在遵照規(guī)定重組農(nóng)作物來源食物的上市前的批準和標識要求的法規(guī)時，能夠檢測具體植株的方法應(yīng)是有用的。反對樣品中存在轉(zhuǎn)基因事件的個體和機構(gòu)也需要可靠的方法來檢測樣品中轉(zhuǎn)基因的存在情況，以便使他們能夠利用他們的沒有轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)品的生意中獲益。
盡管有這些優(yōu)勢，但是昆蟲有可能對僅表達一種蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素的植物進化出抗性。此抗性一旦被廣泛傳播，無疑會明顯限制含有單個bt基因的種質(zhì)的商業(yè)價值。
提高經(jīng)由轉(zhuǎn)基因植物提供的并旨在控制靶害蟲的殺蟲劑有效性并同時減弱抗這類殺蟲劑的害蟲出現(xiàn)的可能性的一種可能途徑應(yīng)是確保轉(zhuǎn)基因作物表達高水平的這些殺蟲劑，例如蘇云金芽孢桿菌δ內(nèi)毒素(mcgaughey和whalon(1992),science258:1451-55；roush(1994)biocontrol.sci.technol..4:501-516)。此外，具有有效對抗多類害蟲且通過不同作用模式顯示其作用的殺蟲基因庫可以避免抗性發(fā)展。由于提供表達兩種或更多種對相同昆蟲物種具有重疊毒性的殺蟲活性的作物，可以顯著延遲抗性的發(fā)生。實現(xiàn)這種雙作用模式的一種方法可以提供表達bt基因連同dsrna的植物，bt基因?qū)μ囟ɡハx物種有毒性，dsrna為了靶向抑制bt毒素所靶向的相同昆蟲物種的必需基因而提供，dsrna在被靶害蟲攝入時激發(fā)rnai應(yīng)答，為昆蟲對dsrna或bt基因發(fā)展出抗性的事件中的冗余提供了方法?；蛘?，在植物中共表達兩種或更多種對相同昆蟲物種均有毒性但每種均表現(xiàn)出不同的其殺傷活性實現(xiàn)模式的殺蟲毒素，尤其是在二者均以高水平表達時，提供了有效抗性管理的方法?？捎糜谶@些組合的這類殺蟲劑的實例包括但不限于bt毒素、致病桿菌屬(xenorhabdussp.)或光桿狀菌屬(photorhabdussp.)殺蟲蛋白、脫敏和去糖基化patatin蛋白和/或permutein、植物凝集素等。
已知外來基因在植物中的表達受到它們的染色體位置的影響，這或許是由于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(如異染色質(zhì))或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(如增強子)緊鄰整合位點(weising等，(19880ann.rev.genet22:421-477)。因此，經(jīng)常必須篩選大量事件，以鑒別以最佳表達所導(dǎo)入的目標基因為特征的事件。盡管這樣，采用手頭上的幾十乃至上百個不同轉(zhuǎn)基因事件，也不能確定成功鑒定這樣的單個轉(zhuǎn)基因事件：其提供至少兩種不同毒素或殺蟲劑的最佳表達水平，且沒有由于插入某些必需的或部分必需的植物基因組區(qū)域或轉(zhuǎn)基因表達水平產(chǎn)生的毒性作用而引起的任何不需要的農(nóng)學(xué)缺陷或植物毒性作用。例如，已經(jīng)在植物和其它生物中觀察到，在事件中所導(dǎo)入基因的表達水平可能廣泛變化。表達的空間或時間模式也可能有差異，例如在多種植物組織中的轉(zhuǎn)基因相對表達的差異，這可能不符合由所導(dǎo)入的基因構(gòu)建體中存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件預(yù)期的模式。因此，通常產(chǎn)生成百至上千的不同事件，并篩選事件中具有商業(yè)用途所需要的轉(zhuǎn)基因表達水平和模式的單個事件。具有需要的轉(zhuǎn)基因表達水平或模式的事件可使用常規(guī)育種方法有性雜交而用于將轉(zhuǎn)基因基因漸滲到其它遺傳背景中。這類雜交的子代保留了原始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達特征。該策略用于在非常適合當(dāng)?shù)厣L條件的多個品種中確?？煽康幕虮磉_。
通過任何公知的核酸檢測方法，諸如聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)或使用核酸探針的dna雜交，有可能檢測轉(zhuǎn)基因的存在情況。這些檢測方法一般集中于經(jīng)常使用的遺傳元件，例如啟動子、終止子、標志基因乃至編碼由轉(zhuǎn)基因表達的目標蛋白或dsrna的編碼序列，等等。因此，這些方法可能對區(qū)別不同事件無效，特別是使用同一dna構(gòu)建體產(chǎn)生的那些，除非鄰近插入dna的染色體dna序列(“側(cè)翼dna”)是已知的。根據(jù)用于將轉(zhuǎn)基因?qū)胫参锘蚪M中的方法，可以觀察到異?；虿怀Ｒ姷淖饔?，這些作用經(jīng)常將預(yù)期導(dǎo)入到植物中的轉(zhuǎn)基因dna側(cè)翼的植物基因組序列的鑒定復(fù)雜化。通常，插入dna的重排、側(cè)翼基因組dna的重排或插入dna和側(cè)翼基因組dna這二者的重排很普遍，使要評價的插入事件的分析復(fù)雜化。因此，有利的是得到選擇、鑒定和確保樣品中特定轉(zhuǎn)基因事件的純度和特征的方法，實現(xiàn)這一點的唯一方法是鑒定僅與所需轉(zhuǎn)基因事件相關(guān)的一種或多種獨有序列，因此，這些序列在含有轉(zhuǎn)基因dna插入其中從而產(chǎn)生事件的植物物種dna的生物樣品中的存在情況診斷該樣品中的事件。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及稱為mon89034的轉(zhuǎn)基因玉米植物及其與玉米事件(cornevent)mon89034無法區(qū)分的子代(它們也含有至少一種對應(yīng)于插入轉(zhuǎn)基因dna的等位基因)，其種子已于2006年3月28日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)，保藏號pta-7455。本發(fā)明的又一方面是所述玉米事件mon89034的植物和種子的子代植物或種子或可再生部分，所述玉米事含有選自以下的多核苷酸：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。本發(fā)明還包括玉米事件mon89034的植物部分，包括但不限于花粉、胚珠、花、枝條(shoots)、根、莖(stalks)、穗絲、花序(tassels)、耳穗和葉，只要這些部分含有至少如上所述的多核苷酸。包含在mon89034基因組中的新的遺傳組分，以及得自mon89034的這些產(chǎn)物，例如對應(yīng)于mon89034事件的玉米粉、玉米面、玉米油、玉米漿和留在玉米作物田間的生物量(biomass)，都為本發(fā)明的一個方面。
本發(fā)明提供具有玉米事件mon89034的所有生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的昆蟲抗性玉米植物。
按照本發(fā)明的一個方面，提供檢測稱為mon89034的新玉米植物的轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)的存在情況的組合物和方法。提供含有mon89034的至少一種接合序列的dna序列，所述接合序列選自seqidno:1(位于seqidno:5上的2051-2070位)和seqidno:2(位于11367-11388位)及其互補物；其中接合序列涵蓋插入基因組中的異源dna和側(cè)接插入位點的玉米細胞dna之間的接合，并診斷所述事件(圖1)。玉米事件mon89034和含有這些dna分子的種子為本發(fā)明的一個方面。
含有玉米事件mon89034的新轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)、seqidno:3和seqidno:4(圖2)的dna序列是本發(fā)明的多個方面。含有這些分子的玉米植物和種子也是本發(fā)明的多個方面。
按照本發(fā)明的又一方面，提供用于dna檢測方法中的兩個dna分子，其中第一個dna分子包含seqidno:3的dna分子的轉(zhuǎn)基因區(qū)的任何部分的至少11個以上連續(xù)多核苷酸，以及seqidno:3的5’側(cè)翼玉米基因組dna區(qū)的任何部分的類似長度的dna分子，其中這些dna分子在一起使用時可在產(chǎn)生擴增子的dna擴增方法中用作dna引物。在使用這些dna引物在dna擴增方法中產(chǎn)生的擴增子含有seqidno:1時，該擴增子診斷玉米事件mon89304。通過與seqidno:3的任何部分同源或互補的dna引物產(chǎn)生的任何擴增子以及含有seqidno:1的任何擴增子是本發(fā)明的一個方面。
按照本發(fā)明的又一方面，提供用于dna檢測方法中的兩個dna分子，其中第一個dna分子含有seqidno:4的dna分子的轉(zhuǎn)基因區(qū)的任何部分的至少11個以上的連續(xù)多核苷酸和seqidno:4的3’側(cè)翼玉米基因組dna的任何部分的類似長度的dna分子，其中這些dna分子可在dna擴增方法中用作dna引物。當(dāng)使用這些dna引物在dna擴增方法中產(chǎn)生的擴增子含有seqidno:2時，該擴增子診斷玉米事件mon89304。通過與seqidno:4的任何部分同源或互補的dna引物產(chǎn)生的任何擴增子和含有seqidno:2的任何擴增子是本發(fā)明的一個方面。
按照本發(fā)明的又一方面，提供檢測樣品中對應(yīng)于玉米事件mon89034的dna的存在情況的方法。這些方法包括：(a)使含有dna的樣品與引物組接觸，所述引物組在玉米事件mon89034的基因組dna的核酸擴增反應(yīng)時，產(chǎn)生診斷玉米事件mon89034的擴增子；(b)進行核酸擴增反應(yīng)，由此產(chǎn)生擴增子；和(c)檢測擴增子，其中所述擴增子含有seqidno:1或seqidno:2。
玉米植物、種子或產(chǎn)物來源于植物或種子mon89034，其中包含的基因組dna含有的dna分子基本上由seqidno:5或其互補物組成。玉米植物或種子或產(chǎn)物來源于植物或種子mon89034，其中基因組dna在分離自玉米植物、種子或產(chǎn)物時，含有摻入seqidno:5的核苷酸的2061-11377及其互補物的dna分子。
玉米植物或種子或產(chǎn)物來源于植物或種子mon89034，其中基因組dna在分離自玉米植物或種子或產(chǎn)物時，在dna擴增方法中產(chǎn)生擴增子，其中在dna擴增方法中使用dna引物分子seqidno:6和seqidno:7。
按照本發(fā)明的又一方面，檢測樣品中對應(yīng)于mon89034事件的dna的存在情況的方法，這些方法包括：(a)使含有dna的樣品與探針接觸，所述探針在嚴格雜交條件下與玉米事件mon89034的基因組dna雜交，但在嚴格雜交條件下不與對照玉米植物雜交；(b)對樣品和探針實施嚴格雜交條件；和(c)檢測探針與玉米事件mon89034dna的雜交，其中所述探針含有seqidno:1和seqidno:2。
本發(fā)明的又一方面是測定玉米事件mon89034子代的接合性的方法，包括：(a)使含有玉米dna的樣品與包含sq2842(seqidno:6)、sq2843(seqidno:7)、sq6523(seqidno:10)、sq6524(seqidno:11)、pb880(seqidno:14)和pb2931(seqidno:15)的引物組接觸，所述引物組在玉米事件mon89034的基因組dna的核酸擴增反應(yīng)中使用時，產(chǎn)生診斷玉米事件mon89034的第一個擴增子，和(b)進行核酸擴增反應(yīng)，由此產(chǎn)生第一個擴增子；和(c)檢測第一個擴增子；和(d)使含有玉米dna的樣品與所述引物組接觸，所述引物組在玉米植物的基因組dna的核酸擴增反應(yīng)中使用時，產(chǎn)生含有與鑒定為玉米事件mon89034的轉(zhuǎn)基因插入序列的玉米基因組區(qū)同源的天然玉米基因組dna的第二個擴增子；和(e)進行核酸擴增反應(yīng)，由此產(chǎn)生第二個擴增子，和(f)檢測第二個擴增子；和(g)比較樣品中的第一個和第二個擴增子，其中兩個擴增子均存在指示該樣品對轉(zhuǎn)基因插入序列為雜合的。
本發(fā)明的一個方面是在鱗翅類害蟲的膳食中提供有效殺蟲量的玉米事件mon89034。
本發(fā)明的又一方面提供為農(nóng)產(chǎn)品或食品形式的組合物或生物樣品，其來源于玉米事件mon89034，所述農(nóng)產(chǎn)品或食品包含玉米耳穗、去包葉玉米、玉米穗絲、玉米花粉、玉米糝、玉米粉、壓碎玉米、玉米面、玉米油、玉米淀粉、玉米漿、玉米麥芽、玉米糖、玉米糖漿、由玉米油生產(chǎn)的人造黃油、不飽和玉米油、飽和玉米油、玉米片、爆裂玉米、由含有診斷玉米事件mon89034的dna的玉米或玉米產(chǎn)物產(chǎn)生的乙醇和/或汁(liquor)、由這些玉米事件發(fā)酵產(chǎn)生的干酒糟(distillersdrygoodssolids,ddgs)，以及含有這些ddgs和/或玉米(無論是完整的、碎裂的還是壓碎的)的動物飼料、加工食品、化妝品和其中存在可檢測量的多核苷酸的填充劑，所述多核苷酸診斷生物樣品中轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的存在情況。提供玉米作為食品的替代方法以多種喂飼用粒狀形式提供玉米，例如完整玉米、玉米糝、壓碎玉米，以及在與蜀黍、板油、粟、向日葵、燕麥、小麥、水稻、豆等的混合物中以多種先前形式提供玉米。在所述農(nóng)產(chǎn)品或食品中的可檢測量的核苷酸序列，如在seqidno:1或seqidno:2中所示，或其互補物，診斷樣品中該轉(zhuǎn)基因事件mon89034dna的存在情況，由此，診斷樣品中產(chǎn)生所述dna的轉(zhuǎn)基因事件細胞的存在情況。
根據(jù)以下的詳述，本發(fā)明的前述方面和其它方面將變得更顯而易見。
附圖簡述
圖1.在轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034基因組中存在的轉(zhuǎn)基因插入序列的構(gòu)成。中空或白色條棒代表插入dna。白色條棒以下是代表了插入dna中的多個元件的示意圖。插入dna的末端已被隨意地稱為5’(至圖的左側(cè))和3’(至圖的右側(cè))。右邊界和左邊界序列或區(qū)段在每個示意圖底部標記，圖解了插入dna中的多個元件。插入dna內(nèi)的表達盒中的標記元件以連續(xù)順序由右邊界開始為：e35s啟動子、小麥cab非翻譯前導(dǎo)序列、水稻肌動蛋白內(nèi)含子、cry1a.105編碼序列、小麥hsp173’終止和多腺苷酸化序列、fmv啟動子、hsp70內(nèi)含子、rubisco小亞基葉綠體靶向肽編碼序列、cry2ab編碼序列、nos3’終止和多腺苷酸化信號序列，然后為左邊界。在中空或白色條棒的任一個末端的垂直陰影條棒對應(yīng)于隨意標記的5’和3’玉米基因組側(cè)翼序列。在陰影和空心或白色條棒之上的最長黑線代表seqidno:5(該圖提供的全長序列圖示了5’側(cè)翼序列、插入dna序列和3’側(cè)翼序列)。標記為seqidno:5的黑線之上和之下的較短黑線代表seqidno:5中的近似位置，其中每個具體標記的序列都可以找到(即seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4)。seqidno:1和seqidno:2以及來源于含有seqidno:1和/或seqidno:2的玉米事件mon89034的任何序列，都診斷生物樣品中的玉米事件mon89034dna。
發(fā)明詳述
提供以下定義和方法以更好地詳細說明本發(fā)明，并指導(dǎo)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員實施本發(fā)明。除非另外指出，否則術(shù)語根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解。分子生物學(xué)的普通術(shù)語的定義也可見于rieger等,glossaryofgenetics:classicalandmolecular,第5版,springer-verlag:newyork,1991；和lewin,genesv,oxforduniversitypress:newyork,1994。
本文使用的術(shù)語“玉米”是指玉米(zeamays)，包括可與玉米交配的所有植物品種，包括野生玉米種。
本文使用的術(shù)語“包含”意指“包括但不限于”。
通過用異源dna(即含有目的轉(zhuǎn)基因的核酸構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化植物細胞，再生由轉(zhuǎn)基因插入植物基因組而產(chǎn)生的植物群，并選擇以插入到特定基因組位置為特征的特定植株，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因“事件”。術(shù)語“事件”是指含有異源dna的原初轉(zhuǎn)化體和轉(zhuǎn)化體后代。術(shù)語“事件”還指通過在轉(zhuǎn)化體和含有異源dna的另一個品種之間進行有性異型雜交產(chǎn)生的后代。即使在與回交親本進行重復(fù)回交后，來自于轉(zhuǎn)化親本的插入dna和側(cè)翼dna也存在于雜交后代中的同一染色體位置。術(shù)語“事件”也指含有插入dna和與插入dna緊密相鄰的側(cè)翼基因組序列的原初轉(zhuǎn)化體的dna，預(yù)期該dna應(yīng)由于一個含有插入dna的親本系(如原初轉(zhuǎn)化體和由自交產(chǎn)生的后代)與不含有插入dna的親本系進行有性雜交而被轉(zhuǎn)移到接受含有目的轉(zhuǎn)基因的插入dna的后代中。本發(fā)明涉及事件mon89034dna、來源于mon89034的植物細胞、組織、種子和加工產(chǎn)物。
還要理解的是，也可以使兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物交配，產(chǎn)生含有兩個獨立地分離添加的外源基因的后代。適宜后代的自交能夠產(chǎn)生對于兩個所添加的外源基因為純合的植物。還設(shè)想了對親本植物回交和與非轉(zhuǎn)基因植物異交，無性繁殖就是這種情況。通常用于不同性狀和作物的其它育種方法的描述可見于若干參考文獻當(dāng)中的一篇，如fehr，載于breedingmethodsforcultivardevelopment，wilcoxj.編輯，americansocietyofagronomy，madisonwi(1987)。
“探針”是連接常規(guī)可檢測的標記或報告分子的分離核酸，所述標記或報告分子例如為放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光劑或酶。這樣的探針與靶核酸鏈互補，就本發(fā)明而言，與玉米事件mon89034的基因組dna鏈互補，無論它來自玉米植物還是來自包含該事件的dna的樣品。本發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特異性地結(jié)合靶dna序列并可用于檢測該靶dna序列的存在情況的聚酰胺和其它探針材料。
“引物”是分離的核酸，它們通過核酸雜交與互補靶dna鏈退火，在引物和靶dna鏈之間形成雜合體，隨后經(jīng)聚合酶如dna聚合酶沿著靶dna鏈延伸。本發(fā)明的引物對是指它們例如通過聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)或其它常規(guī)核酸擴增方法來擴增靶核酸序列的用途。
探針和引物一般為11個以上長度的核苷酸，優(yōu)選為18個以上的核苷酸，更優(yōu)選為24個以上的核苷酸，最優(yōu)選為30個以上的核苷酸。這些探針和引物在高嚴格雜交條件下與靶序列特異性雜交。優(yōu)選地，盡管可以通過常規(guī)方法設(shè)計與靶序列不同并保有同靶序列雜交的能力的探針，但根據(jù)本發(fā)明的探針和引物與靶序列具有完全的序列相似性。
制備與使用探針和引物的方法描述于例如molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,1-3卷,sambrook等編輯,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,1989(在下文，“sambrook等，1989”)；currentprotocolsinmolecularbiology,ausubel等編輯,greenepublishingandwiley-interscience,newyork,1992(定期更新)(在下文,“ausubel等,1992”)；和innis等,pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,academicpress:sandiego,1990。pcr引物對可從已知序列得到，例如，通過使用擬用于該用途的計算機程序，如primer(0.5版,
基于此處公開的側(cè)翼dna和插入序列的引物和探針可用于通過常規(guī)方法(例如通過重新克隆和對這些序列測序)證實(如有需要，則校正)所公開的序列。
本發(fā)明的核酸探針和引物在嚴格條件下同靶dna序列雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴增方法均可用于鑒定樣品中轉(zhuǎn)基因事件的dna的存在情況。在某些情況下，核酸分子或其片段能夠與其它核酸分子特異性雜交。在本文中，如果兩個核酸分子能形成反向平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，則這兩個分子被稱為能夠彼此特異性雜交。如果核酸分子顯示出完全互補，則一個核酸分子被稱為另一個核酸分子的“互補物”。在本文中，當(dāng)一個分子的每個核苷酸均與另一個分子的核苷酸互補時，這些分子被稱為表現(xiàn)出“完全互補”。如果兩個分子可相互雜交，具有的穩(wěn)定性足以使它們在至少常規(guī)的“低嚴格”條件下保持互相退火，則它們被稱為“最低限度互補”。類似的，如果分子可相互雜交，具有的穩(wěn)定性足以使它們在常規(guī)的“高嚴格”條件下保持互相退火，則這些分子被稱為“互補”。常規(guī)嚴格條件由sambrook等,1989和haymes等，描述于：nucleicacidhybridization,apracticalapproach,irlpress,washington,dc(1985)。因此，允許相對于完全互補有偏離，只要這些偏離沒有完全排除分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。為了使核酸分子用作引物或探針，僅僅需要在序列上足夠互補，以能夠在所用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
在本文中，大體上同源的dna序列是指這樣的核酸序列：在高嚴格條件下其將與同其比較的核酸序列互補物特異地雜交。促進dna雜交的適宜嚴格條件，如在約45℃下的6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(ssc)，隨后在50℃以2.0×ssc洗滌，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者可見于currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,n.y.(1989),6.3.1-6.3.6。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可選自低嚴格的50℃、約2.0×ssc到高嚴格的50℃、約0.2×ssc。此外，洗滌步驟的溫度也可以從約22℃室溫的低嚴格條件升高到約65℃的高嚴格條件。溫度和鹽濃度都是可變的，或者溫度或鹽濃度中的任一個可保持恒定，而改變另一個變量。在優(yōu)選的實施方案中，在中度嚴格條件(如約2.0×ssc和約65℃)下，本發(fā)明的核酸與seqidno:1和2中所示的一種或多種核酸分子或其互補物或任一個的片段特異性雜交。在特別優(yōu)選的實施方案中，在高嚴格條件下，本發(fā)明的核酸與seqidno:1和seqidno:2中所示的一種或多種核酸分子或任一個的互補物或片段特異性雜交。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明優(yōu)選的標記核酸分子具有seqidno:1和seqidno:2中所示的核酸序列或其互補物或任一個的片段。在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明優(yōu)選的標記核酸分子與seqidno:1和seqidno:2中所示的核酸序列或其互補物或任一個的片段共有80％-100％或90％-100％的序列同一性。在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明優(yōu)選的標記核酸分子與seqidno:1和seqidno:2中所示的序列或其互補物或任一個的片段共有95％-100％的序列同一性。seqidno:1和seqidno:2可以在植物育種方法中用作標記，以鑒定遺傳雜交的后代，這類似于在“dnamarkers:protocols,applications,andoverviews:(1997)173-185,cregan等編輯,wiley-lissny”中針對簡單序列重復(fù)dna標記分析所描述的方法；所述文獻在此全部引用作為參考。探針與靶dna分子的雜交可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的眾多方法中的任一種檢測，這些方法可包括但不限于熒光標簽法、放射性標簽法、基于抗體的標簽法和化學(xué)發(fā)光標簽法。
關(guān)于利用特定擴增引物對進行靶核苷酸序列擴增(例如通過pcr)，“嚴格條件”是指這樣的條件：在dna熱擴增反應(yīng)中使引物對僅與靶核酸序列(具有相應(yīng)野生型序列(或其互補物)的引物應(yīng)與該靶核酸序列結(jié)合)雜交并優(yōu)選產(chǎn)生獨特的擴增產(chǎn)物—擴增子。
術(shù)語“特異于(靶序列)”是指在嚴格雜交條件下探針或引物僅同含有靶序列的樣品中的該靶序列雜交。
本文所用的“擴增的dna”或“擴增子”是指為核酸模板一部分的靶核酸序列的核酸擴增產(chǎn)物。例如，為了確定玉米植物是否由含有本發(fā)明玉米植物的轉(zhuǎn)基因事件基因組dna的有性雜交產(chǎn)生，可使用包含來源于緊鄰插入異源dna的插入位點的植物基因組中的側(cè)翼序列的引物和來源于插入異源dna的第二個引物的引物對，對從玉米植物組織樣品提取的dna實施核酸擴增方法，以產(chǎn)生診斷事件dna的存在情況的擴增子。所述擴增子具有一定長度，并具有也診斷所述事件的序列。擴增子的長度可在引物對加一個核苷酸堿基對、優(yōu)選加大約50個核苷酸堿基對、更優(yōu)選加大約250個核苷酸堿基對、甚至更優(yōu)選加大約450個核苷酸堿基對的組合長度范圍內(nèi)?；蛘?，引物對可來源于插入dna兩邊的側(cè)翼序列，以便產(chǎn)生包含全部插入核苷酸序列的擴增子。來自植物基因組序列的引物對的成員可以與插入dna分子相距一定距離定位，該距離可以在一個核苷酸堿基對至最高大約兩萬個核苷酸堿基對的范圍內(nèi)。術(shù)語“擴增子”的使用特別排除了可以在dna熱擴增反應(yīng)中形成的引物二聚體。
核酸擴增可以通過本領(lǐng)域已知的多種核酸擴增方法中的任一種來實現(xiàn)，包括聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)。多種擴增方法是本領(lǐng)域已知的，尤其是描述于美國專利號4,683,195和4,683,202以及pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,innis等編輯,academicpress,sandiego,1990。pcr擴增方法已發(fā)展成擴增最多22kb的基因組dna和最多42kb的噬菌體dna(cheng等，proc.natl.acad.sci.usa91:5695-5699,1994)。這些方法以及dna擴增領(lǐng)域已知的其它方法可用于實施本發(fā)明。來自玉米事件mon89034和以atcc編號保藏的種子樣品的異源dna插入序列或側(cè)翼序列可如下檢驗(且如有必要進行校正)：使用源于本文提供的序列的引物擴增來自所述事件的這些序列，隨后對pcr擴增子或克隆的dna進行標準dna測序。
可以通過多種技術(shù)來檢測通過這些方法產(chǎn)生的擴增子。一個這樣的方法是遺傳比特分析(geneticbitanalysis)(nikiforov等，nucleicacidres.22:4167-4175,1994)，其中設(shè)計與相鄰側(cè)翼基因組dna序列和插入dna序列這二者重疊的dna寡核苷酸。將寡核苷酸固定在微量滴定板的孔中。在對目的區(qū)域進行pcr后(使用位于插入序列的一個引物和位于相鄰側(cè)翼基因組序列的一個引物)，可以將單鏈pcr產(chǎn)物同固定的寡核苷酸雜交，并作為模板用于利用dna聚合酶和特異于下一個期望堿基的標記ddntp的單堿基延伸反應(yīng)。讀數(shù)器可以是熒光的或基于elisa的。信號指示歸因于成功的擴增、雜交和單堿基延伸的插入序列/側(cè)翼序列的存在情況。
另一個方法是winge(innov.pharma.tech.00:18-24,2000)描述的焦磷酸測序技術(shù)(pyrosequencingtechnique)。在該方法中，設(shè)計與相鄰基因組dna和插入dna接合區(qū)重疊的寡核苷酸。使寡核苷酸與來自目的區(qū)域的單鏈pcr產(chǎn)物雜交(一引物位于插入序列，另一引物位于側(cè)翼基因組序列)，并在dna聚合酶、atp、硫酸化酶、螢光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸酯以及螢光素存在下溫育。單獨加入dntp，測量摻入產(chǎn)生的光信號。光信號指示歸因于成功的擴增、雜交和單堿基或多堿基延伸的轉(zhuǎn)基因插入序列/側(cè)翼序列的存在情況。
如chen等描述的熒光偏振(genomeres.9:492-498,1999)是一種可用于檢測本發(fā)明的擴增子的方法。使用此方法設(shè)計與基因組側(cè)翼和插入dna接合區(qū)重疊的寡核苷酸。將寡核苷酸與來自目的區(qū)域的單鏈pcr產(chǎn)物雜交(一引物位于插入dna序列，另一引物位于側(cè)翼基因組dna序列)，并在dna聚合酶和熒光標記的ddntp存在下溫育。單堿基延伸導(dǎo)致?lián)饺雂dntp?？梢允褂脽晒庥嫺鶕?jù)偏振變化測量摻入。偏振變化指示歸因于成功的擴增、雜交和單堿基延伸的轉(zhuǎn)基因插入序列/側(cè)翼序列的存在情況。
如tyangi等(naturebiotech.14:303-308,1996)所述，業(yè)已描述了分子信標可用于序列檢測。簡而言之，設(shè)計與側(cè)翼基因組和插入dna接合區(qū)重疊的fret寡核苷酸探針。fret探針的獨特結(jié)構(gòu)使其含有保持熒光部分和淬滅部分緊鄰的二級結(jié)構(gòu)。將fret探針和pcr引物(一引物位于插入dna序列，一引物位于側(cè)翼基因組序列)在熱穩(wěn)定聚合酶和dntp存在下循環(huán)。在成功pcr擴增之后，fret探針與靶序列雜交導(dǎo)致除去探針二級結(jié)構(gòu)以及熒光和猝滅部分空間分離，這導(dǎo)致產(chǎn)生熒光信號。熒光信號指示歸因于成功的擴增和雜交的側(cè)翼序列/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在情況。
其它描述的方法，例如微流化(美國專利公布號2006068398、美國專利號6,544,734)，提供了分離和擴增dna樣品的方法和裝置。光學(xué)染料用于檢測和定量特定dna分子(wo/05017181)。然后可使用含有檢測dna分子的電傳感器的納管裝置(wo/06024023)或結(jié)合特定dna分子的納珠檢測。
使用本文公開的組合物提供dna檢測試劑盒。所述試劑盒可用于鑒定樣品中的玉米事件mon89034dna，并可至少應(yīng)用于育種含適宜事件dna的玉米植物的方法。所述試劑盒含有與選自seqidno:1-7所示序列的區(qū)段同源或互補的dna引物和/或探針，或與包含在如序列表所示的dna的轉(zhuǎn)基因遺傳元件中的dna同源或互補的dna引物或探針。這些dna序列可用于dna擴增反應(yīng)，或在dna雜交方法中用作探針，檢測診斷樣品中靶dna的存在情況的多核苷酸的存在情況。在熱擴增反應(yīng)中產(chǎn)生的預(yù)定擴增子診斷樣品中對應(yīng)于pto-7455基因組dna的dna的存在情況。如果雜交是選擇性的，則檢測探針與生物樣品的雜交診斷樣品中mon89034轉(zhuǎn)基因事件dna的存在情況。通常，樣品為玉米或玉米產(chǎn)物或玉米應(yīng)用的副產(chǎn)品。
本發(fā)明提供稱為玉米事件mon89034的轉(zhuǎn)基因玉米植物、植物子代和植物細胞，以及由植物產(chǎn)生的種子。用于生長植物、生產(chǎn)子代、獲得細胞或生產(chǎn)一組含有轉(zhuǎn)基因玉米事件的所述種子的代表性種子已于2006年3月28日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)，并獲得保藏號pta-7455。
植物和細胞以及由這些實施方案生產(chǎn)的產(chǎn)物等含有診斷任何生物樣品中來源于轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034來源的任何細胞的dna存在情況的dna。這是因為這兩個新序列包含在轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034細胞中。診斷dna包含的核苷酸序列選自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5。這些序列的關(guān)系在本文和圖1的圖例中以及參考圖1更具體地描述。
由對診斷轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的dna為純合的種子培育的玉米植物也屬于本發(fā)明的范圍。由對診斷轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的dna為雜合的種子培育的玉米植物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要這些種子也含有診斷dna序列。由含有診斷dna的這些植物產(chǎn)生的細胞、種子和組織也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
含有診斷轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的dna的玉米植物和玉米植物細胞等表現(xiàn)出對鱗翅類昆蟲侵襲的抗性。這些細胞和植物含有編碼殺蟲蛋白(殺蟲劑、毒劑)cry2ab的dna以及具有seqidno:1和seqidno:2的核苷酸序列(構(gòu)成植物細胞基因組的一部分)的dna。這些植物和植物細胞還含有編碼殺蟲蛋白(殺蟲劑、毒劑)cry1a.105的dna。這些蛋白可被分別或倒轉(zhuǎn)稱為第一種和第二種殺蟲蛋白。這些蛋白的表達由嵌入在表達盒中的調(diào)節(jié)組分/遺傳元件實現(xiàn)，所述表達盒供編碼這些毒素的每種dna序列表達用，并在本文和圖1的圖例中以及參考圖1和示于seqidno:5的序列完整描述。含有這些序列的玉米植物和玉米植物細胞有效保護植物免于鱗翅類害蟲侵襲，無論對其中存在這些編碼序列的等位基因是雜合的還是純合的。
本發(fā)明還提供可由本文所述的序列產(chǎn)生的擴增子，其診斷生物樣品中來源于轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034dna的dna的存在情況。診斷生物樣品中的轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034dna存在情況的擴增子含有至少一種由seqidno:1或seqidno:2所示的核苷酸序列組成的多核苷酸區(qū)段。這些擴增子可以使用下文所述的引物序列由含有來源于轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的至少約0.5飛摩爾(femto-mole)或約0.5皮克dna的任何生物樣品產(chǎn)生。這些對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的dna的生物樣品源可以為來源于該轉(zhuǎn)基因事件的玉米粉、玉米油、玉米餅、玉米種子、玉米胚芽、玉米淀粉和玉米面等。
本發(fā)明還提供分離的多核苷酸分子，其具有連續(xù)核苷酸序列，例如在seqidno:5中所示的那些。這些連續(xù)核苷酸序列包含：(1)約11個至約12000個核苷酸以及其間的任何長度，并還含有如在seqidno:1中的1-11或9-20位核苷酸和seqidno:2中所示的1-11或9-20位核苷酸所示的連續(xù)核苷酸；(2)如在seqidno:3中所示的約11個至約2000個核苷酸以及其間的任何長度的任何連續(xù)核苷酸序列，并還含有如在seqidno:1中的1-11和9-20位核苷酸所示的連續(xù)核苷酸；如在seqidno:4中的約11個至約914個核苷酸以及其間的任何長度所示的任何連續(xù)核苷酸序列，并還含有如在seqidno:2中的1-11和9-20位核苷酸所示的連續(xù)核苷酸。這些分離的多核苷酸分子可用于dna擴增方法中由含有玉米dna的生物樣品產(chǎn)生一種或多種擴增子。此擴增子的檢測診斷樣品中轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034dna的存在情況。分離的多核苷酸分子還可用于多種核苷酸檢測方法，這些方法用于檢測生物樣品中來源于轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的dna的存在情況。具體地說，含有如在seqidno:1或seqidno:2中所示的至少約11個連續(xù)核苷酸的多核苷酸探針可在檢測樣品中的轉(zhuǎn)基因事件mon89034dna的這類方法中用作探針。這些分離的多核苷酸分子的互補序列也可以用于相同的檢測和/或擴增方法中。
本發(fā)明還提供用于檢測生物樣品中來源于轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的dna的存在情況的試劑盒。使用探針多核苷酸分子的試劑盒應(yīng)可用于檢測樣品中mon89034dna的存在情況，所述探針分子含有至少約11個至約12000個連續(xù)核苷酸，與包含在seqidno:5中所示序列的核苷酸區(qū)段具有顯著同源性，或具有顯著互補性。探針分子應(yīng)含有如在seqidno:1和seqidno:2中所示的至少一種序列。在seqidno:1和seqidno:2中所示的序列還可以被稱為接合序列，即在插入玉米植物中而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的轉(zhuǎn)基因dna的任一個末端的序列。這些序列隨意地分別被稱為5’和3’末端，含有部分插入dna序列和部分側(cè)翼玉米基因組序列。例如，seqidno:1在其5’一半提供側(cè)接插入dna的5’末端的玉米基因組序列的3’末端，插入dna的5’末端由在seqidno:1中所示序列的3’末端一半提供。seqidno:2在其5’一半提供插入dna的3’末端，在其3’末端一半提供側(cè)接插入dna的3’末端的玉米基因組序列的5’末端。在天然的玉米基因組中seqidno:5所示的插入序列的位置，插入dna的5’末端的側(cè)翼序列和插入dna的3’末端的側(cè)翼序列接合，與seqidno:3所示序列(非seqidno:3的3’末端的21個核苷酸)的互補序列雜交的第一個引物分子和與seqidno:4所示序列(非seqidno:4的5’末端的20個核苷酸)雜交的第二個引物分子將在模板為非mon89034dna的dna的熱擴增反應(yīng)中產(chǎn)生擴增子，該擴增子用于診斷mon89034中不存在插入dna，當(dāng)使用mon89034dna作為模板時，相同的引物將產(chǎn)生稍微大于12000個核苷酸的擴增子(取決于引物在seqidno:3和seqidno:4中所示的側(cè)翼序列中的位置)。還提供其它實施方案。
提供在生物樣品中檢測玉米事件mon89034的接合序列seqidno:1或seqidno:2的試劑盒。該試劑盒含有多核苷酸探針，還含有用于核酸擴增反應(yīng)的引物對，所述多核苷酸探針為選自seqidno:1或seqidno:2或其互補物的序列，或與該序列完全互補。所述引物對可被稱為第一引物和第二引物，第一引物由seqidno:3的玉米基因組部分的至少約15個至約50個連續(xù)核苷酸組成，第二引物由與seqidno:5的異源插入dna部分互補的至少約15個至約50個連續(xù)核苷酸組成。多核苷酸引物對的第一引物與對應(yīng)于seqidno:3中約核苷酸1位至約2050位所示序列的反向互補序列特異性雜交，所述多核苷酸引物對的第二引物與seqidno:5中約核苷酸位2060至約核苷酸位12,208所示的序列特異性雜交，所述引物對彼此相對延伸，形成含有seqidno:1的擴增子，所述擴增子診斷樣品中mon89034事件dna的存在情況。不同的引物對可被稱為第一引物和第二引物，第一引物由與seqidno:4的玉米基因組部分互補的至少約15個至約50個連續(xù)核苷酸組成，第二引物由seqidno:5的異源插入dna部分的至少約15個至約50個連續(xù)核苷酸組成。多核苷酸引物對的第一引物與對應(yīng)于seqidno:5中由約核苷酸1位至約11,370位所示序列的反向互補序列特異性雜交，多核苷酸引物對的第二引物與seqidno:4中由約核苷酸1位至約核苷酸914位所示的序列特異性雜交，所述引物對彼此相對延伸，形成含有seqidno:2的擴增子，所述擴增子診斷所述樣品中mon89034事件dna的存在情況。
這些引物對可用于產(chǎn)生含有seqidno:1或seqidno:2的擴增子，視情況而定，并因此診斷生物樣品中mon89034dna的存在情況。這些擴增子能夠檢測生物樣品中診斷玉米事件mon89034的接合序列的存在情況。
還提供產(chǎn)生和檢測擴增子的方法，所述擴增子診斷含有玉米dna的生物樣品中的轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034dna。該方法包括使生物樣品與兩種或更多種引物在核酸擴增反應(yīng)中一起接觸，進行核酸擴增反應(yīng)，然后檢測擴增子。擴增子的存在情況診斷樣品中的所述事件dna，只要該擴增子含有seqidno:1和seqidno:2中約1-11或9-20位核苷酸所示的至少一種連續(xù)序列，或?qū)?yīng)于這些位置的互補序列。
還可以使用其它方法檢測診斷生物樣品中轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的存在情況的核苷酸序列。例如，使懷疑含有mon89034dna的生物樣品與探針接觸，所述探針在嚴格雜交條件下與在seqidno:1或seqidno:2中所示的一種或多種核苷酸序列雜交，對樣品和探針實施嚴格雜交條件；然后檢測探針與核苷酸序列的雜交。檢測雜交診斷樣品中mon89034dna的存在情況。
本發(fā)明還提供用于在熱擴增反應(yīng)中產(chǎn)生擴增子的引物多核苷酸，所述擴增子診斷生物樣品中玉米事件mon89034dna的存在情況。通常，引物成對提供，為方便起見，引物對的成員被稱為第一引物和第二引物。第一引物可以由在seqidno:3中所示的玉米基因組部分的至少約15個連續(xù)核苷酸組成，第二引物可以由與seqidno:5中所示的異源插入dna部分互補的至少約15個連續(xù)核苷酸組成。這2個引物應(yīng)在熱擴增反應(yīng)中產(chǎn)生擴增子，采用的模板dna得自玉米事件mon89034dna，含有seqidno:1所示多核苷酸序列?；蛘撸谝灰锟梢杂蓅eqidno:4的玉米基因組部分的至少約15個連續(xù)核苷酸組成，第二引物可以由與seqidno:5的異源插入dna部分互補的至少約15個連續(xù)核苷酸組成。這2個引物應(yīng)在熱擴增反應(yīng)中產(chǎn)生擴增子，采用的模板dna得自玉米事件mon89034dna，含有seqidno:2所示多核苷酸序列。
檢測含有玉米dna的生物樣品中玉米事件mon89034的接合序列(例如seqidno:1或seqidno:2)的替代方法由以下組成：使樣品與在嚴格雜交條件下與其中一個接合序列雜交的多核苷酸探針接觸，對樣品和探針實施嚴格雜交條件；檢測探針與接合序列的雜交。檢測探針與接合序列的結(jié)合/雜交指示生物樣品中mon89034dna的存在情況。其dna在實施本文所述方法時產(chǎn)生含有seqidno:1或seqidno:2的dna擴增子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米植物，屬于本發(fā)明的范圍。具體地說，示例性的引物序列—引物對序列，陳述于本文中的實施例以及seqidno:6和seqidno:7。
檢測生物樣品中玉米事件mon89034dna的存在情況的替代方法可以由以下步驟組成：使樣品探針接觸，所述探針在嚴格雜交條件下與mon89034dna雜交，但在嚴格雜交條件下不與非mon89034dna的玉米植物基因組dna雜交，對樣品和探針實施嚴格雜交條件，然后檢測探針與mon89034dna的雜交。符合本實施方案的探針為選自seqidno:1和seqidno:2的序列，或與該序列互補。檢測探針與樣品的雜交診斷樣品中玉米事件mon89034多核苷酸的存在情況。生物樣品可以為任何含有mon89034dna的樣品，包括但不限于玉米油、玉米粉、玉米面、玉米面筋、玉米餅、玉米淀粉、玉米漿、玉米組織、玉米細胞、玉米籽粒、玉米花粉、玉米根組織、ddgs，甚至作為這類轉(zhuǎn)基因玉米發(fā)酵的副產(chǎn)物產(chǎn)生的乙醇，只要該樣品含有至少可檢測量的、診斷樣品中mon89034事件的存在情況的多核苷酸。多核苷酸探針可以為選自脫氧核糖核酸、核糖核酸和核苷酸類似物的任何核苷酸，并可以用至少一種熒光團、含有放射性發(fā)射同位素的分子或可以用抗體或其它結(jié)合型反應(yīng)特異性檢測的半抗原型分子標記。
可以通過使含有轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034dna的玉米植物與非事件mon89034的玉米植物一起交配，產(chǎn)生含有診斷所述事件的dna的雜種玉米植物，從而獲得含有診斷mon89034轉(zhuǎn)基因事件dna的存在情況的dna的玉米品種。含有診斷轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的dna的該雜種玉米植物屬于本發(fā)明的范圍，由該雜種產(chǎn)生的種子(只要含有診斷轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的dna)，以及雜種玉米植物mon89034的花粉、胚珠、種子、根或葉(也是就它們含有診斷dna序列而言)，和由這些實施方案產(chǎn)生的子代，也屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明提供保護玉米植物免遭鱗翅類昆蟲侵襲的方法，包括在靶鱗翅類害蟲的膳食中提供一種或多種轉(zhuǎn)基因玉米植物細胞，每種玉米植物細胞在其基因組中均含有對應(yīng)于seqidno:1和seqidno:2二者所示序列以及在seqidno:1和seqidno:2之間的、如seqidno:5所示的連續(xù)核苷酸序列的多核苷酸。以這樣的轉(zhuǎn)基因玉米植物細胞為食的靶鱗翅類昆蟲被抑制進一步以源自玉米植物細胞的玉米植物為食。
本發(fā)明還提供對玉米植物的靶鱗翅類害蟲有毒的組合物。以靶鱗翅類害蟲膳食提供轉(zhuǎn)基因植物細胞組合物，其中每種轉(zhuǎn)基因玉米植物細胞在其基因組中均含有對應(yīng)于seqidno:1和seqidno:2二者所示序列連同在seqidno:1和seqidno:2之間的、如在seqidno:5中所示的連續(xù)核苷酸序列的多核苷酸，所述組合物為玉米植物或玉米植物細胞有效提供抵御鱗翅類昆蟲侵襲的保護，只要玉米植物或細胞由連續(xù)核苷酸序列中包含的表達盒表達cry1a.105和/或cry2ab2。為轉(zhuǎn)基因玉米種子形式的這些組合物已保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號pta-9708。這些昆蟲抗性玉米植物或其部分在這些植物細胞基因組中將含有以下dna：其具有至少一種選自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5的核苷酸序列。昆蟲抗性玉米植物的子代和種子，其中所述子代和種子具有本文提出的診斷序列，也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些昆蟲抗性玉米植物可以用包含以下步驟的方法生產(chǎn)：使轉(zhuǎn)基因玉米植物事件mon89034與不同的玉米植物雜交，并通過分析至少一種選自seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4和seqidno:5的核苷酸序列選擇昆蟲抗性子代。
昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034可以與其它玉米轉(zhuǎn)基因品種組合，例如抗除草劑如草甘膦、草銨膦和麥草畏等的玉米，或由于插入編碼蛋白如ps149b1和修飾的cry3bb的序列而抗食根昆蟲的玉米，或由于插入編碼其它毒素蛋白如vip3a、cry1ab和cry1fa等的序列而抗鱗翅類昆蟲侵襲的其它轉(zhuǎn)基因玉米品種。所有這些不同轉(zhuǎn)基因事件的各種組合與本發(fā)明的玉米植物(即mon89034事件)一起育種，提供抗鞘翅類和鱗翅類侵襲并抗選擇的除草劑的改良雜種轉(zhuǎn)基因玉米品種。這些品種相比于非轉(zhuǎn)基因品種和單獨性狀的轉(zhuǎn)基因品種表現(xiàn)出產(chǎn)量提升和耐干旱特征。
提供一種生產(chǎn)抗昆蟲侵襲的玉米植物的方法，其中玉米植物含有殺蟲有效量的毒素編碼序列，如在seqidno:5中所示。該方法包括由轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034提取毒素編碼序列，并將這些編碼序列單獨或一起導(dǎo)入一種或多種玉米細胞中，產(chǎn)生含有這一種或多種毒素編碼序列的轉(zhuǎn)基因玉米細胞。然后將轉(zhuǎn)基因玉米細胞培育(再生)為含有一種或多種編碼序列的轉(zhuǎn)基因玉米植物，轉(zhuǎn)基因植物則表現(xiàn)出對昆蟲侵襲的抗性。
本發(fā)明提供一種測定含有玉米事件mon89034dna的轉(zhuǎn)基因玉米植物的dna相對于診斷生物樣品中的該mon89034dna的存在情況的dna的接合性的方法。該方法由以下組成：作為第一步，使樣品與包含seqidno:6、seqidno:7和seqidno:10的3種不同引物接觸，所述引物在一起用于含有玉米事件mon89034dna的核酸擴增反應(yīng)時，產(chǎn)生診斷玉米事件mon89034的第一擴增子，在用于含有非mon89034dna的玉米基因組dna的核酸擴增反應(yīng)時，產(chǎn)生診斷非mon89034dna的玉米基因組dna的第二擴增子。后續(xù)步驟由以下組成：進行核酸擴增反應(yīng)，并比較在熱擴增反應(yīng)過程中產(chǎn)生的擴增子。檢測兩種擴增子的存在情況診斷樣品的接合性。僅檢測到第一擴增子指示樣品僅含有mon89034dna，即純合樣品。僅檢測到第二擴增子指示樣品不含mon89034dna。在樣品中同時檢測到第一和第二擴增子指示(1)樣品含有相對于僅含有雜合起始物質(zhì)的純樣品的雜合dna，或(2)樣品含有純合和雜合的起始樣品dna，或(3)樣品含有純合、雜合和/或非mon89034dna的樣品的某些組合。
本發(fā)明還提供生長玉米植物，其含有診斷插入到玉米植物細胞基因組中的轉(zhuǎn)基因dna區(qū)段的dna。玉米細胞基因組中的dna包含選自以下的任一個或全部序列：
(a)如在seqidno:5所示的核苷酸序列；
(b)如在seqidno:1和seqidno:2所示的兩個核苷酸序列；
(c)如在seqidno:3所示的核苷酸序列；和
(d)如在seqidno:4所示的核苷酸序列。
包括下列實施例是為了證明本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案的實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，以下實施例中公開的技術(shù)代表本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明實施中有效的方法，因此可被認為構(gòu)成用于實施本發(fā)明的優(yōu)選模式的實施例。然而，根據(jù)本文的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，在公開的具體實施方案中進行多種改變，而仍可獲得相同或相似的結(jié)果。
實施例
實施例1
本實施例闡述了轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的構(gòu)建和分子表征。
采用質(zhì)粒構(gòu)建體pmon38850(表達盒示于圖1)進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的近交玉米系轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生玉米植物mon89034。所用轉(zhuǎn)化方法類似于在美國專利號6,603,061中描述的方法。質(zhì)粒構(gòu)建體pmon38850含有連鎖植物表達盒，該表達盒具有在玉米植物細胞中表達cry1a.105殺蟲蛋白所必需的調(diào)節(jié)遺傳元件。將玉米細胞再生為由至少約23,000個不同轉(zhuǎn)基因事件組成的完整玉米植株。由事件群中選擇顯示出植物表達盒完整性和對鱗翅類幼蟲攝食損傷抗性的單獨的轉(zhuǎn)基因事件(植株)。在其基因組中含有pmon38850的連鎖植物表達盒的玉米植株是本發(fā)明的一個方面。在大體分析了這些轉(zhuǎn)基因事件后，基于其分子特征和沒有任何不需要的表型或農(nóng)學(xué)缺陷作用選擇mon89034轉(zhuǎn)基因事件。
包含在mon89034玉米基因組中的轉(zhuǎn)基因遺傳元件的序列如在圖1中所示，由每個彼此有效連接的以下元件組成。首先，在序列的隨意確定的5’末端(即接近圖1中所示區(qū)段的左中心部分)標記根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)右邊界區(qū)(rb)的部分。這之后為按順序由以下組成的表達盒：增強的camv35s啟動子元件(本文稱為p-camv35sen，位于seqidno:5上的2350-2651位)；小麥葉綠素a/b結(jié)合蛋白非翻譯前導(dǎo)序列(本文稱為l-ta.lhcb1，位于seqidno:5上的2678-2738位)；水稻肌動蛋白內(nèi)含子序列(本文稱為i-os.act1，位于seqidno:5上的2755-3234位)；編碼嵌合基因cry1a.105的非天然序列(位于seqidno:5上的3244-6777位)；小麥的3’終止區(qū)(本文稱為t-ta.hsp17-1:1:1，位于seqidno:5上的6809-7018位)。以上提到的非邊界序列的元件的組合，在玉米植物中時一起用于引起cry1a.105殺蟲蛋白表達。這些元件隨后按順序連接至另一個表達盒，該表達盒由以下元件組成：玄參花葉啟動子(位于seqidno:5上的7086-7649位)、玉米hsp70前導(dǎo)序列(本文稱為hsp70或i-hsp70，位于seqidno:5上的7672-8475位)和玉米葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼序列(本文稱為ctp2或ts-ssu-ctp，位于seqidno:5上的8492-8892位)。這些有效連接的區(qū)段然后連接至編碼殺蟲蛋白cry2ab的核苷酸序列(位于seqidno:5上的8893-10800位)，該序列以其3’末端連接根癌農(nóng)桿菌的胭脂堿合酶基因的3'非翻譯區(qū)(本文稱為t-agrtu.nos-1:1:13，位于seqidno:5上的10827-11377位)。cry2ab編碼序列側(cè)翼的這些元件在玉米植物中存在時一起用于指導(dǎo)cry2ab表達。cry2ab表達盒隨后按順序后接由根癌農(nóng)桿菌的左邊界(lb)區(qū)的足夠部分組成的核苷酸序列。
在dna擴增方法中用作引物的dna分子可來源于mon89034事件中包含的轉(zhuǎn)基因插入序列的遺傳元件的序列。這些引物分子可以用作引物組的組成部分，該引物組還包含來源于側(cè)接轉(zhuǎn)基因插入片段的事件基因組的dna引物分子。
pmon38850質(zhì)粒dna的一部分插入玉米基因組中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米植物事件mon89034，該部分由左和右邊界區(qū)段以及邊界區(qū)段之間的兩個連鎖植物表達盒(第一個表達盒編碼cry1a.105，第二個表達盒編碼cry2ab，其中就某一個表達盒而言，無論是被稱為第一個還是第二個表達盒，每個表達盒均是可互換的)組成，該部分通過詳細的分子分析來表征。進行這些分析，以鑒定僅含單個且完整的插入?yún)^(qū)段(由邊界和邊界之間所需的兩個表達盒(玉米基因組中的整合位點數(shù)量)組成)的事件、拷貝數(shù)(一個基因座中的t-dna拷貝數(shù))和插入基因表達盒的完整性(即與已知存在于質(zhì)粒pmon38850中的序列沒有任何重排或序列變異)。所用的dna分子探針包含完整的cry1a.105編碼區(qū)及其對應(yīng)的調(diào)節(jié)元件、植物表達盒的啟動子、內(nèi)含子和多腺苷酸化序列，以及質(zhì)粒pmon38850骨架dna區(qū)。得自所有事件分析的數(shù)據(jù)表明，mon89034含有單個t-dna插入和1個拷貝的cry1a.105表達盒。在mon89034基因組中沒有檢測到與完整基因表達盒連接或未連接的、得自轉(zhuǎn)化載體pmon38850的額外元件。最后，進行pcr和dna序列分析，以確定5’和3’插入序列-植物基因組接合，檢驗插入序列中的元件構(gòu)成(參見例如圖1)，并確定插入到玉米植物基因組中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的dna的完整序列。完整的插入序列，連同在插入dna的任一個末端的玉米基因組側(cè)翼序列部分，示于如seqidno:5中所示的序列。
首先通過在harbil5g-hd涂料振蕩儀(harbilinc,cincinnati,ohio)中將種子(至多200個種子)加工為精細粉末，由玉米種子提取mon89034的基因組dna和非mon89034的玉米的非轉(zhuǎn)基因dna(對照dna)。簡而言之，以提取緩沖液(emscience目錄號3700,emscience,gibbstown,newjersey,usa)提取粉末化的種子，用異丙醇(sigma目錄號i-0398,sigma,st.louis,mo,usa)由溶液沉淀dna。將沉淀的dna倒入含有70％乙醇的微離心管中。以最大速度(約14,000rpm)沉淀微離心管中的dna約5分鐘，真空干燥，并再溶解在te緩沖液(ph8.0)中。然后將dna儲存于4℃冰箱中。該方法可由本領(lǐng)域技術(shù)人員修改，以便由單個玉米種子提取dna。
用于在樣品中鑒定事件mon89034的代表性方法描述于事件特異性終點taqmanpcr，用于其的條件實例描述于表1和表2。用于該測定的dna引物為引物sq2842(seqidno:6)、sq2843(seqidno:7)、6famtm標記引物pb880(seqidno:14)和victm標記引物pb2931(seqidno:15)，6fam和vic為appliedbiosystems(fostercity,ca)的熒光染料產(chǎn)品，與dna引物連接。對于taqmanmgb探針，taqdna聚合酶的5'-胞外核酸酶活性由5'-末端切割熒光團和猝滅劑之間的探針。在與靶dna鏈雜交時，猝滅劑和熒光團在三維空間足夠分離，產(chǎn)生熒光(熒光團激發(fā)波長)信號。
sq2842(seqidno:6)和sq2843(seqidno:7)在與pb880(seqidno:14)一起用于這些反應(yīng)方法時產(chǎn)生dna擴增子，該擴增子診斷事件mon89034dna。用于該分析的對照應(yīng)包括得自含有事件mon89034dna的玉米的陽性對照、得自非轉(zhuǎn)基因玉米或非事件mon89034的轉(zhuǎn)基因玉米的陰性對照以及不含模板dna的陰性對照。
sq1564(seqidno:17)和sq1565(seqidno:18)在與pb351(seqidno:21)一起用于這些反應(yīng)方法時，產(chǎn)生診斷mon89034中的cry1a.105的擴增子。
這些測定為用于appliedbiosystemsgeneamppcrsystem9700或stratagenerobocycler、mjengine、perkin-elmer9700或eppendorfmastercyclergradient熱循環(huán)儀進行了優(yōu)化。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的、產(chǎn)生鑒定事件mon89034dna的擴增子的其它方法和裝置在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。
在生物樣品中特異性結(jié)合seqidno:1或其完全互補序列、并含有如在seqidno:1中所示的至少11個連續(xù)核苷酸、或者視情況含有seqidno:1中序列的反向互補物的任何探針，只要可以檢測到結(jié)合，就可用于診斷該樣品中玉米事件mon89034dna的存在情況。在生物樣品中特異性結(jié)合seqidno:2或其完全互補序列、并含有如在seqidno:2中所示的至少11個連續(xù)核苷酸、或者視情況含有seqidno:2中序列的反向互補物的任何探針，只要可以檢測到結(jié)合，就可用于診斷該樣品中玉米事件mon89034dna的存在情況。
用于或設(shè)計用于由含有玉米dna的生物樣品產(chǎn)生擴增子以及含有seqidno:1或seqidno:2中的任一個或者視情況含有這兩個序列的擴增子的任何引物對，被認為屬于本發(fā)明的范圍。對于本文公開的本發(fā)明用途，含有seqidno:1或seqidno:2中的任一個或這二者的任何這樣的擴增子，均用于診斷所述生物樣品中玉米事件mon89034dna的存在情況。提供以下實施例供本領(lǐng)域技術(shù)人員參考。
表1.玉米mon89034事件特異性終點taqmanpcr
可使用任何用于熱循環(huán)的方法設(shè)置和進行dna擴增，包括人工操作或電控操作溫度步驟和循環(huán)。已成功使用stratagenerobocycler、mjengine、perkin-elmer9700或eppendorfmastercyclergradient熱循環(huán)儀或appliedbiosystemsgeneamppcrsystem9700或mjresearchdnaengineptc-225熱循環(huán)儀實施下列循環(huán)參數(shù)。在使用eppendorfmastercyclergradient或mjengine進行pcr時，熱循環(huán)儀以計算模式循環(huán)。在使用perkin-elmer9700時，循環(huán)條件以設(shè)為最大的升溫速度實施。
表2.接合性測定熱循環(huán)儀條件
實施例2
本實施例闡述了含有診斷其基因組中的轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034的dna的玉米植物的鑒定，以及該玉米植物的接合性測定。
在接合性測定中描述了用于鑒定在其基因組中含有事件mon89034dna的純合子代和雜合子代的方法，在表3和表4中示例了用于該接合性測定的條件。用于接合性測定的示例性dna引物是引物sq2842(seqidno:6)、sq2843(seqidno:7)、sq6523(seqidno:10)、sq6524(seqidno:11)、6famtm標記引物pb880(seqidno:14)和victm標記引物pb2931(seqidno:15)。如上所示，6fam和vic是appliedbiosystems(fostercity,ca)的熒光染色產(chǎn)品，連接dna引物。
當(dāng)sq2842(seqidno:6)、sq2843(seqidno:7)、sq6523(seqidno:10)、sq6524(seqidno:11)一起用于熱擴增反應(yīng)時，產(chǎn)生用于診斷非玉米事件mon89034dna的玉米dna的dna擴增子(與玉米dna是來源于非轉(zhuǎn)基因樣品還是某些其它轉(zhuǎn)基因樣品無關(guān))，在所述熱擴增反應(yīng)中，含有模板dna的生物樣品含有診斷該樣品中玉米事件mon89034的存在情況的dna?；蛘?，反應(yīng)將由含有來源于玉米基因組的dna的生物樣品產(chǎn)生兩個不同的dna擴增子，所述來源于玉米基因組的dna對于和轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034中存在的插入dna對應(yīng)的等位基因是雜合的。這兩個不同的擴增子將對應(yīng)于來源于野生型玉米基因組基因座的第一擴增子和診斷玉米事件mon89034dna的存在情況的第二擴增子。僅產(chǎn)生對應(yīng)于針對雜合基因組描述的第二擴增子的單個擴增子的玉米dna樣品診斷樣品中玉米事件mon89034的存在情況，并診斷確定用作模板的玉米dna由對于和轉(zhuǎn)基因玉米事件mon89034插入dna對應(yīng)的等位基因為純合的玉米種子產(chǎn)生。該分析的對照應(yīng)包括得自含有事件mon89034dna的純合和雜合玉米的陽性對照、得自非轉(zhuǎn)基因玉米或任何其它轉(zhuǎn)基因玉米品種的陰性對照以及不含模板dna的陰性對照。該測定為用于stratagenerobocycler、mjengine、perkin-elmer9700或eppendorfmastercyclergradient熱循環(huán)儀進行了優(yōu)化。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的產(chǎn)生擴增子的其它方法和裝置包括在本技術(shù)領(lǐng)域的范圍內(nèi)，所述擴增子鑒定用mon89034植株產(chǎn)生的雜交后代的接合性。
表3.接合性測定反應(yīng)溶液
在stratagenerobocycler、mjengine、perkin-elmer9700或eppendorfmastercyclergradient熱循環(huán)儀或appliedbiosystemsgeneamppcrsystem9700或mjresearchdnaengineptc-225熱循環(huán)儀中進行的dna擴增已成功運行下列循環(huán)參數(shù)。在使用eppendorfmastercyclergradient或mjengine時，循環(huán)以計算模式運行。在使用perkin-elmer9700時，循環(huán)以設(shè)為最大的升溫速度運行。
表4.接合性測定熱循環(huán)儀條件a
a：使用appliedbiosystemsgeneamppcrsystem9700
對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因事件mon89034的種子已根據(jù)布達佩斯條約于2006年3月28日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc),10801universityboulevard,manassas,va.20110。atcc保藏號或?qū)＠２靥枮閜ta-7455。保藏物將在保藏處保藏30年，或在最后請求后保藏5年，或保藏專利的有效期，取更長久的那一個，并根據(jù)需要在該期限內(nèi)更換。
已經(jīng)圖解和詳述了本發(fā)明的原理，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)顯而易見的是，在不偏離這些原理的情況下，可在排列和細節(jié)上對本發(fā)明進行修改。我們要求保護在隨附權(quán)利要求書的精神和范圍內(nèi)的所有修改。
本說明書中引用的所有出版物和公開專利文件都在此引用作為參考，其引用程度如同每種單獨的出版物或?qū)＠暾埦唧w個別地指明引入作為參考一樣。
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<211>21
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>5'接合序列；對應(yīng)于seqidno:5的2051-2071
<400>1
aatgagtatgatggatcagca21
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>3'接合序列；對應(yīng)于seqidno:5的11295-11314
<400>2
actcattgcatccccggaaa20
<210>3
<211>2071
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>5'側(cè)翼序列加接合序列；對應(yīng)于seqidno:5的1-2071
<400>3
aatatttaaaaatggaagtaatactatattaaaatgattcatgtggaactcctgcgcttc60
tttttgaagtttcaaaagggagctttcagggtcgcttagagtttgtttggttggaaatac120
aagcgaaaagagagctaatgagggggacatccatattttctatggtgtttgaataagagt180
cacgcgggaataagatgaacaccgaaacaatttttttgtagctacgtggttccaaaaaat240
cgagtagacggtgtcgcttccacctcatactacttcaacctcaaaccacacatccttacg300
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ggtaggtaggtaggtggagatttttgttaactggtgttgttgacggactcgaacggggcc540
gggcgtgtggtgtggctagctgtggtggtttgctcgccagccagccagccacacatcagc600
gagcatgcagagcttaagcatgtatgtacggatcggcttgcttagcggttaagggtgtgt660
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actgaaatgttgtcagatgaaacagcagagccgatctccgcacggaaacccatgcacggc1980
cattcaaattcaggtgcccacgtacgtcagggtgctgctgctactactatcaagccaata2040
aaaggatggtaatgagtatgatggatcagca2071
<210>4
<211>914
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>3'側(cè)翼序列加接合序列；對應(yīng)于seqidno:5的11295-12208
<400>4
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<211>12208
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>5’側(cè)翼序列加插入的dna序列加3’側(cè)翼序列
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<210>6
<211>22
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列；對應(yīng)于seqidno:5的2034-2055
<400>6
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<210>7
<211>23
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列；對應(yīng)于seqidno:5的11345-11367
<400>7
ctttttctccatattgaccatca23
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>8
ggtatccctccagaccagca20
<210>9
<211>24
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>9
gtggactccttctggatgttgtaa24
<210>10
<211>21
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>10
gtcagggtgctgctgctgcta21
<210>11
<211>23
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>11
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<210>12
<211>24
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列；對應(yīng)于seqidno:5的2003-2026
<400>12
tacgtcagggtgctgctgctacta24
<210>13
<211>24
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>13
atratttycggggatgcaaccaac24
<210>14
<211>16
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列；對應(yīng)于seqidno:5的2061-2076
<400>14
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<210>15
<211>26
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>15
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<210>16
<211>26
<212>dna
<213>人工的
<220>
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<400>16
ctgtcaagccaataaaagggttgttt26
<210>17
<211>20
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>17
caactcgtccgtgagcatca20
<210>18
<211>24
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列；對應(yīng)于seqidno:5的4605-4628的序列的反向互補物
<400>18
aactcagcactacggtgtatccaa24
<210>19
<211>16
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>19
gcctgccgcagaccaa16
<210>20
<211>22
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>20
caatgcagagctcagcttcatc22
<210>21
<211>17
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列；對應(yīng)于seqidno:5的4587-4603
<400>21
cagagctcctatgttct17
<210>22
<211>26
<212>dna
<213>人工的
<220>
<223>合成序列
<400>22
tccagtacgtgcagtccctcctccct26