本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)用于治療或管控HIV/AIDS的組合物的用途。本發(fā)明的方法包括施用包含有效量的雙膦酸鹽的制劑以抑制單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞活性和/或降低炎癥和/或減少HIV儲(chǔ)庫(kù)。組合物的使用可以補(bǔ)充抗病毒療法，諸如高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)。

技術(shù)背景

人免疫缺陷病毒感染/獲得性免疫缺陷綜合征(HIV/AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的人免疫系統(tǒng)的疾病。自從其在1980年代初發(fā)現(xiàn)以來(lái)，AIDS已變?yōu)榱餍胁∏乙鸪^(guò)2500萬(wàn)例死亡。目前全球約3500萬(wàn)人攜帶HIV/AIDS生活，迫切需要該疾病的有效、可負(fù)擔(dān)、長(zhǎng)期的治療和管控。

HIV可感染各種免疫細(xì)胞，其中CD4⁺T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是主要目標(biāo)。HIV首先通過(guò)病毒包膜與細(xì)胞膜的融合且將HIV衣殼釋放至細(xì)胞中而攻擊目標(biāo)細(xì)胞。在受感染細(xì)胞內(nèi)，HIV的單鏈RNA基因組被逆轉(zhuǎn)錄為雙鏈病毒DNA，并且病毒DNA被整合至受感染細(xì)胞的基因組中。然后，受感染細(xì)胞的細(xì)胞機(jī)制被劫持以產(chǎn)生RNA基因組以及病毒的蛋白組分，其在受感染細(xì)胞內(nèi)裝配成未成熟的HIV病毒粒子。在細(xì)胞表面最終裝配之后，未成熟的HIV病毒粒子從受感染細(xì)胞的細(xì)胞膜出芽，并且在蛋白酶切割的最后步驟之后，釋放所得成熟病毒粒子，完成復(fù)制循環(huán)。HIV在感染之后的前2-4周快速?gòu)?fù)制，導(dǎo)致循環(huán)CD4⁺T細(xì)胞數(shù)量的顯著下降。在調(diào)動(dòng)仍然大部分完整的免疫系統(tǒng)以對(duì)抗HIV復(fù)制后，病毒水平受到控制，并且CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)穩(wěn)定，使得HIV感染進(jìn)入臨床潛伏，并且潛伏可持續(xù)約三年至超過(guò)20年。隨著HIV侵蝕免疫系統(tǒng)，CD4⁺T細(xì)胞的水平最終下降至報(bào)警水平，并且HIV感染進(jìn)展為AIDS。AIDS患者經(jīng)常由于其免疫系統(tǒng)的崩潰而死于機(jī)會(huì)性感染。HIV也可損害神經(jīng)系統(tǒng)，在感染早期通過(guò)受感染免疫細(xì)胞進(jìn)入腦部，并進(jìn)一步傳播至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)駐留的免疫細(xì)胞，諸如小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。這些感染可損害腦部和脊髓并引起癥狀諸如混亂和健忘，行為改變，頭痛，進(jìn)行性無(wú)力和手臂和腿部的感覺(jué)喪失。

AIV/AIDS的主流治療是高度活性的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)，其使用包括多種類(lèi)型的抗病毒劑的化合物的組合(或“混合物(cocktail)”)。受感染個(gè)體中的病毒產(chǎn)生主要是涉及具有游離病毒和病毒產(chǎn)生細(xì)胞的快速更新的活化的CD4⁺T細(xì)胞的連續(xù)輪次的重新感染和復(fù)制的動(dòng)態(tài)過(guò)程的結(jié)果。這些抗病毒混合物抑制HIV復(fù)制周期的步驟，包括進(jìn)入、逆轉(zhuǎn)錄、整合、裝配和釋放。因此，HAART暫停HIV復(fù)制周期，引起未成熟的HIV病毒粒子和宿主細(xì)胞的消耗，導(dǎo)致HIV感染的遏制。

然而，目前的抗病毒療法無(wú)法根除HIV感染，因?yàn)槠渌麳IV感染的細(xì)胞，包括靜息記憶CD4⁺T細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，具有長(zhǎng)半衰期，因此充當(dāng)病毒儲(chǔ)庫(kù)。HAART還具有高成本、不利的毒性作用、藥物相互作用和耐藥性的缺點(diǎn)。這些不良反應(yīng)有時(shí)使得有必要引入結(jié)構(gòu)化治療中斷(“TI”或藥物假期)或完全停止治療。耐藥性是HAART中的重要問(wèn)題：HIVRNA的逆轉(zhuǎn)錄易于出錯(cuò)，導(dǎo)致將突變引入病毒基因組。持續(xù)的抗病毒藥物施用為耐藥性突變病毒株提供了天然選擇。存在這樣的理論：TI可允許更“適合的”野生型藥物敏感的病毒的生長(zhǎng)超過(guò)不太“適合的”耐藥突變株。由于該額外原因，經(jīng)常推薦以結(jié)構(gòu)化方式中斷抗病毒療法。然而，血漿病毒載量(VL)的反彈和CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)的下降在TI期間是常見(jiàn)的，由此否定HAART治療的效果。在HIV儲(chǔ)庫(kù)中隔絕的病毒粒子，特別是耐藥性病毒粒子，在TI期間不再被抑制，并且可以成熟并被釋放。這被認(rèn)為是TI期間治療挫折以及當(dāng)隨后重新引入時(shí)HAART頻繁提供的不太有效的抑制的原因。

受感染的靜息記憶CD4⁺T細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是HIV的儲(chǔ)庫(kù)，包括耐藥性毒株。此外，單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，例如TNFα，其在其它受感染細(xì)胞(例如CD4⁺T細(xì)胞)中誘導(dǎo)HIV復(fù)制。受感染的活化巨噬細(xì)胞能夠觸發(fā)未感染的T細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，并保護(hù)HIV感染的T細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡。因此，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞提供了準(zhǔn)備在TI期間復(fù)制的病毒池，并且它們的生理活性進(jìn)一步放大HIV感染對(duì)免疫系統(tǒng)的損害。一些研究已靶向單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作為HIV/AIDS的治療，然而，這些方法的治療效力已受限制。

測(cè)試通過(guò)選擇性單采血液成分術(shù)(apheresis)清除循環(huán)單核細(xì)胞的效果的臨床研究產(chǎn)生了混合結(jié)果。選擇性單采血液成分術(shù)涉及將HIV感染的接受HAART的患者的血液通過(guò)體外裝置以去除循環(huán)單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。在一項(xiàng)研究中，在HAART治療期間的單采血液成分術(shù)與對(duì)照相比不影響血漿HIV-1RNA載量，但在3-4次單采血液成分術(shù)期間之后降低TNFα水平且增加CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)。(Beretta,A.等人,J.Biol.Regulators and Homeostatic Agents 14,27-31(2000).)在另一項(xiàng)研究中，在TI的前5周期間進(jìn)行單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的選擇性單采血液成分術(shù)。在重新引入HAART后，單采血液成分術(shù)組表現(xiàn)出CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加。HAART重新引入未能抑制大多數(shù)、但不是所有對(duì)照組中的病毒反彈，而大部分單采血液成分術(shù)組表現(xiàn)出病毒學(xué)抑制。在一些單采血液成分術(shù)組中觀(guān)察到高達(dá)52％的單核細(xì)胞HIV病毒載量的降低，但在其它中觀(guān)察到與對(duì)照相當(dāng)?shù)脑鰪?qiáng)。(Hasson,H.等人,J.Med.Virol.79,1640-49(2007).)這些有限的結(jié)果可能是由于以下事實(shí)負(fù)責(zé)：?jiǎn)尾裳撼煞中g(shù)導(dǎo)致循環(huán)單核細(xì)胞僅30％的平均降低，并且循環(huán)單核細(xì)胞代表全身單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞池的一小部分。這樣的方法的另一個(gè)限制在于單采血液成分術(shù)是侵入性和耗時(shí)的住院患者程序，其可對(duì)患者造成顯著負(fù)擔(dān)。

其他研究人員還在HIV動(dòng)物模型中測(cè)試了巨噬細(xì)胞抑制藥物，并且在HAART停止之后看到對(duì)病毒載量對(duì)照和CD4⁺T細(xì)胞反彈的陽(yáng)性效應(yīng)。為了實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的特異和有效的靶向，將藥物裝載于紅細(xì)胞血影(爆發(fā)的紅血細(xì)胞)中。(參見(jiàn)Cervasi,B.等人,J.Viol.80,10335-45(2006)；Serafini,S.等人,Antirivial Res.81,93-102(2009).)然而，紅細(xì)胞血影難以制備和儲(chǔ)存，使它們不是以大量需求遞送藥物的理想選擇。此外，紅細(xì)胞血影因?yàn)楣逃械臐B漏和消除紅血細(xì)胞的正常生理過(guò)程而迅速釋放其內(nèi)容物。所得升高的血漿藥物濃度導(dǎo)致毒理學(xué)問(wèn)題。(參見(jiàn)Lanao,J.M.等人,J.Drug Targeting 15(1),21-36(2007).)

因?yàn)榭茖W(xué)家仍未找到可靠的治愈或有效的HIV疫苗，所以至關(guān)重要的是減緩HIV感染的進(jìn)展并盡可能長(zhǎng)地維持臨床潛伏。因此，本領(lǐng)域需要一種安全且有效的方法來(lái)抑制HIV/AIDS患者中的病毒復(fù)制以補(bǔ)充HAART，特別是在TI期間。此外，期望這樣的方法易于施用，并且具有大量產(chǎn)生的潛能以滿(mǎn)足大量HIV/AIDS群體的需求。

本發(fā)明提供了特異性靶向單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、HIV潛伏儲(chǔ)庫(kù)、預(yù)防或延緩HIV病毒載量的反彈的優(yōu)點(diǎn)。預(yù)期該配方改善TI安全性并延長(zhǎng)TI的長(zhǎng)度。考慮到HAART對(duì)HIV/AIDS患者和公共衛(wèi)生系統(tǒng)的身體和財(cái)務(wù)負(fù)擔(dān)，高度期望更安全和更長(zhǎng)的TI用于長(zhǎng)期管控疾病。與現(xiàn)有技術(shù)相比，作為HIV/AIDS抗病毒療法的輔助療法，本發(fā)明的制劑易于施用，非侵入性，易于儲(chǔ)存和分配，并且適于大量生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及用于治療或管控HIV/AIDS的藥物組合物的用途，特別是在TI期間或在抗病毒療法停止之后補(bǔ)充和維持抗病毒療法的效果的用途。本發(fā)明的方法包括在設(shè)計(jì)以抑制吞噬細(xì)胞的活性和/或減少吞噬細(xì)胞的數(shù)量的制劑中施用有效量的一種或多種治療劑。這樣的吞噬細(xì)胞包括，但不限于，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞。治療劑優(yōu)選包括雙膦酸鹽。這樣的根據(jù)本發(fā)明的施用目的在于在抗病毒療法和TI期間抑制或消耗HIV儲(chǔ)庫(kù)(包括潛伏儲(chǔ)庫(kù))，以及幫助增加外周CD4⁺T細(xì)胞的水平，以便防止或延緩病毒的反彈，特別是當(dāng)適用TI時(shí)。

具體而言，本發(fā)明涉及通過(guò)向有需要的個(gè)體施用有效量的包含任選地與其它治療劑組合的雙膦酸鹽的制劑而消耗HIV儲(chǔ)庫(kù)(即單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)的數(shù)量和/或抑制其功能，用于治療或管控HIV/AIDS的方法。

雙膦酸鹽(以前稱(chēng)為二膦酸鹽)是特征在于兩個(gè)碳-磷酸(C-P)鍵的化合物。它們是內(nèi)源性無(wú)機(jī)焦磷酸鹽的類(lèi)似物，其參與骨形成和再吸收的調(diào)節(jié)。如果兩個(gè)鍵位于同一碳原子上(P-C-P)，則它們被稱(chēng)為偕雙膦酸鹽，且術(shù)語(yǔ)雙膦酸鹽通常用于偕雙膦酸鹽和非偕雙膦酸鹽。雙膦酸鹽和焦磷酸鹽有時(shí)可以一起形成聚合鏈。在臨床環(huán)境中，雙膦酸鹽主要用作骨吸收和異位鈣化的有效抑制劑；最近，正在探索它們?cè)谄渌I(lǐng)域的臨床適應(yīng)癥，并且已經(jīng)顯示脂質(zhì)體包裹的雙膦酸鹽治療心血管病況，包括再狹窄。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,719,998。

該方法中使用的制劑可以包含包封的、包埋的或微粒狀的雙膦酸鹽。該制劑包含具有允許該制劑主要或僅經(jīng)由吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞的特性的顆粒，因此預(yù)期該制劑特異性靶向吞噬細(xì)胞。不受理論所束縛，一旦被靶向的吞噬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞吞噬，雙膦酸鹽就被釋放至吞噬細(xì)胞中，并抑制其功能和/或消耗其數(shù)量。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法中使用的制劑包含包封于適當(dāng)尺寸的脂質(zhì)體中的雙膦酸鹽。脂質(zhì)體包封的雙膦酸鹽，憑借其允許該制劑主要或僅通過(guò)吞噬作用攝取的特性，諸如脂質(zhì)體的大小、電荷、電導(dǎo)率和脂質(zhì)組成，特異性靶向單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞。一旦被吞噬細(xì)胞攝取，脂質(zhì)體包封的雙膦酸鹽就在細(xì)胞內(nèi)釋放，以抑制單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的活性和/或殺死單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法使用包含包埋在具有適于吞噬攝取的粒徑的載體中的雙膦酸鹽的制劑。包埋載體還可以具有使其成為巨噬細(xì)胞和/或單核細(xì)胞的吞噬目標(biāo)的電荷或表面特性。

在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法使用包含微粒形式的雙膦酸鹽的制劑，所述微粒具有適于吞噬攝取的大小。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑在抗病毒療法期間施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑在TI期間施用。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑在抗病毒療法期間和TI期間均施用。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑在即將停止抗病毒療法之前施用。所述抗病毒療法可以是HAART。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括特異性靶向單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、HIV儲(chǔ)庫(kù)，以及預(yù)防或延緩HIV病毒載量的反彈。預(yù)期該配方改善TI安全性并延長(zhǎng)TI周期?？紤]到HAART對(duì)HIV/AIDS患者和公共衛(wèi)生系統(tǒng)兩者的身體和財(cái)務(wù)負(fù)擔(dān)，高度期望更安全和更長(zhǎng)的TI用于長(zhǎng)期管控該疾病。與現(xiàn)有技術(shù)相比，作為HIV/AIDS抗病毒治療的輔助療法，本發(fā)明的制劑易于施用，非侵入性，易于儲(chǔ)存和分配，并且適于大量生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1A-1B示出經(jīng)7天向食蟹猴施用單次劑量的0.1mg/kg脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽與媒介物對(duì)照相比對(duì)外周CD4+計(jì)數(shù)的影響。圖1A示出單核細(xì)胞的絕對(duì)頻率；圖1B示出單核細(xì)胞的相對(duì)頻率。

圖2A-2D示出在脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽的不同劑量方案之后不同時(shí)間的恒河猴中的血清化學(xué)。圖2A顯示血清白蛋白的濃度；圖2B顯示丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的濃度；圖2C顯示堿性磷酸酶的濃度；圖2D顯示總膽紅素。

圖3A-3B示出使用流式細(xì)胞術(shù)染色組測(cè)量的施用單次1mg/kg劑量的脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽與媒介物對(duì)照相比對(duì)恒河猴中的單核細(xì)胞頻率(圖3A)和單核細(xì)胞亞群頻率(圖3B)的影響。

圖4A-4D示出經(jīng)7天施用單次1mg/kg劑量的脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽與媒介物對(duì)照相比對(duì)恒河猴的全血中的單核細(xì)胞和三種單核細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)和頻率的影響。圖4A:全血；圖4B:CD14⁺CD16^-；圖4C:CD14⁺CD16⁺；圖4D:CD14^-CD16⁺。

圖5A-5E示出用于鑒定組織和骨髓中的巨噬細(xì)胞的設(shè)門(mén)方法。

圖6A-6C示出來(lái)自恒河猴中的各種組織的代表性組織駐留的巨噬細(xì)胞和骨髓髓樣前體染色。

圖7A-7C示出在脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽治療前后在恒河猴的組織和骨髓中的巨噬細(xì)胞和髓樣前體的頻率。圖7A：骨髓；圖7B：肝臟；圖7C：結(jié)腸。

圖8A-8C示出脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽對(duì)非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型中的單核細(xì)胞治療的影響。圖8A顯示通過(guò)CD45染色相比側(cè)向散射概況評(píng)價(jià)的全血中的單核細(xì)胞頻率；圖8B顯示絕對(duì)單核細(xì)胞計(jì)數(shù)；圖8C顯示使用BrdU之后的單核細(xì)胞更新。

圖9示出施用脂質(zhì)體雙膦酸鹽阿侖膦酸鹽1mg/kg與媒介物對(duì)照相比對(duì)SHIV感染的恒河猴的病毒載量的影響。

圖10示出施用1mg/kg脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽與媒介物對(duì)照相比對(duì)SHIV感染的恒河猴中的外周CD4+計(jì)數(shù)的影響。

注意的是提供附圖作為本發(fā)明的示例性理解，且示意性地示出本發(fā)明的特定實(shí)施方案。技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到同樣在本發(fā)明的范圍內(nèi)的其它類(lèi)似實(shí)例。附圖不旨在限制如所附權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的范圍。

具體實(shí)施方式

單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞易受HIV感染，并且感染的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞具有整合至其基因組中的病毒DNA。因?yàn)閱魏思?xì)胞和巨噬細(xì)胞具有長(zhǎng)壽命并且不頻繁循環(huán)，所以它們?cè)诳共《警煼ㄆ陂g充當(dāng)HIV的儲(chǔ)庫(kù)，庇護(hù)未成熟的HIV病毒粒子，該HIV病毒粒子可以在抗病毒療法中斷后釋放。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也分泌各種趨化因子，該趨化因子促進(jìn)HIV感染的進(jìn)一步傳播。

本發(fā)明提供藥物制劑，該藥物制劑用于在抗病毒療法期間和/或之后的一段時(shí)間通過(guò)減少或抑制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活性和/或消除或減少單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的量來(lái)治療HIV感染。本發(fā)明的方法包括在被單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞選擇性攝取的制劑中施用有效量的雙膦酸鹽。考慮施用以補(bǔ)充抗病毒療法，諸如HAART，以便在抗病毒療法的中斷期間預(yù)防或延緩病毒載量的反彈和增加CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)。預(yù)期這可以允許延長(zhǎng)TI周期，由此延緩重新引入抗病毒療法的需求。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在抗病毒療法期間施用制劑以起始單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞抑制作用，在TI期間持續(xù)并持續(xù)直到療法停止。期望該制劑的HIV抑制作用在TI期間持續(xù)，因此該制劑可以在抗病毒療法中斷之前的短時(shí)段內(nèi)施用，例如在抗病毒療法中斷之前約3天、或約5天、或約7天、或約10天內(nèi)施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑在TI期間施用。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑在抗病毒療法期間和TI期間均施用。在抗病毒療法期間和/或在TI期間多次施用該制劑以達(dá)到有效量并持續(xù)期望時(shí)間段維持HIV抑制效果在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

使用本發(fā)明的制劑，例如包封的、包埋的或微粒狀雙膦酸鹽，選擇性滅活作為重要的HIV儲(chǔ)庫(kù)的單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞和/或消耗作為重要的HIV儲(chǔ)庫(kù)的單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的數(shù)量。因?yàn)槠涮囟ù笮『?或其它物理化學(xué)特性，該制劑將主要或僅通過(guò)吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞。因此，本發(fā)明的制劑特異性靶向吞噬細(xì)胞，諸如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。一旦在吞噬細(xì)胞內(nèi)，雙膦酸鹽就被釋放，并抑制、滅活、喪失能力、殺死和/或消耗單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞。

如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“吞噬作用”是指進(jìn)入吞噬細(xì)胞的優(yōu)選方式，并且是本領(lǐng)域眾所周知的。然而，該術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)理解為還涵蓋也可以實(shí)現(xiàn)相同效果的內(nèi)吞作用的其它形式。具體而言，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的方法和組合物還涵蓋胞飲作用、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和用于從胞外吸收/內(nèi)化物質(zhì)的其它細(xì)胞方式。

雙膦酸鹽

該制劑中使用的治療劑是雙膦酸鹽或其類(lèi)似物。如本文所使用的術(shù)語(yǔ)雙膦酸鹽表示偕雙磷酸鹽和非偕雙磷酸鹽。該治療劑在其范圍內(nèi)還涵蓋雙膦酸鹽或焦磷酸鹽的聚合鏈，具體地由最多達(dá)40個(gè)雙膦酸鹽單體組成的這樣的鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙膦酸鹽具有下式(I)：

其中R₁是H、OH或鹵素原子；且R₂是鹵素；直鏈或支鏈的C₁-C₁₀烷基或C₂-C₁₀烯基，所述直鏈或支鏈的C₁-C₁₀烷基或C₂-C₁₀烯基任選地被雜芳基或雜環(huán)基C₁-C₁₀烷基氨基或C₃-C₈環(huán)烷基氨基取代，其中氨基是伯氨基、仲氨基或叔氨基；-NHY，其中Y是氫、C₃-C₈環(huán)烷基、芳基或雜芳基；或R₂是-SZ，其中Z是氯取代的苯基或吡啶基。

根據(jù)本發(fā)明可以使用的其它雙膦酸鹽包括，但不限于，氯膦酸鹽、替魯膦酸鹽、3-(N,N-二甲基氨基)-1-羥基丙烷-1,1-二膦酸，即二甲基-APD；1-羥基-亞乙基-1,1-雙膦酸，即，依替膦酸鹽；1-羥基-3(甲基戊基氨基)-亞丙基-雙膦酸，(伊班膦酸)，即，伊班膦酸鹽；6-氨基-1-羥基己烷-1,1-二膦酸，即，氨基-己基-BP；3-(N-甲基-N-戊基氨基)-1-羥基丙烷-1,1-二膦酸，即，甲基-戊基-APD；1-羥基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1,1-二膦酸,即，唑來(lái)膦酸；1-羥基-2-(3-吡啶基)乙烷-1,1-二膦酸(利塞膦酸)，即，利塞膦酸鹽；3-[N-(2-苯基硫代乙基)-N-甲基氨基]-1-羥基丙烷-1,1-雙膦酸；1-羥基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷-1,1-雙膦酸，1-(N-苯基氨基硫代羰基)甲烷-1,1-二膦酸,即，F(xiàn)R 78844(Fujisawa)；5-苯甲?；?3,4-二氫-2H-吡唑-3,3-二膦酸四乙酯，即，U81581(Upjohn)；和1-羥基-2-咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)乙烷-1,1-二膦酸，即，YM529，或其類(lèi)似物。上述雙膦酸鹽中的一些的化學(xué)式描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,719,998(其通過(guò)引用并入本文)中。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，雙膦酸鹽是阿侖膦酸鹽或其類(lèi)似物。在這樣的實(shí)施方案中，式I具有R1＝OH和R2＝(CH₂)₃-NH₃。

阿侖膦酸鹽是提供良好的治療窗口[17,21,22]的第二代含氮雙膦酸鹽。通常，含氮雙膦酸鹽包含特別在本發(fā)明中有用的優(yōu)選的雙膦酸鹽亞類(lèi)。這樣的雙膦酸鹽可以基于其模擬阿侖膦酸鹽的生物活性的能力來(lái)選擇。這包括，例如：一旦在這樣的細(xì)胞內(nèi)就抑制吞噬細(xì)胞活性(例如，巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)的體外活性；抑制從巨噬細(xì)胞分泌IL-1和/或IL-6和/或TNF-α；和體內(nèi)活性，例如受測(cè)制劑消耗動(dòng)物模型或人體中的血液?jiǎn)魏思?xì)胞或使動(dòng)物模型或人體中的血液?jiǎn)魏思?xì)胞喪失能力或治療HIV/AIDS的能力。

制劑、藥物組合物和施用途徑

本發(fā)明的制劑可以制備為具有適于僅僅或主要通過(guò)吞噬作用細(xì)胞內(nèi)化、由此為吞噬細(xì)胞諸如巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞賦予特異性的粒徑。優(yōu)選制備含有根據(jù)本發(fā)明的雙膦酸鹽的制劑，使得所述制劑具有將僅僅或主要通過(guò)吞噬作用內(nèi)化的粒徑，即優(yōu)選大于0.03微米。例如，這樣的制劑可以具有這樣的粒徑，例如約0.03-1.0微米、或約0.1-0.3微米、或約0.1-0.18微米、或約0.07-0.5微米、或約0.07-0.15微米的平均直徑。在施用于有需要的患者之前，可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)確定制劑顆粒的大小。例如，可以使用利用激光散射的Nicomp Submicron Particle Sizer(型號(hào)370,Nicomp,Santa Barbara,Calif.)。

可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法將雙膦酸鹽摻入可以?xún)H僅或主要通過(guò)吞噬作用攝入細(xì)胞的制劑中。該制劑可以隔離雙膦酸鹽足夠時(shí)間以增強(qiáng)向目標(biāo)位點(diǎn)的遞送。該制劑可以具有影響或增強(qiáng)吞噬作用的電荷或表面特性。此外，當(dāng)在目標(biāo)位點(diǎn)處的目標(biāo)細(xì)胞(例如，單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞)內(nèi)時(shí)，該制劑可以排出雙膦酸鹽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，雙膦酸鹽被包封。包封形式意指具有充當(dāng)治療劑的屏障的結(jié)構(gòu)的包封物，諸如例如聚合物或脂質(zhì)遞送系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，包封劑是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體包含包封雙膦酸鹽的脂質(zhì)成分，并且脂質(zhì)體可以是單一脂質(zhì)層或可以是多層的。所述脂質(zhì)體可以是帶正電荷的，中性的或帶負(fù)電荷的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體是帶負(fù)電荷的。根據(jù)本發(fā)明的合適的脂質(zhì)體優(yōu)選是無(wú)毒脂質(zhì)體，諸如例如由磷脂酰-膽堿、磷酸甘油和膽固醇制備的脂質(zhì)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)成分可包括，例如，二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和膽固醇(chol)。例如，所述脂質(zhì)體可以包含3:1:2摩爾比的DSPC:DSPG:chol。雙膦酸鹽的質(zhì)量與脂質(zhì)成分的質(zhì)量的比率，稱(chēng)為藥物:脂質(zhì)比，可以為約1:5至1:8(以重量計(jì))，或約1:6至1:7(以重量計(jì))。在某些實(shí)施方案中，可以使用，諸如，例如，DSPC、DSPG和膽固醇中包封的阿侖膦酸鈉，可以使用藥物:脂質(zhì)質(zhì)量比為1:5.7–等于對(duì)于阿侖膦酸鈉的約1:3摩爾比。作為另一個(gè)實(shí)例，在相同脂質(zhì)成分中包封氯膦酸二鈉，可以使用約1:5.4的質(zhì)量比，其等于1:3摩爾比。其它雙膦酸鹽和其它脂質(zhì)組合的摩爾比的確定在本領(lǐng)域的技術(shù)之內(nèi)。

該制劑的脂質(zhì)體具有允許主要經(jīng)由吞噬作用攝取的特定特征，包括大小、電荷、pH、電導(dǎo)率和重量摩爾滲透壓濃度。使用的脂質(zhì)體的直徑可以在適合于通過(guò)單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的吞噬作用的大小范圍內(nèi)，例如，0.03-1.0微米的范圍內(nèi)，或者該直徑可以具有在如本文所述范圍內(nèi)的大小或大小范圍。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體可以具有約0.08±0.005微米的直徑。所述脂質(zhì)體的電導(dǎo)率可以為，例如約13.5-17.5ms/cm。所述脂質(zhì)體的外部重量摩爾滲透壓濃度可以與人體的重量摩爾滲透壓濃度匹配，并且內(nèi)部重量摩爾滲透壓濃度可以更低，因?yàn)楦偷闹亓磕枬B透壓濃度可以增強(qiáng)制劑的穩(wěn)定性。因此，例如，內(nèi)部重量摩爾滲透壓濃度可以為約340-440osmol/kg。所述脂質(zhì)體和/或脂質(zhì)體制劑的內(nèi)部pH可以為約6.9。

脂質(zhì)體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法制備(參見(jiàn)，例如，J.,等人,J.DRUG TARGET,2:299-308(1994)；J.,等人,CALCIF.TISSUE INT.,53:139-145(1993)；Lasic,D..,LIPOSOMES TECHNOLOGY INC.,Elsevier,第3章,第63-105頁(yè)(1993)；Winterhalter,M,Lasic,D.D.,CHEM.PHYS.LIPIDS,54(1-3):35-43(1993年9月)；Epstein-Barash,H.,等人,J.CONTROLLED RELEASE,146:182-195(2010)；Epstein,H.等人,AAPS J,10:505-515(2008)；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,008,645；美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2010/0015213；美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2004/0266734；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)13/804,707)；其中所有都以其整體通過(guò)引用并入本文)。在一種這樣的方法中，脂質(zhì)體被形成為液態(tài)晶體雙層的堆疊，該液態(tài)晶體雙層被水化成水化的液態(tài)片材，該液態(tài)片材在振動(dòng)期間脫離并自行閉合以形成大的多層囊泡(MLV)(稱(chēng)為薄脂質(zhì)膜水化技術(shù))。一旦形成這些顆粒，可以使用聲能(超聲處理)或機(jī)械能(擠出)降低這些顆粒的大小。超聲處理通常產(chǎn)生小的單層囊泡(SUV)；并且脂質(zhì)擠出(在高壓下(最高達(dá)500psi)迫使脂質(zhì)懸浮液通過(guò)一系列聚碳酸酯過(guò)濾器(通常為0.8、0.4、0.2和0.1微米膜))產(chǎn)生具有接近所用過(guò)濾器的孔徑的直徑的顆粒。

基本均勻的脂質(zhì)體可以通過(guò)低壓方法制備，如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)2004/0266734和共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)13/804,707(其兩者均通過(guò)引用并入本文)中所述。簡(jiǎn)言之，例如，所述治療劑可以與預(yù)選的脂質(zhì)混合以形成囊泡，所述囊泡可以在單階段中通過(guò)具有單一預(yù)選大小的過(guò)濾器擠出，隨后超濾。該方法可以產(chǎn)生具有約0.03-0.5微米、約0.07-0.12微米、約0.07-0.15微米、約0.1-0.18微米和約0.1-0.3微米的粒徑的脂質(zhì)體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體可以如下制備：(1)混合雙膦酸鹽和預(yù)選的脂質(zhì)以形成多層囊泡(MLV)，(2)產(chǎn)生最終大小的囊泡，和(3)純化和選擇雙膦酸鹽負(fù)載的脂質(zhì)體。在步驟(1)中，通常將雙膦酸鹽溶解于水中，同時(shí)將精確稱(chēng)重的脂質(zhì)成分溶解于溶劑(諸如氯仿:甲醇(9:1)、乙醇:叔丁醇(1:1)或乙醇:叔丁醇:水(77:77:6v/v/v))中。然后將雙膦酸鹽溶液混入脂質(zhì)溶液中，并且可以采用溫和加熱以幫助混合。該過(guò)程導(dǎo)致雙膦酸鹽有效包封于MLV中，所述MLV大小不均勻且大于期望的最終大小。在步驟(2)中，使用機(jī)械方法來(lái)減小囊泡的大小并使囊泡具有均勻大小和形狀。本領(lǐng)域已知的方法包括超聲處理和擠出。可以通過(guò)施加壓力并迫使脂質(zhì)-藥物混合物通過(guò)具有遞減孔徑的一系列過(guò)濾器來(lái)擠出脂質(zhì)體?；蛘?，可以通過(guò)共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)13/804,707中描述的方法使用單級(jí)過(guò)濾和單一孔大小過(guò)濾器在低壓下擠出脂質(zhì)體。該方法可以節(jié)省操作成本和時(shí)間，并且可以相比于多級(jí)、高壓擠出增加產(chǎn)率。在步驟(3)中，將適當(dāng)包封的雙膦酸鹽與未包封的雙膦酸鹽、溶劑和脂質(zhì)分離。該步驟的示例性方法包括通過(guò)凝膠柱的凝膠過(guò)濾和通過(guò)膜的超濾。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，將雙膦酸鹽包埋于載體中，即具有期望特性(例如，具有在0.03-1.0微米范圍內(nèi)的粒徑)的包埋劑中。包埋的雙膦酸鹽包括包埋、包封和/或吸附于載體中、分散于載體基質(zhì)中、吸附或連接于載體表面上或任何這些形式的組合的雙膦酸鹽。在具體實(shí)施方案中，所述包埋劑(或載體)是微粒、納米顆粒、納米球、微球、微膠囊或納米膠囊(參見(jiàn)，例如，M.Donbrow:Microencapsulation and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy,CRC Press,Boca Raton,Fla.,347,1991)。術(shù)語(yǔ)“載體”包括聚合和非聚合的制劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述包埋劑是納米顆粒。所述納米顆粒可以是球形、非球形或聚合顆粒。所述治療劑可以包埋于納米顆粒中，均勻或不均勻地分散于聚合物基質(zhì)中，吸附于表面上，或者以任何這些形式的組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用于制造納米顆粒的聚合物是生物相容的和可生物降解的，諸如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)聚合物(PLGA)。然而，可用于制造納米顆粒的額外聚合物包括，但不限于，PLA(聚乳酸)及其共聚物，聚酐類(lèi)，聚烷基氰基丙烯酸酯類(lèi)(諸如聚異丁基氰基丙烯酸酯)，聚乙二醇類(lèi)，聚環(huán)氧乙烷類(lèi)及其衍生物，殼聚糖，白蛋白，明膠等。包埋的雙膦酸鹽可以具有例如0.03-1.0微米的大小范圍內(nèi)的粒徑，或者粒徑可以具有如本文所述的適合于由單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬的該范圍內(nèi)的大小或大小范圍，例如約0.03-1.0微米、或約0.1-0.3微米、或約0.1-0.18微米、或約0.07-0.5微米、或約0.07-0.15微米的平均直徑。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述雙膦酸鹽為微粒形式，該微粒各自具有期望特性。微粒形式包括未包封或包埋的任何不溶性懸浮或分散的微粒形式。微粒形式的雙膦酸鹽可以是懸浮或分散的膠體、聚集物、絮凝物、不溶性鹽、不溶性復(fù)合物和聚合鏈的形式。這樣的微粒不溶于它們儲(chǔ)存/施用的流體(例如，鹽水或水)中以及它們提供其治療效果的流體(例如，血液或血清)中。通常，“不溶性”是指一(1)份微粒狀化合物于超過(guò)一萬(wàn)(10,000)份溶劑中的溶解度?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知制備微粒或聚集物的任何方法。微粒狀雙膦酸鹽可以具有例如0.03-1.0微米的大小范圍內(nèi)的粒徑，或者粒徑可以具有如本文所述的適合于由單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬的該范圍內(nèi)的大小或大小范圍，例如約0.03-1.0微米、或約0.1-0.3微米、或約0.1-0.18微米、或約0.07-0.5微米、或約0.07-0.15微米的平均直徑。

盡管本發(fā)明的每種制劑被設(shè)計(jì)為吞噬作用的目標(biāo)，但除單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以外的吞噬細(xì)胞，諸如例如嗜中性粒細(xì)胞，可以吞噬顆粒，但將不受影響或影響較小，因?yàn)殡p磷酸鹽的活性對(duì)于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是相對(duì)排他的。由于脂質(zhì)體制劑的特定物理化學(xué)特性，非吞噬細(xì)胞相對(duì)地不能攝取該制劑。

在被單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞攝取之后，預(yù)期雙膦酸鹽對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞具有持續(xù)的抑制的活性。這種持續(xù)活性足以調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的炎性作用。因此，不需要藥劑的延遲釋放以維持抑制。因此，通過(guò)抑制單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，諸如例如通過(guò)使用包封的藥劑來(lái)治療某些疾病的方法，優(yōu)選為系統(tǒng)性療法，因?yàn)樗鲋苿┌邢蜓h(huán)單核細(xì)胞和組織駐留的巨噬細(xì)胞兩者。取決于制劑中的特定雙膦酸鹽，吞噬性單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞可不同響應(yīng)。例如，阿倫膦酸鹽包封的脂質(zhì)體可引起細(xì)胞凋亡，而氯膦酸鹽包封的脂質(zhì)體可引起壞死。

用于本發(fā)明方法中的制劑可以以用于施用的各種藥物形式提供，這取決于每個(gè)患者特異性的各種因素(例如，患者的病癥的嚴(yán)重度和類(lèi)型，年齡，體重，反應(yīng)，和過(guò)去病史)，制劑中的治療劑的數(shù)量和類(lèi)型，制劑的類(lèi)型(例如，包封的，包埋的，微粒狀的，等)，組合物的形式(例如，液體、半液體或固體形式)，和/或施用途徑(例如，口服，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，髓內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，經(jīng)皮，皮下，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，腸內(nèi)，局部，舌下，陰道，或直腸方式)。本發(fā)明的組合物中可以包括藥物載體、媒介物、賦形劑或稀釋劑，包括，但不限于，水，鹽水溶液，緩沖鹽水溶液，油類(lèi)(例如，石油，動(dòng)物油，植物油或合成油)，淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，稻米，面粉，白堊，硅膠，硬脂酸鈉，單硬脂酸甘油酯，滑石，氯化鈉，干燥脫脂乳，甘油，丙二醇，乙二醇，乙醇，右旋糖等。所述組合物，如果需要，也可以含有少量的潤(rùn)濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、散劑、緩釋制劑等的形式。

適合于不經(jīng)腸胃施用的制劑可以在水溶液中制備，優(yōu)選在生理相容的緩沖液諸如Hanks氏溶液、Ringer氏溶液或生理緩沖鹽水中制備。水性注射懸浮液可以含有增加混懸液的粘度的物質(zhì)，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。此外，活性化合物的混懸液可被制備為適當(dāng)?shù)挠托宰⑸浠鞈乙?。合適的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油諸如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，諸如油酸乙酯、甘油三酯或脂質(zhì)體。任選地，混懸液也可含有合適的穩(wěn)定劑或增加化合物的溶解度以制備高度濃縮的溶液的試劑。

雙膦酸鹽可以以任何形式提供，例如，包括其鹽，其鹽的溶劑化物和其水合物。因此，例如，當(dāng)包封時(shí)，雙膦酸鹽可以是固體或在溶液中，并且固體可以是溶劑化物或水合物。

制劑的施用

本發(fā)明意在涵蓋在一個(gè)或多個(gè)劑量的方案中施用含有有效量的一種或多種雙膦酸鹽的制劑，以治療或管控HIV/AIDS。使用的劑量數(shù)量將是實(shí)現(xiàn)期望效果所必需的，例如1、3、5、8或10，每天一次，b.i.d.，q.i.d.，或作為連續(xù)輸注經(jīng)一段時(shí)間連續(xù)。本發(fā)明的制劑可以與其它藥物組合施用。術(shù)語(yǔ)“組合”不限于在完全相同的時(shí)間施用藥物，而且意味著本發(fā)明的制劑和其它藥物以一定順序和在一定時(shí)間間隔內(nèi)施用于患者，以至于它們可以一起作用以提供比如果它們以其它方式施用時(shí)更大的益處。例如，本發(fā)明的制劑和其它藥物可以同時(shí)施用或在不同時(shí)間點(diǎn)以任何順序依次施用；然而，如果不同時(shí)施用，則它們應(yīng)當(dāng)在時(shí)間上足夠接近地施用，以便提供期望的治療效果。本發(fā)明制劑的每次施用，無(wú)論是否與其它藥物組合，可以分開(kāi)、以任何適當(dāng)形式和通過(guò)任何合適途徑進(jìn)行，所述途徑有效地將治療劑轉(zhuǎn)運(yùn)至適當(dāng)或期望的作用部位。本發(fā)明的制劑的優(yōu)選的施用方式包括靜脈內(nèi)(i.v.)和動(dòng)脈內(nèi)(i.a.)施用。其它合適的施用方式包括肌肉內(nèi)(i.m.)、皮下(s.c.)和腹膜內(nèi)(i.p.)以及口服(經(jīng)口)。這樣的施用可以是大劑量注射或輸注。另一種施用方式可以通過(guò)血管周?chē)f送。也可以根據(jù)本發(fā)明使用任何上述施用途徑的組合。

當(dāng)施用時(shí)，期望制劑以一定劑量和時(shí)間施用，所述劑量和時(shí)間使得單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞抑制作用持續(xù)整個(gè)隨后的TI。在一個(gè)實(shí)施方案中，在TI之前不久的期間，例如，抗病毒療法結(jié)束之前約3至約10天期間，施用制劑至少一次。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑可以在抗病毒療法期間施用多次。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑可以在TI期間施用，在剛剛先前的抗病毒療法期間有或沒(méi)有TI前施用。由于HIV/AIDS的管控是長(zhǎng)期努力并且可以包括由TI并列的多種抗病毒療法，因此根據(jù)本發(fā)明涵蓋在適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)與抗病毒療法方案和TI結(jié)合的多輪根據(jù)本發(fā)明的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞抑制治療。

術(shù)語(yǔ)“有效量”表示制劑中雙膦酸鹽的量，其有效抑制或降低單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活性以延長(zhǎng)活性病毒粒子的再度出現(xiàn)和/或有效消除或減少循環(huán)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的數(shù)量?？紤]制劑中的雙膦酸鹽的有效量提供長(zhǎng)期治療以補(bǔ)充HIV/AIDS的管控中的抗病毒療法。優(yōu)選的是，制劑中雙膦酸鹽的有效量持續(xù)一定時(shí)段抑制和/或消耗單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，所述時(shí)段為約一周，約兩周，優(yōu)選≥一個(gè)月，更優(yōu)選≥兩個(gè)月，仍更優(yōu)選≥三個(gè)月，最優(yōu)選最長(zhǎng)達(dá)或長(zhǎng)于六個(gè)月。技術(shù)人員可以通過(guò)將制劑施用于有需要的個(gè)體(或這樣的個(gè)體的動(dòng)物模型)并監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的抑制/消耗水平來(lái)經(jīng)驗(yàn)性地確定有效期。也可以將抑制時(shí)間與適當(dāng)期望臨床效果(例如HIV病毒載量的抑制和/或CD4⁺T細(xì)胞水平的增加)關(guān)聯(lián)。

制劑中雙膦酸鹽的有效量可取決于幾個(gè)因素，包括，但不限于：患者的性別、年齡和體重；制劑的施用方式；用于包封或包埋雙膦酸鹽的載體的類(lèi)型(例如，其是快速釋放雙膦酸鹽的載體還是經(jīng)一段時(shí)間釋放雙膦酸鹽的載體)；治療方案(例如，制劑是每幾天施用一次，每幾周施用一次還是每次抗病毒療法施用一次)；HIV/AIDS的狀態(tài)，包括在施用制劑前后的受治療個(gè)體的病毒的毒株、病毒載量和CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)；在抗病毒混合物中使用的藥物的類(lèi)型和量；患者的耐藥性；患者的基因型，因?yàn)榛颊叩幕蛐蜕婕癏IV/AIDS易感性；抗病毒療法的持續(xù)時(shí)間；TI的持續(xù)時(shí)間。技術(shù)人員，通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，可以基于上述因素或其它相關(guān)因素和本文的描述確定有效量。

用于人使用的本發(fā)明制劑的雙膦酸鹽的示例性、非限制性劑量考慮為，例如，約1.5ng/kg至約10mg/kg體重、或約15ng/kg至約15微克/kg體重、或約0.15mg/kg至約15微克/kg體重、或約0.15mg/kg至約1.5mg/kg體重。因此，例如，患者可接受約0.1微克至約1mg、例如約0.1微克、或約1微克、或約10微克、或約100微克或約1mg范圍內(nèi)的劑量。也可以使用其它劑量，這取決于使用的具體雙膦酸鹽、具體的制劑和劑量方案，這可以由技術(shù)人員容易地確定。

從細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于確定用于人使用的制劑的劑量范圍。制劑中的雙膦酸鹽的劑量?jī)?yōu)選導(dǎo)致包括ED₅₀的循環(huán)濃度的范圍，其毒性很少或沒(méi)有毒性。特定患者的劑量將取決于采用的具體制劑、利用的施用途徑和患者的狀況或特征。對(duì)于本發(fā)明方法中使用的任何制劑，可以最初從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)估計(jì)有效劑量?？梢耘渲苿┝浚员阍趧?dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)循環(huán)血漿濃度范圍，其包括如細(xì)胞培養(yǎng)物中所測(cè)定的IC₅₀(即，實(shí)現(xiàn)癥狀的半數(shù)最大抑制的測(cè)試化合物的濃度)。這樣的信息可以用于更準(zhǔn)確地確定人體中的有用劑量。血漿中的水平可以，例如，通過(guò)高效液相色譜法來(lái)測(cè)量。人的有效劑量可以經(jīng)由臨床試驗(yàn)進(jìn)一步確定。

治療效用的表征

在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制或降低單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞活性和/或消除或減少單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量的期望治療結(jié)果是持續(xù)足夠時(shí)間段的HIV病毒載量的抑制和/或CD4⁺T細(xì)胞的增加。足夠時(shí)間段可以是整個(gè)TI時(shí)段。在某些情況下，足夠時(shí)段可以比整個(gè)TI時(shí)段更長(zhǎng)或更短。

本發(fā)明的治療方法的毒性和效力可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序來(lái)確定，所述標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序例如用于測(cè)定LD₅₀(對(duì)50％群體致死的劑量)，無(wú)可觀(guān)察的不良反應(yīng)水平(NOAEL)和ED₅₀(50％群體中的治療有效劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)，并且其可以被表示為比率LD₅₀/ED₅₀或NOAEL/ED₅₀。表現(xiàn)出大治療指數(shù)的制劑是優(yōu)選的。盡管可以使用表現(xiàn)出毒性副作用的制劑，但應(yīng)當(dāng)注意設(shè)計(jì)將這樣的制劑的藥劑靶向至目標(biāo)細(xì)胞的部位的遞送系統(tǒng)，以便使對(duì)未受影響的細(xì)胞的潛在損害最小化，由此減少副作用。此外，這樣的制劑的藥物載體應(yīng)該設(shè)計(jì)成控制藥物釋放，使得釋放的藥物的水平不超過(guò)任何毒性限值。

本發(fā)明方法的方案和組合物優(yōu)選在用于人體之前針對(duì)期望治療活性進(jìn)行體外測(cè)試，然后體內(nèi)測(cè)試。這樣的體外測(cè)定的一個(gè)實(shí)例是單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，使單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)并暴露于或以其它方式施用于細(xì)胞，并觀(guān)察該試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的影響，例如，抑制或降低活性和/或完全或部分的細(xì)胞死亡。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞可以獲得自建立的細(xì)胞系或最近作為原代細(xì)胞系分離自個(gè)體。本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的許多試驗(yàn)可用于測(cè)量該制劑對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的活性，例如，通過(guò)定量趨化因子諸如巨噬細(xì)胞化學(xué)誘導(dǎo)蛋白-1(MCP-1)、白介素1β(IL-1B)、組織壞死因子α(TNF-α)和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)的水平。本領(lǐng)域中的許多試驗(yàn)可用于評(píng)價(jià)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的存活和/或生長(zhǎng)；例如通過(guò)測(cè)量³H-胸苷摻入，通過(guò)直接細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過(guò)檢測(cè)已知基因諸如原癌基因(例如，fos，myc)或細(xì)胞周期標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄活性的變化來(lái)測(cè)定細(xì)胞增殖；可以通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。

本文引用的所有公開(kāi)的文章、書(shū)籍、參考手冊(cè)和摘要的內(nèi)容在此以其整體通過(guò)引用并入，以更完全描述本發(fā)明所述領(lǐng)域的狀態(tài)。

實(shí)施例

本文所述的以下實(shí)施例意在示出和例舉實(shí)施本發(fā)明的各個(gè)方面，而不意在以任何方式限制本發(fā)明。

脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽(LA)可以，例如，根據(jù)以下中描述的方法來(lái)制備：Epstein-Barash,H.,等人,J.CONTROLLED RELEASE,146:182-195(2010)；Epstein,H.等人,AAPS J,10:505-515(2008)；和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)13/804,707。更具體地，為了實(shí)施例2-7的目的，根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)13/804,707(其在本文中作為實(shí)施例1再現(xiàn))制備LA。

實(shí)施例1-脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽制備

產(chǎn)生包封于含有膽固醇、DSPC和DSPG的脂質(zhì)體中且分散于磷酸鹽緩沖鹽水溶液中的1升批次的脂質(zhì)體阿倫膦酸鹽。為了臨床便利，脂質(zhì)體阿倫膦酸鹽可以以?xún)煞N濃度(5mg/ml和0.5mg/ml)提供為無(wú)菌帶白色的脂質(zhì)體分散體。可以進(jìn)一步配制這些濃度以獲得任何特定體積的期望量的治療劑。脂質(zhì)成分由膽固醇、DSPC和DSPG構(gòu)成。分散體還含有磷酸鹽緩沖鹽水溶液用于pH控制、輸注適用性和用于維持等滲性。將最終產(chǎn)物中至少96％的藥物包封于脂質(zhì)體中。為了施用，用鹽水媒介物稀釋小瓶的內(nèi)容物(或者根據(jù)需要，其部分)，然后作為輸注施用。在一個(gè)特定臨床前實(shí)施例中，將適當(dāng)質(zhì)量的LA(由體重確定)在室溫1X PBS中稀釋至20ml的最終體積，并以4ml/分鐘通過(guò)靜脈內(nèi)(隱靜脈)或腹膜內(nèi)注射施用。

包括制造方法中使用的組分的量和質(zhì)量的批次配方及其在每1升批次基礎(chǔ)上的量呈現(xiàn)于下表1中。

表1–用于IV輸注的脂質(zhì)體阿倫膦酸鹽，用于1升的批次配方

表1的1升批次中產(chǎn)生的用于IV輸注的脂質(zhì)體阿倫膦酸鹽的含量和定量組成概述于下表2中。注意，在該批次中，DSPC:DSPG:膽固醇的摩爾比為3:1:2。此外，藥物:脂質(zhì)比率被計(jì)算為約1:5.7±1.5w:w。

表2–用于IV輸注的脂質(zhì)體阿倫膦酸鹽的組成

實(shí)際上通過(guò)本文描述的制造方法產(chǎn)生的用于IV輸注的脂質(zhì)體阿倫膦酸鹽制劑呈現(xiàn)于下表3中。

表3–用于5mg/ml劑量形式的規(guī)格

0.5mg/ml劑量強(qiáng)度可以通過(guò)與上述5mg/ml劑量強(qiáng)度相同的方法制造。僅(下述)最后標(biāo)準(zhǔn)化步驟在形成用于施用的不同最終制劑濃度中不同。0.5mg/ml的濃度用于以下實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解可以根據(jù)本方法制造其它劑量。

治療劑溶液(阿倫膦酸鹽溶液)和脂質(zhì)溶液如下制備：

阿倫膦酸鹽溶液.稱(chēng)取NaOH(6.8-8.0g)并將其在70±3℃的溫度下以600±150RPM溶解于850ml注射用水(WFI)中。通過(guò)目視檢查確認(rèn)完全溶解。在70±3℃的溫度以600±150RPM攪拌，將阿倫膦酸鈉(68至80.75g)溶解于NaOH溶液中。通過(guò)目視檢查驗(yàn)證完全溶解(即，澄清溶液)，驗(yàn)證電導(dǎo)率和pH測(cè)量值(pH＝6.8±0.3。電導(dǎo)率＝18.0±1ms/cm)。

脂質(zhì)溶液.稱(chēng)取包含30g DSPC(37.9毫摩爾)、10g DSPG(12.5毫摩爾)和10g膽固醇(25.8毫摩爾)(DSPC/DSPG/膽固醇；3/1/2mol/mol/mol)的脂質(zhì)并在加熱的磁力攪拌器上在70±3℃將其溶解于250ml燒杯中的160ml叔丁醇/EtOH/H₂O(77/77/6,v/v/v)中，形成濃度為312mg/ml的脂質(zhì)溶液。一旦溫度在限值內(nèi)就形成澄清的黃色溶液。

MLV制劑.將脂質(zhì)溶液添加至阿倫膦酸鹽溶液(1份藥物；5.3份脂質(zhì))，同時(shí)以600+150RPM混合并維持溫度70±3℃。至少5分鐘之后，添加100ml WFI(10％總體積)以在擠出之前降低溶劑濃度。將制劑再混合10分鐘。

擠出.通過(guò)裝配有一個(gè)0.14μm陶瓷膜或兩個(gè)聚碳酸酯膜(例如，0.2預(yù)過(guò)濾器和0.1μm膜)的1.2L加熱不銹鋼擠出機(jī)在壓力＝90±15psi且溫度＝68±5℃下將所述制劑進(jìn)行擠出以降低囊泡的大小并改善囊泡均勻性。該過(guò)程需要12-18輪以得到80-100nm的囊泡。將擠出通過(guò)物實(shí)時(shí)取樣以驗(yàn)證超濾之前的囊泡大小。脂質(zhì)體制劑大小使用Malvern Nano ZS分析儀(接受限值：95±20nm)來(lái)分析。還分析擠出樣品的需氧細(xì)菌計(jì)數(shù)(生物負(fù)載控制)。接受限值為<100CFU/ml。

超濾和透析.首先，在進(jìn)行超濾之前使制劑冷卻至<45℃。在具有500K中空纖維膜的Amersham QuixStand系統(tǒng)上進(jìn)行超濾。使用不超過(guò)25psi的入口壓力濃縮制劑。在達(dá)到最小體積后，用10倍初始體積(～7L)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液透析所述制劑。通過(guò)將145mM NaCl、13mM Na₂HPO₄和7mM NaH₂PO₄溶解于10L WFI中來(lái)制備PBS溶液。PBS具有約6.9的pH和約16.9ms/cm的電導(dǎo)率。將PBS過(guò)濾通過(guò)0.2μm過(guò)濾器。通過(guò)測(cè)量經(jīng)透析制劑的pH和電導(dǎo)率來(lái)標(biāo)記透析終點(diǎn)。將所述制劑從超濾系統(tǒng)排出，不超過(guò)120％的初始體積(～1.2升)。取樣品用于常規(guī)分析和需氧細(xì)菌計(jì)數(shù)(生物負(fù)載控制)。接受限值為<1,000CFU/ml。

在透析結(jié)束時(shí)，將所述制劑過(guò)濾通過(guò)0.2μm過(guò)濾器以維持生物負(fù)載控制。將含有所述制劑的壓力容器連接至無(wú)菌0.2μm過(guò)濾器(Sartorius Sartobran P)。將過(guò)濾器預(yù)裝配至無(wú)菌接收罐。通過(guò)對(duì)壓力容器施加5-30psi的壓力進(jìn)行過(guò)濾。取樣品用于常規(guī)分析和需氧細(xì)菌計(jì)數(shù)(生物負(fù)載控制)。接受限值為<100CFU/ml。

最終標(biāo)準(zhǔn)化.分析所述制劑的脂質(zhì)體的大小、脂質(zhì)/治療劑組成，藥物和游離治療劑含量(通過(guò)HPLC)。本實(shí)施例中的預(yù)期產(chǎn)率為含有約6mg/ml包封阿倫膦酸鹽和35mg/ml脂質(zhì)的1升制劑?；诎愳⑺猁}濃度的結(jié)果，計(jì)算所需稀釋度以得到約1升的5mg/ml或0.5mg/ml的最終制劑濃度。為了產(chǎn)生5mg/ml制劑，用如上文所述的約100ml PBS稀釋約900ml超濾之后的脂質(zhì)體阿倫膦酸鹽。此外，為了產(chǎn)生0.5mg/ml制劑，對(duì)于0.5mg/ml濃度，用約900ml PBS稀釋約100ml超濾后的脂質(zhì)體阿倫膦酸鹽。取樣品以確定得到的阿倫膦酸鹽濃度。

產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)制劑濃度之后，將含有所述制劑的瓶子連接至位于100級(jí)房間或無(wú)菌生物學(xué)罩中的兩個(gè)連續(xù)的無(wú)菌0.2μm過(guò)濾器(Sartorius Sartobran P)。將過(guò)濾器預(yù)裝配至預(yù)先除菌的一次性接收袋或瓶。通過(guò)蠕動(dòng)泵或加壓氮?dú)膺M(jìn)行過(guò)濾。壓力應(yīng)當(dāng)不超過(guò)10psi。當(dāng)結(jié)束過(guò)濾時(shí)，測(cè)試過(guò)濾器的完整性。

上述實(shí)施例中產(chǎn)生的用于IV輸注的脂質(zhì)體阿倫膦酸鹽具有許多期望特性，例如(i)至少阿倫膦酸鹽和脂質(zhì)在5℃(范圍2-8℃)的三年穩(wěn)定性；(ii)80±5的平均囊泡直徑，沒(méi)有微粒狀物質(zhì)；(iii)最高達(dá)5mg/ml(范圍0.1–5.0mg/ml)的阿倫膦酸鈉的濃度；(iv)大于或等于96％的阿倫膦酸鹽包封率；(v)3/1/2mol/mol/mol的二硬脂酰磷脂酰膽堿/二硬脂酰磷脂酰甘油/膽固醇(DSPC/DSPG/CHOL)的脂質(zhì)組成；(vi)270-340osmol/kg的生理學(xué)重量摩爾滲透壓濃度；(vii)與水相似的粘度，即在20℃下約1.0mPa s的動(dòng)力學(xué)粘度；(viii)pH6.8(范圍6.8-7.0)；(ix)根據(jù)美國(guó)或者歐洲藥典的賦形劑質(zhì)量的全世界接受度；(x)符合在USP 24-NF 19中公開(kāi)的用于無(wú)菌性和熱原的USP指南；(xi)與鹽水、輸注套件和注射器的相容性(可用性)；和(xii)與過(guò)濾器、不銹鋼和玻璃的相容性(工藝)。

實(shí)施例2

非人靈長(zhǎng)類(lèi)中的脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽消耗的單核細(xì)胞。在食蟹猴中測(cè)試LA消耗單核細(xì)胞的能力。具體地，用單次0.1mg/kg i.v.劑量的LA(LA 1和LA 2)處理兩只食蟹猴。然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)全血中的CD14+單核細(xì)胞的絕對(duì)和相對(duì)頻率，直到注射后7天(d.p.i.)。結(jié)果呈現(xiàn)于圖1A-1B中。接受0.1mg/kg of LA i.v.的食蟹猴顯示到1d.p.i.的CD14+單核細(xì)胞頻率降低～50％。然而，如圖1A-1B中所示，該消耗是短暫的，因?yàn)镃D14+單核細(xì)胞頻率到2d.p.i.返回至基線(xiàn)水平。因此，顯示LA對(duì)于非人靈長(zhǎng)類(lèi)中的單核細(xì)胞消耗是有效的。

血液處理.將全血收集至EDTA處理管(BD Biosciences,San Jose,CA)中。使用500μl等分試樣用Horiba/ABX Pentra 60C+(Horiba,Irvine,CA)來(lái)評(píng)價(jià)全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(CBC)。

單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。設(shè)計(jì)并優(yōu)化11色流式細(xì)胞術(shù)染色組用于分析恒河猴的血液和組織中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，如表4中所示。

表4.設(shè)計(jì)用于流式細(xì)胞術(shù)的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞染色組。

將100μl全血或1x 106總組織細(xì)胞在1x PBS中洗滌兩次，然后在室溫下表面染色30分鐘。然后將全血和脾在1ml FACSLyse中孵育10分鐘，以830x g離心4分鐘，并在補(bǔ)充有10％胎牛血清的1x PBS(FACS緩沖液)中洗滌三次。其它組織細(xì)胞在1x PBS中洗滌一次，并在2％多聚甲醛中固定。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)染色，將固定的細(xì)胞在含有1mg/ml皂苷的FACS緩沖液(皂苷緩沖液)中洗滌兩次，并在室溫下染色1小時(shí)。對(duì)于核內(nèi)染色(BrdU和Ki-67)，將固定的細(xì)胞在皂苷緩沖液和2X BD FACSPerm的1:1混合物中洗滌兩次，然后在皂苷緩沖液中洗滌一次，并在室溫下在0.5mg/ml DNA酶I存在的情況下染色1小時(shí)。染色之后，將樣品在皂苷緩沖液中洗滌兩次，然后在BD-LSRII(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)上運(yùn)行。使用FlowJo版本9.6.4(TreeStar,Ashland,OR)分析流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)。通過(guò)使用熒光減一(FMO)對(duì)照管針對(duì)適當(dāng)熒光團(tuán)設(shè)置所有陽(yáng)性設(shè)門(mén)。

實(shí)施例3

脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽在非人靈長(zhǎng)類(lèi)得到良好耐受。在非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型中檢查L(zhǎng)A治療的安全性。在四只恒河猴(每只接受兩種不同的LA-治療方案之一)中監(jiān)測(cè)肝功能的四種關(guān)鍵讀數(shù)(白蛋白、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶和膽紅素)的血清濃度。圖2A-2D示出接受重復(fù)低劑量(每天0.1mg/kg i.v.，持續(xù)一周；Rh22618和Rh28450)或單一高劑量(10mg/kg i.v.；Rh28438和Rh29054)的LA的恒河猴的血清化學(xué)分析。虛線(xiàn)代表基于俄勒岡國(guó)家靈長(zhǎng)類(lèi)研究中心(Oregon National Primate Research Center)的恒河猴群體統(tǒng)計(jì)的白蛋白、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶和總膽紅素血清濃度的預(yù)期范圍。在第0、3和7天對(duì)接受LA的重復(fù)低劑量注射的動(dòng)物的血清化學(xué)進(jìn)行取樣。在尸檢前兩天跟蹤接受LA的單一高劑量注射的動(dòng)物的血清化學(xué)。

如圖2A-D中所示出，重復(fù)低劑量LA施用揭示肝功能無(wú)變化，而單一高劑量導(dǎo)致肝功能的擾動(dòng)。具體地，基線(xiàn)測(cè)量和LA后測(cè)量之間的比較揭示接受重復(fù)低劑量LA的動(dòng)物中的血清化學(xué)無(wú)不利變化(Rh22618和Rh28450)。所有值都落入預(yù)期范圍內(nèi)，除了Rh28450中的堿性磷酸酶，其在基線(xiàn)處高(圖2C)。與接受每日低劑量LA的動(dòng)物相比，接受單一高劑量LA的動(dòng)物(Rh28438和Rh29054)表現(xiàn)出降低的白蛋白血清濃度(圖2A)，與升高的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶濃度一致(圖2B)，盡管丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶濃度在預(yù)期值內(nèi)。白蛋白和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶血清濃度的這些變化指示肝臟運(yùn)用，可能是由于肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞的消耗(參見(jiàn)下文)。盡管有這些發(fā)現(xiàn)，但在高劑量動(dòng)物和接受LA的任何動(dòng)物中都沒(méi)有觀(guān)察到LA治療的不利臨床副作用，無(wú)論劑量或頻率如何。重要的是注意到，0.1mg/kg的LA i.v.足以消耗單核細(xì)胞(圖1A-B)，并且該劑量的LA在恒河猴中是安全的，甚至在重復(fù)每日注射后(圖2A-D)。因此，LA在有效劑量得到良好耐受，并且構(gòu)成了非人靈長(zhǎng)類(lèi)中的單核細(xì)胞消耗的可行的新技術(shù)。

恒河猴圈養(yǎng)于俄勒岡國(guó)家靈長(zhǎng)類(lèi)研究中心。俄勒岡健康科學(xué)大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(The Oregon Health&Science University Institutional Animal Care and Use Committee)審查并批準(zhǔn)了所有研究方案，所述研究方案是根據(jù)針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用的美國(guó)衛(wèi)生和人類(lèi)服務(wù)部的指南。

實(shí)施例4

以替代劑量和途徑的LA治療在另一非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型中產(chǎn)生單核細(xì)胞消耗。觀(guān)察到LA施用的不同劑量和途徑在恒河猴中產(chǎn)生相比于對(duì)照更大的單核細(xì)胞消耗，如圖3A-B中所示出。三只恒河猴(Rh24937、Rh28034和Rh28099)用1mg/kg LAi.v.和腹膜內(nèi)(i.p.)注射，并在1d.p.i.使用上述流式細(xì)胞術(shù)染色組監(jiān)測(cè)單核細(xì)胞的頻率。兩只對(duì)照恒河猴(Rh26118和Rh26144)接受磷酸鹽緩沖鹽水注射，其體積和途徑與LA治療的動(dòng)物相同。單核細(xì)胞群體與淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞的區(qū)別在于不同的CD45平均熒光強(qiáng)度(MFI)相比側(cè)向散射概況(圖3A)。

圖3A示出使用表4中記載的流式細(xì)胞術(shù)染色組測(cè)量的向恒河猴給予單一1mg/kg劑量的LA(與對(duì)照相比)之后一天的單核細(xì)胞的頻率。具體地，圖3A示出通過(guò)CD45MFI相比側(cè)向散射概況的流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)定的LA治療前后的全血中的單核細(xì)胞的頻率。LA治療之后，在1d.p.i.觀(guān)察到單核細(xì)胞頻率的大幅降低，其中Rh28034中的消耗特別顯著(基線(xiàn)：8.22％；1d.p.i.：1.78％)。相反，對(duì)照動(dòng)物中的單核細(xì)胞頻率在1d.p.i.保持穩(wěn)定(圖3A)。

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)LA治療的恒河猴中觀(guān)察到的單核細(xì)胞消耗，評(píng)估單核細(xì)胞亞群以確定哪些最受影響。在LA治療前后，在總單核細(xì)胞池中比較三種先前描述的單核細(xì)胞亞群(經(jīng)典CD14+CD16-、中間CD14+CD16+和非經(jīng)典CD14-CD16+)[24]的頻率。結(jié)果示出于圖3B中。具體地，圖3B示出使用表4中記載的流式細(xì)胞術(shù)染色組測(cè)量的向恒河猴給予單一1mg/kg劑量的LA(與對(duì)照相比)之后一天的單核細(xì)胞亞群的頻率。具體地，圖3B示出通過(guò)CD14+相比CD16+染色的流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)定的LA治療前后的全血中的單核細(xì)胞亞群的頻率。當(dāng)比較治療前后的單核細(xì)胞亞群頻率時(shí)，觀(guān)察到顯著的動(dòng)物-動(dòng)物間差異。重要的是，LA治療的恒河猴在1d.p.i.表現(xiàn)出幾乎所有CD14-CD16+單核細(xì)胞的消耗，而對(duì)照恒河猴在1d.p.i.維持類(lèi)似的單核細(xì)胞亞群頻率，支持觀(guān)察到的總體單核細(xì)胞消耗的缺乏(圖3A-B)。

為了測(cè)定消耗的持續(xù)時(shí)間，監(jiān)測(cè)單核細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)和頻率，直到7d.p.i.。結(jié)果示出于圖4A-D中，其中空心符號(hào)代表LA治療的動(dòng)物，而實(shí)心符號(hào)代表對(duì)照動(dòng)物。圖4A-D的最上面一行示出LA治療前后的全血中的絕對(duì)單核細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過(guò)評(píng)價(jià)CD14+和/或CD16+單核細(xì)胞的頻率并將該值與總體白細(xì)胞計(jì)數(shù)(CD45+細(xì)胞)進(jìn)行比較來(lái)計(jì)算絕對(duì)單核細(xì)胞計(jì)數(shù)。圖4A-D的最下面一行示出通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)的LA治療前后的全血中的單核細(xì)胞的頻率。與顯示LA治療之后單核細(xì)胞頻率大幅降低的數(shù)據(jù)一致，每微升血液的單核細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)也顯示在1d.p.i.的顯著下降(圖4A，最下面)。這在Rh28034和Rh28099中最顯著，其中絕對(duì)單核細(xì)胞計(jì)數(shù)分別降低87％和84％。有趣的是，絕對(duì)單核細(xì)胞計(jì)數(shù)也揭示LA治療之后CD14+CD16+單核細(xì)胞的保留。這與CD14+CD16-和CD14-CD16+群體中觀(guān)察到的單核細(xì)胞計(jì)數(shù)的大幅下降形成鮮明對(duì)比(圖4A-D，最上面一行)。這些LA治療的恒河猴中觀(guān)察到的單核細(xì)胞消耗是高度短暫的，這類(lèi)似于在用單一0.1mg/kg劑量的LA i.v.治療的食蟹猴中觀(guān)察到的單核細(xì)胞消耗(圖1A-B；圖4A-D，最下面一行)。因此，LA治療可以在恒河猴中安全地誘導(dǎo)單核細(xì)胞的顯著、但高度瞬時(shí)的消耗。

實(shí)施例5

LA治療降低組織駐留的巨噬細(xì)胞的頻率并增加骨髓單核細(xì)胞的頻率。如上所示，脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽在非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型中一致地消耗組織駐留的巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞生成。為了確定LA施用之后觀(guān)察到的非人靈長(zhǎng)類(lèi)組群中的一致單核細(xì)胞消耗(圖1A-B；圖4A-D)是否與組織駐留的巨噬細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞的頻率降低相平行，收集各種組織并使用11色流式細(xì)胞術(shù)染色組(實(shí)施例2，表4)使用設(shè)門(mén)程序評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞頻率。在LA治療前后通過(guò)下述組織處理方法從六只恒河猴收集支氣管肺泡灌洗液(BAL)、結(jié)腸活檢樣品、肝臟活檢樣品和骨髓穿刺物。圖5A-E示出用于鑒定組織(定義為MAC387+和/或CD163+)和骨髓(定義為CD163+)中的巨噬細(xì)胞的設(shè)門(mén)策略，如結(jié)腸組織所代表。

在LA治療之后，在BAL中未觀(guān)察到肺泡巨噬細(xì)胞的頻率變化(數(shù)據(jù)未顯示)。圖6A-C示出來(lái)自Rh28450和Rh29724的代表性組織駐留的巨噬細(xì)胞和骨髓髓樣前體染色。更具體地，圖6A-C(圖4B)顯示在LA治療前后來(lái)自骨髓穿刺物、肝臟和結(jié)腸的MAC387相比CD163染色的比較實(shí)施例。MAC387是識(shí)別鈣結(jié)合骨髓相關(guān)蛋白MRP14的抗體，所述MRP14表達(dá)于組織駐留的巨噬細(xì)胞中[25-27]。該染色組在這些組織中鑒定了三種不同的巨噬細(xì)胞群體：MAC387+CD163-、MAC387+CD163+和MAC387-CD163+。通常，如圖6A-B中所示，發(fā)現(xiàn)MAC387-CD163+巨噬細(xì)胞的頻率低于MAC387+CD163-和MAC387+CD163+巨噬細(xì)胞。為了進(jìn)一步評(píng)估這三種組織巨噬細(xì)胞群體，檢查它們的CD68(一種還在組織駐留的巨噬細(xì)胞中表達(dá)的糖蛋白[26,28,29])的表達(dá)。具體地，將LA治療前后的來(lái)自Rh29724的結(jié)腸的MAC387+CD163-和MAC387+CD163+群體中的CD68表達(dá)與MAC387-CD163+的CD68表達(dá)(陰影)進(jìn)行比較。圖6C示出LA治療前后來(lái)自Rh29724的結(jié)腸的三個(gè)群體的CD68表達(dá)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)具有相似的染色概況。圖6C還顯示MAC387+CD163-和MAC387+CD163+巨噬細(xì)胞兩者均表達(dá)CD68，其中后者群體顯示最高表達(dá)，證實(shí)了我們的流式細(xì)胞術(shù)組能夠鑒定組織巨噬細(xì)胞。因此，本文首次顯示使用三種先前描述的巨噬細(xì)胞標(biāo)志物在非人靈長(zhǎng)類(lèi)的LA治療之后消耗組織駐留的巨噬細(xì)胞。

延伸分析以確定LA治療對(duì)骨髓中的單核細(xì)胞消耗的有效性。因?yàn)檠簡(jiǎn)魏思?xì)胞在從骨髓移出之后表達(dá)MAC387和CD163，所以在六只恒河猴中在LA治療前后檢查骨髓中表達(dá)這些標(biāo)志物的細(xì)胞的頻率。以類(lèi)似的方式，在肝臟和結(jié)腸中評(píng)價(jià)組織巨噬細(xì)胞消耗。圖7A描繪LA治療前后骨髓中的CD163+細(xì)胞的頻率。圖7B描繪在LA治療前后肝臟中的組織駐留的巨噬細(xì)胞頻率(與基線(xiàn)的百分比變化)。圖7C描繪LA治療前后結(jié)腸中的組織駐留的巨噬細(xì)胞的頻率。

當(dāng)定義為MAC387+和/或CD163+時(shí)，骨髓抽吸物的染色揭示單核細(xì)胞的總頻率的改變很小(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，鑒于骨髓中的粒細(xì)胞也可以表達(dá)MAC387，進(jìn)行單獨(dú)分析以將骨髓單核細(xì)胞定義為CD163+[25]。觀(guān)察到骨髓中單核細(xì)胞前體產(chǎn)生的顯著增加，如圖7A中所示出。具體地，該分析揭示施用LA之后骨髓單核細(xì)胞頻率的顯著增加(p＝0.031)(圖7A)。盡管最初假設(shè)是LA治療會(huì)消耗骨髓單核細(xì)胞，但該發(fā)現(xiàn)并不令人驚訝，因?yàn)榻M織巨噬細(xì)胞的SIV相關(guān)的消耗已經(jīng)顯示增加骨髓更新，其開(kāi)始于從骨髓釋放單核細(xì)胞[30]。然而，不能排除在檢查的最早時(shí)間點(diǎn)(1d.p.i.)之前在骨髓中發(fā)生單核細(xì)胞減少的可能性。

如圖7B-C中所示出，LA治療降低組織駐留的巨噬細(xì)胞頻率。圖7B揭示肝臟中的顯著減少。圖7C顯示五只恒河猴中的四只具有結(jié)腸巨噬細(xì)胞減少，盡管這不是顯著的由于一只動(dòng)物表現(xiàn)出結(jié)腸巨噬細(xì)胞頻率的增加。具體地，在研究的六只動(dòng)物中的五只中，在LA治療之后，肝臟中的巨噬細(xì)胞頻率降低>45％(p＝0.031；圖4D，左小圖)。圖7A-C的顯著性檢驗(yàn)都是Wilcoxon符號(hào)秩。鑒于庫(kù)普弗(Kupffer)細(xì)胞構(gòu)成人體中80-90％的組織巨噬細(xì)胞，該結(jié)果突出了LA在組織巨噬細(xì)胞消耗中的有效性[31]。重要的是注意到，肝臟中大多數(shù)消耗的巨噬細(xì)胞是MAC387+CD163-(圖7B，數(shù)據(jù)未顯示)。在結(jié)腸中觀(guān)察到相同的趨勢(shì)，其中在五只動(dòng)物中的四只中，總巨噬細(xì)胞頻率降低>45％(Rh22618由于不可檢測(cè)的LA前巨噬細(xì)胞頻率而被排除)(p＝0.625)。然而，在結(jié)腸中，消耗在三個(gè)巨噬細(xì)胞群體中更均勻地分布(圖7C，數(shù)據(jù)未顯示)。令人驚訝地，動(dòng)物之一(Rh27508)顯示結(jié)腸中巨噬細(xì)胞頻率的大幅增加。然而，該動(dòng)物還表現(xiàn)出上述骨髓中CD163+單核細(xì)胞的擴(kuò)增，絕對(duì)單核細(xì)胞計(jì)數(shù)減少>80％，且肝臟中巨噬細(xì)胞頻率減少>50％，提供了LA治療的直接效應(yīng)的充分證據(jù)(圖7B-C)。因此，不能排除結(jié)腸巨噬細(xì)胞頻率的增加是該動(dòng)物中LA相關(guān)的消耗之后的差異骨髓細(xì)胞更新動(dòng)力學(xué)的結(jié)果的可能性。

組織處理.通過(guò)70μm過(guò)濾器過(guò)濾支氣管肺泡灌洗液。通過(guò)以830xg離心4分鐘將骨髓沉淀，然后在含有2mM EDTA的1x PBS中重懸浮并劇烈振蕩以分散大細(xì)胞團(tuán)塊。將細(xì)胞在含有10％胎牛血清(R10)(Hyclone Laboratories,Logan,UT)的RPMI-1640中洗滌兩次。用解剖刀將淋巴結(jié)和脾臟切塊，然后通過(guò)70μm細(xì)胞過(guò)濾器搗碎。用R10重復(fù)沖洗過(guò)濾器以獲得單細(xì)胞懸浮液。將結(jié)腸和肝臟切成5mm³片，并將這些片中的約25-30片置于含有25ml補(bǔ)充有3％胎牛血清(R3)的RPMI-1640的50ml錐形瓶中。以200μM的最終濃度添加二硫蘇糖醇，并將組織在室溫下以225rpm振蕩15分鐘。使組織沉降，并吸出含有DTT的R3，并用含有5mM EDTA的R3替換。將組織在37℃下以225rpm振蕩30分鐘，并收集含有細(xì)胞的上清液并通過(guò)細(xì)胞過(guò)濾器。再次添加含有EDTA的R3，振蕩組織，并收集細(xì)胞。將組織在1x Hank氏平衡鹽溶液中洗滌兩次以去除過(guò)量EDTA，然后懸浮于含有0.1mg/ml膠原酶(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和0.1mg/ml DNA酶I(Roche,Indianapolis,IN)的R3中。將組織在37℃下以225rpm振蕩45分鐘，并收集含有細(xì)胞的上清液并通過(guò)70μm細(xì)胞過(guò)濾器。再次添加含有膠原酶和DNA酶I的R3，振蕩組織，并收集細(xì)胞。將從EDTA和膠原酶消化步驟收集的細(xì)胞碎片合并(全部組織)，并重懸浮于30％等滲percoll(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)中。然后將細(xì)胞在60％/40％percoll梯度上分層，并以500x g旋轉(zhuǎn)，其中制動(dòng)關(guān)閉。收集來(lái)自界面下部的單核細(xì)胞，并在R10中洗滌。

實(shí)施例6

5’-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)揭示LA治療后的單核細(xì)胞更新。如上面數(shù)據(jù)所示出，在LA治療之后一致地檢測(cè)單核細(xì)胞，但該數(shù)據(jù)無(wú)法區(qū)分單核細(xì)胞是從骨髓新遷移的細(xì)胞還是僅僅是來(lái)自原始細(xì)胞池的剩余物。CD163⁺骨髓單核細(xì)胞的頻率增加表明血液?jiǎn)魏思?xì)胞更新在LA治療之后加劇。為了提供單核細(xì)胞更新的更詳細(xì)的表征、支持消耗結(jié)果且允許更好地計(jì)算總血液?jiǎn)魏思?xì)胞消耗，設(shè)計(jì)和執(zhí)行LA治療，其與BrdU施用串聯(lián)，以確定該非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型中的單核細(xì)胞更新的水平。

BrdU是在S期期間摻入正在分裂細(xì)胞的DNA的合成胸腺嘧啶類(lèi)似物，并且可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)抗體染色來(lái)檢測(cè)[32,33]。骨髓中正在分裂的單核細(xì)胞前體在作為單核細(xì)胞釋放至血液中之前摻入BrdU。從骨髓釋放之后，單核細(xì)胞和組織駐留的巨噬細(xì)胞很少分裂，使BrdU成為骨髓細(xì)胞更新的可靠標(biāo)志物[30]。

為了評(píng)價(jià)單核細(xì)胞更新，兩只恒河猴Rh28438和Rh29054接受10mg/kg LA(i.v.)連同60mg/kg BrdU(i.v.)。對(duì)照動(dòng)物Rh31577接受磷酸鹽緩沖鹽水連同相同60mg/kg劑量的BrdU。將BrdU以10mg/ml懸浮于HBSS(Hank氏平衡鹽溶液)(HyClone Laboratories,Logan,UT)中。以2-3ml/分鐘的速率靜脈內(nèi)(隱靜脈)注射BrdU 60mg/kg。圖8A-C揭示LA治療之后的單核細(xì)胞消耗和高單核細(xì)胞更新。LA治療消耗了大多數(shù)血液?jiǎn)魏思?xì)胞，這基于：通過(guò)CD45染色相比側(cè)向散射概況評(píng)價(jià)的頻率(圖8A)和絕對(duì)單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖8B)。BrdU染色(圖8C)揭示在CD14⁺CD16^-(經(jīng)典)和CD14⁺CD16^-(中間)單核細(xì)胞群體中LA治療之后高水平的單核細(xì)胞更新。顯示的值表明BrdU染色陽(yáng)性的總CD14⁺CD16^-(經(jīng)典)和CD14⁺CD16⁺(中間)群體的百分比。為了測(cè)定LA治療之后單核細(xì)胞更新的水平，用10mg/kg LA(i.v.)連同60mg/kg BrdU(i.v.)注射兩只恒河猴(Rh28438和Rh29054)，并監(jiān)測(cè)BrdU⁺和BrdU^-單核細(xì)胞的頻率，直到2d.p.i.。對(duì)照動(dòng)物Rh31577接受磷酸鹽緩沖鹽水連同相同60mg/kg劑量的BrdU。如圖8A中所示出，Rh28438和Rh29054中的LA治療再次導(dǎo)致到1d.p.i.的單核細(xì)胞頻率的顯著降低。出乎意料地，對(duì)照動(dòng)物Rh31577還表現(xiàn)出單核細(xì)胞頻率的下降，盡管程度較小。

為了證實(shí)Rh31577確實(shí)是適當(dāng)?shù)膶?duì)照，鑒于該動(dòng)物中觀(guān)察到的單核細(xì)胞頻率的減少(圖8A)，在所有三只恒河猴中在LA治療前后評(píng)價(jià)絕對(duì)單核細(xì)胞計(jì)數(shù)。如所預(yù)期，在LA治療的動(dòng)物中觀(guān)察到單核細(xì)胞計(jì)數(shù)的大幅減少，而在磷酸鹽緩沖鹽水注射之后，Rh31577中的單核細(xì)胞計(jì)數(shù)保持不變，如圖8B中所示出。

最后，通過(guò)將LA治療的動(dòng)物與對(duì)照進(jìn)行比較來(lái)監(jiān)測(cè)來(lái)自骨髓(BrdU⁺)的單核細(xì)胞的遷移(圖8C)。有趣的是觀(guān)察到，在1d.p.i.，與對(duì)照動(dòng)物相比，LA治療的動(dòng)物中的CD14⁺CD16^-BrdU⁺單核細(xì)胞的頻率較高，其中Rh28438中超過(guò)一半的CD14⁺CD16^-單核細(xì)胞為BrdU染色陽(yáng)性(圖8C，左小圖)。圖8C還顯示，在1d.p.i.，LA治療的動(dòng)物中≥10％的CD14⁺CD16⁺單核細(xì)胞對(duì)BrdU染色陽(yáng)性，與對(duì)照動(dòng)物Rh31577(其在1d.p.i.沒(méi)有CD14⁺CD16⁺BrdU⁺單核細(xì)胞)形成鮮明對(duì)比。急性炎癥導(dǎo)致單核細(xì)胞更新增加，因?yàn)閱魏思?xì)胞進(jìn)入受影響的組織以分化成巨噬細(xì)胞[34]。在猿猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的恒河猴的情況下，單核細(xì)胞更新是進(jìn)展為AIDS的強(qiáng)烈預(yù)測(cè)因子[30]。類(lèi)似地，高水平的單核細(xì)胞更新與恒河猴中SIV誘導(dǎo)的腦炎的嚴(yán)重度相關(guān)[35]。值得注意的是，我們?cè)贚A治療的動(dòng)物中在1d.p.i.觀(guān)察到的單核細(xì)胞更新水平類(lèi)似于或大于在SIV感染的恒河猴中所見(jiàn)的那些，包括嚴(yán)重腦炎的快速進(jìn)展者[30,35]。因此，LA治療增加血液?jiǎn)魏思?xì)胞更新，該發(fā)現(xiàn)支持增加的骨髓單核細(xì)胞生成和血液?jiǎn)魏思?xì)胞消耗數(shù)據(jù)。此外，這些血液?jiǎn)魏思?xì)胞更新水平與晚期SIV感染相當(dāng)，其中觀(guān)察到單核細(xì)胞的顯著更新。

LA對(duì)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的影響的概述

因此，首次顯示LA是非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型中單核細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞消耗的安全且有效的方式。重要的是，此處首次表明選擇性單核細(xì)胞亞群消耗，其中CD14⁺CD16^-和CD14^-CD16⁺單核細(xì)胞與CD14⁺CD16⁺亞群相比表現(xiàn)出強(qiáng)烈消耗。LA的施用一致地降低肝臟和結(jié)腸中的絕對(duì)單核細(xì)胞計(jì)數(shù)和組織巨噬細(xì)胞頻率。該消耗與骨髓中單核細(xì)胞生成的顯著增加相關(guān)，該發(fā)現(xiàn)得到如通過(guò)DNA BrdU摻入所測(cè)量的血液中增加的單核細(xì)胞更新所支持，。

LA-介導(dǎo)的單核細(xì)胞消耗在檢查的所有非人靈長(zhǎng)類(lèi)中是高度短暫的，并且該發(fā)現(xiàn)完全支持先前用兔、大鼠和人的工作，其中單核細(xì)胞的LA消耗也是瞬時(shí)的。重要的是，已經(jīng)顯示瞬時(shí)單核細(xì)胞消耗觸發(fā)顯著和持續(xù)的抗炎效應(yīng)，由通過(guò)LA治療之后再狹窄和子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生率降低所例舉[23,36,37]。因此，對(duì)非人靈長(zhǎng)類(lèi)施用LA的有用性可以延伸遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)單核細(xì)胞消耗的時(shí)間范圍。

與肝臟和結(jié)腸相比，在LA治療之后，在肺中沒(méi)有檢測(cè)到肺泡巨噬細(xì)胞的消耗。該差異的原因不清楚，但不受理論束縛，可能取決于LA在肺中的生物分布或巨噬細(xì)胞靶向。鑒于肺中大量的巨噬細(xì)胞(肺免疫細(xì)胞的約70％)，可能在i.v.或i.p.注射之后到達(dá)肺的LA的質(zhì)量不足以消耗可檢測(cè)數(shù)量的細(xì)胞[38]。此外，鑒于將經(jīng)由血液攜帶少量離開(kāi)肝臟的LA，系統(tǒng)性L(fǎng)A施用(i.v.和i.p.)可以抑制肺的粘膜表面的肺泡巨噬細(xì)胞的消耗。該LA會(huì)遇到并潛在地靶向替代的肺組織巨噬細(xì)胞，諸如間質(zhì)巨噬細(xì)胞。

在恒河猴的組織中觀(guān)察到兩種主要的巨噬細(xì)胞群體：MAC387⁺CD163⁺和MAC387⁺CD163^-。然而，在人中，MAC387⁺巨噬細(xì)胞已被表征為M1樣的，且CD163⁺巨噬細(xì)胞已被表征為M2樣的，其在相同細(xì)胞上很少或沒(méi)有共表達(dá)這些標(biāo)志物。支持MAC387⁺CD163⁺組織巨噬細(xì)胞的這種鑒定，恒河猴中的最近研究全面表征了不同群體的肺駐留的巨噬細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)志物，其顯示血液?jiǎn)魏思?xì)胞和間質(zhì)巨噬細(xì)胞共表達(dá)高水平的MAC387和CD163[38]。該細(xì)胞群體的功能分析揭示MAC387⁺CD163⁺間質(zhì)巨噬細(xì)胞響應(yīng)于經(jīng)典巨噬細(xì)胞激活信號(hào)(IFNγ和LPS)。因此，MAC387⁺CD163⁺似乎定義巨噬細(xì)胞的M1樣群體，盡管解剖位置可能影響這些標(biāo)志物的表達(dá)，因?yàn)镸AC387⁺CD163⁺巨噬細(xì)胞在恒河猴腦組織中是罕見(jiàn)的[26]。

本文進(jìn)行的分析通過(guò)設(shè)計(jì)11色流式細(xì)胞染色組來(lái)輔助，所述11色流式細(xì)胞染色組被分別普遍應(yīng)用于血液和組織的對(duì)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的鑒定。參見(jiàn)上文實(shí)施例2，表4。研究已大量依賴(lài)于巨噬細(xì)胞細(xì)胞系，諸如U937和體外單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞，該體外單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞可能不會(huì)真正重現(xiàn)組織駐留的巨噬細(xì)胞的復(fù)雜性[42-44]。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估組織駐留的巨噬細(xì)胞提供了分選活細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，這是傳統(tǒng)免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色技術(shù)不能提供的技術(shù)。鑒于巨噬細(xì)胞在生理過(guò)程中的許多作用，對(duì)巨噬細(xì)胞直接離體進(jìn)行功能測(cè)定的能力牽涉于多個(gè)研究領(lǐng)域中。

非人靈長(zhǎng)類(lèi)提供了人生物學(xué)的強(qiáng)大模型。此處，通過(guò)首次顯示可以通過(guò)施用LA實(shí)驗(yàn)性地消耗單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞來(lái)推進(jìn)非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型。鑒于通過(guò)消耗非人靈長(zhǎng)類(lèi)中的T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞獲得的科學(xué)見(jiàn)解[8-13]，據(jù)信本文所述的技術(shù)進(jìn)一步加強(qiáng)了非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型，并為血液?jiǎn)魏思?xì)胞和組織巨噬細(xì)胞的許多生理過(guò)程的研究提供了獨(dú)特途徑。

實(shí)施例7-HIV/AIDS治療方案

在動(dòng)物模型中評(píng)估脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽對(duì)HAART停止之后的血漿病毒載量和外周CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響。具體地，在AIDS的印度恒河猴模型中測(cè)試LA減少或消耗HIV儲(chǔ)庫(kù)的能力。恒河猴已經(jīng)廣泛用于AIDS研究，并且該物種是HIV/AIDS的最佳表征的非人靈長(zhǎng)類(lèi)模型之一。(參見(jiàn)Pereira,L.E.等人,Immunodeficiency,Ch.15,可得自http://dx.doi.org/10.5772/53556.)用雜合猿猴人免疫缺陷病毒(SHIV)感染兩只恒河猴，且縱向隨訪(fǎng)血漿病毒載量和外周CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)。本研究中使用的SHIV，SHIV DH12克隆7，系統(tǒng)性消耗CD4⁺T細(xì)胞，然后開(kāi)始在巨噬細(xì)胞中復(fù)制，這類(lèi)似于人中HIV感染的晚期慢性階段。如圖9和10中所示，當(dāng)病毒開(kāi)始在巨噬細(xì)胞中復(fù)制時(shí)，動(dòng)物接受HAART以抑制從SHIV感染后接近于8周開(kāi)始的病毒復(fù)制。

遵循實(shí)施例1中所述的方法制備LA。

為了測(cè)試根據(jù)本發(fā)明的制劑在HAART期間的效果，一只動(dòng)物以靜脈內(nèi)接受1mg/kg體重的劑量的LA，而作為對(duì)照的另一只動(dòng)物接受磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的i.v.注射。該施用的時(shí)機(jī)由圖9和10中的箭頭表示。在該施用之后，HAART再繼續(xù)1.5周，直到接近于感染后第15周，以便在由于這些細(xì)胞的LA介導(dǎo)的消耗導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞隔室的循環(huán)期間保護(hù)目標(biāo)細(xì)胞。從感染直至感染后約第20周，定期監(jiān)測(cè)兩只動(dòng)物的血漿病毒載量和外周CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)。

通過(guò)測(cè)量每mL血漿的病毒RNA拷貝數(shù)來(lái)評(píng)估血漿病毒載量(“VL”)，即血液中正在復(fù)制的HIV的量。該測(cè)量是HIV/AIDS研究中的常規(guī)測(cè)定，并且遵循Friedrich,T.C.等人,“Subdominant CD8+T-cell responses are involved in durable control of AIDS virus replication.”J.VIROLOGY,81(7):3465-76(2007)中描述的方法進(jìn)行。

圖9示出與接受安慰劑(i.v.PBS)對(duì)照的SHIV感染的恒河猴相比，靜脈內(nèi)注射的LA對(duì)SHIV感染的恒河猴的VL的影響。VL表示為每mL血漿的病毒RNA拷貝數(shù)。陰影區(qū)域表示HAART療法的持續(xù)時(shí)間，且箭頭指向施用脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽的時(shí)間點(diǎn)。具體而言，圖9示出在整個(gè)研究過(guò)程中病毒載量的動(dòng)力學(xué)和幅度。兩只動(dòng)物在HAART停止后的第一周內(nèi)經(jīng)歷正在復(fù)制的病毒的增加，但LA治療的動(dòng)物與對(duì)照動(dòng)物相比表現(xiàn)出血漿病毒載量的一致的1-2log減少，直到感染后至少第20周。

外周CD4⁺T細(xì)胞的數(shù)量反映了HIV/AIDS的嚴(yán)重性，其中較低計(jì)數(shù)對(duì)應(yīng)于較高的HIV復(fù)制和對(duì)免疫系統(tǒng)的更多損害。外周CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)可以在HIV/AIDS研究中的常規(guī)測(cè)定中測(cè)量，并且在本實(shí)施例中遵循Friedrich,T.C.等人,“Subdominant CD8+T-cell responses are involved in durable control of AIDS virus replication.”J.VIROLOGY,81(7):3465-76(2007)中描述的方法測(cè)量。

圖10示出與接受安慰劑i.v.PBS(對(duì)照)的SHIV感染的恒河猴相比，靜脈內(nèi)注射的LA對(duì)SHIV感染的恒河猴的外周CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響。CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)表示為每μL血液中CD4⁺T細(xì)胞的數(shù)量。陰影區(qū)域表示HAART療法的持續(xù)時(shí)間，且箭頭指向施用脂質(zhì)體阿侖膦酸鹽的時(shí)間點(diǎn)。具體而言，圖10示出在整個(gè)研究過(guò)程中CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化。兩只動(dòng)物中的CD4⁺T細(xì)胞在SHIV感染之后迅速減少，并且在兩周之后幾乎耗盡。兩只動(dòng)物在抗病毒療法開(kāi)始之后具有外周CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)的有限增加。如圖10中所示，LA治療的動(dòng)物在LA施用之后經(jīng)歷外周CD4⁺T細(xì)胞計(jì)數(shù)的顯著反彈，并且所述反彈持續(xù)至少約5周。未用LA治療的對(duì)照動(dòng)物在整個(gè)研究中維持最低水平的外周CD4⁺T細(xì)胞。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，可以對(duì)本文通過(guò)實(shí)施方案的方式具體顯示和描述的內(nèi)容進(jìn)行許多變化、添加、修改和其它應(yīng)用。因此，通過(guò)下面權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍意欲包括所有可預(yù)見(jiàn)的變化、添加、修改或應(yīng)用。

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