專利名稱：核苷膦酸類化合物的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種用于藥物的制劑，特別是一種核苷膦酸類化合物的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物制劑。
背景技術：
病毒感染嚴重威脅著人類健康，迫切需要有效的藥物治療。以乙型肝炎為例，我國的乙肝病毒攜帶者有超過一億人，其中慢性乙型肝炎患者約3000萬，目前的治療用藥中，α-干擾素的療程較長，價格昂貴，而且只有30~50％的響應率，拉米呋定為核苷類似物，通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶以及DNA聚合酶的作用來阻斷病毒繁殖，效果明顯，但有一定的副作用，而且容易引發(fā)病毒DNA聚合酶突變而出現(xiàn)抗藥性，停藥后反彈更是嚴重。
核苷膦酸類化合物，對逆轉(zhuǎn)錄酶以及DNA聚合酶有廣譜的抑制性，是一類很有前途的抗病毒化合物。經(jīng)對現(xiàn)有技術文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，美國Gilead公司在此領域已經(jīng)獲得一系列專利(USP 5,935,946 Nucleotide analog compositionand synthesis method核苷類似物的處方和合成途徑；USP 5,733,788 PMPApreparation替諾福韋的制備)。但不足之處在于其中某些化合物生物利用度低，特別是病灶細胞攝取率低，但代謝迅速，用藥劑量較大，毒性相應變大；已上市的阿德福韋酯，因腎臟毒性較大，導致患者往往不能完成治療。將脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物技術應用于核苷膦酸類化合物尚未見專利和文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，提供一種核苷膦酸類化合物的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物制劑，使其提高核苷膦酸類化合物在病灶部位的有效濃度以及進入被感染細胞的效率，從而提高藥效，降低用藥劑量，減小毒性。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明含有核苷膦酸類化合物作為活性成分，將核苷膦酸類化合物和脂質(zhì)形成脂質(zhì)復合物和脂質(zhì)體制劑，其中核苷膦酸類化合物的摩爾百分比為0.99~50％，脂質(zhì)的摩爾百分比為50~99.01％。
本發(fā)明所說的核苷膦酸類化合物是如下開鏈結構 其中，B為核苷堿基或修飾的堿基，包括腺嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，鳥嘌呤以及它們的修飾衍生物，還包括以上結構的膦酸酯類化合物。
R為H，CH3，CF3，CH2OH，CH2F；X為O，S。
本發(fā)明所說的脂質(zhì)為各種天然或人工合成的陽離子磷脂、陰離子磷脂、中性磷脂、以上磷脂的聚乙二醇修飾修飾產(chǎn)物、膽固醇和其混合物。
本發(fā)明所說的脂質(zhì)體，其結構為脂質(zhì)雙分子層構成的囊泡結構，包括單層脂質(zhì)體、多層脂質(zhì)體、多室脂質(zhì)體，其粒徑在20nm到50μm之間。
本發(fā)明所說的脂質(zhì)復合物，其中包含的核苷膦酸類化合物與脂質(zhì)間通過非共價鍵作用結合，包括配位鍵、氫鍵、親水疏水作用、電荷相互作用或物理包裹。復合物的粒徑在20nm到50μm之間。
本發(fā)明所說的脂質(zhì)復合物，是帶負電荷的核苷膦酸類化合物與帶正電荷的陽離子脂質(zhì)間以電性作用力相互結合形成的復合物。
本發(fā)明中所說的磷脂具有兩親性，可以形成雙分子層囊泡結構裝載藥物，或直接形成脂質(zhì)顆粒裝載藥物。
本發(fā)明所形成的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物均包含脂質(zhì)膜，其中包含0~100％天然或人工合成的陽離子兩親性化合物。
部分核苷膦酸類化合物帶負電，本發(fā)明中所說的陽離子磷脂和陽離子兩親性化合物帶正電荷，可以和帶負電荷的核苷膦酸類化合物結合，通過兩者間的靜電作用形成復合物，大大提高載藥率。
本發(fā)明中所說的磷脂的聚乙二醇修飾產(chǎn)物可以在脂質(zhì)體或脂質(zhì)復合物表面形成一個親水性的高分子層，有助于保持其穩(wěn)定性，降低了血漿蛋白與其作用，使其在血漿中的循環(huán)時間大大延長，從而維持較高的、平穩(wěn)的血藥濃度，在抗病毒治療中，發(fā)揮持續(xù)的抗病毒作用防止病毒復制，抑制耐藥變異株的產(chǎn)生。
本發(fā)明中所說的膽固醇具有調(diào)節(jié)藥物從脂質(zhì)復合物或脂質(zhì)體中釋放速度的作用。
應當說明的是，許多脂質(zhì)都適合用于本發(fā)明，除以上脂質(zhì)外，藥學領域內(nèi)的技術人員已知的任何成囊泡脂質(zhì)都可以考慮。
本發(fā)明可以通過薄膜分散法、乙醇注入法、高壓乳勻法等方法實現(xiàn)，也可通過pH梯度法、鈣離子梯度法和電性包裹法實現(xiàn)，后者有更高的包封率。
采用激光粒度散射儀(英國MALVEN公司)檢測實施例5得到的脂質(zhì)復合物，其粒徑在200納米以下，且分布集中，呈單峰分布。采用原子力顯微鏡(AFM)觀察的圖片也證實其粒徑的納米尺度。進一步，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)配方或改變制備方法，可以使制得的粒子粒徑小至十幾納米，大至50微米。
本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)在以下方面核苷膦酸類化合物脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物能夠有效地作用于細胞膜，促進細胞對藥物的攝取，使藥物在細胞內(nèi)的濃度增加，藥效得以提高。將核苷膦酸類化合物中的替諾福韋制成脂質(zhì)復合物，以Hep G22.2.15細胞株作為體外細胞模型(該細胞含有整合的乙肝病毒DNA，在細胞培養(yǎng)過程中，能持續(xù)穩(wěn)定地向培養(yǎng)液中分泌表面抗原(HBsAg)及乙肝病毒DNA，為評價抗乙肝病毒藥物活性的最常用細胞)，進行細胞藥效試驗。相對于游離的替諾福韋溶液，替諾福韋脂質(zhì)復合物在相同濃度下對病毒的抑制作用，得到了有效的提高，表面抗原量顯著下降，乙肝病毒DNA拷貝數(shù)大大降低。
核苷膦酸類化合物脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物能夠顯著改變藥物的體內(nèi)組織分布。將核苷膦酸類化合物中的替諾福韋制成脂質(zhì)復合物，用同樣劑量的游離藥物和藥物的脂質(zhì)復合物對小鼠進行尾靜脈注射，分別于不同時間點處死小鼠，將其肝臟和腎臟用生理鹽水洗凈，用濾紙吸干，稱重后組織勻漿，用高效液相色譜測定組織勻漿中的藥物濃度。替諾福韋脂質(zhì)復合物與替諾福韋溶液相比，在肝臟藥物濃度大幅度提高，增加了對病毒的抑制作用，而在腎臟藥物濃度大大降低，減輕了對腎臟的毒性。核苷膦酸類化合物臨床使用時一個非常顯著的缺點就是腎毒性大，往往使得治療不能完成。本發(fā)明對肝臟的靶向性和對腎毒性的降低將大大提高此類藥物的應用前景。
具體實施例方式
實施例1將含24mg 1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化銨(DOTAP)的氯仿溶液加到茄形瓶中，30℃水浴，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿使其成膜后，保持真空1小時以除盡溶劑，向茄形瓶中加入1mg/ml替諾福韋(Tenofovir，PMPA)的HEPES溶液(pH＝7)10ml，超聲振蕩，室溫放置2h，形成半透明的脂質(zhì)復合物的混懸液。
本實施例中核苷膦酸類化合物的摩爾百分比為50.00％，脂質(zhì)的摩爾百分比為50.00％。
以本實施例制得的制劑作為實驗組，同樣劑量的替諾福韋溶液作為對照組，與對照組相比，細胞實驗乙肝病毒表面抗原數(shù)降低81％，乙肝病毒的DNA拷貝數(shù)下降66％，藥物組織分布的動物實驗表明，藥物在肝臟中最大濃度增加180％，在腎臟中的最大濃度下降35％。
實施例2將含66毫克二月桂酰磷脂酰膽堿(DLPC)、14毫克3β-[N-(N’，N’-二甲氨基乙基)-氨甲酰]膽固醇(DC-cholestrol)和11毫克膽固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，30℃水浴，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿使其成膜后，保持真空1小時以除盡溶劑，向茄形瓶中加入1mg/ml替諾福韋的HEPES溶液(pH＝7)10ml，超聲振蕩，室溫放置2h，形成半透明的脂質(zhì)復合物的混懸液。
本實施例中核苷膦酸類化合物的摩爾百分比為20.00％，脂質(zhì)的摩爾百分比為80.00％。
以本實施例制得的制劑作為實驗組，同樣劑量的替諾福韋溶液作為對照組，與對照組相比，細胞實驗乙肝病毒表面抗原數(shù)降低58％，乙肝病毒DNA拷貝數(shù)下降51％，藥物組織分布的動物實驗表明，藥物在肝臟中最大濃度增加230％，在腎臟中的最大濃度下降49％。
實施例3將含64mg十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的丙酮溶液加到茄形瓶中，30℃水浴，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮使其成膜后，保持真空1小時以除盡溶劑，向茄形瓶中加入1mg/ml替諾福韋的HEPES溶液(pH＝7)10ml，超聲振蕩，室溫放置2h，形成半透明的脂質(zhì)復合物的混懸液。
本實施例中核苷膦酸類化合物的摩爾百分比為16.67％，脂質(zhì)的摩爾百分比為83.33％。
以本實施例制得的制劑作為實驗組，同樣劑量的替諾福韋溶液作為對照組，與對照組相比，細胞實驗乙肝病毒表面抗原數(shù)降低85％，乙肝病毒DNA拷貝數(shù)下降76％，藥物組織分布的動物實驗表明，藥物在肝臟中最大濃度增加280％，在腎臟中的最大濃度下降54％。
實施例4將含186.2毫克卵磷脂(EPC)、40.6毫克膽固醇溶于乙醇中，用微孔濾膜過濾乙醇溶液，待用。將20毫升0.5毫克/毫升替諾福韋的HEPES緩沖液加入到50ml含有攪拌子的燒瓶中，然后將乙醇溶液以一定的速率，注入HEPES緩沖液中，恒溫高速攪拌，減壓蒸去乙醇，形成脂質(zhì)體的混懸液。
本實施例中核苷膦酸類化合物的摩爾百分比為9.09％，脂質(zhì)的摩爾百分比為90.91％。
以本實施例制得的制劑作為實驗組，同樣劑量的替諾福韋溶液作為對照組，與對照組相比，細胞實驗乙肝病毒表面抗原數(shù)下降53％，乙肝病毒DNA拷貝數(shù)下降47％，藥物組織分布的動物實驗表明，藥物在肝臟中最大濃度增加320％，在腎臟中的最大濃度下降53％。
實施例5將含251毫克二豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、47毫克溴化雙甲基雙十八烷基胺(DDAB)和115毫克膽固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，30℃水浴，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿使其成膜后，保持真空1小時以除盡溶劑，向茄形瓶中加入1mg/ml阿德福韋(Adefovir，PMEA)的HEPES溶液(pH＝7)10ml，超聲振蕩，室溫放置2h，形成半透明的脂質(zhì)復合物的混懸液。
本實施例中核苷膦酸類化合物的摩爾百分比為4.76％，脂質(zhì)的摩爾百分比為95.24％。
以本實施例制得的制劑作為實驗組，同樣劑量的阿德福韋溶液作為對照組，與對照組相比，細胞實驗乙肝病毒表面抗原數(shù)降低62％，乙肝病毒DNA拷貝數(shù)下降55％，藥物組織分布的動物實驗表明，藥物在肝臟中最大濃度增加400％，在腎臟中的最大濃度下降57％。
實施例6將含399mg卵磷脂、289mg甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)、73mg1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化銨(DOTAP)、122mg膽固醇(cholesterol)的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使其成膜后，向茄形瓶中加入1mg/ml替諾福韋磷酸鹽緩沖液10ml，振搖，-70℃冷凍后，室溫復融，反復10次后，過高壓乳勻機10次，形成半透明的脂質(zhì)體的混懸液。
本實施例中核苷膦酸類化合物的摩爾百分比為3.23％，脂質(zhì)的摩爾百分比為96.77％。
以本實施例制得的制劑作為實驗組，同樣劑量的替諾福韋溶液作為對照組，與對照組相比，細胞實驗乙肝病毒表面抗原數(shù)下降72％，乙肝病毒DNA拷貝數(shù)下降62％，藥物組織分布的動物實驗表明，藥物在肝臟中最大濃度增加530％，在腎臟中的最大濃度下降72％。
實施例7將553mg二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、105mg二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、217mg膽固醇溶于乙醚溶液中，將10mg替諾福韋溶于磷酸鹽緩沖液中，條件下將脂質(zhì)的乙醚溶液注入替諾福韋水溶液中，加熱攪拌除去乙醚，形成半透明的脂質(zhì)體的混懸液。
本實施例中核苷膦酸類化合物的摩爾百分比為2.44％，脂質(zhì)的摩爾百分比為97.56％。
以本實施例制得的制劑作為實驗組，同樣劑量的替諾福韋溶液作為對照組，與對照組相比，細胞實驗乙肝病毒表面抗原數(shù)下降68％，乙肝病毒DNA拷貝數(shù)下降60％，藥物組織分布的動物實驗表明，藥物在肝臟中最大濃度增加570％，在腎臟中的最大濃度下降75％。
實施例8將含815mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、125mg[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲銨(DOTMA)、215mg膽固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使其成膜后，向茄形瓶中加入HEPES氯化鈣緩沖液(pH＝7)10ml，振搖，室溫放置2h，以HEPES緩沖液透析，調(diào)節(jié)鈣離子濃度，形成鈣離子梯度，加入10mg阿德福韋，形成均勻乳白的脂質(zhì)體的混懸液。
本實施例中核苷膦酸類化合物的摩爾百分比為1.96％，脂質(zhì)的摩爾百分比為98.04％。
以本實施例制得的制劑作為實驗組，同樣劑量的阿德福韋溶液作為對照組，與對照組相比，細胞實驗乙肝病毒表面抗原數(shù)下降55％，乙肝病毒DNA拷貝數(shù)下降43％，藥物組織分布的動物實驗表明，藥物在肝臟中最大濃度增加450％，在腎臟中的最大濃度下降60％。
實施例9將含963mg二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)和183mg二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、379mg膽固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使其成膜后，向茄形瓶中加入HEPES溶液(pH＝7)10ml，振搖，室溫放置2h，加入酸性溶液調(diào)節(jié)外水相至pH＝4，加入10mg替諾福韋，搖勻，形成均勻乳白的脂質(zhì)復合物的混懸液。
本實施例中核苷膦酸類化合物的摩爾百分比為1.41％，脂質(zhì)的摩爾百分比為98.59％。
以本實施例制得的制劑作為實驗組，同樣劑量的替諾福韋溶液作為對照組，與對照組相比，細胞實驗乙肝病毒表面抗原數(shù)下降43％，乙肝病毒DNA拷貝數(shù)下降31％，藥物組織分布的動物實驗表明，藥物在肝臟中最大濃度增加660％，在腎臟中的最大濃度下降87％。
實施例10將1687mg豆磷脂(SPC)、573mg膽固醇的氯仿溶液加到茄形瓶中，水浴，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使其成膜后，向茄形瓶中加入1mg/ml阿德福韋的緩沖液10ml，手搖振蕩，使脂質(zhì)充分水化，將脂質(zhì)體依次通過0.8um，0.4um，0.3um，0.22um等一系列的聚碳酸脂膜數(shù)次，結果隨著膜孔徑的減小，得到半透明的脂質(zhì)體的混懸液。
本實施例中核苷膦酸類化合物的摩爾百分比為0.99％，脂質(zhì)的摩爾百分比為99.01％。
以本實施例制得的制劑作為實驗組，同樣劑量的阿德福韋溶液作為對照組，與對照組相比，細胞實驗乙肝病毒表面抗原數(shù)下降33％，乙肝病毒DNA拷貝數(shù)下降25％，藥物組織分布的動物實驗表明，藥物在肝臟中最大濃度增加700％，在腎臟中的最大濃度下降93％。
權利要求
1.一種核苷膦酸類化合物的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物制劑，其特征在于，含有核苷膦酸類化合物作為活性成分，將核苷膦酸類化合物和脂質(zhì)形成脂質(zhì)復合物和脂質(zhì)體制劑，其中核苷膦酸類化合物的摩爾百分比為0.99~50％，脂質(zhì)的摩爾百分比為50~99.01％。
2.根據(jù)權利要求1的核苷膦酸類化合物的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物制劑，其特征是，所述的核苷膦酸類化合物是如下開鏈結構 其中，B為核苷堿基或修飾的堿基，包括腺嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，鳥嘌呤以及它們的修飾衍生物，還包括以上結構的膦酸酯類化合物；R為H，CH3，CF3，CH2OH，CH2F；X為O，S。
3.根據(jù)權利要求1的核苷膦酸類化合物的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物制劑，其特征是，所述的脂質(zhì)體，其結構為脂質(zhì)雙分子層構成的囊泡結構，包括單層脂質(zhì)體、多層脂質(zhì)體、多室脂質(zhì)體，其粒徑在20nm到50μm之間。
4.根據(jù)權利要求1的核苷膦酸類化合物的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物制劑，其特征是，所述的脂質(zhì)為各種天然或人工合成的陽離子磷脂、陰離子磷脂、中性磷脂、以上磷脂的聚乙二醇修飾修飾產(chǎn)物、膽固醇和其混合物。
5.根據(jù)權利要求4的核苷膦酸類化合物的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物制劑，其特征是，所述的磷脂，具有兩親性，形成雙分子層囊泡結構裝載藥物，或直接形成脂質(zhì)顆粒裝載藥物。
6.根據(jù)權利要求1的核苷膦酸類化合物的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物制劑，其特征是，所述的脂質(zhì)復合物，其中包含的核苷膦酸類化合物與脂質(zhì)間通過非共價鍵作用結合，包括配位鍵、氫鍵、親水疏水作用、電荷相互作用或物理包裹，復合物的粒徑在20nm到50μm之間。
7.根據(jù)權利要求1或者6的核苷膦酸類化合物的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物制劑，其特征是，所述的脂質(zhì)復合物，是帶負電荷的核苷膦酸類化合物與帶正電荷的陽離子脂質(zhì)間以電性作用力相互結合形成的復合物。
8.根據(jù)權利要求1或者3或者6的核苷膦酸類化合物的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物制劑，其特征是，所述的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物均包含脂質(zhì)膜，其中包含0~100％天然或人工合成的陽離子兩親性化合物。
全文摘要
一種核苷膦酸類化合物的脂質(zhì)體和脂質(zhì)復合物制劑，用于治療病毒感染性疾病。本發(fā)明含有核苷膦酸類化合物作為活性成分，核苷膦酸類化合物和脂質(zhì)分子形成復合物或脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明相對于核苷膦酸類化合物的其它制劑，能夠有效地改變藥物在體內(nèi)的分布特性，使藥物富集于病灶部位，使藥物在相同劑量下對病毒的抑制作用，得到了有效的提高，并降低藥物對腎臟的毒副作用。大大提高此類藥物的應用前景。
文檔編號A61K31/7042GK1679514SQ20051002378
公開日2005年10月12日 申請日期2005年2月3日 優(yōu)先權日2005年2月3日
發(fā)明者徐宇虹, 張健存, 陳劍, 章麗輝 申請人:上海交通大學