一種基于實驗仔兔的空腸彎曲菌致腹瀉模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細菌致病模型，特別是空腸彎曲菌致實驗仔兔的腹瀉模型。該模型是由空腸彎曲菌人工感染仔兔并引起自限性的、水樣腹瀉癥狀。該感染模型臨床癥狀和病理變化明顯，能夠正確反應菌株的毒力，且模型動物體型小，易于操作，適合用作空腸彎曲菌的研究模型。
【專利說明】一種基于實驗仔兔的空腸彎曲菌致腹瀉模型
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及細菌致病模型，特別是空腸彎曲菌致實驗仔兔的腹瀉模型。
【背景技術】
[0002]空腸彎曲菌是人類腸胃炎的最主要的致病菌，臨床約90%的急性細菌腸炎均與該菌相關。在歐美等國，其致病率已超過沙門氏菌、志賀氏菌、0157大腸桿菌等。除了引起腸炎之外，空腸彎曲菌還是吉蘭-巴雷綜合征(GBS)的主要誘因之一，鑒于它極高的感染率以及后續(xù)的潛在威脅，已受到人們的密切關注。
[0003]空腸彎曲菌感染后，臨床表現(xiàn)復雜多樣，但主要癥狀為腹瀉性腸炎，同時也有無癥狀攜帶和極少數(shù)因菌血癥而引起的腸道外感染。動物模型是研究空腸彎曲菌的致病機理、與宿主間的相互作用及研發(fā)疫苗的基礎，研究者嘗試了多種動物的空腸彎曲菌感染試驗，主要包括靈長類動物、雪貂、豬、兔、嚙齒類動物和雞，綜合考慮其疾病相似性、重復性及經(jīng)濟性，仍沒有建立起良好的空腸彎曲菌感染實驗動物模型，給致病機制、保護性抗原研究以及疫苗效力檢驗等造成困難。
[0004]以初生實驗仔兔構建動物模型，其主要優(yōu)勢如下:首先，比起嚙齒類動物，兔在心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)、骨骼發(fā)育、營養(yǎng)代謝等方面與人類具有較大的相似性，利用兔構建動物模型，可以在很大程度上模擬人感染空腸彎曲菌引發(fā)腸胃炎病發(fā)的整個過程；其次初生仔兔沒有受過外界細菌的感染，對許多病毒和致病菌非常敏感，適用于各種微生物學的研究，應用初生仔兔 已成功建立大腸桿菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌等腸道致病菌感染模型；再者，仔兔體型小、遺傳背景清晰，這樣既方便實驗操作，又可保證個體間在基因型方面的均一性，以便于后期基因表達的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于為人們提供一種基于實驗仔兔的空腸彎曲菌致腹瀉模型。
[0006]一種基于實驗仔兔的空腸彎曲菌致腹瀉模型，是空腸彎曲菌人工感染仔兔并引起自限性的、水樣腹瀉癥狀。通過剖檢發(fā)現(xiàn)主要病變是小腸積液、腸壁出現(xiàn)出血點，盲腸、結腸腫大，腸腔內(nèi)充滿水樣內(nèi)容物；組織病理切片顯示盲腸黏膜出現(xiàn)壞死脫落，固有層小血管擴張、充血。
[0007]通過劑量反應實驗顯示腹瀉疾病的程度與攻毒劑量、腸道細菌定植量正相關，至少IO6CFU細菌可引起仔兔可觀察的腹瀉癥狀和各腸道的定植；至少IO4CFU細菌可引起盲腸和結腸的定植。
[0008]通過不同來源空腸彎曲菌分離株對實驗仔兔致病性存在明顯差異，說明該模型能夠有效評價不同分離株的毒力強弱。
[0009]通過細菌分離，顯示空腸彎曲菌侵入血液的速度很快，對肝臟、腎臟等實質(zhì)器官的黏附性無明顯差異，并在48hr后被清除；在盲腸和結腸中定植時間大于60hr，定植量高達108CFU/g。[0010]通過掃描和透射電子顯微鏡結果顯示空腸彎曲菌可黏附在腸絨毛，并在攻毒后24~36hr侵襲破壞部分上皮細胞；48~60hr可見部分上皮細胞脫落、凋亡，大量上皮內(nèi)淋巴細胞浸潤。
[0011 ] 通過Real-time RT-PCR結果顯示感染后12hr可見IL-10和抗菌肽CAP-18的大量分泌，36hr時IL-18、CCL20分泌增加；60hr時IFN- y、IL-10、IL-8、iNOS發(fā)揮重要免疫作用。
[0012]本發(fā)明公開了一種空腸彎曲菌感染實驗仔兔致腹瀉動物模型，腹瀉癥狀和病理變化等與人類感染表現(xiàn)相似，仔兔腹瀉疾病的程度與攻毒劑量、腸道細菌定植量正相關，仔兔模型能有效評價空腸彎曲菌的毒力強弱，進一步分析顯示空腸彎曲菌進入血液引起菌血癥，但菌血癥最終病情轉歸，在兔盲腸和結腸中定植率最高，24hr為定植最高峰，空腸彎曲菌可侵襲細胞引起腸上皮細胞凋亡，兔上皮內(nèi)淋巴細胞的數(shù)量增加，多種細胞因子發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用。
[0013]本發(fā)明首次建立了空腸彎曲菌感染實驗仔兔致腹瀉的動物模型，該感染模型臨床癥狀和病理變化明顯，能夠正確反應菌株的毒力，且模型動物體型小，易于操作，適合用作空腸彎曲菌的研究模型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1空腸彎曲菌感染兔臨床病理學變化。a:對照組.b:實驗組腹瀉。
[0015]圖2空腸彎曲菌感染兔解剖病理學變化。A:心包炎；B:脾臟略顯腫大；C:腹腔積液，小腸腫脹，積液；D:盲腸充滿內(nèi)容物，結腸腸壁菲?。籈:小腸內(nèi)壁有出血點。
[0016]圖3感染兔盲腸組織HE染色。A:盲腸局部腸粘膜出現(xiàn)壞死脫落200 X ;B:固有層小血管擴張，充血200 X。
[0017]圖4感染仔兔空腸彎曲菌分離株菌落形態(tài)(A)、革蘭染色(B)及多重PCR(C)。
[0018]圖5空腸彎曲菌感染仔兔腸道的掃描電鏡觀察。A =PBS對照組，B =NCTCl1168攻毒組，箭頭和方框所指被認為可能是空腸彎曲菌。
[0019]圖6空腸彎曲菌感染腸上皮的透射電鏡觀察。A-B為攻毒后12hr ;C_D為攻毒后24hr ；E為攻毒后36hr ；F為攻毒后60hr。
【具體實施方式】
[0020](圖1到圖6都要在實施例中提及，圖1-6的實驗和效果所反映的對比內(nèi)容也要在實施例中說明)
[0021]1、攻毒方式
[0022]采用灌胃攻毒方式。通過腹腔注射實驗仔兔西咪替丁注射液(50mg/kg)后3hr，用無菌2 % NaHCO3溶液將空腸彎曲菌從CCDA綿羊血平板上刮取至指形管，調(diào)制其終濃度為攻毒所需要的濃度，使用柔軟性灌胃針灌胃實驗仔兔細菌懸液。
[0023]2、評價指標
[0024]為更好地評價幼兔腹瀉狀況，每天2次記錄腹瀉狀況，進行評分，標準如下表1所示。根據(jù)實際情況用腹瀉率、腹瀉頻率和腹瀉指數(shù)來作為評價腹瀉的指標。腹瀉率反映腹瀉的發(fā)病率腹瀉頻率和腹瀉指數(shù)反映腹瀉的嚴重程度。結合使用3項指標可較為全面地反映仔兔在試驗期內(nèi)的腹瀉狀況。
[0025]腹瀉率=腹瀉只數(shù)/供試兔只數(shù)X 100%。
[0026]腹瀉頻率=(腹瀉仔兔只數(shù)X腹瀉次數(shù))/(供試兔只數(shù)X總記錄次數(shù))X100%
[0027]腹瀉指數(shù)=糞便評分之和/供試兔只數(shù)。
[0028]表1腹瀉評分標準
[0029]
【權利要求】
1.一種基于實驗仔兔的空腸彎曲菌致腹瀉模型，其特征在于空腸彎曲菌人工感染仔兔并引起自限性的、水樣腹瀉癥狀。。
2.根據(jù)權利要求1所述實驗仔兔的空腸彎曲菌致腹瀉模型，其特征在于腹瀉疾病的程度與攻毒劑量、腸道細菌定植量正相關，至少IO6CFU細菌可引起仔兔可觀察的腹瀉癥狀和各腸道的定植；至少IO4CFU細菌可引起盲腸和結腸的定植。不同來源空腸彎曲菌分離株對仔兔致病性存在明顯差異。
3.根據(jù)權利要求1所述實驗仔兔的空腸彎曲菌致腹瀉模型，其特征在于空腸彎曲菌主要定植于盲腸和結腸中，感染后12hr可見IL-10和抗菌肽CAP-18的大量分泌，36hr時IL-18、CCL20分泌增加；60hr時IFN- y、 IL-10、IL-8、iNOS發(fā)揮重要免疫作用。
【文檔編號】A61K35/74GK104000852SQ201410274608
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權日:2014年6月18日
【發(fā)明者】焦新安, 黃金林, 商宇偉, 任方哲, 孫林 申請人:揚州大學