一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包括培養(yǎng)基和檢測液；所述的培養(yǎng)基為肉湯；所述的檢測液由以下含量的組分制成:10PCR Buffer緩沖液3~5μl，TaqDNA聚合酶0.2~0.4μl，dNTP3~5μl，100bpDNALadderMarker0.1~0.6μl，PCR引物1~2μl,Tris.Cl5~10mg，氯化鈉1~2.2mg，氯化鎂1~2.2mg，十二水磷酸氫二鈉0.2~0.5mg，增菌液3~5mg。本發(fā)明在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，可用于空腸彎曲桿菌的定性檢測，將PCR及DHPLC等技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)相互綜合，檢測結(jié)果特異性強(qiáng)，靈敏度高，保證了食品空腸彎曲桿菌的有效檢測。
【專利說明】一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品檢測領(lǐng)域，具體涉及一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒及檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002]豬肉是人們?nèi)粘Ｉ钪械闹饕馐称贩N，豬肉中微生物的含量是否達(dá)標(biāo)直接關(guān)系到大家的飲食健康?？漳c彎曲桿菌是豬肉類食品中最容易感染的微生物之一。它是引起全球人類及動物食源性細(xì)菌胃腸炎的主要原因，可引起急性腸炎及腹瀉，報道顯示，空腸彎曲桿菌感染占所有食源性細(xì)性菌感染的47%，能導(dǎo)致散發(fā)性和地方流行性胃腸炎爆發(fā)，尤其以惡性腫瘤、艾滋病、慢性疾病、兒童及老年人發(fā)病率最高，此外，還可引起格林巴利綜合征(GBS)，反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等多種并發(fā)疾病，其中格林巴利綜合征(GBS)是最嚴(yán)重的并發(fā)癥，可致感染者死亡。
[0003]空腸彎曲桿菌引起的胃腸現(xiàn)病例數(shù)已超過沙門氏菌及李斯特菌，其作為一項感染率極高的致病菌，目前已作為食品安全、畜牧獸醫(yī)及公共衛(wèi)生等領(lǐng)域的常規(guī)監(jiān)測指標(biāo)。
[0004]傳統(tǒng)的檢測與分離方法為生化及血清凝集試驗，但培養(yǎng)周期長、檢驗程序復(fù)雜、確診檢驗結(jié)果需10-20d，且報告結(jié)果差異大，該菌生長條件苛刻，食品中該菌數(shù)量極少，傳統(tǒng)的選擇性富集培養(yǎng)，很難從樣品中檢出，且該菌還存在一種“存在但不可培養(yǎng)”的狀態(tài)，給傳統(tǒng)方法檢出帶來極大的困難。因此，尋求一種能對食品空腸彎曲桿菌進(jìn)行快速檢測、檢測靈敏度度且的方法十分重要。
[0005]變性高效液相色譜(DHPLC)通過反相高效液相色譜原理，對核苷酸片段分子進(jìn)行分離，操作全自動化，準(zhǔn)確度和靈敏度高，但對于食品中空腸彎曲桿菌含量極低時，檢測結(jié)果并不十分準(zhǔn)確。本發(fā)明提供一種檢測靈敏度高、準(zhǔn)確性高的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒及檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種檢測靈敏度高、準(zhǔn)確性高的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒及檢測方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包括培養(yǎng)基和檢測液；所述的培養(yǎng)基為肉湯；所述的檢測液由以下含量的組分制成:
10PCR Buffer 緩沖液3?5 μ 1，
Taq DNA 聚合酶0.2?0.4 μ 1，
dNTP3 ?5μ1，
10bp DNA Ladder Marker0.1^0.6 μ 1，
PCR引物I?2μ1，
Tris.Cl5?10mg， 氯化鈉I?2.2mg,
氯化鎂I?2.2mg，
十二水磷酸氫二鈉0.2^0.5mg,
增菌液3?5 mg。
[0008]優(yōu)選的，所述的肉湯為Bo I ton肉湯，肉湯中含有0.3°/Γθ.5%重量份的生長促進(jìn)劑。
[0009]優(yōu)選的，所述的生長促進(jìn)劑為焦亞硫酸鈉、丙酮酸鈉與硫酸亞鐵按2:1:5的重量份混合的混合物。
[0010]優(yōu)選的，所述的PCR 引物為:C16S-F:5’ -CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTAGG-3’ (183 ?205)，C16S-R:5’ -TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3’ (449 ?468)。
[0011]優(yōu)選的，所述的Taq DNA聚合酶濃度為2_5υ/μ I。
[0012]優(yōu)選的，所述的dNTP濃度為5-10mmol/L，所述的PCR引物濃度為10-25 μ mol/L。
[0013]一種采用上述檢測試劑盒檢測豬肉中空腸彎曲桿菌的方法，包括以下步驟:
(1)量取10PCR Buffer 緩沖液 3 ?5 μ 1，Taq DNA 聚合酶 0.2 ?0.4 μ 1，dNTP3 ?5 μ 1，10bp DNA Ladder Marker 0.I?0.6 μ 1，PCR 引物 I?2 μ I, Tris.Cl 5?10mg，氯化鈉1^2.2mg,氯化鎂1?2.2mg,十二水磷酸氫二鈉0.2"0.5mg,增菌液3?5 mg,配置成檢測液；
在Bolton肉湯中加入0.39ΓΟ.5%重量份的生長促進(jìn)劑制得培養(yǎng)基；
(2)取待測豬肉樣品2?5g，研碎，接種于培養(yǎng)基中，于微需氧條件下培養(yǎng)；
(3)取增菌液接種于步驟(2)中的培養(yǎng)基中，按細(xì)菌基因組小量提取待測樣品DNA；
(4)將步驟(3)中待測樣品DNA加入檢測液中，并加入滅菌超純水，離心，進(jìn)行PCR反應(yīng)，94°C變性、72 °C變性，進(jìn)入循環(huán)，35個循環(huán)后72 °C終止延伸，制得樣品PCR產(chǎn)物；
(5)DHPLC 分析:色譜柱=PS-DVB ；C18DNASep ;柱溫 40-50°C ;色譜柱:4.5 mmX50mm ；流動相體積比:0、30s、60s、120s、240s時緩沖溶液A:緩沖溶液B之比分別為:(55%:45%)、(50.2%:49.8%)、(44.2%:55.8%)、(40.9%:59.1%)、(38.8%:61.2%);流速:(0.5-0.8) ml/min ;進(jìn)樣量:PCR產(chǎn)物(2_5) μ I; PCR檢測器:熒光檢測器。
[0014]優(yōu)選的，步驟(5)中所述的緩沖溶液A為TEAA水溶液，其濃度為0.5-0.8mmol/L。
[0015]優(yōu)選的，步驟(5)中所述的緩沖溶液B為緩沖溶液A與乙腈的混合溶液，所述的緩沖溶液A與乙腈的體積比為(4-6): (1-2)。
[0016]優(yōu)選的，步驟(5)中所述的熒光檢測器的光源為Xenon燈，功率為150w。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
(I)本發(fā)明在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，可用于空腸彎曲桿菌的定性檢測，將PCR及DHPLC等技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)相互綜合，檢測結(jié)果特異性強(qiáng)，靈敏度高，保證了食品空腸彎曲桿菌的有效檢測。
[0018](2)本發(fā)明操作簡單，不需要電泳及PCR產(chǎn)物純化，整個檢測過程僅需12h左右，與傳統(tǒng)檢測方法相比，檢測時間明顯縮短，為食品致病菌檢測提供技術(shù)支持，能滿足檢測部門對樣品的快速檢測需求，為食品安全監(jiān)督提供了有力的保障。
[0019](3)本發(fā)明在檢測前采用加入了生長促進(jìn)劑的Bolton肉湯對樣品進(jìn)行培養(yǎng)增菌，提高了檢測陽性率，降低了假陰性率的發(fā)生。

【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明:
本發(fā)明中PCR引物購自美國ATCC標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，微需氧條件采用微需氧袋實現(xiàn)。
[0021]實施例1
一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包括培養(yǎng)基和檢測液；所述的培養(yǎng)基為肉湯；所述的檢測液由以下含量的組分制成:
10PCR Buffer 緩沖液3 μ 1，
Taq DNA 聚合酶0.2μ1，
dNTP3μ I,
10bp DNA Ladder Marker0.1 μ 1，
PCR 引物Ιμ?，
Tris.Cl5mg,
氯化鈉Img,
氯化鎂Img,
十二水磷酸氫二鈉0.2mg，
增菌液3 mg。
[0022]所述的肉湯為Bo I ton肉湯，肉湯中含有0.3%重量份的生長促進(jìn)劑；所述的生長促進(jìn)劑為焦亞硫酸鈉、丙酮酸鈉與硫酸亞鐵按2:1:5的重量份混合的混合物。
[0023]所述的PCR 引物為:C16S-F:5’ -CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG-3’(183 ?205)，C16S-R:5’ -TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3’ (449 ?468)。
[0024]所述的Taq DNA聚合酶濃度為2U/ μ I ;所述的dNTP濃度為5mmol/L，所述的PCR引物濃度為10 μ mol/L。
[0025]采用上述檢測試劑盒檢測豬肉中空腸彎曲桿菌的方法，包括以下步驟:
(O按上述比例制備培養(yǎng)基和檢測試液；
(2)取待測豬肉樣品2g，研碎，接種于培養(yǎng)基中，于微需氧條件下培養(yǎng)；
(3)取增菌液接種于步驟(2)中的培養(yǎng)基中，按細(xì)菌基因組小量提取待測樣品DNA；
(4)將步驟(3)中待測樣品DNA加入檢測液中，并加入滅菌超純水，離心，進(jìn)行PCR反應(yīng)，94°C變性、72 °C變性，進(jìn)入循環(huán)，35個循環(huán)后72 °C終止延伸，制得樣品PCR產(chǎn)物；
(5)DHPLC 分析:色譜柱=PS-DVB ；C18DNASep ;柱溫 40-50°C ;色譜柱:4.5 mmX50mm ；流動相體積比:0、30s、60s、120s、240s時緩沖溶液A:緩沖溶液B之比分別為:(55%:45%)、(50.2%:49.8%)、(44.2%:55.8%)、(40.9%:59.1%)、(38.8%:61.2%);流速:(0.5-0.8) ml/min ;進(jìn)樣量:PCR產(chǎn)物(2_5)μ1; PCR檢測器:熒光檢測器。
[0026]步驟(5)中所述的緩沖溶液A為TEAA水溶液，其濃度為0.5mmol/L ;步驟(5)中所述的緩沖溶液B為緩沖溶液A與乙腈的混合溶液，所述的緩沖溶液A與乙腈的體積比為(4-6): (1-2);步驟(5)中所述的熒光檢測器的光源為Xenon燈，功率為150w。
[0027]實施例2
一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包括培養(yǎng)基和檢測液；所述的培養(yǎng)基為肉湯；所述的檢測液由以下含量的組分制成:
10PCR Buffer 緩沖液5 μ 1， Taq DNA 聚合酶0.4μ1，
dNTP5μ I,
10bp DNA Ladder Marker0.6 μ 1，
PCR 引物2μ1，
Tris.Cl1mg,
氯化鈉2.2mg,
氯化鎂2.2mg，
十二水磷酸氫二鈉0.5mg,
增菌液5 mg。
[0028]所述的肉湯為Bolton肉湯，肉湯中含有0.5%重量份的生長促進(jìn)劑；所述的生長促進(jìn)劑為焦亞硫酸鈉、丙酮酸鈉與硫酸亞鐵按2:1:5的重量份混合的混合物。
[0029]所述的PCR 引物為:C16S-F:5’ -CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG-3’(183 ?205)，C16S-R:5’ -TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3’ (449 ?468)。
[0030]所述的Taq DNA聚合酶濃度為5U/ μ I ;所述的dNTP濃度為10mmol/L，所述的PCR引物濃度為25 μ mol/L。
[0031]一種采用上述檢測試劑盒檢測豬肉中空腸彎曲桿菌的方法，包括以下步驟:
(O按上述比例制備培養(yǎng)基和檢測試液；
(2)取待測豬肉樣品5g，研碎，接種于培養(yǎng)基中，于微需氧條件下培養(yǎng)；
(3)取增菌液接種于步驟(2)中的培養(yǎng)基中，按細(xì)菌基因組小量提取待測樣品DNA；
(4)將步驟(3)中待測樣品DNA加入檢測液中，并加入滅菌超純水，離心，進(jìn)行PCR反應(yīng)，94°C變性、72 °C變性，進(jìn)入循環(huán)，35個循環(huán)后72 °C終止延伸，制得樣品PCR產(chǎn)物；
(5)DHPLC 分析:色譜柱=PS-DVB ；C18DNASep ;柱溫 40-50°C ;色譜柱:4.5 mmX50mm ；流動相體積比:0、30s、60s、120s、240s時緩沖溶液A:緩沖溶液B之比分別為:(55%:45%)、(50.2%:49.8%)、(44.2%:55.8%)、(40.9%:59.1%)、(38.8%:61.2%);流速:(0.5-0.8) ml/min ;進(jìn)樣量:PCR產(chǎn)物(2_5)μ1; PCR檢測器:熒光檢測器。
[0032]步驟(5)中所述的緩沖溶液A為TEAA水溶液，其濃度為0.8mmol/L ;步驟(5)中所述的緩沖溶液B為緩沖溶液A與乙腈的混合溶液，所述的緩沖溶液A與乙腈的體積比為(4-6): (1-2);其特征在于，步驟(5)中所述的熒光檢測器的光源為Xenon燈，功率為150w。
[0033]實施例3
一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，所述的檢測試劑盒包括培養(yǎng)基和檢測液；所述的培養(yǎng)基為肉湯；所述的檢測液由以下含量的組分制成:
10PCR Buffer 緩沖液4 μ 1，
Taq DNA 聚合酶0.3μ1，
dNTP4μ I,
10bp DNA Ladder Marker0.5 μ 1，
PCR 引物1.5μ1，
Tris.Cl8mg,
氯化鈉2mg,
氯化鎂1.5mg, 十二水磷酸氫二鈉0.3mg，
增菌液4 mg。
[0034]所述的肉湯為Bolton肉湯，肉湯中含有0.4%重量份的生長促進(jìn)劑；所述的生長促進(jìn)劑為焦亞硫酸鈉、丙酮酸鈉與硫酸亞鐵按2:1:5的重量份混合的混合物。
[0035]所述的PCR 引物為:C16S-F:5’ -CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG-3’(183 ?205)，C16S-R:5’ -TTC CTT AGG TAC CGT CAG AA-3’ (449 ?468)。
[0036]所述的Taq DNA聚合酶濃度為3U/ μ I ;所述的dNTP濃度為8mmol/L，所述的PCR引物濃度為15 μ mol/L。
[0037]—種采用上述檢測試劑盒檢測豬肉中空腸彎曲桿菌的方法，包括以下步驟:
(O按上述比例制備培養(yǎng)基和檢測試液；
(2)取待測豬肉樣品4g，研碎，接種于培養(yǎng)基中，于微需氧條件下培養(yǎng)；
(3)取增菌液接種于步驟(2)中的培養(yǎng)基中，按細(xì)菌基因組小量提取待測樣品DNA；
(4)將步驟(3)中待測樣品DNA加入檢測液中，并加入滅菌超純水，離心，進(jìn)行PCR反應(yīng)，94°C變性、72 °C變性，進(jìn)入循環(huán)，35個循環(huán)后72 °C終止延伸，制得樣品PCR產(chǎn)物；
(5)DHPLC 分析:色譜柱=PS-DVB ；C18DNASep ;柱溫 40-50°C ;色譜柱:4.5 mmX50mm ；流動相體積比:0、30s、60s、120s、240s時緩沖溶液A:緩沖溶液B之比分別為:(55%:45%)、(50.2%:49.8%)、(44.2%:55.8%)、(40.9%:59.1%)、(38.8%:61.2%);流速:(0.5-0.8) ml/min ;進(jìn)樣量:PCR產(chǎn)物(2_5) μ I; PCR檢測器:熒光檢測器。
[0038]步驟(5)中所述的緩沖溶液A為TEAA水溶液，其濃度為0.5-0.8mmol/L ;步驟(5)中所述的緩沖溶液B為緩沖溶液A與乙腈的混合溶液，所述的緩沖溶液A與乙腈的體積比為(4-6): (1-2);步驟(5)中所述的熒光檢測器的光源為Xenon燈，功率為150w。
[0039]上述實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的檢測試劑盒包括培養(yǎng)基和檢測液；所述的培養(yǎng)基為肉湯；所述的檢測液由以下含量的組分制成: 1PCR Buffer 緩沖液3?5 μ 1， Taq DNA 聚合酶0.2?0.4 μ 1， dNTP3 ?5μ1， 10bp DNA Ladder Marker0.1^0.6 μ I, PCR引物I?2μ1， Tris.Cl5?1mg, 氯化鈉I?2.2mg, 氯化鎂I?2.2mg， 十二水磷酸氫二鈉0.2^0.5mg, 增菌液3?5 mg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的肉湯為Bolton肉湯，肉湯中含有0.39ΓΟ.5%重量份的生長促進(jìn)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的生長促進(jìn)劑為焦亞硫酸鈉、丙酮酸鈉與硫酸亞鐵按2:1:5的重量份混合的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的PCR引物為:C16S-F:5’ -CTG CTT AAC ACA AGT TGA GTA GG-3’ (183 ?205)，C16S-R:5’ -TTCCTT AGG TAC CGT CAG AA-3’ (449 ?468)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的TaqDNA聚合酶濃度為2-5υ/μ I。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬肉中空腸彎曲桿菌的檢測試劑盒，其特征在于，所述的dNTP濃度為5-10mmol/L，所述的PCR引物濃度為10-25 μ mol/L。
7.一種采用如權(quán)利要求1飛中任一所述的檢測試劑盒檢測豬肉中空腸彎曲桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)量取10PCR Buffer 緩沖液 3 ?5 μ 1，Taq DNA 聚合酶 0.2 ?0.4 μ 1，dNTP3 ?5 μ 1，10bp DNA Ladder Marker 0.I?0.6 μ 1，PCR 引物 I?2 μ I, Tris.Cl 5?10mg，氯化鈉1^2.2mg,氯化鎂1?2.2mg,十二水磷酸氫二鈉0.2"0.5mg,增菌液3?5 mg,配置成檢測液； 在Bolton肉湯中加入0.39ΓΟ.5%重量份的生長促進(jìn)劑制得培養(yǎng)基； (2)取待測豬肉樣品2?5g，研碎，接種于培養(yǎng)基中，于微需氧條件下培養(yǎng)； (3)取增菌液接種于步驟(2)中的培養(yǎng)基中，按細(xì)菌基因組小量提取待測樣品DNA； (4)將步驟(3)中待測樣品DNA加入檢測液中，并加入滅菌超純水，離心，進(jìn)行PCR反應(yīng)，94°C變性、72 °C變性，進(jìn)入循環(huán)，35個循環(huán)后72 °C終止延伸，制得樣品PCR產(chǎn)物； (5)DHPLC 分析:色譜柱=PS-DVB ；C18DNASep ;柱溫 40-50°C ;色譜柱:4.5 mmX50mm ；流動相體積比:0、30s、60s、120s、240s時緩沖溶液A:緩沖溶液B之比分別為:(55%:45%)、(50.2%:49.8%)、(44.2%:55.8%)、(40.9%:59.1%)、(38.8%:61.2%);流速:(0.5-0.8) ml/min ;進(jìn)樣量:PCR產(chǎn)物(2_5) μ I; PCR檢測器:熒光檢測器。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種檢測豬肉中空腸彎曲桿菌的方法，其特征在于，步驟(5)中所述的緩沖溶液A為TEAA水溶液，其濃度為0.5-0.8mmol/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種檢測豬肉中空腸彎曲桿菌的方法，其特征在于，步驟(5)中所述的緩沖溶液B為緩沖溶液A與乙腈的混合溶液，所述的緩沖溶液A與乙腈的體積比為(4-6):(1-2)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種檢測豬肉中空腸彎曲桿菌的方法，其特征在于，步驟(5)中所述的熒光檢測器的光源為Xenon燈，功率為150w。
【文檔編號】C12Q1/04GK104278087SQ201410482598
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月20日
【發(fā)明者】郭狄 申請人:中山鼎晟生物科技有限公司