專利名稱：一種檢測空腸彎曲菌抗體的特異抗原及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，特別是涉及一種檢測空腸彎曲菌抗體的特異診斷蛋白抗原，具體地，是空腸彎曲菌烷基過氧化氫還原酶(Alkyl Hydroperoxide Reductase, AhpC)蛋白抗原及其應用。
背景技術(shù)：
空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是彎曲菌屬中主要導致人類疾病的食源性病原菌，是導致人類腹瀉的主要病原之一?？漳c彎曲菌分布廣泛，人類感染主要是由于空腸彎曲菌污染食品、飲用水以及環(huán)境引起的，除腸炎外，空腸彎曲菌的感染可導致格林-巴利綜合癥(Guillain-Barre Syndrome，GBQ，給人類帶來嚴重的疾病負擔?？漳c彎曲菌感染后導致GBS的機理是由于病原與外周神經(jīng)細胞上的神經(jīng)節(jié)苷脂有共同的抗原成分，感染后產(chǎn)生特異抗體的錯誤識別造成神經(jīng)的損傷?？漳c彎曲菌感染后血清特異抗體的檢測是確定空腸彎曲菌的前期感染以及進行GBS的病因分析的主要手段。目前由于這種特異檢測抗原的缺乏，造成空腸彎曲菌感染后抗體檢測試劑以及檢測方法的缺乏。研究發(fā)現(xiàn)空腸彎曲菌不同菌型菌株感染產(chǎn)生的抗體的種類及其類神經(jīng)節(jié)苷脂靶點的種類不同，從而導致神經(jīng)病變的損傷不同。我國導致GBS的空腸彎曲菌菌株的菌型主要為HS :41和HS 19，腹瀉患者感染菌株的血清型主要為HS :37，HS :6，7等。迄今，國際上只有一種的檢測空腸彎曲菌抗體商業(yè)ELISA試劑盒，其為德國生產(chǎn)，但該試劑盒對于我國菌株感染的檢測靈敏度較低。目前還沒有針對我國菌株感染特異抗體檢測的相關特異性診斷抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種空腸彎曲菌AhpC蛋白抗原；本發(fā)明的第二個目的在于提供編碼上述AhpC蛋白的基因；本發(fā)明的第三個目的在于提供上述AhpC蛋白的用途，以彌補目前針對我國空腸彎曲菌感染特異抗體檢測沒有相關特異性抗原的空白。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先對空腸彎曲菌菌株NCTC11168的ahpC基因DNA序列進行自主測序，用BLASTn與Vector NTI Suite 6. 0軟件對NCBI公布的測序菌種ahpC基因的DNA序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同菌株的ahpC基因皆為597bp，菌株間DNA序列沒有明顯的缺失及插入，不同菌株共有12個堿基存在差異，一致性為98%，證明ahpC基因在空腸彎曲菌菌種內(nèi)具有高度的保守性。其核苷酸序列如SEQ IDN0. 1所示。應當理解，本領域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的AhpC的氨基酸序列(SEQ ID No. 2)，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第30位的天冬酰胺N替換為甘氨酸G，或是將第35位的甘氨酸G缺失，或是在第M位增加丙氨酸A，均不影響其生物活性。因此，本發(fā)明AhpC還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有與AhpC同等活性的由AhpC衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因包括編碼上述蛋白的核苷酸序列。此外，應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達的密碼子。因而，本發(fā)明ahpC基因還包括由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸，得到編碼AhpC的核苷酸序列。ahpC基因的DNA序列經(jīng)NCBI的Blast數(shù)據(jù)庫的比對，發(fā)現(xiàn)僅與幽門螺桿菌有部分交叉。本發(fā)明將6株幽門螺桿菌的基因ahpC的堿基序列，其中有4株菌有542個堿基，2株菌有597個堿基，進行6株已知序列的幽門螺桿菌ahpC基因與空腸彎曲菌ahpC基因序列進行比對，一致性僅為62%，而與大腸桿菌0157，弗氏埃希氏桿菌，腸炎菌株，弗氏志賀菌， 鮑氏志賀(氏)菌等其它腸道細菌相比，DNA —致性為45. 1%。說明ahpC基因的DNA序列與其它病原相比具有特異性。本發(fā)明提供了一種重組表達載體，含有以空腸彎曲菌AhpC蛋白編碼基因為目的基因的表達盒。本發(fā)明的重組表達載體為PGEX-ahpC。本發(fā)明的空腸彎曲菌AhpC蛋白具有彎曲菌相關毒力因子的特征，且具有良好的抗原性，特異性，可用于檢測空腸彎曲菌特異抗體。針對AhpC蛋白的上述特點，本發(fā)明還提供了一種空腸彎曲菌抗體的檢測方法。本發(fā)明所述的空腸彎曲菌抗體的檢測方法，是以AhpC重組蛋白為抗原，以間接 ELISA方法檢待測樣本中的空腸彎曲菌特異抗體。為了使上述方法操作更簡便，本發(fā)明還提供了一種空腸彎曲菌抗體檢測酶聯(lián)免疫吸附試劑盒。本發(fā)明的空腸彎曲菌抗體酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，以上述的AhpC重組蛋白為包被抗原。該試劑盒還含有酶結(jié)合物工作液、陽性對照、陰性對照、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、 顯色液和終止液。酶結(jié)合物工作液可以用辣根過氧化物酶(HRP)標記的金黃色葡萄球菌A 蛋白，簡稱SPA，陽性對照可以用兔免疫C. jejuni標準陽性血清，陰性對照可以用兔標準陰
性血清。本發(fā)明的AhpC蛋白為非全菌抗原，與空腸彎曲菌免疫血清、空腸彎曲菌標準陽性血清反應，不與幽門螺桿菌、大腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、霍亂弧菌等腸道細菌的陽性血清發(fā)生交叉反應，具有良好的抗原性，特異性強。以AhpC蛋白為抗原，以ELISA方法可以檢測空腸彎曲菌抗體，該方法操作簡便，檢測快速，成本低，可用于我國空腸彎曲菌感染特異抗體的檢測。


圖1.為PCR擴增ahpC基因結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1 :DNA marker, 泳道2,3,4 :ahpC的PCR擴增產(chǎn)物，大小597bp。圖2.為重組質(zhì)粒PGEX-ahpC的雙酶切鑒定結(jié)果圖，其中IDNA marker ；2重組質(zhì)粒 PGEX-ahpC雙酶切結(jié)果；3重組質(zhì)粒PGEX-ahpC。圖3.為SDS-PAGE電泳圖，其中1.蛋白marker ；2.宿主菌BL21的誘導；3.轉(zhuǎn)化體PGEX-BL21誘導后；4.轉(zhuǎn)化體BL21_AhpC未誘導；5.轉(zhuǎn)化體BL21_AhpC沉淀；6.轉(zhuǎn)化體 BL21-AhpC上清；7. AhpC純化蛋白。圖4.為AhpC蛋白免疫印跡分析圖，其中泳道1.蛋白maker ;2.菌株ICDCCJ07001 全菌蛋白；3. GBS散發(fā)株免疫前的兔血清；4. GBS散發(fā)菌株免疫兔血清；5. GBS爆發(fā)株 ICDCCJ07001免疫前兔血清；6. GBS爆發(fā)株ICDCCJ07001免疫后兔血清；7. NCTCl 1168免疫前兔血清；8. NCTCl 1168免疫后兔血清；9.結(jié)核桿菌免疫兔血清；10.蛋白maker ；11.空表達載體PGEX-4T-1散發(fā)株免疫后的兔血清。圖5.為AhpC抗原對空腸彎曲菌免疫前和免疫后血清抗體檢測結(jié)果圖，其中縱坐標為檢測結(jié)果的OD值，橫坐標為1-11份稀釋了的血清，其稀釋度分別從1 100至 1 102400。圖6.為AhpC抗原對空腸彎曲菌和其他病原免疫血清抗體的ELISA檢測結(jié)果圖， 縱坐標為ELISA檢測空腸彎曲菌及其它病原免疫血清的OD值，橫坐標為1-11份稀釋了的血清(從1 11，稀釋度分別為1 100至1 10M00)，幾種免疫血清分別為空腸彎曲菌免疫前血清，空腸彎曲菌免疫后血清，幽門螺桿菌免疫血清，小腸耶爾森氏菌08免疫血清， 小腸耶爾森氏菌09免疫血清，大腸0 :157免疫血清和霍亂弧菌免疫血清。圖7.為AhpC抗原包被ELISA試劑盒對患者血清的檢測結(jié)果圖，其中36份陽性血清，51份陰性血清。圖8.為三種試劑盒檢測空腸彎曲菌的結(jié)果圖，三種試劑盒分別為AhpC抗原包被 ELISA，空腸彎曲菌全菌蛋白抗原包被ELISA和商品化試劑盒virion\serion。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1空腸彎曲菌AhpC蛋白的制備1、AhpC編碼基因的克隆1. 1 材料空腸彎曲菌菌株NCTC11168來自美國國家典型菌種保藏中心(ATCC)，購自北京中原公司；質(zhì)粒PGEX-4T-1購自GE Healthcare公司；La Taq酶，限制性內(nèi)切酶BamH I和 Xho I，T4DNA 連接酶，Pmdl8_TVector，protein marker，均購自大連 TaKaRa 公司；大腸桿菌 E. coliDH5a，菌株 E. coli BL21(DE3), Taq DNA 聚合酶，dNTP, DNA marker，細菌基因組 DNA提取試劑盒，DNA電泳瓊脂糖凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；GST標簽的快速親和層析柱購自GE Healthcare公司；辣根過氧化物酶標記 SPA(北京博奧森生物技術(shù)公司)；兔免疫血清(本研究制備)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。 引物合成由上海生工生物技術(shù)有限公司北京合成部完成，DNA測序由天一輝遠公司完成，飛行質(zhì)譜鑒定由本實驗室ABI4700MALDI-T0F-T0F完成。1. 2PCR擴增和產(chǎn)物回收(1)PCR25 μ L 擴增體系10 X PCR buffer 2. 5 μ 1 ；dNTP 2 μ 1 ;LA taq 酶 0· 5 μ 1 ；
5模板 DNA 1 μ 1 ；上下游引物各 0. 5 μ 1，ahpC 上游引物5 ‘ -BamHI-CGCGGATCCATGATAGTT ACTAAAAAAGCTTTAGATTT-3 ‘；下游引物5 ‘ -XhoI-CCGCTCGAGTTAAAGTTTAGCTTCGTTTTTG C-3' ；ddH20 18 μ 1。PCR 循環(huán)條件-MV 5min ；94°C lmin，55°C lmin，72°C 90s，35 個循環(huán)； 720C 5min ；PCR 產(chǎn)物于 4°C保存。Q)PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下觀察結(jié)果，見圖1。PCR擴增產(chǎn)物大小597bp，與預期的ahpC基因大小一致。用普通瓊脂糖凝膠試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物。1.3目的基因連接T載體10 μ 1連接體系PMD18_T載體1μ 1，PCR產(chǎn)物3μ 1，連接液5μ 1，雙蒸水1μ 1，于 16°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a。取5 μ 1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到50 μ 1 的大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞中，混勻后放置于冰上30min。42°C熱激90s，立刻放于冰上 90s。加入500 μ 1的LB培養(yǎng)基，混勻，37°C，220rpm搖菌45 60min，取出200 μ 1菌液均勻涂在含有抗性的平板上，37°C培養(yǎng)過夜。取出過夜培養(yǎng)平板，隨機挑取幾個單克?。辉谛碌目剐云桨迳陷p輕劃一下以便保存，其余加到PCR體系中；反應條件同1.2項。結(jié)果顯示擴增出預期的目的條帶。(4)測序?qū)㈥栃钥寺∽?4h搖菌lml，送天一輝遠公司測序，測序結(jié)果說明成功克隆出ahpC基因。2、空腸彎曲菌AhpC蛋白的表達以上述提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，回收目的片段，與克隆載體連接。 以含有第一次PCR擴增片段的重組載體為模板，用含有BamHI和BioI酶切位點引物進行 PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和BioI酶切，與同樣酶切的PGEX-4T-1表達載體進行連接獲得重組表達載體PGEX-ahpC。該重組表達載體PGEX-ahpC的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示，SEQ ID No. 1長597bp，編碼序列表中SEQ ID No. 2所示的蛋白。重組表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)，在IPTG誘導下表達蛋白AhpC。分別取AhpC蛋白表達菌液的上清、沉淀各5 μ 1進行SDS-PAGE實驗(12%的分離膠，5%的濃縮膠)，80V電泳半小時，待蛋白進入分離膠，調(diào)整電壓120V電泳2小時。用考馬斯亮藍R250染色1- 后，脫色觀察，見圖3。結(jié)果表明，在誘導溫度為37°C，誘導劑IPTG終濃度為0. 5mmol/L時，AhpC蛋白大量表達，并在誘導4小時時表達量最大，AhpC重組蛋白大小為48kD(含載體PGEX-4T-1蛋白分子量26KD)，與理論值相當。實施例2空腸彎曲菌AhpC蛋白的質(zhì)譜鑒定、純化和Wfestern-Blot分析1、空腸彎曲菌AhpC蛋白的質(zhì)譜鑒定用25mM NH4HCO3 (pH 8.0)每孔加入100 μ 1，室溫下置于搖床上300rpm，洗膠 20min ；吸去上清，加入50μ 1含30%乙腈的0. IMNH4HCO3置于搖床上lOOrpm，搖動脫色，中間換液一次，至看不到顏色為止。去液后，加入100 μ 1 25mM NH4HCO3搖動(IOOrpm) 20min， 洗膠。-80°C預凍約1小時。取出，放于真空干燥機內(nèi)低溫凍干約1小時。每管加入20 μ 1/ ml的Trypsin(胰酶)8 μ 1于干燥的膠上，膠塊立即吸液漲大，等完全漲大后，置于4°C冰箱 30min，加入10μ 125mM NH4HCO3,然后用封口膜封緊，37°C 16h。離心后將反應液吸出，加到 PCR反應管中，然后加入50%乙腈(CAN)/5%三氟乙酸(TFA)40 μ 1到膠上，輕微震蕩萃取時間60min(40rpm)，把萃取液吸出加到前面的PCR管中，共萃取兩次。萃取液和反應液預凍抽干。AhpC蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果為所表達蛋白條帶為空腸彎曲菌的烷基過氧化氫還原酶 (AhpC)蛋白，其分子量約為22KD，其鑒定結(jié)果的可信度為100%。2、AhpC蛋白的純化將含有陽性克隆子的細菌培養(yǎng)液收集到500ml離心管中，7000rpm，離心40分鐘。 細菌轉(zhuǎn)入50毫升離心管，10000rpm，15分鐘，PBS(pH7. 4)洗3遍。將菌體懸于60毫升PBS， 冰浴中進行超聲破碎，60W，20分鐘，超聲5秒，停頓10秒。IOOOOrpm離心20分鐘，上清用 0. 45 μ m濾膜過濾。利用AKTA(PURIFIERIOO)蛋白純化儀進行純化。A、B泵用超純水泵洗。A、B泵分別用20mM PBS (pH7. 3)和50mM的L-谷胱甘肽(pH 8. 0)進行泵洗。設定純化程序，用兩步法5毫升的GSTrap親和純化柱進行純化，即先用8% L-谷胱甘肽去除非特異蛋白，100% L-谷胱甘肽完全洗脫。SDS-PAGE電泳檢查蛋白純化結(jié)果良好，純化后AhpC蛋白的濃度為0. 185μ g/μ 1。3、AhpC蛋白抗原性的免疫印跡(Western-Blot)分析純化后的AhpC蛋白作為抗原，一抗用3組6種血清(上述中國感染菌株代表免疫血清)，分別為格林-巴利綜合癥散發(fā)相關空腸彎曲菌菌株免疫血清；格林-巴利綜合癥爆發(fā)相關空腸彎曲菌菌株免疫血清；NCTC11168免疫血清，一抗的濃度1 50;二抗用 HRP-SPA，濃度1 10000。純化后的Ahpc蛋白的濃度為0. 185 μ 1/μ 1，上樣量1. 2 μ 1，空表達載體的蛋白分子量大小26KD。結(jié)果表明=AhpC蛋白只與空腸彎曲菌免疫血清發(fā)生反應，而與空表達載體以及其它免疫血清沒有反應，見圖4，說明AhpC蛋白具有免疫原性。實施例3空腸彎曲菌抗體間接ELISA診斷試劑盒的制備空腸彎曲菌抗體ELISA診斷試劑盒包含抗體檢測板、酶結(jié)合工作物、陽性對照、陰性對照、樣品稀釋液、IOX濃縮洗滌液、顯色液A、顯色液B和終止液?？贵w檢測板的制備用pH7. 4的磷酸鹽(PBS)緩沖液作為包被稀釋液，將實施例1制備的蛋白AhpC稀釋為10μ g/mL，100 μ L/孔包被96孔酶標板，使每孔所含的蛋白為1 μ g，用封口膜封閉后37°C孵育2h，再4°C包被過夜；pH7. 4的磷酸鹽緩沖液為 KCl (26. 7mM)，KH2PO4 (14. 7mM)，Na2HPO4 (80. 9mM)，NaCl (1. 37M)溶液；甩干，按 300 μ L/ 孔1 %脫脂奶粉封閉(PBS配制)，4 °C溫箱中過夜，洗滌，甩干；PBS為KCl (26. 7mM)， KH2PO4(14. 7mM)，Na2HPO4(80. 9mM)，NaCl (1. 37M)的混合液，ρΗ7· 2 7. 5 ；再加入 20%蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護3小時，將酶標板真空無菌、干燥包裝。酶結(jié)合物工作液的制備辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG。以含0. 1 % (質(zhì)量百分含量，下同)小牛血清白蛋白(BSA)，0.05%吐溫-20，0.01%硫柳汞鈉，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液按1 200 5000稀釋凍存的辣根過氧化物酶標記的抗體作為酶結(jié)合物工作液。樣品稀釋液、洗滌液、終止液的配制樣品稀釋液為含0.05%酪蛋白(casein) 的磷酸鹽緩沖液(1. 99g KCl (26. 7mM),2. OOg KH2PO4 (14. 7mM), 11. 48g Na2HPO4 (80. 9mM), 80. 06g NaCl (1. 37M)定容至 IOOOmL pH7. 4) ； 10 X 濃縮洗滌液為含 0. 05% 吐溫-20 的 0. IM 的磷酸鹽緩沖液(1. 99g KCl (26. 7mM),2. OOg KH2PO4 (14. 7mM), 11. 48gNa2HP04 (80 . 9mM), 80. 06g NaCl (1. 37M)定容至 lOOOmL，再加 5mLTween_20，pH7. 4)；顯色液 A 為 0. lmg/mL 的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，顯色液B為含0.05%過氧化氫的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液；終止液為2M硫酸溶液，即取22. 2mL濃硫酸緩慢加入177. SmL去離子水中制備獲得。顯色液的制備稱取IOOmg四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，用IOOmL無水乙醇或DMSO溶解后，定容至IOOOmL,配制顯色液A ；稱取；35. 8gNa2HP04 · 12H20，21g—水檸檬酸，6. 4mL 0. 75% 的過氧化氫尿素，雙蒸水定容至IOOOmL,調(diào)pH值到4. 5 5. 0，配制顯色液B。陰、陽性對照的制備陰性血清為未感染C. jejuni的健康新西蘭大白兔血清；陽性血清為用4X IO9個C. jejuni菌連續(xù)免疫健康新西蘭大白兔4次，每次間隔10天，取免疫前后血清效價相差IO5的大白兔血清，為陽性血清。診斷試劑盒具體檢測程序為(1)將10X濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；(2) 將待檢血清用樣品稀釋液作1 500稀釋，按100 μ L/孔加入反應板中，同時設陽性對照 (C. jejuni標準陽性血清)、陰性對照(C. jejuni標準陰性血清)和空白對照(只加IOOyL 樣品稀釋液)37°C反應1小時；(3)將酶標板應用美國BioTek Elx808洗板機洗板6次；(4) 每孔加入IOOyL酶結(jié)合物工作液(空白不加)，37°C溫箱中放置30min ； (5)將酶標板應用美國BioTek Elx808洗板機洗板6次；(6)依次加入底物顯色液A、B各50 μ L，室溫下避光反應15min ； (7)每孔加入50 μ L終止液，混合均勻，于酶標儀中雙波長(第一波長450nm， 第二波長630nm)下讀取其OD值。檢測樣本的判定標準為血清抗體檢測結(jié)果的定性判定標準陰性血清判斷樣本OD值> 2. 5倍陰性標準的OD值陰性血清判斷樣本OD值彡2倍陰性標準的OD值，可疑陽性血清判斷樣本OD值> 2倍陰性標準的OD值< 2. 5倍陰性標準的OD值，對于可疑陽性的判斷，重復實驗，如果結(jié)果仍為可疑陽性值則判斷為陰性。實施例4空腸彎曲菌抗體間接ELISA診斷試劑盒的應用用建立好的方法對空腸彎曲菌免疫血清抗體進行檢測，結(jié)果如下。1、AhpC蛋白抗原包被ELISA檢測空腸彎曲菌免疫血清抗體用建立的方法對本實驗室自行獲得的空腸彎曲菌免疫兔血清進行抗空腸彎曲菌抗體檢測，檢測步驟如下(1)對空腸彎曲菌免疫前及免疫后血清利用PBS緩沖液(同上) 進行倍比稀釋，稀釋度分別為1 100，1 200,1 400 1 102400，共11個稀釋度。 (2)按100μ L/孔加入上述方法制備的ELISA反應板中，37°C反應1小時。(3)將酶標板應用美國BioTek Elx808洗板機洗板6次；(4)每孔加入100 μ L酶結(jié)合物工作液(空白不加)，37°C溫箱中放置30min ； (5)將酶標板應用美國BioTek ElxSOS洗板機洗板6次；(6) 依次加入底物顯色液A、B各50 μ L，室溫下避光反應15min ； (7)每孔加入50 μ L終止液，混合均勻，于酶標儀中雙波長(第一波長450nm，第二波長630nm)下讀取其OD值?？漳c彎曲菌免疫前后血清ELISA檢測結(jié)果的OD值見下表1及附圖5。表1 AhpC抗原包被ELISA板對空腸彎曲菌免疫血清抗體檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.空腸彎曲菌烷基過氧化氫還原酶AhpC蛋白，其氨基酸序列為a)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；或b)SEQID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失、或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述空腸彎曲菌AhpC的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其為PGEX-ahpC。
6.權(quán)利要求1所述的AhpC蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因在檢測空腸彎曲菌抗體中的應用。
7.空腸彎曲菌抗體的檢測方法，是以權(quán)利要求1所述的AhpC蛋白為抗原，以間接 ELISA方法檢測待測樣本中的空腸彎曲菌抗體。
8.以權(quán)利要求1所述的AhpC蛋白為包被抗原的空腸彎曲菌酶聯(lián)免疫吸附試劑盒。
9.如權(quán)利要求8所述的空腸彎曲菌酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征在于還含有酶結(jié)合物工作液、陽性對照、陰性對照、樣品稀釋液、濃縮洗滌液、顯色液和終止液。
10.如權(quán)利要求9所述的空腸彎曲菌酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征在于所述酶結(jié)合物工作液為HRP標記SPA，所述陽性對照為兔免疫空腸彎曲菌標準陽性血清，所述陰性對照為兔標準陰性血清。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測空腸彎曲菌的特異抗原，為空腸彎曲菌烷基過氧化氫還原酶AhpC(Alkyl Hydroperoxide Reductase，AhpC)重組蛋白抗原，該抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，編碼該抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明提供的特異抗原可用于定量、定性檢測血清中空腸彎曲菌特異抗體的各種檢測試劑及試劑盒的制備。本發(fā)明還提供了以該抗原作包被原的ELISA檢測試劑盒，具有檢測準確，靈敏度高、特異性強，簡便快速的優(yōu)點，可用于臨床檢測血清中空腸彎曲菌的抗體。
文檔編號C12N15/63GK102286437SQ20111018426
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者孟凡亮, 張建中, 張茂俊, 曹芳芳 申請人:中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所