一種檢測耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌的多重pcr方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明整合了錯配擴增突變分析PCR（MAMA-PCR）和多重PCR技術(shù)，提供了一種快速檢測由于核苷酸點突變引起的耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌的方法及試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒包括具有序列表中SEQ?ID?№：1-5、SEQ?ID?№：7所示的核苷酸序列的引物組合物和具有序列表中SEQ?ID?№：1-6所示核苷酸序列的質(zhì)控組引物組合物。本發(fā)明提供的檢測方法及試劑盒可快速從疑似菌中鑒定出耐喹諾酮類抗生素的空腸彎曲桿菌，簡化了以菌種鑒定和藥敏試驗為代表的傳統(tǒng)檢測方法的復雜程序，具有良好的特異性和靈敏度，非常適合基層一線用于快速檢測疑似菌，繼而提供準確的用藥指導。
【專利說明】—種檢測耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌的多重PCR方法及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及ー種快速檢測耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌的分子生物學技木 。
【背景技術(shù)】
[0002]空腸彎曲桿菌是ー種主要的食源性感染病原菌，在許多經(jīng)濟發(fā)達國家由空腸彎曲桿菌感染引起的腹瀉在細菌性腹瀉病中位居榜首。在發(fā)展中國家，空腸彎曲桿菌引起的腹瀉僅次于大腸桿菌和志賀氏菌。近年來，隨著空腸彎曲桿菌耐藥性的增強，使其在食物中污染程度增高，由其造成的食物中毒事件迅速増加。世界衛(wèi)生組織(WTO)已將該病列為最常見的傳染病之一，我國的國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)于2003年増加了對彎曲菌病的監(jiān)測。在自然界中，空腸彎曲桿菌廣泛存在于雞，鴨，牛，羊等家禽，家畜以及鳥類的腸道內(nèi)，構(gòu)成空腸彎曲桿菌的體外儲存宿主?？漳c彎曲桿菌污染的肉，奶，蛋以及水源等是空腸彎曲桿菌感染的主要傳染源。無論在動物體內(nèi)還是在人類感染中，目前空腸彎曲桿菌的耐藥問題世界性普遍存在，成為空腸彎曲桿菌病預防控制及臨床治療所面臨的重要挑戰(zhàn)。
[0003]喹諾酮類藥物是治療空腸彎曲桿菌腸炎中使用最普遍的藥，不幸的是90年代后隨著其大量的應用，其耐藥性迅速増加，耐藥菌株也開始傳播。不僅人類感染菌株中其耐藥比例逐漸增加，在動物中，家畜，家禽及肉類食品分離菌株中，喹諾酮的耐藥也逐漸增加。隨著喹諾酮類抗性菌種造成感染數(shù)量的增多，人類感染空腸彎曲桿菌病例也越來越多。人們在肉用動物生產(chǎn)中使用了大量的喹諾酮類藥物，使喹諾酮類藥物在食物鏈中出現(xiàn)造成空腸彎曲桿菌對其產(chǎn)生耐藥性。
[0004]目前細菌耐藥性檢測主要是通過基于培養(yǎng)的藥物敏感性實驗，包括紙片擴散法、最小抑菌濃度(MIC)法等。其中MIC法屬于金標準，可以表明細菌對藥物的敏感性，從而指導臨床治療。由于上述藥物敏感性實驗是基于培養(yǎng)的，因此耗時較長，約2-3天才能獲得結(jié)果，而且靈敏度較差，因此，臨床亟需快速靈敏的實驗方法來檢測細菌耐藥性，指導臨床治療方案，控制耐藥細菌的傳播和擴散。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了克服傳統(tǒng)檢測方法的缺陷，提供ー種簡便、快捷、準確率高的檢測耐喹諾酮類抗生素的空腸彎曲桿菌的引物組合物及方法，所述方法具體涉及ー種整合菌種鑒定多重PCR技術(shù)和MAMA-PCR技術(shù)的分子生物學方法。
[0006]本發(fā)明提供的ー種用于輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的引物對，由如下I)和2)所述引物組成:
[0007]I)具有序列表中SEQ ID No:5所不的核昔酸序列；
[0008]2)具有序列表中SEQ ID Na:7所示的核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明提供的另ー種用于輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的引物組合物，由如下所述引物組成:具有序列表中SEQ ID N2:1、所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID Na:2所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID Na:3所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:4所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ IDNs:5所示核苷酸序列的引物和具有序列表中SEQ ID N2:7所示核苷酸序列的引物。
[0010]本發(fā)明提供的再一種用于輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的引物組合物，由檢測組引物組合物和質(zhì)控組引物組合物組成；
[0011]所述檢測組引物組合物由如下所述引物組成:具有序列表中SEQ ID N2:l、所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:2所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQID N2:3所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:4所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:5所示核苷酸序列的引物和具有序列表中SEQ ID N2:7所示核苷酸序列的引物；
[0012]所述質(zhì)控組引物組合物由如下引物組成:具有序列表中SEQ ID N2:1、所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:2所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ IDNs:3所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:4所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:5所示核苷酸序列的引物和具有序列表中SEQ ID N2:6所示核苷酸序列的引物。
[0013]本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的試劑盒，所述試劑盒包括上述任一所述的引物對或引物組合物。
[0014]本發(fā)明的還一個目的是提供一種用于輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的PCR試劑，包括檢測PCR試劑和質(zhì)控PCR試劑，其中檢測PCR試劑包括如下引物組合物:具有序列表中SEQ I D Na:1-5和SEQ ID Na:7所示核苷酸序列的引物組合物；質(zhì)控PCR試劑包括具有序列表中SEQ ID N2:1-6所示核苷酸序列的引物組合物。
[0015]所述檢測PCR試劑中，所述具有序列表中SEQ ID Na: 1-2,SEQ ID Ns:5和SEQ IDNa:7的引物與所述具有序列表中SEQ ID Na:3_4的引物的摩爾比為4:3 ;所述質(zhì)控PCR試劑中，所述具有序列表中SEQ ID Na:1-2, SEQ ID Na:5~6的引物與所述具有序列表中SEQID Na:3-4的引物的摩爾比為4:3。
[0016]本發(fā)明的還一個目的是提供上述任一所述引物對或引物組合物、所述試劑盒、或所述試劑在制備輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的產(chǎn)品中的應用。
[0017]本發(fā)明的還一個目的是提供上述任一所述引物對或引物組合物、所述試劑盒、或所述試劑在制備待測空腸彎曲桿菌是否發(fā)生突變的產(chǎn)品中的應用。
[0018]所述突變?yōu)榇郎y空腸彎曲桿菌基因組gyrA基因中第257位核苷酸(從起始密碼子的第一個堿基開始計算)由C突變?yōu)門。
[0019]本發(fā)明的再一個目的是提供一種輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的方法，包括如下步驟:以待測空腸彎曲桿的基因組DNA為模板，使用上述任一所述的引物對或引物組合物、上述任一所述的試劑盒或PCR試劑，進行PCR擴增。
[0020]所述方法中，所述PCR擴增條件為:94 V 3min, I循環(huán)；94 V 30s,56 V 30s、72°C 40s，共計30個循環(huán)。
[0021]所述方法中，所述PCR擴增結(jié)果通過凝膠電泳檢測；所述凝膠電泳檢測條件為IlOV電壓，電泳50min ;所述凝膠電泳采用體積百分比為2.5%濃度的瓊脂糖凝膠。[0022]所述耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌具體指空腸彎曲桿菌基因組gyrA基因中的第257位(從起始密碼子的第一個堿基開始計算)核苷酸由C突變?yōu)門。
[0023]所述方法還包括鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的判斷標準:當利用所述檢測組引物組合物可擴增出358bp、134bp和180bp大小的核酸片段；同時，利用所述質(zhì)控組引物組合物可擴增出358bp、134bp和237bp大小的核酸片段時，表明待測空腸彎曲桿菌為耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌。
[0024]本發(fā)明具有以下有益效果:它具有檢測快速準確，靈敏度好，能一歩到位確定待檢菌株是否為耐喹諾酮類抗生素的空腸彎曲桿菌。由于檢測技術(shù)很簡單，本方法十分適合基層ー線檢測，并用于指導用藥。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為整合錯配擴增突變分析PCR (MAMA-PCR)和菌種鑒定多重PCR技術(shù)快速檢測耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌的結(jié)果圖；其中，左右兩邊M泳道為DL2000DNAMarker ；I號、2號泳道為不加DNA模板的空白對照；3號、4號泳道為加入某耐喹諾酮類抗生素的沙門氏菌模板的結(jié)果；5號、6號泳道為加入沙門氏菌ATCC13311模板的結(jié)果；7號、8號泳道為加入某結(jié)腸彎曲菌模板的結(jié)果；9號、10號泳道為加入某耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌DH69模板的結(jié)果；11號、12號泳道為加入對喹諾酮類藥物敏感的空腸彎曲桿菌模式菌株NCTCl1168模板；13號、14號泳道為加入對喹諾酮類藥物敏感的空腸彎曲桿菌標準質(zhì)控菌株ATCC33560模板；此外，編號為奇數(shù)的泳道為檢測組，編號為偶數(shù)的泳道為質(zhì)控組。
[0026]圖2為整合錯配擴增突變分析PCR (MAMA-PCR)和菌種鑒定多重PCR技術(shù)快速檢測耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌驗證效果實施例結(jié)果圖，其中，I號、2號泳道為不加DNA模板的空白對照；3號、4號泳 道為加入ZPll的DNA模板的結(jié)果；5號、6號泳道為加入HT8的DNA模板的結(jié)果；7號、8號泳道為加入LYlO的DNA模板的結(jié)果；9號、10號泳道為加入LY17的DNA模板的結(jié)果；11號、12號泳道為加入SX4的DNA模板的結(jié)果；13號、14號泳道為加入PL66S的DNA模板的結(jié)果；15號、16號泳道為加入LY121的DNA模板的結(jié)果；17號、18號泳道為加入ZP74的DNA模板的結(jié)果；19號、20號泳道為加入不耐藥的空腸彎曲桿菌標準質(zhì)控菌株ATCC33560的DNA模板的結(jié)果；此外，編號為奇數(shù)的泳道為檢測組，編號為偶數(shù)的泳道為質(zhì)控組。
[0027]圖3為整合錯配擴增突變分析PCR (MAMA-PCR)和菌種鑒定多重PCR技術(shù)快速檢測耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌的結(jié)果圖，其中，A1-A3泳道使用的是引物I和2、引物3和4、以及引物5和6，作為質(zhì)控引物擴增結(jié)果，產(chǎn)物大小分別為134bp、237bp、358bp ；B1-B3泳道使用的是引物I和2、引物3和4、以及引物5和7，作為檢測組2的多重PCR擴增結(jié)果，產(chǎn)物大小分別為134bp、180bp、358bp。C1-C3泳道使用的是引物I和2、引物3和4、以及引物5和8，作為檢測組I的多重PCR擴增結(jié)果，產(chǎn)物大小分別為134bp、180bp、358bp ;此外泳道A1、B1、C1為不加DNA模板的空白對照；泳道A2、B2、C2為加入對喹諾酮類藥物敏感的空腸彎曲桿菌模式菌株NCTCl1168的DNA模板的結(jié)果；泳道A3、B3、C3為加入某耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌DH69模板的結(jié)果。
【具體實施方式】[0028]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0029]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030]實施例1、整合錯配擴增突變分析PCR (MAMA-PCR)和菌種鑒定多重PCR技術(shù)快速檢測耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌
[0031] 待測菌株:
[0032]耐喹諾酮類抗生素的沙門氏菌(編號為395，為本實驗室自己從中國采集的菌株，經(jīng)藥敏實驗確證其為耐喹諾酮類抗生素的沙門氏菌)、沙門氏菌ATCC13311 (購自美國標準生物品收藏中心)、結(jié)腸彎曲菌(編號為TA-60，為本實驗室自己從中國采集的菌株，經(jīng)藥敏實驗確證其為耐喹諾酮類抗生素的結(jié)腸彎曲菌)、耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌DH69、喹諾酮類藥物敏感的空腸彎曲桿菌模式菌株11168 (編號為NCTC11168)、喹諾酮類藥物敏感(不耐藥)的空腸彎曲桿菌標準質(zhì)控菌株33560 (編號為ATCC33560)。
[0033]耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌ZPl1、HT8、LY10、LY17、SX4、PL66S、LY121、ZP74 (參考文獻:Xia Chen, Gao-Wa Naren, Congming Wu, Yang Wang, LeiDai，Li—Ning Xiaj Peng-jie Luoj Qingjing Zhang, Jian-Zhong Shen.Prevalence andantimicrobial resistance of Campylobacter isolates in broilers from China.VetMicrobiol.2010.144:133-139 ;陳霞.山東省肉雞源耐藥彎曲菌流行病學調(diào)查及其對喹諾酮和氨基糖苷類耐藥機制研究.[博士學位論文].北京.中國農(nóng)業(yè)大學.2011。公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學獲得這些菌株)。
[0034](一) PCR反應模板的制備
[0035]使用TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒,按照試劑盒說明書的方法提取上述各待測菌株的基因組DNA。
[0036](二)PCR引物序列的設(shè)計與合成
[0037]分別以上述提取的各待測菌株的基因組DNA為模板，每個菌株設(shè)置陽性質(zhì)控組和檢測組兩個多重PCR反應，陽性質(zhì)控組和檢測組多重PCR反應所用引物如下所示:
[0038]1、人工合成下述陽性質(zhì)控組引物:
[0039]I)擴增彎曲桿菌屬特異性基因16s rRNA基因的引物對:
[0040]引物I (16s F):5，GGCATATACAATGAGACGCAATACC3，
[0041]引物2 (16s R):5，TCACCGTAGCATGGCTGATCTA3，
[0042]2)擴增空腸彎曲桿菌菌種特異性基因hipO基因的引物對:
[0043]引物3 (hip0-F):5，CAGATATGGATGCTTTGCCTTTGC3，
[0044]引物4 (hip0-R):5，CCACCTCTTCCAATAACTTCAATGC3’
[0045]3 )擴增含QRDR突變熱點的gyrA基因的引物對:
[0046]引物5 (gyrA-F):5，ATAGGTCGTGCTTTGCCTGAC3’
[0047]引物6 (gyrA-R):5，GTTGCCTTGTCCTGTAATACTTGG3，
[0048]上述引物1-引物6的核苷酸序列依次見序列表中SEQ ID Na:1-SEQ ID Na:6。
[0049]2、人工合成下述檢測組引物:
[0050]I)擴增彎曲桿菌屬特異性基因16s r RNA基因的引物對:
[0051]引物I (16s F):5，GGCATATACAATGAGACGCAATACC3，
[0052]引物2 (16s R):5，TCACCGTAGCATGGCTGATCTA3，[0053]2)擴增空腸彎曲桿菌菌種特異性基因hipO基因的引物對:
[0054]引物3 (hipO-F):5，CAGATATGGATGCTTTGCCTTTGC3，
[0055]引物4 (hipO-R):5，CCACCTCTTCCAATAACTTCAATGC3’
[0056]3 )用于檢測突變位點的MAMA-PCR引物:
[0057]引物5 (gyrA-F):5，ATAGGTCGTGCTTTGCCTGAC3’
[0058]引物8 (MAMA-2):5，CAAAGCATCATAAACTGCCA3，
[0059]上述引物8的核苷酸序列見序列表中SEQ ID Na:7。
[0060]上述引物I和2可擴增得到的16s rRNA基因片段的核苷酸序列見序列表中SEQID No:8所示，共134bp ;引物3和4可擴增得到的hipO基因片段的核苷酸序列見序列表中SEQ ID Na:9所示，共358bp ;引物5和6可擴增得到的gyrA基因片段的核苷酸序列見序列表中SEQ ID Na:10所示，共237bp ;用于檢測突變位點的MAMA-PCR引物對5和8，可擴增得到的gyrA基因片段的核苷酸序列見序列表中SEQ ID Na:11所示，共180bp。
[0061 ](三)PCR反應體系和反應條件
[0062]多重PCR反應體系采用TIANGEN公司的2XTaq PCR MasterMix試劑，該反應體系中引物的加入量關(guān)系為:陽性質(zhì)控組和檢測組中引物1-2和引物5、6、8的用量與引物3-4加入量的摩爾比為4:3。
[0063]質(zhì)控組、檢測組的多重PCR反應體系均為25ul反應體系，具體如下:
[0064]質(zhì)控組:
[0065]
【權(quán)利要求】
1.ー種用于輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的引物對，由如下I)和2)所述引物組成: 1)具有序列表中SEQID No:5所示的核苷酸序列； 2)具有序列表中SEQID No:7所示的核苷酸序列。
2.ー種用于輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的引物組合物，由如下所述引物組成:具有序列表中SEQ ID No:1、所核昔酸序列的引物、具有序列表中SEQ IDN2:2所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:3所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID No:4所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID Na:5所示核苷酸序列的引物和具有序列表中SEQ ID N2:7所示核苷酸序列的引物。
3.ー種用于輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的引物組合物，由檢測組引物組合物和質(zhì)控組引物組合物組成； 所述檢測組引物組合物由如下所述引物組成:具有序列表中SEQ ID N2:1、所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:2所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ IDNs:3所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:4所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:5所示核苷酸序列的引物和具有序列表中SEQ ID N2:7所示核苷酸序列的引物； 所述質(zhì)控組引物組合物由如下引物組成:具有序列表中SEQ ID N2:1、所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:2所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID No:3所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:4所示核苷酸序列的引物、具有序列表中SEQ ID N2:5所示核苷酸序列的引物和具有序列表中SEQ ID N2:6所示核苷酸序列的引物。
4.ー種用于輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的試劑盒，包括權(quán)利要求1-3任一所述的引物對或引物組合物。
5.ー種用于輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的PCR試劑，包括檢測PCR試劑和質(zhì)控PCR試劑，其中檢測PCR試劑包括如下引物組合物:具有序列表中SEQ IDNa:1-5和SEQ ID Na:7所示核苷酸序列的引物組合物；質(zhì)控PCR試劑包括具有序列表中SEQ ID N2:1-6所示核苷酸序列的引物組合物。
6.權(quán)利要求1-3任一所述的引物對或引物組合物、權(quán)利要求4所述試劑盒、或權(quán)利要求5所述試劑在制備輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的產(chǎn)品中的應用。
7.權(quán)利要求1-3任一所述的引物對或引物組合物、權(quán)利要求4所述試劑盒、或權(quán)利要求5所述試劑在制備待測空腸彎曲桿菌是否發(fā)生突變的產(chǎn)品中的應用； 所述突變?yōu)榇郎y空腸彎曲桿菌基因組gyrA基因中的第257位核苷酸由C突變?yōu)門。
8.一種輔助鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的方法，包括如下步驟:以待測空腸彎曲桿菌的基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求1-3任一所述的引物對或引物組合物、權(quán)利要求5-7任一所述的試劑盒或權(quán)利要求8所述的PCR試劑，進行PCR擴增。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述方法還包括鑒別待測空腸彎曲桿菌是否耐喹諾酮類抗生素的判斷標準:當利用所述檢測組引物組合物可擴增出358bp、134bp和ISObp大小的核酸片段；同時，利用所述質(zhì)控組引物組合物可擴增出358bp、134bp和237bp大小的核酸片段時，表明待測空腸彎曲桿菌為耐喹諾酮類抗生素空腸彎曲桿菌。
【文檔編號】C12Q1/04GK103525930SQ201310481416
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】汪洋, 吳聰明, 吳辰斌, 沈建忠 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學