一種鑒別空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌雙重pcr引物及其鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種雙重PCR引物及其鑒別方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)和結(jié)腸彎曲桿菌(Campylobactercoli)屬 于彎曲桿菌屬，是人畜共同感染的細(xì)菌性腸道病原菌，可以引起人和動(dòng)物發(fā)生多種疾病。彎 曲桿菌對(duì)動(dòng)物和人類表現(xiàn)出不同程度的危害，禽類感染該菌一般會(huì)導(dǎo)致下痢、肝臟變性出 血及產(chǎn)蛋下降為等癥狀，火雞則會(huì)引發(fā)肝炎和藍(lán)冠病;空腸彎曲桿菌還可引起羊流產(chǎn)，對(duì)養(yǎng) 殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)人類致病主要表現(xiàn)為急性腸炎，免疫力低下者還會(huì)繼發(fā)格林-巴利綜合征(Guillain-Barrisyndrome，GBS)。彎曲桿菌主要通過飲水，食物等方式傳染給 動(dòng)物和人類，其感染的病例數(shù)已經(jīng)超過李斯特菌病，沙門菌病和志賀菌病，在引起的感染中 超過80 %是由空腸彎曲桿菌引起，約10 %是由結(jié)腸彎曲桿菌引起，其他彎曲桿菌也偶爾致 病。
[0003] 近年來，我國雞群大規(guī)模爆發(fā)彎曲桿菌病的報(bào)道也越來越多，雖然發(fā)病率高、死亡 率低、多呈慢性經(jīng)過，但其對(duì)雞群潛在的影響卻不容忽視，空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌感 染的臨床癥狀不明顯且不易區(qū)分，因此很難通過臨床癥狀判斷感染情況。建立快速而特異 的檢測(cè)方法是有效診斷空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌感染的關(guān)鍵所在。目前對(duì)彎曲桿菌的 常規(guī)檢測(cè)鑒定主要是增菌培養(yǎng)生化鑒定，但是由于空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌在食品樣 品中的含量很低，生長條件比較苛刻，常規(guī)檢測(cè)及鑒定方法繁瑣耗時(shí)，伴隨著假陽性和假陰 性菌株的不斷發(fā)現(xiàn)，一些初步的生化試驗(yàn)項(xiàng)目已經(jīng)不能有效鑒別出空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎 曲桿菌，傳統(tǒng)的鑒別方法面臨著巨大的挑戰(zhàn)，因此有必要尋找更加有效地鑒別空腸彎曲菌 的檢測(cè)方法。近年來隨著分子生物學(xué)，特別是PCR方法快速發(fā)展，已成為快速，可靠和靈敏檢 測(cè)病原體感染的工具。PCR檢測(cè)方法目前已經(jīng)廣泛運(yùn)用到細(xì)菌的分離鑒定之中，它具有快速 簡單、特異性強(qiáng)和敏感性高等特點(diǎn)。已報(bào)道的PCR方法常用的靶基因有16SrRNA、23SrRNA、 flaA或f]^、〇6此、〇3(^、11丨口0、〇(^六13(^15^等，其中11丨口0是空腸彎曲桿菌所特有的，它可以 有效鑒別空腸彎曲桿菌。細(xì)胞致死性膨脹毒素cdtC，是結(jié)腸彎曲桿菌重要的毒力因子之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種鑒別空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌雙重PCR引物及其鑒別方 法。
[0005] 本發(fā)明選擇hipO，cdtC為靶序列，設(shè)計(jì)特異性引物，建立雙重PCR方法用于空腸彎 曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌的鑒別。
[0006] 本發(fā)明的一種鑒別空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌雙重PCR引物，是根據(jù)GenBank中 發(fā)表的空腸彎曲桿菌hipO基因序列和結(jié)腸彎曲桿菌cdtC基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，具 體如下：
[0007] hipOFATCAACATTGCGAGATAC；
[0008] hipORTAGACTTACAAGGCGAAT；
[0009] cdtCFGGATATGCACTCTCAAGATTTG；
[0010] cdtCRCTTGCTTAGTTCGGTTACAATAG。
[0011] 本發(fā)明的一種鑒別空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌的雙重PCR方法，它是按照以下 步驟進(jìn)行的：
[0012] -、提取待檢測(cè)樣本的基因組DNA;
[0013] 二、以步驟一的基因組DNA為模板，將上述的引物對(duì)放入同一PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；
[0014]三、PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；
[0015]四、對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行分析：在653bp和313bp位置有兩條擴(kuò)增條帶，表示樣品為陽 性，待檢測(cè)樣品中同時(shí)含有空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌。
[0016] 本發(fā)明包含以下有益效果：
[0017] 本發(fā)明通過對(duì)空腸彎曲桿菌(包括空腸亞種和德萊亞種)所特有的馬尿酸酶基因 (hipO)和結(jié)腸彎曲桿菌cdtc基因進(jìn)行擴(kuò)增，建立雙重PCR方法，對(duì)hip0，cdtc基因的擴(kuò)增產(chǎn) 物分別為653bp和313bp，基因片段大小的差異就可以在瓊脂糖凝膠電泳上區(qū)分兩條片段， 能夠在一次PCR中檢測(cè)出兩種彎曲桿菌。通過序列同源性分析，本發(fā)明所選擇的菌株hipO， cdtC基因序列與空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌其他菌株同源性較高，因此此方法的建立不 僅用于空腸彎曲桿菌RM1221菌株與結(jié)腸彎曲桿菌RM5611菌株的鑒別，也適用于其他菌株的 空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌鑒別。雙重PCR方法的敏感性達(dá)到了6.68Xl(T2μg/ml;特異性 試驗(yàn)中空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌有特異性條帶，其他細(xì)菌沒有擴(kuò)增出特異性條帶，說 明該方法對(duì)空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌具有良好特異性，并且符合試驗(yàn)中該方法與單 PCR方法的結(jié)果一致。這種方法的建立不僅可以準(zhǔn)確檢測(cè)和鑒定空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲 桿菌，大大節(jié)省了生化試驗(yàn)所消耗的成本和時(shí)間，而且特異性、敏感性高，更加適用于臨床 樣品分離鑒定和流行病學(xué)調(diào)查。本發(fā)明不僅可以對(duì)分離出的可疑菌落進(jìn)行快速鑒定，而且 還可以對(duì)檢測(cè)樣品的增菌液直接進(jìn)行篩選檢測(cè)，使可疑菌株的分離更具有針對(duì)性，從而提 高了檢出率。實(shí)現(xiàn)對(duì)空腸彎曲桿菌，結(jié)腸彎曲桿菌簡便、快速的鑒定，可應(yīng)用于臨床診斷、食 品衛(wèi)生監(jiān)控及進(jìn)出口食品病原微生物檢測(cè)等各個(gè)方面，也為公共衛(wèi)生的預(yù)警提供支持。
【附圖說明】
[0018]圖1為確定的雙重PCR退火溫度的電泳圖；其中，M:DL2000 DNA Marker; 1:50°C;2: 51°C；3：52〇C；4：53〇C；5：54〇C；6：Negative control；
[0019]圖2為PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果電泳圖；其中，M:DL2000DNAMarker;l:66.8yg/ml;2: 6 · 68yg/ml; 3:6 · 68X10-Vg/ml; 4:6 · 68X10-2yg/ml; 5:6 · 68X10-3yg/ml; 6:6 · 68X10-Vg/ ml；7：Negativecontrol；
[0020] 圖3為雙重PCR特異性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)電泳圖；其中，M:DL2000DNAMarker1 :CampylobacterjejuniCampylobactercoli;2:多殺性巴氏桿菌3:單核細(xì)胞李斯特桿菌； 4:產(chǎn)氣莢膜梭菌;5:傷寒沙門氏菌;6:金黃色葡萄球菌7:Negativecontrol;
[0021] 圖4為臨床樣品檢測(cè)電泳圖；其中，M:DL2000DNAMarker;l:樣品1;樣品2:樣品 2;3:樣品3;4:樣品4;5:樣品5;6:樣品6;7 :樣品7 ;8:樣品8;9:樣品9; 10:樣品10; 11:樣品 樣品 12;13:樣品 13;14:樣品 14;15:樣品 15;16:樣品 16;17:樣品 17;18:樣品 18;19: 樣品19; 20:樣品20。
【具體實(shí)施方式】
[0022]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式的一種鑒別空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌雙重PCR 引物，是根據(jù)GenBank中發(fā)表的空腸彎曲桿菌hipO基因序列和結(jié)腸彎曲桿菌cdtC基因序列， 設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，具體如下：
[0023] hipOFATCAACATTGCGAGATAC；
[0024] hipORTAGACTTACAAGGCGAAT；
[0025] cdtCFGGATATGCACTCTCAAGATTTG；
[0026] cdtCRCTTGCTTAGTTCGGTTACAATAG。
[0027]【具體實(shí)施方式】二：本實(shí)施方式的一種鑒別空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌的雙重 PCR方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的：
[0028]一、提取待檢測(cè)樣本的基因組DNA;
[0029]二、以步驟一的基因組DNA為模板，將上述的引物對(duì)放入同一PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0030]三、PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；
[0031]四、對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行分析：在653bp和313bp位置有兩條擴(kuò)增條帶，表示樣品為陽 性，待檢測(cè)樣品中同時(shí)含有空腸彎曲桿菌和結(jié)腸彎曲桿菌。
[0032]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】二不同的是:PCR擴(kuò)增的PCR體系如 下：
[0034] PCR擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性5min; 95°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循 環(huán)，最后72°C延伸5min。
[0035] 其它與【具體實(shí)施方式】二相同。
[0036]本
【發(fā)明內(nèi)容】
不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)【具體實(shí)施方式】的組 合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。
[0037] 通過以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 1材料和方法 [0