用于空腸彎曲菌pcr-elisa檢測的引物組、探針和試劑盒及試劑盒的使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測的引物組、探針和試劑盒及試劑盒的使用方法。本發(fā)明建立了空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒，本試劑盒根據(jù)空腸彎曲桿菌hipO基因保守區(qū)域設(shè)計了引物和探針。對比單純的PCR檢測，PCR-ELISA加入了雜交探針，使得此方法能夠準確檢測到樣品中目的基因片段，而不是單純檢測擴增產(chǎn)物分子量的大小，從而增加了檢測的特異性，使得此方法能夠準確鑒定樣品。本方法采用了鏈霉素-親和素-地高辛-抗地高辛抗體系統(tǒng)，對比單純的PCR和ELISA檢測，由于雙標記物的存在此檢測法在敏感性上有了提高；在結(jié)果的判定上，此法采用ELISA的顯色反應(yīng)，使結(jié)果的判定更加直接。
【專利說明】用于空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測的弓|物組、探針和試劑盒及試劑盒的使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]空腸彎曲桿菌(campylobacter jejuni)是近年來國內(nèi)外廣泛重視的人畜共患病原菌，主要引起人類發(fā)熱、急性腸炎、急性感染性多發(fā)性神經(jīng)病，即格林巴利綜合征。該菌分布廣泛，多種動物上都分離到該菌，尤其是廣泛存在于家禽類動物的腸道中，雞的帶菌率占首位，次為豬。人類感染主要是由于空腸彎曲菌污染的食品、飲用水以及環(huán)境引起，根據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心公布的美國食源性病原微生物導(dǎo)致疾病人數(shù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)，空腸彎曲菌所導(dǎo)致的發(fā)病人數(shù)居第2位。因此國內(nèi)外對空腸彎曲桿菌的監(jiān)測都非常重視。
[0002]由于空腸彎曲桿菌培養(yǎng)條件苛刻，在25°C不生長，42°C生長良好，但容易進入VBNC狀態(tài)，使得常規(guī)的分離培養(yǎng)和生化鑒定耗時費力、靈敏度不高，所需時間長，而不利于爆發(fā)疫情時的快速診斷，也不符合臨床病原菌檢測所要求的快速、準確的原則。此外，在經(jīng)典的空腸彎曲桿菌鑒定中，馬尿酸鹽水解實驗是區(qū)分空腸彎曲菌與其它彎曲菌的重要指標，但是這種表型鑒定準確性并不穩(wěn)定。此項區(qū)分菌株的生化鑒定的主要缺點在于有時結(jié)果的一致性不好或存在個別的非典型菌株，可能會造成分離菌株的假陰性。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外已經(jīng)先后開展了一些針對空腸彎曲菌的基因檢測研究，針對的靶基因主要包括16SrDNA、23SrDNA、鞭毛蛋白基因(flaA或flaB)等。馬尿酸水解酶基因為空腸彎曲菌獨有的基因，因此可用于空腸彎曲桿菌的定性檢測。
[0003]目前，空腸彎曲桿菌的分子生物學(xué)方法以普通PCR和熒光定量PCR方法為主。普通PCR方法因其簡便快速，被廣泛應(yīng)用于各病原體的檢測。但該方法電泳上樣個數(shù)受凝膠大小限制，不適于大量樣品的診斷，結(jié)果以對條帶的直觀觀察為準，影響敏感度。熒光定量PCR需要昂貴的儀器設(shè)備，而且檢測樣品費用能夠高，不能滿足大規(guī)模樣品檢測的要求。隨著人們對食品安全的高度重視，建立一種快速、準確、特異、靈敏的空腸彎曲菌檢測方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對上述缺陷，目的在于提供一種具有靈敏度、特異性強、方便快捷的用于空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測的引物組、探針和試劑盒及試劑盒的使用方法。
[0005]為此本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:所述上游引物和下游引物以及探針的核苷酸序列如下:
上游引物:hip0 F: 5’ -GGGTTTGGGTGGTGCTAAG-3’；
下游引物:hip0 R: 5’ -Biotin-CCACAACAAGCAAAGAAGCAG-3’ ；
探針:5’ -GATGATGGCTTCTTCGGATAG-Dig-3’；
所述的下游引物5’端為生物素標記，探針的3’端為地高辛標記 。
[0006]本發(fā)明還包括有:PCR(DNA)模板、PCR反應(yīng)液和ELISA反應(yīng)液。
[0007]所述PCR (DNA)模板由增菌培養(yǎng)液培養(yǎng)而成。
[0008]所述PCR反應(yīng)液包括PCR buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶和超純水。[0009]一種空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒的使用方法，按照以下步驟進行:
1)以包被緩沖液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.5)稀釋鏈霉親和素，包被酶標板，100 μ L/孔，終濃度為20 μ g/L, 37°C過夜，甩干后以含0.5mL/L吐溫20的PBST洗板3次，200 μ L/孔,每次靜置5min,思干；
2)以含40mg/L脫脂乳的PBS稀釋魚精DNA，封閉酶標板，200μ L/孔，37°C lh,同上法洗板3次，
3)以PBS將PCR產(chǎn)物做1:50稀釋，取100 μ L加入孔中，37°C固定lh，洗板4次；
4)以1/6體積SSC和0.1%濃度SDS溶液稀釋探針(濃度為50pmol/mL)，在96孔板中加入100 μ L含雜交探針的雜交液，55-60°C反應(yīng)lh，洗板5次；
5)加入100μ L以PBS稀釋的ΑΚΡ標記的抗地高辛抗體，37°C lh,洗板5次；
6)加入100μ L臨時配制的ρΝΡΡ顯色液，置37°C避光顯色，最后加入50 μ L 2mol/LNaOH終止液； 7)可用肉眼觀察，與陰性對照孔進行比較，hipO基因陽性的孔中顯黃色，而陰性應(yīng)與陰性對照一致；或用酶標儀檢測，用顯色底物溶液調(diào)零，在405nm處測定各孔的吸光值，ODi05rm大于0.17為陽性，小于0.17為陰性；
生成PCR產(chǎn)物的反應(yīng)步驟如下:
PCR 擴增反應(yīng)體系:10 倍 PCR buffer 2.5 μ L、MgCl2 (25mmol/L)2 μ L、dNTP (2.5mmol/L)2yL、酶0.25 μ L、上游引物和下游引物各1 μ L、模板2 μ L，超純水14.25 μ L，反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸30s，30個循環(huán)；72°C延伸5min。
[0010]所述模板的制備步驟如下:取0.5 mL增菌培養(yǎng)液于1.5mL EP管中，10000 r/min離心5min,棄上清，加入100 μ L超純水，鏇潤混勻，100°C水浴20min,立即冰浴lOmin,12000r/min 離心 5min,取上清。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點是:本發(fā)明建立了空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒，本試劑盒根據(jù)空腸彎曲桿菌hipO基因保守區(qū)域設(shè)計了引物和探針。對比單純的PCR檢測，PCR-ELISA加入了雜交探針，使得此方法能夠準確檢測到樣品中目的基因片段，而不是單純檢測擴增產(chǎn)物分子量的大小，從而增加了檢測的特異性，使得此方法能夠準確鑒定樣品。本方法采用了鏈霉素-親和素-地高辛-抗地高辛抗體系統(tǒng)，對比單純的PCR和ELISA檢測，由于雙標記物的存在此檢測法在敏感性上有了提高；在結(jié)果的判定上，此法采用ELISA的顯色反應(yīng)，使結(jié)果的判定更加直接。
[0012]本發(fā)明所建立的檢測方法具有靈敏度、特異性強、方便快捷、使用范圍廣的優(yōu)點。所需要的儀器為PCR儀和酶標儀，普通實驗室就有配置，試劑和耗材已有商品化的成品，容易購買，利于推廣。本發(fā)明在96孔酶標板中進行，成本低廉，適用于對空腸彎曲菌進行大規(guī)模、高通量的檢測。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合實例進一步闡述本發(fā)明
如利用本發(fā)明空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測技術(shù)檢測20份家禽泄殖腔棉拭子。
[0014][1] PCR模板的制備將棉拭子置于含500ul滅菌PBS中，充分浸透20min，將浸液加至含9.5ml布氏肉湯的試管中，在微需氧條件下120rpm 42°C培養(yǎng)24h。取0.5 mL增菌培養(yǎng)液于1.5mL EP管中，10000 r/min離心5min，棄上清，加入100 μ L超純水，漩渦混勻，100°C水浴20min，立即冰浴 lOmin, 12000r/min 離心 5min,取上清。
[0015][2] PCR 反應(yīng)
PCR 擴增反應(yīng)體系:10 倍 PCR buffer 2.5 μ L、MgC12 (25mmol/L)2 μ L、dNTP (2.5mmol/L)2yL、Taq酶0.25 μ L、上游引物和下游引物各1 μ L、模板2 μ L，超純水14.25 μ L。反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸30s，30個循環(huán)；72°C延伸5min。
[0016] [3] ELISA 反應(yīng)
a以包被緩沖液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.5)稀釋鏈霉親和素，包被酶標板，100 μ L/孔，終濃度為20 μ g/L, 37°C過夜。甩干后以含0.5mL/L吐溫20的PBST洗板3次，200 μ L/孔,每次靜置5min,思干。
[0017]b以含40mg/L脫脂乳的PBS稀釋魚精DNA，封閉酶標板，200yL/孔，37°C lh，同上法洗板3次。
[0018]c以PBS將PCR產(chǎn)物做1:50稀釋，取100 μ L加入孔中，37°C固定lh，洗板4次。
[0019]d以1/6體積SSC和0.1%濃度SDS溶液稀釋探針(濃度為50pmol/mL)，在96孔板中加入100 μ L含雜交探針的雜交液，55-60°C反應(yīng)lh，洗板5次。
[0020]e加入100 μ L以PBS稀釋的ΑΚΡ標記的抗地高辛抗體，37°C lh,洗板5次。
[0021]f加入lOOyL臨時配制的ρΝΡΡ顯色液，置37°C避光顯色，最后加入50yL 2mol/L NaOH終止液。
[0022][4]結(jié)果檢測
可用肉眼觀察，與陰性對照孔進行比較，hipO基因陽性的孔中顯黃色，而陰性應(yīng)與陰性對照一致；或用酶標儀檢測，用顯色底物溶液調(diào)零，在405nm處測定各孔的吸光值，0D405nm大于0.17為陽性，小于0.17為陰性。
【權(quán)利要求】
1.用于空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測的引物組和探針，其特征在于，所述上游引物和下游引物以及探針的核苷酸序列如下:上游引物:hipOF: 5’-GGGTTTGGGTGGTGCTAAG-3’；下游引物:hipOR: 5’-Biotin-CCACAACAAGCAAAGAAGCAG-3’ ；探針:5’ -GATGATGGCTTCTTCGGATAG-Dig-3’；所述的下游引物5’端為生物素標記，探針的3’端為地高辛標記 。
2.一種含有權(quán)利要求1引物組和探針的檢測試劑盒，其特征在于，還包括有:PCR(DNA)模板、PCR反應(yīng)液和ELISA反應(yīng)液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR(DNA)模板由增菌培養(yǎng)液培養(yǎng)而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液包括PCRbuffer、MgCl2、dNTP、Taq酶和超純水。
5.一種空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，按照以下步驟進行:1)以包被緩沖液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.5)稀釋鏈霉親和素，包被酶標板，100 μ L/孔，終濃度為20 μ g/L，37°C過夜，甩干后以含0.5mL/L吐溫20的PBST洗板3次，200 μ L/孔,每次靜置5min,思干；2)以含40mg/L脫脂乳的PBS稀釋魚精DNA，封閉酶標板，200yL/孔，37°Clh，同上法洗板3次；3)以PBS將PCR產(chǎn)物做1:50稀釋，取100 μ L加入孔中，37°C固定lh，洗板4次；4)以1/6體積SSC和0.1%濃度SDS溶液稀釋探針(濃度為50pmol/mL)，在96孔板中加入100 μ L含雜交探針的雜交液，55-60°C反應(yīng)lh，洗板5次；5)加入100μ L以PBS稀釋的ΑΚΡ標記的抗地高辛抗體，37°C lh,洗板5次；6)加入100μ L臨時配制的ρΝΡΡ顯色液，置37°C避光顯色，最后加入50 μ L 2mol/LNaOH終止液；7)可用肉眼觀察，與陰性對照孔進行比較，hipO基因陽性的孔中顯黃色，而陰性應(yīng)與陰性對照一致；或用酶標儀檢測，用顯色底物溶液調(diào)零，在405nm處測定各孔的吸光值，ODi05rm大于0.17為陽性，小于0.17為陰性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，生成PCR產(chǎn)物的反應(yīng)步驟如下:PCR 擴增反應(yīng)體系:10 倍 PCR buffer 2.5 μ L、MgCl2 (25mmol/L)2 μ L、dNTP (2.5mmol/L)2yL、酶0.25 μ L、上游引物和下游引物各1 μ L、模板2 μ L，超純水14.25 μ L，反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸30s，30個循環(huán)；72°C延伸5min,各物料的用量可同比例放大或縮小。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述模板的制備步驟如下:取0.5 mL增菌培養(yǎng)液于1.5mL EP管中，10000 r/min離心5min，棄上清，加入100 μ L超純水，漩渦混勻，100°C水浴20min，立即冰浴lOmin，12000r/min離心5min,取上清，各物料的用量可同比例放大或縮小。
【文檔編號】C12N15/11GK103667454SQ201310585012
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】唐夢君, 高玉時, 陳大偉, 蒲俊華, 張小燕, 唐修君, 陸俊賢, 施祖灝, 葛慶聯(lián), 顧榮 申請人:江蘇省家禽科學(xué)研究所, 唐夢君, 高玉時