一種星柳珊瑚甾體皂苷的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種星柳珊瑚甾體皂苷的制備方法，包括：星柳珊瑚總提取物經(jīng)萃取、MCI柱層析分離獲得星柳珊瑚總皂苷；再經(jīng)硅膠、凝膠Sephadex?LH-20柱層析得到甾體皂苷dimorphoside?A。本發(fā)明的純化工藝簡(jiǎn)單，成本低，可有效制備在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在用途的純化合物dimorphoside?A。
【專利說(shuō)明】一種星柳珊瑚留體皂苷的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于留體皂苷領(lǐng)域，特別涉及一種星柳珊瑚留體皂苷的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]柳珊瑚，屬于腔腸動(dòng)物門珊瑚綱八放珊瑚亞綱動(dòng)物，在《本草綱目》中有詳細(xì)記載，是中藥寶庫(kù)的重要組成部分。為了尋找有重要生物活性和藥用前景的海洋天然產(chǎn)物，20世紀(jì)60年代，美國(guó)Weinheimer等從柳珊瑚中發(fā)現(xiàn)了具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和強(qiáng)烈生理活性的前列腺素前體，世界各國(guó)的科學(xué)工作者先后從不同海域的珊瑚中已先后提取分離了脂類、留體、生物堿以及多種骨架類型的萜類等成分，多數(shù)化合物的結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特，有較強(qiáng)的抗腫瘤、抗結(jié)核、抗炎等生物活性。其中，留體皂苷是一大類具有特殊生物活性的重要海洋天然產(chǎn)物。
[0003]海洋留體皂苷類成分的常規(guī)提取、制備方法一般包括以下過(guò)程:(1)海洋生物切片粉碎，或凍干個(gè)體粉碎，然后用有機(jī)溶劑或/和水提取制備得到總提取物，所用的有機(jī)溶劑可采用醇類，如乙醇，甲醇；將總提取物溶于水或甲醇水溶液后，以較高沸點(diǎn)烷烴(石油醚、正己烷、環(huán)己烷)，或乙酸乙酯等酯類、氯仿或二氯甲烷等鹵代烴類溶劑萃取脫除脂溶性的中、低極性成分。(2)水相用不和水混溶的高極性溶劑萃取，回收溶劑后干燥即得到總皂苷，其中所用的高極性溶劑優(yōu)選采用正丁醇或者不同比例的氯仿-甲醇混合溶液；萃取得到的總皂苷可以通過(guò)大孔樹脂吸附、甲醇或者乙醇水溶液梯度洗脫，獲得較為精制的皂苷混合物。水相也可以直接通過(guò)大孔樹脂吸附、甲醇或者乙醇水溶液梯度洗脫獲得較為精制的皂苷混合物。(3)皂 苷混合物通過(guò)正相、反相硅膠柱色譜等進(jìn)行純化獲得純留體皂苷化合物。
[0004]不同結(jié)構(gòu)的海洋留體皂苷具體提取、制備方法具有特殊性。利用星柳珊瑚(Astrogorgia dumbea)提取、制備留體阜苷 dimorphoside A,以及 dimorphoside A 的體外抗腫瘤活性目前尚無(wú)文獻(xiàn)公開報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種星柳珊瑚留體皂苷的制備方法，該方法純化工藝簡(jiǎn)單，成本低，可有效制備在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在用途的純化合物dimorphosideA0
[0006]本發(fā)明的一種星柳珊瑚留體皂苷的制備方法，包括:
[0007]( I)采用甲醇提取星柳珊瑚，總提取物加水成混懸液，依次加石油醚、氯仿萃取，然后將水相濃縮，通過(guò)MCI柱層析分離，依次以60%、100%甲醇水溶液洗脫，取甲醇洗脫部分減壓濃縮回收溶劑后干燥，得到星柳珊瑚總皂苷；
[0008](2)星柳珊瑚總皂苷用100~200目硅膠拌勻，經(jīng)200~300目硅膠柱色譜分離，依次以體積比為12:1、8:1、6:1的氯仿-甲醇、體積比為50:10:1、40:10:1、30:10:1、14:6:1的氯仿-甲醇-水梯度洗脫，薄層色譜(TLC)檢測(cè)各餾分，相同組分合并濃縮，得到7個(gè)粗皂苷混合物；[0009](3)取硅膠柱色譜分離得到的第6個(gè)粗皂苷混合物溶解于無(wú)水乙醇中形成300-500mg/mL溶液,進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠柱分離，收集主要成分合并濃縮得到留體阜苷。
[0010]所述步驟(1)中的星柳珊瑚原料與水的質(zhì)量體積比為Ikg: lL-5kg: 1L,優(yōu)選3kg:1L0
[0011]所述步驟(1)中的星柳珊瑚原料與石油醚以及氯仿的質(zhì)量體積比為8kg:1L-12kg: 1L，優(yōu)選9kg: 1L，萃取次數(shù)為3-5次，優(yōu)選4次。
[0012]所述步驟(1)中的MCI柱層析分離的上樣水溶液的體積為每公斤星柳珊瑚原料60mL-100mL, MCI柱床體積為每公斤星柳珊瑚原料80mL_100mL，60%、100%甲醇水溶液的用量為每公斤星柳珊瑚原料300mL-500mL。
[0013]所述步驟(2)中的100~200目硅膠用量為星柳珊瑚總皂苷質(zhì)量的1_1.5倍；200~300目硅膠的用量為星柳珊瑚總皂苷質(zhì)量的10-15倍；每份氯仿-甲醇用量為星柳珊瑚總皂苷質(zhì)量的40-60倍；每份氯仿-甲醇-水用量為星柳珊瑚總皂苷質(zhì)量的25-40倍。
[0014]所述步驟(3)中的Sephadex LH-20凝膠柱分離具體為:按照每50_80mL柱床體積ImL樣品溶液的比例上樣，經(jīng)無(wú)水乙醇洗脫，TLC檢測(cè)各餾分，收集在體積比為40:10:1的氯仿-甲醇-水體系中Rf值為0.3的成分合并，減壓濃縮回收無(wú)水乙醇，即可。
[0015]所述步驟(3)中得 到的甾體皂苷用于抗腫瘤藥物的制備。
[0016]所述留體皂苷用于肝癌和早幼粒細(xì)胞白血病抗腫瘤藥物的制備。
[0017]本發(fā)明中制備柳珊瑚留體阜苷dimorphoside A結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁、質(zhì)譜等波譜學(xué)方法以及與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照鑒定，產(chǎn)率大于等于0.03%。
[0018]本發(fā)明中留體阜苷dimorphoside A對(duì)腫瘤細(xì)胞株肝癌Bel-7402和早幼粒細(xì)胞白血病HL-60的半數(shù)抑制濃度IC5tl分別為31.6、31.6 μ M，顯示一定的體外抗腫瘤活性。
_9] 有益.效果
[0020]文獻(xiàn)表明該化合物本來(lái)是另一種柳珊瑚Anthoplexaura dimorpha的成分,具有良好的細(xì)胞分裂抑制作用；本發(fā)明純化工藝簡(jiǎn)單，成本低；提供了 dimorphoside A新的制備方法，尤其是作為星柳珊瑚最主要成分并顯示較好的體外抗腫瘤活性，表現(xiàn)出在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的潛在用途。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0022]實(shí)施例1
[0023]星柳珊瑚(新鮮樣品濕重2.25kg)剪碎，用甲醇1.0L滲漉提取4次，提取液經(jīng)減壓回收溶劑后加水至700mL混懸,依次加石油醚250ml萃取4次、氯仿250ml萃取4次,然后將水相濃縮至200mL，通過(guò)200mL柱體積的MCI (購(gòu)自日本三菱化學(xué)公司)層析柱分離，依次以60%、100%甲醇水溶液800mL、1000mL洗脫，取甲醇洗脫部分，水浴(≤40°C)減壓濃縮回收溶劑后干燥，得到褐色粉末10.Sg,即星柳珊瑚總皂苷；其提取率為0.48%。[0024]實(shí)施例2
[0025]星柳珊瑚總皂苷10.8g按1:1比例用硅膠(100~200目)拌勻，經(jīng)樣品與硅膠(200~300目，120g)的硅膠柱色譜分離，依次以氯仿-甲醇(12:1、8:1、6:1，每洗脫液500mL)、氯仿-甲醇-水(50:10:1、40:10:1、30:10:1、14:6:1，每洗脫液 300mL)梯度洗脫，薄層色譜(TLC)檢測(cè)各餾分，相同組分合并濃縮，得到7個(gè)粗皂苷混合物。硅膠柱色譜分離得到的第6個(gè)粗皂苷混合物1.12g，溶解于3mL無(wú)水乙醇中形成濃溶液，進(jìn)行凝膠柱Sephadex LH-20分離(柱體積200mL)，用無(wú)水乙醇溶液洗脫，TLC檢測(cè)各餾分，收集主要成分合并濃縮得到化合物L(fēng)AD-01 (810mg)，產(chǎn)率為0.036%。
[0026]實(shí)施例3
[0027]LAD-Ol為無(wú)色粉末，溶于甲醇；TLC檢測(cè)在氯仿-甲醇-水(40:10:1)體系中Rf值0.3，紫外(254nm)下有弱吸收，用7%硫酸-乙醇浸潤(rùn)，加熱顯紫紅色；ES 1-MS m/z:749.2[M+Na]+,725.4[M-H]- ; 1H-?3C-匪R 數(shù)據(jù)見表 I ;以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Nobuhiro F，KenjiY，Shigeki M，et al.Dimorphosides A and B,novel steroid glycosides from thegorgonian Anthoplexaura dimorpha[J].Tetrahedron Lett.，1987，28 (11):1187-1190.)對(duì)照，與化合物dimorphoside A波譜數(shù)據(jù)基本一致，故將此化合物L(fēng)AD-Ol鑒定為dimorphoside A,結(jié)構(gòu)如下:
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種星柳珊瑚留體皂苷的制備方法，包括: (1)采用甲醇提取星柳珊瑚，總提取物加水成混懸液，依次加石油醚、氯仿萃取，然后將水相濃縮，通過(guò)MCI柱層析分離，依次以60%、100%甲醇水溶液洗脫，取甲醇洗脫部分減壓濃縮回收溶劑后干燥，得到星柳珊瑚總皂苷； (2)星柳珊瑚總皂苷用100~200目硅膠拌勻，經(jīng)200~300目硅膠柱色譜分離，依次以體積比為12:1,8:1,6:1的氯仿-甲醇、體積比為50:10:1,40:10:1,30:10:1,14:6:1的氯仿-甲醇-水梯度洗脫，薄層色譜檢測(cè)各餾分，相同組分合并濃縮，得到7個(gè)粗皂苷混合物； (3)取硅膠柱色譜分離得到的第6個(gè)粗皂苷混合物溶解于無(wú)水乙醇中形成300-500mg/mL溶液，進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠柱分離，收集主要成分合并濃縮得到甾體皂苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種星柳珊瑚留體皂苷的制備方法，其特征在于:所述步驟(O中的星柳珊瑚原料與水的質(zhì)量體積比為lkg:lL-5kg:lL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種星柳珊瑚留體皂苷的制備方法，其特征在于:所述步驟(O中的星柳珊瑚原料與石油醚以及氯仿的質(zhì)量體積比為8kg:lL-12kg:lL，萃取次數(shù)為3-5 次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種星柳珊瑚留體皂苷的制備方法，其特征在于:所述步驟(1)中的MCI柱層析分離的上樣水溶液的體積為每公斤星柳珊瑚原料60mL-100mL，MCI柱床體積為每公斤星柳珊瑚 原料80mL-100mL，60%、100%甲醇水溶液的用量為每公斤星柳珊瑚原料 300mL-500mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種星柳珊瑚留體皂苷的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中的100~200目硅膠用量為星柳珊瑚總皂苷質(zhì)量的1-1.5倍；200~300目硅膠的用量為星柳珊瑚總皂苷質(zhì)量的10-15倍；每份氯仿-甲醇用量為星柳珊瑚總皂苷質(zhì)量的40-60倍；每份氯仿-甲醇-水用量為星柳珊瑚總皂苷質(zhì)量的25-40倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種星柳珊瑚留體皂苷的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中的S印hadexLH-20凝膠柱分離具體為:按照每50_80mL柱床體積ImL樣品溶液的比例上樣，經(jīng)無(wú)水乙醇洗脫，TLC檢測(cè)各餾分，收集在體積比為40:10:1的氯仿-甲醇-水體系中Rf值為0.3的成分合并，減壓濃縮回收無(wú)水乙醇，即可。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種星柳珊瑚留體皂苷的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中得到的留體皂苷用于抗腫瘤藥物的制備。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種星柳珊瑚留體皂苷的制備方法，其特征在于:所述甾體皂苷用于肝癌和早幼粒細(xì)胞白血病抗腫瘤藥物的制備。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103936810SQ201410069695
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】陸亞男, 樊成奇, 田曉清, 楊橋, 崔萍 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所