攜帶p21ras單鏈抗體基因腫瘤特異性腺病毒載體的構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種攜帶p21ras單鏈抗體基因腫瘤特異性腺病毒載體的構(gòu)建及其裝載在CIK細胞中的應(yīng)用。本發(fā)明所制備的條件復(fù)制型腫瘤特異性腺病毒具有雙重靶向性，并能夠感染CIK細胞。同時將p21ras單鏈抗體和GFP基因克隆至重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pXC2P中，制備出攜帶有p21ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒KGHV500。本發(fā)明所制備的重組腺病毒可特異性的識別腫瘤細胞，對正常細胞毒性小，病毒攜帶的p21ras單鏈抗體基因能隨病毒的復(fù)制而長效表達，通過體內(nèi)外實驗均顯示出了良好的抗腫瘤效果。本發(fā)明所述的腫瘤特異性腺病毒載體可用于乳腺腫瘤等由p21ras蛋白過表達引起的相關(guān)腫瘤藥物制劑的研發(fā)。
【專利說明】攜帶p21 ras單鏈抗體基因腫瘤特異性腺病毒載體的構(gòu)建及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學生物學領(lǐng)域，涉及基因工程和腫瘤生物治療領(lǐng)域。具體的涉及利用分子克隆技術(shù)，用腫瘤特異性啟動子調(diào)控病毒E1A、ElB蛋白的表達，改造腫瘤特異性腺病毒的纖毛蛋白使腺病毒外殼具有5型/ 35型腺病毒嵌合型纖毛蛋白，同時在腫瘤特異性腺病毒基因中插入p21ras單鏈抗體基因，通過CIK細胞將攜帶該基因的雙靶向腫瘤特異性腺病毒運載到腫瘤組織部位，協(xié)同發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，腫瘤已經(jīng)成為一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤死亡率高、生存期短，已經(jīng)嚴重威脅人們的身體健康。統(tǒng)計資料表明，全世界每年約有700多萬人死于腫瘤，且有逐年上升趨勢。據(jù)2005年新英格蘭雜志報道癌癥已成為中國男性第一位、女性第三位的死亡原因。因此，預(yù)防和治療惡性腫瘤已成為醫(yī)學研究的熱點。
[0003]腫瘤傳統(tǒng)治療是以手術(shù)、化療和放療等方法為主，而這些常規(guī)的治療手段無法徹底清除殘存的腫瘤細胞，導致其治愈率低，復(fù)發(fā)率和病死率高，無法明顯改善人們對腫瘤相對無奈的局面。隨著分子生物學技術(shù)和基因工程的發(fā)展，腫瘤的分子生物學機制得到進一步闡明，腫瘤基因治療技術(shù)也隨之發(fā)展，為腫瘤治療提供了一種新的且有希望的治療手段。
[0004]ras基因是一種重要的細胞原癌基因，其命名來自大鼠肉瘤的英文rat asrcoma。ras基因家族包括三個主要成員，即H-ras、K_ras、N-ras,分別定位于第12、11和I號染色體，編碼由188-189個氨基酸組成的分子量約為21KD的蛋白質(zhì)，即p21ras蛋白，三種p21ras蛋白的氨基酸序列約有85%的同源性。
[0005]p21ras蛋白作為極其重要的信號轉(zhuǎn)導傳遞蛋白調(diào)節(jié)細胞的正常分化和增殖。p21ras蛋白合成后，其羧基端必須經(jīng)過`復(fù)雜的翻譯后修飾，使其準確定位于細胞膜的內(nèi)側(cè)面才能發(fā)揮其生物學功能。p21ras蛋白有自身GTP水解酶活性，可分別與GTP和GDP結(jié)合，p2Iras蛋白中GTP結(jié)合與在GTP酶激活蛋白作用下水解為GDP之間的循環(huán)形成了一種分子開關(guān)機制，即通過鳥嘌呤核苷酸不同形式的結(jié)合形成不同的激酶構(gòu)象，也即ras蛋白的活性和非活性形式。P21ras蛋白在細胞外生長信號刺激下與GTP結(jié)合成為活性狀態(tài)的p2Iras-GTP形式，從而激活p21ras蛋白下游眾多信號通道，促進細胞分裂、增生，抑制細胞凋亡，使細胞間接觸抑制減弱。
[0006]當ras基因發(fā)生突變或p21ras蛋白過表達或GTP酶激活蛋白缺失或生長因子受體活化及ras下游效應(yīng)子的突變或擴增，均可導致細胞惡性轉(zhuǎn)化并促進惡性腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。研究表明，大約30%的人類腫瘤中存在ras基因突變或ras基因過表達，部分學者認為p21ras蛋白主要在腫瘤形成的早期階段充當重要作用。
[0007]用于腫瘤生物治療的完整抗體由于分子量較大，其血管通透性弱，擴散入腫瘤內(nèi)能力差，半衰期長，毒性高而限制了其靶向傳遞及腫瘤拮抗應(yīng)用效果。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的單鏈抗體(single chain fragment vriable, ScFv)是用柔性寡核苷酸片段連接完整抗體的可變區(qū)構(gòu)建的線性片段，分子量只有完整抗體的I / 6;滲透力強；在非靶向組織中滯留時間短、易從體內(nèi)清除；且免疫原性低，用于人體幾乎不會產(chǎn)生抗鼠抗體反應(yīng)；容易在原核表達系統(tǒng)中表達獲得，易于基因操作和基因工程大量生產(chǎn)，實用性強。將ScFv基因用病毒載體等導入非淋巴細胞內(nèi)，通過偶聯(lián)定位信號序列，定向表達于亞細胞器(如細胞核、細胞漿或內(nèi)質(zhì)網(wǎng))而構(gòu)建的抗體稱為細胞內(nèi)抗體。這種抗體通過在細胞內(nèi)結(jié)合某種特定蛋白使其失活，并且封閉該蛋白與其它蛋白相互作用，或干擾該蛋白的正常胞內(nèi)定位，從而阻止其發(fā)揮正常生物學功能而起作用。細胞內(nèi)抗體用于腫瘤基因治療是通過將抗癌相關(guān)蛋白的抗體基因?qū)肽[瘤細胞，在細胞內(nèi)表達的ScFv與癌相關(guān)蛋白相互作用，從而抑制腫瘤的生長。
[0008]腫瘤祀向性溶瘤病毒，又稱條件復(fù)制型病毒(conditionally replicatingadenoviruses, CRAd)，是一種通過基因工程技術(shù)改造病毒基因組，使其能夠攜帶抑癌基因并選擇性地在腫瘤細胞中完成感染、復(fù)制周期，從而特異性溶解、殺傷腫瘤細胞，而在正常體細胞內(nèi)這種能力減弱甚至消失。改造后的病毒載體可選擇性地殺滅腫瘤細胞而不影響正常細胞，該載體具有一定程度的靶向性。溶瘤病毒作為一種特殊的腫瘤治療藥物和基因治療載體近兩年來發(fā)展迅速，許多高效、靶向性病毒相繼進入臨床試驗，顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。
[0009]雖然攜帶抑癌基因的溶瘤病毒在體外能顯示出良好的抗腫瘤療效，但仍無法完全消滅腫瘤。主要原因是溶瘤病毒進入人體后會受到多種免疫機制的清除。目前病毒主要給藥方法是瘤內(nèi)注射或靜脈注射，由于各種免疫、生化或物理屏障的作用，導致病毒遞送效率很低。所以，病毒進入體內(nèi)后很快被補體、抗病毒抗體及各種吞噬細胞等破壞，不能發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。為突破病毒類藥物給藥方式的技術(shù)瓶頸，人們逐漸研究開發(fā)出以細胞為運載工具的新型給藥方式，利用某些細胞具有靶向腫瘤部位這一特性通過系統(tǒng)給藥將所攜帶的病毒藥物運載到腫瘤組織部位。
[0010]細胞因子誘導殺 傷細胞(cytokine-1nduced killer cells,CIK)作為腫瘤的細胞治療方法之一，已成功地在臨床上得到了廣泛應(yīng)用?？茖W家使用CIK細胞作為痘病毒運載工具，成功將病毒藥物運載到腫瘤組織部位并顯示出高效地抗腫瘤作用。該方法結(jié)合ClK細胞靶向腫瘤部位的特性和細胞自身溶瘤作用，不僅為病毒類藥物運輸定位于腫瘤病變部位找到了突破口，更為細胞治療與基因、病毒治療方案的融合提供了一個嶄新的思路。
[0011]本發(fā)明利用小鼠抗體輕、重鏈混合引物,從經(jīng)過p21ras蛋白免疫后的Balb / c小鼠脾B淋巴細胞中擴增獲得其輕、重鏈可變區(qū)基因片段。通過重疊延伸PCR，將柔性寡核苷酸鏈(Linker)和所述兩片段連接,構(gòu)建出p21ras_Anti_ScFv單鏈抗體基因片段。用腫瘤特異性啟動子端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT啟動子和缺氧反應(yīng)元件啟動子HRE分別控制病毒復(fù)制所必須的ElA和ElB蛋白，將人5型腺病毒改造為只能夠在腫瘤細胞中復(fù)制增殖的腫瘤特異性腺病毒。同時為解決5型腺病毒對CIK細胞吸附能力差的問題，本發(fā)明將對CIK細胞具有高侵染力的35型腺病毒的纖毛蛋白(Fiber)基因克隆至5型腺病毒的骨架質(zhì)粒中，構(gòu)建出具有5型/ 35型嵌合型腺病毒纖毛蛋白的腫瘤特異性腺病毒，從而增加了腺病毒對CIK細胞的結(jié)合能力，使腫瘤特異性腺病毒能夠利用CIK細胞作為其運載工具。最后將p21ras-Ant1-ScFv單鏈抗體基因及GFP基因克隆至腫瘤特異性腺病毒穿梭質(zhì)粒pXC2P中，將經(jīng)過重組包裝后的攜帶有p21ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒KGHV500感染CIK細胞，并由CIK細胞將腫瘤特異性腺病毒KGHV500靶向運送至腫瘤組織，在CIK細胞殺傷腫瘤細胞死亡后釋放出腺病毒感染腫瘤細胞。感染腫瘤細胞的腺病毒在腫瘤細胞內(nèi)通過復(fù)制增殖殺傷細胞的同時還能夠長效的表達抗p21ras蛋白產(chǎn)物,所產(chǎn)生的細胞內(nèi)抗體阻斷腫瘤細胞中p21ras蛋白信號轉(zhuǎn)導途徑，限制腫瘤的生長和擴散，可用于靶向治療過表達p21ras蛋白的乳腺腫瘤，有望達到治療p21ras蛋白過表達引起的各類乳腺腫瘤的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶p21ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒載體，其中p21ras單鏈抗體(p21ras_Anti_ScFv)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0013]上述單鏈抗體的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)和位于重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)之間的連接肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
[0014]該攜帶p21ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒載體為攜帶有p21ras單鏈抗體基因和綠色熒光蛋白基因的腫瘤特異性腺病毒載體，其由腫瘤特異性啟動子hTERT和HRE分別調(diào)控腺病毒早期復(fù)制所必須的E1A、ElB蛋白，實現(xiàn)病毒在腫瘤細胞中選擇性復(fù)制的雙重調(diào)控；該雙靶向腫瘤特異性腺病毒的骨架質(zhì)粒嵌合了人35型腺病毒的纖毛蛋白，提高了病毒感染CIK細胞的能力；該雙靶向腫瘤特異性腺病毒載體攜帶了 p21ras-Ant1-SCFv基因，可用于靶向治療各類過表達p21ras蛋白的腫瘤；該雙靶向腫瘤特異性腺病毒載體還攜帶了 GFP基因，可作為信號分子用于腫瘤特異性腺病毒及p21ras單鏈抗體在腫瘤治療過程中的研究；攜帶有p2Iras-Ant1-ScFv基因的腫瘤特異性腺病毒載體經(jīng)過重組并包裝成完整病毒后，能夠由CIK細胞靶向運載至腫瘤組織，在CIK細胞殺傷腫瘤細胞死亡后釋放攜帶有p21ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒。該雙靶向腫瘤特異性腺病毒在對腫瘤細胞進行二次殺傷的同時還會長效表達抗p21ras蛋白的細胞內(nèi)抗體，阻斷腫瘤細胞中p21ras蛋白的信號轉(zhuǎn)導途徑，限制腫瘤細胞的生長和擴散，用于靶向治療p21ras蛋白過表達的各類腫瘤。
[0015]本發(fā)明的另一目的是將攜帶p21`ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒載體應(yīng)用在制備靶向殺傷腫瘤細胞特別是乳腺腫瘤細胞的藥物制劑中，為相關(guān)腫瘤的治療研究提供了一個新的選擇；
[0016]a、該雙靶向腫瘤特異性腺病毒載體包裝為完整病毒后能夠經(jīng)過CIK細胞的運載靶向殺傷腫瘤細胞，而不影響正常細胞；
[0017]b、該雙靶向腫瘤特異性腺病毒載體在腫瘤細胞內(nèi)能夠長效表達抗p21ras蛋白單鏈抗體，從而靶向抑制由P21ras蛋白過表達所引起的腫瘤生長和擴散。
[0018]本發(fā)明用兩種腫瘤特異性啟動子hTERT和HRE分別調(diào)控腺病毒E1A、E1B蛋白的表達，并且病毒衣殼嵌合了人35型腺病毒的纖毛蛋白，增加了 5型腺病毒感染CIK細胞的能力，使得CIK細胞能夠靶向運載腫瘤特異性腺病毒至腫瘤組織，減少了機體免疫系統(tǒng)在腫瘤特異性腺病毒到達腫瘤細胞過程中的破壞和清除作用，最終提供一種更安全、高效的雙靶向腫瘤特異性腺病毒。
[0019]本發(fā)明所提供的腫瘤特異性腺病毒載體從5’_3’依次包括以下可操作性相連的元件:hTERT 啟動子，ElA 基因，CMV 啟動子，p21ras-Anti_ScFv，IRES, GFP 基因，PolyA 序列，HRE啟動子，ElB基因。[0020]本發(fā)明的上述目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0021]1、廣譜抗p21ras蛋白單鏈抗體的制備,這是一種抗ras基因全蛋白序列的單鏈抗體，能廣譜拮抗H-ras、K-ras、N-ras三種p21ras蛋白；該單鏈抗體作為制備雙價或多價單鏈抗體、細胞內(nèi)抗體及其他小分子抗體研究的基礎(chǔ)材料，用于ras基因相關(guān)腫瘤的診斷性研究、發(fā)病機制研究或治療性研究。
[0022]所述單鏈抗體的制備方法如下:
[0023](I)利用小鼠抗體輕、重鏈混合引物，從經(jīng)過p21ras蛋白免疫后的Balb / c小鼠脾B淋巴細胞中擴增獲得其輕、重鏈可變區(qū)基因片段。通過重疊延伸PCR，將柔性寡核苷酸鏈(Linker)和所述兩片段連接，構(gòu)建出單鏈抗體基因片段；
[0024](2)在單鏈抗體的基因片段兩端分別引入不同的酶切位點并與同步雙酶切的噬菌粒表達載體PCANTAB-5E連接，獲得重組噬菌粒。將鑒定連接正確的重組噬菌粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，用輔助噬菌體M13K07進行挽救，通過噬菌體展示技術(shù)將目的單鏈抗體基因片段與表達載體中的gill基因融合表達并展示在噬菌體尾部表面，獲得融合表達的單鏈抗體，通過間接ELISA對融合表達的單鏈抗體進行檢測，篩選出陽性重組噬菌粒；
[0025](3)將篩選獲得的陽性重組噬菌粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)中進行可溶性表達，從而獲得與E-tag標簽融合表達的抗p21ras蛋白的可溶性單鏈抗體，以該單鏈抗體為一抗，以抗E-tag抗體為二抗，采用間接ELISA和免疫細胞化學法檢測目的單鏈抗體的特異性及親和力，證實該單鏈抗體可特異性識別三種p21ras蛋白。
[0026]2、攜帶p21 ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒KGHV500的制備，分別用腫瘤特異性啟動子hTERT和HRE替代原有啟動子調(diào)控腺病毒早期復(fù)制所必須的E1A、ElB蛋白，使得腺病毒的復(fù)制增殖只能夠在腫瘤細胞中完成，而不影響正常細胞。再將編碼人35型腺病毒纖毛蛋白的基因嵌合到人5型腺病毒的骨架質(zhì)粒中，構(gòu)建出含有F5 / 35嵌合型纖毛蛋白的腺病毒，從而提高5型腺病毒感染CIK細胞的能力，使得CIK細胞能夠運載腫瘤特異性腺病毒至腫瘤組織，增強了腫瘤特異性腺病毒對腫瘤細胞的作用效果。最后將p21ras單鏈抗體基因及GFP基因克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒，構(gòu)建出完整的攜帶有p21ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒載體，使得P21ras單鏈抗體基因能夠隨病毒在腫瘤細胞中的復(fù)制而長效表達。該重組腺病毒可用于腫瘤的靶向治療研究特別是由p21ras蛋白過表達引起的乳腺腫瘤等相關(guān)疾病的治療研究，為今后腫瘤的治療和抗癌新藥的研發(fā)提供一種新的途徑。
[0027]本發(fā)明所述的腫瘤特異性腺病毒KGHV500的制備及其應(yīng)用，具體步驟如下:
[0028](I)通過重疊延伸PCR使ElA上游的啟動子缺失，并在缺失位置引入兩個新的酶切位點Sal I和Xho I，將缺失啟動子的部分ElA片段連入pMD-18T simple載體，得到重組質(zhì)粒pMD-mElA，人工化學合成hTERT啟動子片段，并在啟動子序列兩端同時引入Sal I和XhoI酶切位點。將重組質(zhì)粒pMD-mElA與人工合成的hTERT啟動子片段用Sal I和Xho I同步雙酶切，連接，構(gòu)建出完整的用hTERT啟動子調(diào)控ElA蛋白表達的片段。最后將該完整片段替換腺病毒穿梭質(zhì)粒上的原片段，構(gòu)建出含有hTERT啟動子的pXCl-hTERT。
[0029](2)通過重疊延伸PCR使ElB上游的啟動子缺失，并在缺失位置引入新的酶切位點Not 1、Spe I和Cla I，將缺失啟動子的部分ElB片段連入pMD_18T simple載體，得到重組質(zhì)粒pMD-mElB，人工化學合成HRE啟動子片段，并在啟動子序列兩端同時引入Spe I和ClaI酶切位點。將重組質(zhì)粒pMD-mElB與人工合成的HRE啟動子片段用Spe I和Cla I同步雙酶切，連接，構(gòu)建出完整的用HRE啟動子調(diào)控ElB蛋白表達的片段。最后將該完整片段替換腺病毒穿梭質(zhì)粒上的原片段，構(gòu)建出雙靶向腫瘤特異性腺病毒穿梭質(zhì)粒PXC2P。
[0030](3)人工化學合成包含有CMV啟動子、p21ras-Ant1-ScFv片段、IRES、GFP 0RF、Poly A等基因和各調(diào)控元件的長片段，并在兩端引入Not I和Spe I酶切位點。將重組腺病毒穿梭質(zhì)粒PXC2P與人工合成含有p21ras單鏈抗體基因的長片段用Not I和Spe I同步雙酶切，連接，從而構(gòu)建出攜帶有p21ras單鏈抗體基因和GFP基因的由腫瘤特異性啟動子調(diào)控E1A、ElB蛋白表達的腫瘤特異性腺病毒穿梭質(zhì)粒pXC2P-ScFv。
[0031](4)將腺病毒骨架質(zhì)粒PBHGE3用Spe I和Cla I雙酶切，將酶切后含有纖毛蛋白Fiber5基因的片段連入之前構(gòu)建的含有Spe I和Cla I酶切位點的pMD_mElB中，得到重組質(zhì)粒PMD-F5,人工合成含有5型腺病毒和35型腺病毒嵌合纖毛蛋白的基因片段,并在兩端引入Age I和Sbf I酶切位點。將重組的PMD-F5載體與人工合成的F5 / 35嵌合型纖毛蛋白基因片段用Age I和Sbf I同步雙酶切，連接，構(gòu)建出含有F5 / 35嵌合型纖毛蛋白基因片段的重組質(zhì)粒PMD-F5 / 35。最后將重組質(zhì)粒PMD-F5 / 35用Spe I和Cla I雙酶切，將含有F5 / 35嵌合型纖毛蛋白的基因片段與之前用Spe I和Cla I雙酶切的骨架質(zhì)粒PBHGE3大片段連接。構(gòu)建出含有F5 / 35嵌合型纖毛蛋白基因的腺病毒骨架質(zhì)粒PBHGE3-F5 / 35。[0032](5)將構(gòu)建好的腺病毒穿梭質(zhì)粒pXC2P-ScFv與嵌合型骨架質(zhì)粒pBHGE3_F5 /35共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，經(jīng)過同源重組后在293細胞中包裝成完整的腫瘤特異性腺病毒KGHV500。通過測定病毒感染正常細胞及腫瘤細胞后的滴度，來分析病毒的腫瘤復(fù)制特異性。利用流式細胞術(shù)檢測KGHV500病毒感染CIK細胞的能力。再用熒光定量PCR確定病毒所攜帶的單鏈抗體基因在腫瘤細胞內(nèi)的表達情況。
[0033](6)最后用荷載攜帶有p21ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒KGHV500的CIK細胞進行體外抑瘤實驗及體內(nèi)抑制裸鼠移植瘤實驗。通過MTT法檢測感染病毒后腫瘤細胞的活性，并通過觀察注射腺病毒KGHV500后裸鼠移植瘤的生長情況確定腫瘤特異性腺病毒KGHV500分別在體內(nèi)、外的抑瘤作用。
[0034]本發(fā)明的有益成果:本發(fā)明創(chuàng)造性地從經(jīng)過p21ras蛋白免疫后的小鼠脾B淋巴細胞內(nèi)擴增獲得抗體的輕、重鏈基因，通過噬菌體展示技術(shù)和間接ELISA簡單、高效的獲得了廣譜的抗p21ras蛋白的ScFv片段。將人5型腺病毒改造為能夠感染CIK細胞的雙靶向腫瘤特異性腺病毒，增強了腫瘤特異性腺病毒在機體中對腫瘤細胞作用效果的同時也提高了腫瘤特異性腺病毒的安全性。最后將p21ras單鏈抗體基因連同GFP基因共同克隆至腫瘤特異性腺病毒載體，構(gòu)建出完整的攜帶p21ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒KGHV500，最終使得P21ras單鏈抗體基因能夠隨病毒在腫瘤細胞中的復(fù)制而長效表達，進一步增強了腫瘤特異性腺病毒對由P21ras蛋白過表達引起的乳腺腫瘤的抑制作用。最后分別在體外和體內(nèi)研究了由CIK細胞荷載的KGHV500腫瘤特異性腺病毒對腫瘤細胞的殺傷及抑制作用。結(jié)果表明其在體外可以顯著殺傷并抑制乳腺腫瘤細胞的生長和增殖，在體內(nèi)可以顯著抑制乳腺腫瘤的形成、生長及轉(zhuǎn)移，并且沒有明顯的毒副作用，為今后乳腺腫瘤的治療提供了一種新途徑。
[0035]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:
[0036](I)本發(fā)明獲得的單鏈抗體基因比傳統(tǒng)單鏈抗體基因的制備方法簡單，減少了雜交瘤細胞株的制備過程。并且篩選出的單鏈抗體，具有抗H-ras、K-ras、N-ras三種p21ras蛋白的廣譜抗性，同時具有較低的免疫原性和較高的特異性和親和力。
[0037](2)本發(fā)明有機的利用了兩種腫瘤特異性啟動子調(diào)控病毒的復(fù)制和改造腫瘤特異性腺病毒的纖毛蛋白，從病毒對細胞的感染到病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制都做到了特異性。本發(fā)明所制備的腫瘤特異性腺病毒可以有效的靶向腫瘤細胞，進一步的提高了腺病毒的靶向性和安全性。
[0038](3)本發(fā)明構(gòu)建的攜帶有p21ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒經(jīng)體外實驗證明能選擇性的殺死腫瘤細胞，而不影響正常細胞，具有腫瘤靶向性。這種攜帶有p21ras單鏈抗體基因的新型雙靶向腫瘤特異性腺病毒能高效的殺傷并抑制乳腺腫瘤的生長和擴散，為乳腺腫瘤的治療提供了一個良好的新技術(shù)平臺。
[0039](4)本發(fā)明將腫瘤的過繼免疫療法、病毒療法和基因治療有機的結(jié)合在一起，在CIK細胞及腫瘤特異性腺病毒雙重殺傷腫瘤細胞的同時，還可長時間、高效的表達p21ras單鏈抗體對腫瘤細胞進行再次殺傷，相對于單一的腫瘤治療方法大大的增強了對腫瘤的殺傷能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1為p21ras蛋白免疫Balb / c小鼠的脾B淋巴細胞總RNA電泳圖，M:DL2000，
1、2為平行樣品。
[0041]圖2為小鼠脾B淋巴細胞cDNA擴增的輕、重鏈可變區(qū)片段電泳圖，M =DNAMaker I，1-3為擴增出的重鏈可變區(qū)條帶，4-5為擴增出的輕鏈可變區(qū)條帶。
[0042]圖3為構(gòu)建的單鏈抗體基因片段，M:DL2000,1:單鏈抗體條帶。
[0043]圖4為含單鏈抗體基因重組噬菌體表`達載體的Sfi 1、Not I雙酶切鑒定電泳圖，M:DL2000,1-4:雙酶切后的重組噬菌粒條帶，均為平行樣品。
[0044]圖5為SDS-PAGE檢測可溶性表達單鏈抗體的電泳圖，M:14.4_94KDa蛋白質(zhì)分子量標準，1-2:可溶性單鏈抗體，均為平行樣品。
[0045]圖6為重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pXC2P-ScFv的構(gòu)建流程圖。
[0046]圖7為重組腺病毒骨架質(zhì)粒PBHGE3-F5 / 35的構(gòu)建流程圖。
[0047]圖8為通過重疊延伸PCR構(gòu)建的啟動子缺失的ElA部分片段電泳圖，M:DL2000,I為用引物ElAfl和ElArl擴增出的ElA啟動子上游部分片段，2為用引物ElAf2和ElAr2擴增出的ElA啟動子下游部分片段，3為用引物ElAfl和ElAr2擴增出的啟動子缺失的ElA部分片段。
[0048]圖9為含有hTERT啟動子的重組pXCl-hTERT酶切鑒定電泳圖，M:Trans2K PlusII DNA Maker, I為pXCl的EcoR I和Xba I雙酶切電泳圖，2為pMD-mElA-hTERT重組質(zhì)粒的EcoR I和Xba I雙酶切鑒定圖，3為pMD-mElA-hTERT重組質(zhì)粒的SalI和Xho I雙酶切鑒定圖，4為pXCl-hTERT重組質(zhì)粒的EcoR I和Xba I雙酶切鑒定圖。
[0049]圖10為通過重疊延伸PCR構(gòu)建的啟動子缺失的ElB部分片段電泳圖，M:DL2000,I為用引物ElBfl和ElBrl擴增出的ElB啟動子上游部分片段，2為用引物ElBf2和ElBr2擴增出的ElB啟動子下游部分片段，3為用引物ElBfl和ElBr2擴增出的啟動子缺失的ElB部分片段。[0050]圖11為含有HRE啟動子的重組pXC2P酶切鑒定電泳圖，M:D15000+2000,1為pXCl-hTERT重組質(zhì)粒的Xba I和Kpn I雙酶切電泳圖，2為pMD-mElB-HRE重組質(zhì)粒的XbaI和Kpn I雙酶切鑒定圖，3為pMD-mElB-HRE重組質(zhì)粒的Cla I和Spe I雙酶切鑒定圖，4為PXC2P重組質(zhì)粒的Xba I和Kpn I雙酶切鑒定圖。
[0051]圖12為含有嵌合型纖毛蛋白基因的重組腺病毒骨架質(zhì)粒PBHGE3-F5 / 35酶切鑒定電泳圖，I為5型腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGE3的Cla I和Spe I雙酶切電泳圖，2為pMD_F5 /35重組質(zhì)粒的Cla I和Spe I雙酶切鑒定圖，3為pMD_F5 / 35重組質(zhì)粒的Age I和SbfI雙酶切鑒定圖，4為pBHGE3-F5 / 35重組質(zhì)粒的Cla I和Spe I雙酶切鑒定圖。
[0052]圖13為含有單鏈抗體基因及GFP基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pXC2P_ScFV的酶切鑒定電泳圖，I為PXC2P的Spe I酶切電泳圖，2為pXC2P的NotI酶切電泳圖；3為pXC2P的Spe I和Not I雙酶切電泳圖，4為pXC2P-ScFv的Spe I和Not I雙酶切鑒定圖。
[0053]圖14為不同重組病毒在正常細胞及腫瘤細胞中的復(fù)制能力示意圖。
[0054]圖15為不同重組病毒對CIK細胞吸附能力示意圖。
[0055]圖16為腫瘤特異性病毒KGHV500在腫瘤細胞中的表達情況示意圖，I為乳腺癌細胞MDB-MB-231的內(nèi)參基因GAPDH表達曲線，2為乳腺癌細胞MDB-MB-435的內(nèi)參基因GAPDH表達曲線，3為乳腺癌細胞MCF-7的內(nèi)參基因GAPDH表達曲線，4為MDB-MB-231的單鏈抗體基因表達曲線，5為MDB-MB-435的單鏈抗體基因表達曲線，6為MCF-7的單鏈抗體基因表達曲線。
[0056]圖17為MTT法檢測不同重組病毒對正常細胞及腫瘤細胞的殺傷率示意圖。
[0057]圖18為荷載KGHV500病毒的CIK細胞對MDA-MB-231乳腺癌細胞在小鼠體內(nèi)成瘤實驗的影響。
[0058]圖19為荷載KGHV500病毒的CIK細胞對MCF-7乳腺癌細胞在小鼠體內(nèi)成瘤實驗的影響。
【具體實施方式】
[0059]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內(nèi)容，本發(fā)明中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。以下實施例中的定量實驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0060]實施例1:單鏈抗體基因片段的制備
[0061]1、p21ras蛋白免疫Balb / c小鼠:取5只鼠齡在6-8周的Balb / c小鼠(購自重慶第三軍醫(yī)大學實驗動物中心)，每只注射100 μ g的本實驗室經(jīng)過原核表達純化后的p21ras-K蛋白(p21ras_K蛋白的制備方法參照論文《重組p21ras蛋白的表達、鑒定與純化及其多克隆抗體的制備》)，初次注射加等量的完全弗氏佐劑，皮下5點注射。兩周后進行第二次注射，劑量同第一次，加等量不完全弗氏佐劑，皮下5點注射。兩周后進行第三次注射，劑量同第一次，不加佐劑，腹腔注射。兩周后進行第四次注射，劑量同第一次，不加佐劑，腹腔注射。3天后取其脾臟，用IOml滅菌的D-Hank’s液沖洗研碎的脾臟。用滴管吸取培養(yǎng)皿內(nèi)細胞的懸液，移入50ml離心管中，1000g離心10分鐘，棄上清，沉淀即為所需要的小鼠脾B淋巴細胞。
[0062]2、小鼠脾B淋巴細胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:將已分離得到的小鼠脾B淋巴細胞，使用傳統(tǒng)的Trizol法提取總RNA。提取的具體步驟參照分子克隆指南(第三版)。最后將提取出的RNA盡快放在-80°C冰箱中。提取出的RNA進行I %瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為90伏，30分鐘?？梢娞崛〉目俁NA的28S、18S、5S亞基大小正確，條帶清晰無明顯雜帶，可用于下游的反轉(zhuǎn)錄實驗。電泳圖見附圖1。
[0063]反轉(zhuǎn)錄使用購自Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒,具體步驟參見說明書操作。反轉(zhuǎn)錄出的cDNA可保存于_20°C冰箱。
[0064]3、重疊延伸PCR合成單鏈抗體基因片段:擴增小鼠輕、重鏈可變區(qū)引物和重疊延伸PCR構(gòu)建單鏈抗體的Linker引物等均使用購自GE healthcare公司的重組曬菌體抗體系統(tǒng)(Recombinant PhageAntibody System, RPAS)。首先在PCR管內(nèi)加入下列試劑進行輕鏈可變區(qū)擴增:小鼠脾B淋巴細胞cDNA4y I ； 10 X PCR Buffer5 μ I ；dNTP (IOmM) 5 μ I ;輕鏈引物混合液I μ I ；rTaq酶0.5 μ I ;滅菌去離子水34.5 μ I。另一只PCR管內(nèi)加入下列試劑進行重鏈可變區(qū)擴增:小鼠脾B淋巴細胞cDNA4y I ； 10 X PCR Buffer5 μ I ；dNTP (IOmM) 5 μ I ；重鏈引物混合液I P I ;rTaq酶0.5 μ I ;滅菌去離子水34.5 μ I。將上述體系配制好后放入PCR儀經(jīng)95°C，5分鐘；(94°C 30秒，55°C 45秒，72°C I分鐘，30個循環(huán));72°C 10分鐘，結(jié)束反應(yīng)。將擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為90伏，30分鐘?？梢姅U增的重鏈可變區(qū)大小約為350bp，輕鏈可變區(qū)大小約330bp，與預(yù)期一致，電泳圖見附圖2。
[0065]將大小正確的條帶進行切膠純化，膠回收的步驟按天根離心柱型DNA純化試劑盒說明書操作；將純化后的條帶再次取2 μ I進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為90伏，30分鐘，確定膠回收后DNA的質(zhì)量和大致濃度。
[0066]用Linker引物連接擴增的輕重鏈可變區(qū)并在連接產(chǎn)物兩端引入Sfi I和Not I酶切位點:通過重疊延伸PCR法用Linker混合物將純化后的相同摩爾量的輕重鏈可變區(qū)片段進行連接，連接產(chǎn) 物在RS Primers (酶切位點引物)作用下在重鏈的5’末端加上SfiI限制性位點和輕鏈的3’末端加上Not I酶切位點，可用于后續(xù)與有相同酶切位點的表達載體pCANTAB_5E (購自Pharmacia公司)進行連接。具體步驟參照GE healthcare公司的RPAS系統(tǒng)說明書。PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見單鏈抗體條帶大小約780bp，與預(yù)期一致，條帶集中，清晰無雜帶，電泳圖見附圖3。目的條帶進行切膠純化及純化后的濃度測定。對所構(gòu)建好的單鏈抗體命名為p21ras-Ant1-ScFv。
[0067]4、單鏈抗體基因片段的克隆:將構(gòu)建出的單鏈抗體片段p21ras-Anti_ScFv連入PMD-18T載體(購自TAKARA公司)，構(gòu)建出pMD-ScFv重組質(zhì)粒。在200 μ I PCR管中配制如下連接體系:pMD_18T 載體 I μ I ;目的片段 DNA0.lpmol-0.3pmol Solution I 補足 10 μ I。金屬浴16°C反應(yīng)4小時。將連接產(chǎn)物加入到100 μ I DH5a感受態(tài)中，冰浴30分鐘。42°C熱激90秒后立即冰浴90秒。加入900 μ I LB液體培養(yǎng)基，37°C，80rpm,振蕩培養(yǎng)I小時。取200 μ I培養(yǎng)物涂布于含有X-Gal的LB / Amp平板上37°C倒置培養(yǎng)10小時。
[0068]5、菌液PCR鑒定陽性重組子:挑取LB / Amp平板上的單菌落，溶于50 μ I的ddH20中，98 °C熱裂解10分鐘后13000rpm離心I分鐘，所得上清即為PCR的模板。在200 微升 PCR 反應(yīng)管內(nèi)加入 10 X PCR Buffer2.5 μ I ；dNTP 混合液(2.5mM each) 2 μ I ;M13F(10yM)0.5μ 1，M13R(10 μ Μ) 0.5 μ I ;菌液 5μ I ;rTaq 酶 0.5 μ I ；ddH2014y I。設(shè)置PCR反應(yīng)程序為預(yù)變性94°C 4分鐘。(94°C I分鐘，57°C I分鐘，72°C I分鐘，30個循環(huán))，72°C延伸10分鐘，4°C保存。PCR產(chǎn)物進行I %的瓊脂糖凝膠電泳，可見在預(yù)期的930bp處出現(xiàn)條帶，確定為陽性重組克隆。
[0069]實施例2:單鏈抗體庫的建立及篩選鑒定
[0070]1、重組噬菌粒的構(gòu)建
[0071]1.1重組pMD-ScFv載體及表達載體的雙酶切:將經(jīng)PCR鑒定正確的陽性pMD_ScFv克隆提取質(zhì)粒，提取步驟按天根質(zhì)粒小提試劑盒說明書操作。將重組的PMD-ScFv質(zhì)粒及表達載體質(zhì)粒PCANTAB-5E (購自Pharmacia公司)分別先進行Sfi I酶切，在200 μ I PCR反應(yīng)管內(nèi)分別加入表達載體質(zhì)粒/pMD-ScFv載體各30 μ I ;Sfi I酶(10U / μ 1)4μ I ；IOXBuffer Μ5 μ 1，ddH2011 μ 1，上述體系配置好后50°C反應(yīng)4小時。將酶切產(chǎn)物經(jīng)過膠回收純化后，在新的200 μ IPCR反應(yīng)管中加入純化產(chǎn)物30 μ l，Not I酶(10U / μ 1)2μ I,IOXBuffer Η5μ 1，BSA2 μ 1，Trion Χ-1002 μ 1，ddH209 μ I，上述體系配置好后 37°C 反應(yīng) 4小時。酶切產(chǎn)物全部加樣進行I %瓊脂糖凝膠電泳，重組的PMD-ScFv質(zhì)粒雙酶切后在780bp處出現(xiàn)目的條帶，表達載體質(zhì)粒雙酶切后在3.5kb處出現(xiàn)目的條帶。目的條帶分別進行切膠純化，步驟按天根離心柱型DNA純化試劑盒說明書進行。
[0072]1.2重組表達載體的連接:將經(jīng)過Sfi I和Not I同步雙酶切后的表達載體PCANTAB-5E與ScFv目的片段按摩爾比1: 5進行連接，從而構(gòu)建出含有單鏈抗體基因的重組表達載體pCANTAB-ScFv。連接總體積為10 μ 1，16°C反應(yīng)4小時。將連接產(chǎn)物全部加入100 μ I的TGl感受態(tài)中，冰浴30分鐘。42°C熱激90秒后再冰浴90秒。加入900 μ I LB液體培養(yǎng)基，370C，80rpm,振蕩培養(yǎng)I小時。取200 μ I培養(yǎng)物涂布于LB / Amp平板上37°C倒置培養(yǎng)10小時。
[0073]1.3重組表達載體的鑒定:挑取LB / Amp平板上的單菌落，溶于50 μ I的ddH20中，98°C熱裂解10分鐘后13000rpm離心I分鐘，所得上清即為PCR反應(yīng)的模板。PCR鑒定插入片段使用表達載體PCANTAB-5E的通用引物，SlF:CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC,S6R:GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG。在 200 微升 PCR 反應(yīng)管內(nèi)加入 10XPCR Buffer2.5 μ I ;dNTPs(2.5mM each) 2 μ I ；S1F(10 μ Μ) 0.5 μ I, S6R(10 μ Μ) 0.5 μ I ；菌液 5 μ I ;rTaq 酶
0.5 μ I ；ddH2014 μ I。設(shè)置PCR反應(yīng)程序為預(yù)變性94°C 4分鐘。(94°C I分鐘，58°C I分鐘，720C I分鐘，30個循環(huán))，72°C延伸10分鐘，4°C保存。PCR產(chǎn)物進行I %的瓊脂糖凝膠電泳，可見在預(yù)期的950bp處出現(xiàn)條帶。將重組表達載體pCANTAB-ScFv進行Sfi I和Not I分步雙酶切，可見在3.5kb和780bp處有酶切條帶，確認為陽性重組克隆，電泳圖見附圖4。
[0074]2、噬菌體抗體庫的富集和篩選
[0075]2.1噬菌體抗體庫的富集:按細菌數(shù)量與輔助噬菌體數(shù)量1: 20的比例加入輔助噬菌體M13K07 (購自GE healthcare公司)于鑒定為陽性含有pCANTAB-ScFv的重組子菌液內(nèi)，放恒溫搖床內(nèi)37°C，150rpm,培養(yǎng)2小時。當看到液體變渾濁時，放入離心機內(nèi)，室溫下1500g離心25分鐘，棄上清。用2XYTAK液重懸沉淀，37°C，200rpm，過夜振蕩培養(yǎng)。所得的液體即為經(jīng)過富集后的噬菌體培養(yǎng)液。
[0076]2.2間接ELISA法篩選單鏈抗體的特異性:將所得培養(yǎng)液室溫下低速離心25分鐘，吸取上清，上清內(nèi)加入I / 5體積的10%脫脂奶粉封閉液，室溫下放置10分鐘。用PH9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液將p21Ras-H、N、K蛋白分別稀釋至5μ g / ml，在每個酶標板孔內(nèi)加入100 μ I稀釋后蛋白液，4°C冰箱內(nèi)過夜包被。第二天棄孔內(nèi)液體，每孔加入0.15MPBS-Tweenz (磷酸鹽-吐溫)洗滌緩沖液300 μ 1，置振蕩搖床上振搖3分鐘，棄孔內(nèi)液體，重復(fù)洗滌3次。每孔加入I % BSA-PBS封閉液100 μ 1，置37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育I小時，洗板三次。每孔加入100 μ I適當稀釋的融合表達的單鏈重組噬菌體克隆上清為一抗，置濕盒內(nèi)37°C恒溫孵育I小時后洗板三次，同時設(shè)置空白、陰性、陽性對照。每孔加入1: 2000稀釋的酶標二抗(HRP標記的抗M13g8p蛋白)100μ1新鮮配制的TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物液，避光作用5-10分鐘，當陽性對照明顯呈藍色而空白、陰性對照呈無色時即可每孔加入2Μ H2S0450 μ I終止反應(yīng)。使用酶標儀讀取OD45tl值，凡待測孔值/陰性對照孔值≥2即為陽性。
[0077]3、單鏈抗體的可溶性表達及鑒定
[0078]3.1單鏈抗體的可溶性表達:將經(jīng)過ELISA篩選出的含有陽性重組噬菌體的菌液重新擴大培養(yǎng)至0D_~0.8。將培養(yǎng)好的菌液提取質(zhì)粒，步驟按QIAGEN質(zhì)粒小提試劑盒說明書進行。將3μ1各個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至100μΙ BL21(DE3)感受態(tài)中。挑取陽性單克隆接于5ml的LB / Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取前一次的培養(yǎng)菌液按1 / 100比例加入到IL新的LB / Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D_~0.8。收集培養(yǎng)后的菌體，用滅菌PBS緩沖液重懸菌體，加入100U / μ I溶菌酶使溶菌酶終濃度達到IU / μ 1，室溫放置15分鐘，4°C，12000rpm，離心30分鐘后收集上清。
[0079]3.2可溶性表達單鏈抗體的鑒定[0080]3.2.1SDS-PAGE確定單鏈抗體的相對分子量:在上一步所得的上清中加入一定量的2 X SDS上樣緩沖液，使蛋白的終濃度為3-4mg/ml，混合液在沸水浴中加熱10分鐘，冷卻后即可上樣進行電泳。電泳完畢，取出分離膠放在盛有去離子水的容器中，加熱沸騰后取出。加入快速染色液浸沒分離膠即可，在脫色搖床上搖10分鐘，當?shù)鞍讞l帶已可見時棄染色液。再次加入約50ml的水，加熱沸騰2分鐘，停止加熱繼續(xù)在脫色搖床上搖30分鐘后觀察結(jié)果。結(jié)果可見在30KDa處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期一致，電泳圖見附圖5。
[0081]3.2.2免疫細胞化學法檢測可溶性表達的單鏈抗體與腫瘤細胞株的結(jié)合特異性及敏感性:采用人肝癌細胞株H印G2，人肝癌細胞株QGY-7703，人胃癌細胞株BGC-853，人胃癌細胞株MKN-28，人結(jié)腸直腸癌細胞株HCTl 16，人卵巢癌細胞株SK0V3，人宮頸癌細胞株Hela,人乳腺癌細胞株MDA-MB-231，人乳腺癌細胞株MDA-MB-435，人乳腺癌細胞株MCF-7共10種腫瘤細胞株；將呈對數(shù)生長期的10種腫瘤細胞株收集于離心管內(nèi)，離心棄上清，用生理鹽水重懸細胞沉淀，離心棄上清，用95%乙醇重懸細胞沉淀，離心后讓細胞沉淀在95%乙醇中固定3小時，小心取出腫瘤細胞沉淀塊按常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、水化及高壓抗原修復(fù)后，加入制備的可溶性單鏈抗體作為一抗，抗E-tag抗體作為二抗(購自Abcam公司)，通過SP法檢測腫瘤細胞表達p21ras蛋白的情況。結(jié)果顯示制備的可溶性單鏈抗體可與上述所有腫瘤細胞株呈不同程度的陽性反應(yīng)，顯示了良好的廣泛的抗腫瘤細胞株譜系。
[0082]4、將鑒定結(jié)果正確的單鏈抗體進行測序:將可溶性表達結(jié)果正確含有單鏈抗體基因重組pMD-ScFv載體的菌液送測序公司測序，DNA測序結(jié)果表明單鏈抗體的基因序列排列方式為V11-Linker-VL,與小鼠免疫球蛋白可變區(qū)序列數(shù)據(jù)庫Kabat比對后發(fā)現(xiàn)序列符合小鼠輕重鏈可變區(qū)基因結(jié)構(gòu)，具體序列見SEQ ID N0:1。
[0083]實施例3:腫瘤特異性腺病毒KGHV500的制備
[0084]1、腫瘤特異性腺病毒穿梭質(zhì)粒pXC2P的構(gòu)建[0085]1.1hTERT啟動子替換病毒ElA啟動子
[0086]1.1.1構(gòu)建ElA基因啟動子缺失突變的片段:以人5型腺病毒穿梭質(zhì)粒pXCl (購自Microbix Biosystems Ins公司)為模板，用重疊延伸PCR構(gòu)建出ElA啟動子缺失的片段。具體步驟如下:用引物末端帶有EcoR I酶切位點的ElAfl正向引物(5，-CGTCTTCAAGAATTCTCATGTTT-3，)和末端帶有Sal I酶切位點的ElArl反向引物(5’-CCGCTCGAGCGGCGACGTCGACGCGTCACTACACGTCAGCTGACTATAATAATA-3，)擴增 ElA啟動子上游的部分片段894bp。用引物末端帶有Xho I酶切位點的ElAf2正向引物(5，-ACGCGTCGACGTCGGCCGCTCGAGCGG GACTGAAAATGAGACATATTATCTGC-3’ )和末端帶有 XbaI酶切位點的EI Ar 2反向引物(5，-TGCATTCTCTAGACACAGGTGAT-3，)擴增ElA啟動子下游的部分片段 827bp。反應(yīng)體系為 10XTransTaq?-T Buffer5 μ I ；dNTPs(2.5mM each) 4 μ I ；ElAfl / ElAf2(10yM)ly I, ElArl / ElAr2 (10 μ M) I μ I ;質(zhì)粒 pXCll μ I ;TransTaq?-TDNAPolymerasel μ I ；ddH2037 μ I。設(shè)置 PCR 反應(yīng)程序為預(yù)變性 94°C 4 分鐘；(94°C I 分鐘，570C I分鐘，72°C 2分鐘，30個循環(huán))；72°C延伸10分鐘，4°C保存。將擴增得到的PCR產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA純化回收試劑盒分別回收純化兩個目的條帶。再同時以擴增出的兩個目的片段為模板，以ElAfl為上游引物，EI Ar 2為下游引物進行PCR反應(yīng)，從而擴增出ElA基因啟動子缺失突變的片段。配制如下PCR反應(yīng)體系:10XTransTaqTM-TBuffer5 μ I ；dNTPs(2.5mM each) 4 μ I ；ElAf I (10 μ M) I μ 1，ElAr2 (10 μ Μ) I μ I ;之前純化回收后的目的片段各 I P I ；TransTaq?-T DNA Polymerasel μ I ；ddH2036 μ I。設(shè)置 PCR 反應(yīng)程序為預(yù)變性940C 4分鐘；(940C I分鐘，55°C I分鐘，72°C 2分鐘，30個循環(huán));72°C延伸10分鐘，4°C保存。將擴增得到的PCR產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA純化回收試劑盒回收純化約1700bp左右的目的條帶，回收所得片段即為ElA基因啟動子缺失突變的片段，結(jié)果見圖8。將該片段連接至pMD-18T simple載體上構(gòu)建出pMD-mElA，具體操作過程同本發(fā)明實施例1中的步驟4和步驟5。
[0087]1.1.2將hTERT啟動子克隆至ElA基因啟動子缺失`突變的片段:將含有化學合成的hTERT啟動子片段(NCBI登錄號為NC_000005.10)的pUC57_hTERT和pMD_mElA用Sal I和Xho I同步雙酶切，37°C反應(yīng)2小時。將酶切產(chǎn)物全部加樣進行I %瓊脂糖凝膠電泳，pUC57-hTERT載體雙酶切后在300bp處出現(xiàn)目的條帶，pMD-mElA雙酶切后在4.4kb處出現(xiàn)目的條帶。將目的條帶分別進行切膠純化后連接，構(gòu)建出含有hTERT啟動子的pMD-mElA-hTERT。連接體系為:pMD_mElA / Sal I / Xho I 與 hTERT / Sal I / Xho I 按摩爾比1: 5進行連接，連接總體積為10μ1，16?反應(yīng)4小時。具體操作過程同本發(fā)明實施例2中的步驟1.2和步驟1.3。
[0088]1.1.3用含有hTERT啟動子的ElA片段替換pXCl中的原片段:將pMD-mElA-hTERT和pXCl用EcoR I和Xba I同步雙酶切，37°C反應(yīng)2小時。將酶切產(chǎn)物全部加樣進行1%瓊脂糖凝膠電泳，pMD-mElA-hTERT載體雙酶切后在2kb處出現(xiàn)目的條帶，pXCl雙酶切后在
8.2kb處出現(xiàn)目的條帶。將目的條帶分別進行切膠純化后連接，構(gòu)建出含有hTERT啟動子的pXCl-hTERT。連接體系為:pXCl / EcoR I / Xba I 與 ElA-hTERT / EcoR I / Xba I 按摩爾比1: 7進行連接，連接總體積為10μ1，16?反應(yīng)4小時。具體操作過程同本發(fā)明實施例2中的步驟1.2和步驟1.3，結(jié)果見圖9。
[0089]1.2HRE啟動子替換病毒ElB啟動子[0090]1.2.1構(gòu)建ElB基因啟動子缺失突變的片段:以人5型腺病毒穿梭質(zhì)粒pXCl為模板，用重疊延伸PCR構(gòu)建出ElB基因啟動子缺失突變的片段，并將其連在pMD-18T simple載體上，構(gòu)建出pMD-mElB。步驟如下:用引物末端帶有Xba I酶切位點的ElBfl正向引物(5’ -ATCACCTGTGTCTAGAGAATGCA-3?)和末端帶有 Not I 酶切位點的 ElBrl 反向引物(5’-ATCGATGGACTAGTCCTAGCGGCCGCCAAGTTAAACATTATCTCACCCTTT-3’ )擴增 ElA 啟動子上游的部分片段336bp。用引物末端帶有Spe I和Cla I酶切位點的ElBf2正向引物(5，_GCGGCCGCTAGGACTAGTCCATCGATATGGAGGCTTGGGAGTGTTTG-3，)和末端帶有 Kpn I 酶切位點的 ElBr2 反向引物(5，-GGCCGGTACCAGAAAATCCAGCAGGTA-3，)擴增ElB啟動子下游的部分片段383bp。其余操作過程同本發(fā)明實施例3中的步驟1.1.1，最終得到約693bp左右ElB基因啟動子缺失突變的片段，結(jié)果見圖10。
[0091]1.2.2將HRE啟動子克隆至ElB基因啟動子缺失突變的片段:將含有化學合成的HRE啟動子片段(NCBI登錄號為NC_000006.12)的pUC57_HRE和pMD_mElB載體用Cla I和Spe I同步雙酶切，37°C反應(yīng)2小時。將酶切產(chǎn)物全部加樣進行I %瓊脂糖凝膠電泳，PUC57-HRE載體雙酶切后在240bp處出現(xiàn)目的條帶，pMD-mElB雙酶切后在3.3kb處出現(xiàn)目的條帶。將目的條帶分別進行切膠純化后連接，構(gòu)建出含有HRE啟動子的pMD-mElB-HRE。連接體系為:pMD-mElB / Cla I / Spe I與HRE / Cla I / Spe I按摩爾比1: 5進行連接，連接總體積為10μ 1，16°C反應(yīng)4小時。具體操作過程同本發(fā)明實施例2中的步驟1.2和步驟1.3。
[0092]1.2.3用含有HRE啟動子的ElB片段替換pXCl-hTERT中的原片段:將pMD-mEIB-HRE和pXCl-hTERT用KpnI和Xba I同步雙酶切，37°C反應(yīng)2小時。將酶切產(chǎn)物全部加樣進行I %瓊脂糖凝膠電泳，pMD-mEIB-HRE載體雙酶切后在900bp處出現(xiàn)目的條帶，pXCl-hTERT雙酶切后在9.5kb處出現(xiàn)目的條帶。將目的條帶分別進行切膠純化后連接，構(gòu)建出同時含有hTERT啟 動子和HRE啟動子的pXC2P重組質(zhì)粒。連接體系為:PXCl_hTERT /Kpn I / Xba I與ElB-HRE / Kpn I / Xba I摩爾比按1: 7進行連接，連接總體積為10 μ 1，16°C反應(yīng)4小時。具體操作過程同本發(fā)明實施例2中的步驟1.2和步驟1.3，結(jié)果見圖11。
[0093]2、腫瘤特異性腺病毒骨架質(zhì)粒PBHGE3-F5 / 35的構(gòu)建
[0094]2.1F5部分纖毛片段的克隆:用限制性內(nèi)切酶Spe I和Cla I同步雙酶切pBHGE3 (購自Microbix Biosystems Ins公司)和前期構(gòu)建好的含有Spe I和Cla I單克隆位點的pMD-mEIB，37°C反應(yīng)2小時。將酶切產(chǎn)物全部加樣進行I %瓊脂糖凝膠電泳，PBHGE3載體雙酶切后在9.4kb處出現(xiàn)含有部分人5型腺病毒纖毛蛋白基因片段的目的條帶，pMD-mEIB雙酶切后在3.3kb處出現(xiàn)目的條帶。將目的條帶分別進行切膠純化后連接，構(gòu)建出含有部分人5型腺病毒纖毛蛋白基因片段的pMD-F5重組質(zhì)粒。連接體系為:pMD-mE IB / Spe I / Cla I與F5 / Spe I / ClaI按摩爾比1: 5進行連接，連接總體積為10 μ 1，16°C反應(yīng)4小時。具體操作過程同本發(fā)明實施例2中的步驟1.2和步驟1.3。
[0095]2.2F5 / 35嵌合纖毛片段的構(gòu)建:用限制性內(nèi)切酶Age 1-HF和Sbf1-HF同步雙酶切pMD-F5和含有化學合成的人5型和35型腺病毒嵌合型纖毛片段(NCBI登錄號分別為AC_000008和AC_000019.1)的pUC57_F5 / 35，37°C反應(yīng)I小時。將酶切產(chǎn)物全部加樣進行1%瓊脂糖凝膠電泳，PUC57-F5 / 35載體雙酶切后在1.4kb處出現(xiàn)含有人5型和35型腺病毒嵌合型纖毛片段的目的條帶，PMD-F5雙酶切后在10.6kb處出現(xiàn)目的條帶。將目的條帶分別進行切膠純化后連接，構(gòu)建出含有人5型和35型腺病毒嵌合型纖毛片段的PMD-F5 /35 重組質(zhì)粒。連接體系為:pMD-F5 / Age 1-HF / Sbf 1-HF 與 F5 / 35 / Age 1-HF / Sbf
1-HF按摩爾比1: 5進行連接，連接總體積為10 μ 1，16°C反應(yīng)4小時。具體操作過程同本發(fā)明實施例2中的步驟1.2和步驟1.3。
[0096]2.3F5 / 35嵌合纖毛片段替換pBHGE3中的原片段:用限制性內(nèi)切酶Spe I和ClaI同步雙酶切PMD-F5 / 35和pBHGE3，37°C反應(yīng)2小時。將酶切產(chǎn)物全部加樣進行I %瓊脂糖凝膠電泳，PMD-F5 / 35載體雙酶切后在8.6kb處出現(xiàn)含有人5型和35型腺病毒嵌合型纖毛片段的目的條帶，PBHGE3雙酶切后在28kb處出現(xiàn)目的條帶。將目的條帶分別進行切膠純化后連接，構(gòu)建出含有人5型和35型嵌合型腺病毒纖毛基因片段的pBHGE3-F5 / 35重組腺病毒骨架質(zhì)粒。連接體系為:pBHGE3 / Spe I / Cla I與F5 / 35 / Spe I / Cla I按摩爾比1: 7進行連接，連接總體積為10μ1，16?反應(yīng)4小時。具體操作過程同本發(fā)明實施例2中的步驟1.2和步驟1.3，結(jié)果見圖12。
[0097]3、p21ras單鏈抗體基因及GFP基因的克隆
[0098]用限制性內(nèi)切酶Spe I和Not I同步雙酶切pXC2P和含有化學合成的p21ras單鏈抗體基因及GFP基因等一系列操作元件的pUC57-ScFv，37°C反應(yīng)2小時。將酶切產(chǎn)物全部加樣進行I %瓊脂糖凝膠電泳，pUC57-ScFv載體雙酶切后在3kb處出現(xiàn)含有p21ras單鏈抗體基因及GFP基因等操作元件片段的目的條帶，pXC2P雙酶切后在10.3kb處出現(xiàn)目的條帶。將目的條帶分別進行切膠純化后連接，構(gòu)建出含有p21ras單鏈抗體基因及GFP基因等一系列操作元件的pXC2P-ScFv重組腺病毒穿梭質(zhì)粒。連接體系為:pXC2P / Spe I / NotI與ScFv / Spe I / Not I摩爾比按1: 5進行連接，連接總體積為10 μ 1，16°C反應(yīng)4小時。具體操作過程 同本發(fā)明實施例2中的步驟1.2和步驟1.3，結(jié)果見圖13。
[0099]4、腫瘤特異性腺病毒的制備及純化
[0100]4.1腫瘤特異性腺病毒的制備:將腺病毒穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒通過Lipofectamine2000(購自QIAGEN公司)共轉(zhuǎn)染至HEK293細胞，利用同源重組和293細胞本身所表達出的El區(qū)蛋白獲得完整的病毒。具體轉(zhuǎn)染步驟參見QIAGEN Effectene細胞轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。轉(zhuǎn)染分組情況如下:(I)原始腺病毒穿梭質(zhì)粒PXCl+野生型骨架質(zhì)粒PBHGE3，最終獲得野生型腺病毒W(wǎng)tAd5 ； (2)原始腺病毒穿梭質(zhì)粒pXCl+嵌合型骨架質(zhì)粒PBHGE3-F5 / 35，最終獲得嵌合型纖毛腺病毒Ad5F5 / 35 ； (3)重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pXC2P+野生型骨架質(zhì)粒PBHGE3，最終獲得腫瘤特異性腺病毒KGHV200 ； (4)攜帶有p21ras單鏈抗體基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒PXC2P-ScFv+野生型骨架質(zhì)粒PBHGE3，最終獲得腫瘤特異性腺病毒KGHV300 ; (5)重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pXC2P+嵌合型骨架質(zhì)粒pBHGE3-F5 / 35，最終獲得腫瘤特異性腺病毒KGHV400 ； (6)攜帶有p21ras單鏈抗體基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pXC2P-ScFv+嵌合型骨架質(zhì)粒pBHGE3-F5 / 35，最終獲得攜帶有p2 Iras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒KGHV500。
[0101]4.2腫瘤特異性腺病毒的純化:當293細胞出現(xiàn)明顯CPE現(xiàn)象，并有50%以上的細胞脫落時，lOOOrpm，離心5min，棄掉80 %的上清液，用剩余上清重懸細胞沉淀，于_80°C和37°C反復(fù)凍融3次，再次離心后收集病毒上清液。用適量的病毒上清液再次感染293細胞，反復(fù)多次進行病毒的傳代擴增，隨病毒的富集，遞次減少病毒感染量。將收集的病毒液，用腺病毒純化試劑盒(購自CELL B10LABS公司)回收重組腺病毒。由于試劑盒純化腺病毒滴度過低，無法滿足下一步實驗要求，所以通過雙重氯化銫密度梯度離心法純化濃縮重組腺病毒。先用不連續(xù)密度梯度離心將細胞污染物和一些缺陷性病毒顆粒去除，然后用連續(xù)密度梯度離心將感染性病毒顆粒和缺陷性病毒顆粒完全分開。最后用透析法去除純化病毒液中的氯化銫，最終所得腺病毒滿足進一步實驗的要求。
[0102]4.3腫瘤特異性腺病毒滴度測定:病毒滴度測定采用TCID50法，步驟如下:用高糖DMEMlO % FBS準備IOml約IO5個/ ml的293細胞懸液，使用移液器在96孔板中每孔分配100 μ I (約IO4個細胞)進行培養(yǎng)。在10個無菌1.5ml離心管中分別加入0.9ml高糖DMEMlO % FBS，然后向I號管中加入0.1ml病毒原液，上下吹打混勻，稀釋后更換槍頭，再取
0.1mllO-1稀釋液并轉(zhuǎn)移至2號管，依次10倍倍比稀釋至第10個最高稀釋度。上述配液和稀釋度可以根據(jù)接種量和估計的病毒滴度大概范圍自行調(diào)整。取出細胞培養(yǎng)板，用移液器吸去96孔板中的培養(yǎng)液，然后用稀釋的病毒液依次感染96孔板1-10列，每孔0.1ml，每列設(shè)置10個復(fù)孔。在11、12兩列各孔加0.1ml高糖DMEMlO% FBS做陰性對照。蓋好96孔板并在37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10天。10天后用熒光顯微鏡觀察各孔，計數(shù)每列出現(xiàn)CPE的孔數(shù)。即使僅有小塊或一些細胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，該孔也計為陽性。如果存在CPE與死細胞難以判斷，可與陰性對照做比較。確定每列出現(xiàn)陽性孔的百分率。如果陰性對照沒有顯示任何CPE現(xiàn)象并且細胞生長正常，同時最高稀釋液表現(xiàn)100%感染(10 / 10)而最低稀釋液表現(xiàn)100%陰性(O / 10)，則測試有效。病毒滴度計算公式:對于0.1!111樣品，滴度了=101+<1(3_°_5)。d =1glO的稀釋度=1(對于10倍的稀釋度而言)；s=陽性比率之和(從第一個10倍稀釋度算起)將 TCID50 / ml 轉(zhuǎn)換為 pfu / ml ；T=aX10b TCID50 / ml = aX10M.7pfu / ml。注意:兩次重復(fù)試驗得到的滴度值應(yīng)相差< 10°_7，即< 0.7個loglO。
[0103]實施例4:腫瘤特異性腺病毒KGHV500的抑瘤實驗
[0104]1、腫瘤特異性腺病毒KGHV500在正常及腫瘤細胞中的復(fù)制能力分析
[0105]細胞接種6孔板，當細胞長至70%左右時，取IO5的正常細胞或腫瘤細胞鋪于6孔板培養(yǎng) 24 小時后，加入 5M0I 的病毒 `WtAd5、Ad5F5 / 35、KGHV200、KGHV400、KGHV500 和等量的PBS緩沖液作為陰性對照分別感染乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7和正常人乳腺細胞株MCF-10A、正常人胚肺成纖維細胞株MRC-5。感染8小時后，棄培養(yǎng)液用PBS洗兩次，加入新培養(yǎng)液，48小時后收集病毒感染液，在_20°C和37°C反復(fù)凍融三次以釋放病毒。離心去上清檢測病毒滴度，具體方法同實施例3中的步驟4.3。
[0106]由結(jié)果可見，WtAd5和Ad5F5 / 35無論是在腫瘤細胞還是正常細胞中都可以正常復(fù)制，且兩者在不同細胞株中的復(fù)制能力相當，沒有選擇性。而KGHV200、KGHV400和KGHV500在腫瘤細胞中均可以正常復(fù)制，且復(fù)制能力大致相同；但在正常細胞中，KGHV200、KGHV400和KGHV500的復(fù)制能力顯著降低，顯示出了其在腫瘤細胞中選擇性復(fù)制的靶向性。結(jié)果見圖14。
[0107]2、腫瘤特異性腺病毒KGHV500對CIK細胞的吸附實驗
[0108]收集懸浮培養(yǎng)14至21天的CIK細胞于15ml離心管中，以轉(zhuǎn)速1000rpm離心3分鐘，棄上清收集細胞沉淀，用Iml不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液懸浮。以100M0I將病毒KGHV200、KGHV300、KGHV400、KGHV500和等量的PBS緩沖液作為陰性對照分別加入懸浮于無血清培養(yǎng)液的CIK細胞中，置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6小時，每種病毒吸附實驗做3個平行。為去除未吸附于細胞表面的病毒，對37°C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育6小時后的CIK細胞用PBS洗滌兩次。加入一定量的含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液懸浮細胞，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時。48小時后用流式細胞儀檢測表達GFP細胞的比例。結(jié)果顯示病毒KGHV200和KGHV300對CIK細胞的吸附能力較弱，而含有F5 / 35嵌合型腺病毒纖毛蛋白的病毒KGHV400和KGHV500比KGHV200和KGHV300對CIK細胞具有更強的吸附能力，結(jié)果見圖15。
[0109]3、腫瘤特異性腺病毒KGHV500攜帶的單鏈抗體基因在腫瘤細胞中的表達能力分析
[0110]細胞接種6孔板，當細胞長至60%左右時，取IO5的腫瘤細胞鋪于6孔板培養(yǎng)24小時后，加入10M0I的病毒KGHV500感染乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7，感染8小時后，棄培養(yǎng)液用PBS洗兩次，加入新鮮培養(yǎng)液，72小時后收集病毒感染液中的所有細胞，使用Trizol法提取細胞總RNA。使用購自Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，具體步驟參見說明書操作。用反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行熒光定量PCR，從而確定p21ras 單鏈抗體基因的表達情況。引物 p21rasRTf:TTAGTGATGGTGGTAGTTAC ；p21rasRTr:CTCTTAGTGTCGTCTCTG ;選擇 GAPDH 作為內(nèi)參基因，引物 GAPDHRTf:TGACAACAGCCTCAAGAT ；GAPDHRTr:GAGTCCTTCCACGATACC。從熒光定量PCR的曲線可以看出感染了病毒KGHV500的三株腫瘤細胞中均有p21ras單鏈抗體基因的表達，曲線1_3分別為MDA-MB_231、MDA-MB_435、MCF-7細胞株內(nèi)參基因GAPDH的表達曲線，曲線4_5分別為MDA-MB-231、MDA_MB_435、MCF_7細胞內(nèi)p21ras單鏈抗體基因的表達曲線，結(jié)果見圖16。
[0111]4、腫瘤特異性腺病毒KGHV500的體外抑瘤實驗
[0112]用20M0I的病毒KGHV400、KGHV500分別加于CIK細胞或PBS緩沖液中共同孵育6小時，PBS洗滌后繼續(xù)培養(yǎng)。24小時后將預(yù)感染病毒的CIK細胞按效靶比2.5: I或等體積有病毒顆粒的PBS緩沖液加入到鋪有IX IO4個處于對數(shù)生長期的乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7和正常人乳腺細胞株MCF-10A、正常人胚肺成纖維細胞株MRC-5的96孔板中，未加病毒的CIK細胞作為對照組，每個條件設(shè)3個平行孔。培養(yǎng)72小時后加入20 μ I MTT溶液繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入150 μ I的DMS0，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標`儀于490nm處檢測吸光值，計算出殺傷效率。
[0113]結(jié)果表明，各實驗組對正常人乳腺細胞株MCF-10A和正常人胚肺成纖維細胞株MRC-5的毒性很小。CIK細胞、KGHV400和KGHV500對乳腺癌細胞均有一定的殺傷作用。而CIK+KGHV500對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7的殺傷能力顯著提高，說明病毒通過吸附于CIK細胞被成功帶入到靶細胞中，在CIK細胞和病毒的雙重殺傷作用下，腫瘤細胞殺傷率有非常顯著的提升。而病毒攜帶的單鏈抗體基因所表達的P21ras單鏈抗體，阻斷了 p21ras蛋白的信號轉(zhuǎn)導，抑制了腫瘤的生長，使得腫瘤殺傷效率進一步提升，結(jié)果見圖17。
[0114]殺傷率)= [A(靶)+A(效)-A(效 + 靶)]/A靶 X100%
[0115]5、腫瘤特異性腺病毒KGHV500的體內(nèi)抑制裸鼠移植瘤實驗
[0116]5.1裸鼠腫瘤模型的建立:實驗細胞MDA-MB-231和MCF-7生長良好、匯合度達到80%時，使用胰蛋白酶消化，離心收集細胞，PBS緩沖液洗滌細胞后將細胞密度調(diào)整成IO7個細胞/ 200 μ 1，作為單次注射用量。將制備好的細胞注射接種于SPF級4周齡雌性Balb /c裸鼠，每種腫瘤細胞接種20只，觀察裸鼠成瘤后腫瘤特異性病毒KGHV500對體內(nèi)腫瘤生長的抑制情況。[0117]5.2腫瘤特異性腺病毒對腫瘤生長的體內(nèi)抑制實驗:對成瘤后的裸鼠進行分組注射治療，具體分組情況為(I)PBS對照組；(2) CIK細胞；(3)KGHV400 ； (4)KGHV500 ； (5)預(yù)感染KGHV400的CIK細胞；(6)預(yù)感染KGHV500的CIK細胞。當瘤體平均直徑達到0.5cm時，按上述分組進行瘤內(nèi)多點注射治療，每3天注射I次，共注射7次。注射后對裸鼠進行觀察，每隔一天稱量裸鼠體重，并測量裸鼠瘤體長、短徑，計算瘤體體積，繪制腫瘤生長曲線。分析各分組裸鼠移植瘤的生長情況。結(jié)果顯示在成瘤裸鼠中，實驗組腫瘤生長速度明顯減慢，特別是注射有CIK+KGHV500的實驗組。說明瘤內(nèi)注射的預(yù)感染KGHV500的CIK細胞組能夠顯著抑制腫瘤的生長，相比其它組具有更好的抑制腫瘤效果，且與對照組相比具有統(tǒng)計學意義(Ρ〈0.05)，結(jié)果見圖18、19。
[0118]瘤體體積 =I / 2長徑X短徑2。
【權(quán)利要求】
1.攜帶p21ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒載體，其特征在于:腫瘤特異性腺病毒載體中插入的p21ras單鏈抗體基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.權(quán)利要求1所述攜帶p21ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒載體在制備靶向殺傷腫瘤細胞藥物制劑中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述攜帶p21ras單鏈抗體基因的腫瘤特異性腺病毒載體在制備靶向殺傷腫瘤細胞藥物 制劑中的應(yīng)用，其特征在于:腫瘤細胞是乳腺腫瘤細胞。
【文檔編號】A61K39/395GK103882057SQ201410069543
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】楊舉倫, 李靜, 姜英翰, 劉秀娟, 馮強 申請人:成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院