專利名稱：一組伊貝母中的甾體皂苷類化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從伊貝母中分離得到的有效成分，特別是涉及伊貝母中的具有降壓、 抗膽堿、抗炎、抗腫瘤、解痙，平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰和抗菌作用新的留體皂苷類化合物。
背景技術(shù)：
貝母屬是百合科的一種Fritillaria，包括多種重要的藥用植物，其藥用部位多為其地下鱗莖，貝母具有清熱潤(rùn)肺，止咳祛痰的功效，據(jù)記載該屬約有130種。在我國(guó)其種類主要包括川貝母、浙貝母、伊貝母等。貝母中的化學(xué)成分現(xiàn)代研究主要集中在其生物堿類成分，貝母中的生物堿類成分主要包括，留體類生物堿和異留體類生物堿，這類成分是貝母降壓，鎮(zhèn)咳，解痙，平喘，抗膽堿和抗炎作用的主要藥用物質(zhì)基礎(chǔ)；但是隨著對(duì)貝母化學(xué)成分和藥理活性的研究的深入，發(fā)現(xiàn)貝母中還含有大量的多種類的皂苷類成分，而且這類成分的鎮(zhèn)咳和抗炎作用也是很強(qiáng)的。這就為貝母藥理活性的研究注入了新的思路。貝母的十八反研究也是中藥現(xiàn)代化的要求所在，近年來(lái)人們對(duì)十八反的作用機(jī)制的研究正在不斷的深入。百合科貝母屬Fritillaria包括多種重要的藥用植物，其藥用部位多為其地下鱗莖，貝母具有清熱潤(rùn)肺，止咳祛痰的功效，據(jù)記載該屬約有130種，廣泛分布于北半球的歐、 亞及北美洲的溫帶地區(qū)，尤以地中海北岸、伊朗、土耳其等地區(qū)分布的種類最為豐富[1]。在我國(guó)其種類主要包括川貝母、浙貝母、伊貝母等。川貝母，歷版《中國(guó)藥典》收載川貝母為百合科植物川貝母、暗紫貝母、甘肅或棱砂貝母的干燥鱗莖。川貝母生長(zhǎng)于海拔3000-4000m 的山坡草叢或陰濕的小灌木叢中，主產(chǎn)于四川甘孜州、阿壩州及與青海、甘肅、西藏交界的地區(qū)。傳統(tǒng)上將川貝按鱗莖大小和植物來(lái)源分為松貝、青貝、爐貝。松貝和青貝主要來(lái)源于川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母，爐貝主要來(lái)源于棱砂貝母[2]。性味歸經(jīng)川貝母苦、甘，微寒。 歸肺、心經(jīng)。功能主治本品味苦，性微寒，歸肺經(jīng)，具有清熱化痰止咳之功，可用于治療痰熱咳喘，咯痰黃稠之證；又兼甘味，故善潤(rùn)肺止咳，治療肺有燥熱之咳嗽痰少而粘之證，及陰虛燥咳勞嗽等虛證；還有散結(jié)開(kāi)郁之功，治療痰熱互結(jié)所致的胸悶心煩之證，及瘰疬痰核等病；浙貝母系百合科貝母屬植物浙貝母的干燥鱗莖。中醫(yī)認(rèn)為其苦、寒，歸肺、心經(jīng)，具有清熱散結(jié)、化痰止咳功能，主治風(fēng)熱犯肺、痰火咳嗽、肺癰、乳癰、瘰癧和瘡毒 ]。伊貝母包括 伊犁貝母、費(fèi)爾干貝母、灘貝母等幾個(gè)品種，統(tǒng)稱為新疆貝母，是一種與川貝.浙貝齊名的貴重中藥材，生于海拔1300-1780m的林下或陽(yáng)坡草地。主產(chǎn)新疆。伊犁貝母鱗莖圓錐形， 較大。表面稍粗糙，淡黃白色，外層鱗葉心臟形，肥厚，大小懸殊而緊密抱合。頂端稍尖，少有開(kāi)裂，基部微凹陷。質(zhì)稍松脆，斷面白色，粉性。氣微，味微苦。具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳功效M。還有一種是土貝母，與以上不同的是它是是葫蘆科多年生攀援植物假貝母的塊莖，主產(chǎn)于河北、陜西、山西等地土貝母性涼而味苦，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、消癰排膿等功效。對(duì)貝母的化學(xué)成分研究主要集中在它的生物堿類成分。貝母中非生物堿成分的文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)較少。目前已發(fā)現(xiàn)貝母中主要有效成分為異留體生物堿與留體生物堿。到目前為止已經(jīng)分離并確定結(jié)構(gòu)的有100余個(gè)化合物，其中異留體生物堿占86%，膽留衍生物次之M。貝母化學(xué)成分的研究報(bào)道始見(jiàn)于1888年，F(xiàn)rganer首先從德旺貝母中分離到蒂貝靈[6]。從此，植物化學(xué)工作者就以貝母的堿性成分為對(duì)象對(duì)許多種貝母進(jìn)行了研究，到 20世紀(jì)50年代中期取得較大進(jìn)展，朱子清教授等用硒脫氫降解的方法確定了貝母異街生物堿的骨架溝通了貝母生物堿與黎蘆生物堿的關(guān)系生物堿類成分[6]伊貝母中主要主要包括D，E環(huán)雙氫順式的西貝素和新留體生物堿一新貝甲素等，其中D，E環(huán)雙氫順式西貝素屬西藜蘆堿類(cevine groups)等。例如貝母辛(peimissine)，西貝素(Sipeimine)，新貝素甲，西貝素氮氧化物(ImperialineNoxide)，西貝素苷，伊貝辛(yibeissine)，伊貝堿苷 B (yibeinoside B)，伊貝堿苷 E (yibeinoside E)，Ν-Γ，4，-羥基 _1，，2，，3，，4，-四氫化奈基)-丙基-N-二苯基甲基-N-3，3-二甲基丁胺等等[7]；川貝母的主要成分為異留體類生物堿和生物堿。川貝生物堿成分有川貝堿、西貝素。青貝中有青貝堿，白爐貝中有白爐貝素， 黃爐貝中有爐貝堿。白松貝中有松貝堿，甘肅貝母中有岷貝堿，棱砂貝母中有新貝甲素、西貝素、貝母辛、瓊貝酮、代拉文酮、代拉夫林，暗紫貝母中有松貝辛，瓦布貝母中有西貝素、貝母辛、鄂貝乙素異浙貝甲素、西貝素等[2]。浙貝母的主要成分為浙貝甲素、浙貝乙素、異浙貝甲素、貝母辛、寧貝辛等。土貝母的化學(xué)成分主要包括皂苷，脂肪酸，糖類及其苷類成分和三萜類成分。非生物堿類成分對(duì)貝母屬植物化學(xué)成分的研究主要集中在生物堿上，而對(duì)非生物堿成分的研究最早始于1944年，吳榮熙首先從浙貝母.鱗莖中分離到一種含輕基的化合物。迄今從貝母屬植物分到的非生物堿有約40種，其中大多數(shù)都是低極性部分化學(xué)成分，主要是萜類、留體、脂肪酸、糖，嘌呤、嘧啶等類化合物，其中萜類化合物在貝母屬植物中分布最為廣泛。大極性化合物也有分離，主要包括核苷類成分、留體皂苷類成分以及糖類成分等。劉洪寧等[8]，在彭澤貝母中分離得到6個(gè)對(duì)映一貝殼杉類二萜化合物 ent-kauran-15-en-17-ol ；ent_kauran一15一en_3α，17一diol ；等β 貝新，ent-kauran-16 α， 17-diol ；ent-kauran-3,16 α ,17-triol ；ent-16,17-epoxy-kauran-3 α -ol ；曹新偉等 [9]從川貝母中分離的到8個(gè)核苷類成分尿嘧啶(uracil)，胞嘧啶(cytosine)，腺苷 (adenosine)，尿苷(uridine)，肌苷(carnine)，鳥(niǎo)苷(guanosine)，禾口胸苷(thymine)；張久亮等[κι]在湖北貝母的莖葉中分離的到，三種長(zhǎng)鏈脂肪酸類化合物，β-谷留醇和β-胡蘿卜苷；貝母水溶性成分還包括各種氨基酸。結(jié)合現(xiàn)代研究表明貝母總皂苷具有很強(qiáng)的祛痰作用；李萍等對(duì)11種商品貝母暗紫貝母，甘肅貝母，浙貝母，棱砂貝母，伊貝母，平貝母，湖北貝母等，總皂苷部分進(jìn)行了鎮(zhèn)咳祛痰的活性篩選，進(jìn)行氨水引咳試驗(yàn)和酚紅排出試驗(yàn)，結(jié)果表明總生物堿部分具有明顯的祛痰作用?，F(xiàn)代抗癌機(jī)制研究表明皂苷類成分已被體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)有著良好的抗活性氧自由基活性，即又良好的抗促抗癌活性；而且研究表明皂苷可以通過(guò)抑制TPA誘導(dǎo)的32Pi結(jié)合于HeLa細(xì)胞的磷脂中發(fā)揮抗促癌作用β3]。因此我將對(duì)貝母總皂苷進(jìn)行系統(tǒng)的分離，鑒定所得到的單體化合物，并對(duì)單體化合物進(jìn)行抗癌活性以及其他活性的篩選，為尋找到新的抗癌藥物奠定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。但是，對(duì)貝母非生物堿類成分的化學(xué)研究仍存在很多問(wèn)題，沒(méi)有找到非生物堿類成分發(fā)揮降壓、抗膽堿、抗炎、抗腫瘤、解痙，平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰和抗菌作用的有效成分。我們通過(guò)對(duì)伊貝母進(jìn)行系統(tǒng)、現(xiàn)代、科學(xué)的分離技術(shù)，得到了 9種留體皂苷類新化合物，其藥效活性強(qiáng)，說(shuō)明其為貝母的主要有效成分，有望用于降壓、抗膽堿、抗炎、抗腫瘤、解痙，平喘、 鎮(zhèn)咳、祛痰和抗菌的藥物。以上成分，利用HPLC-MS分析證明，在各種貝母屬植物中也不同含量的含有，也是貝母屬植物的有效成分。通過(guò)單獨(dú)使用或加入各種制劑輔料(各種固體制劑、液體制劑、凝膠制劑、緩控釋制劑等)，或與其他中藥配伍，從而實(shí)現(xiàn)了其在藥物、功能食品、保健品和食品中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
1、本發(fā)明的目的提供一類從伊貝母中經(jīng)過(guò)提取分離得到的化合物，其結(jié)構(gòu)特征如表1所示表1伊貝母中的9個(gè)新的留體皂苷類化合物及其鑒定方法
權(quán)利要求
1. 一組伊貝母中的留體皂苷類化合物，其結(jié)構(gòu)特征下
2.權(quán)利要求1的化合物，是從浙貝母、川貝母、伊貝母、湖北貝母、平貝母或安徽貝母藥材基原的貝母屬植物中提取的。
3.權(quán)利要求1的化合物在制備具有平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰、解痙，抗菌、抗膽堿、降壓等改善心腦血管、神經(jīng)退行性疾病、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗過(guò)敏反應(yīng)、抗變態(tài)反應(yīng)、風(fēng)熱感冒、頭暈、抗肝纖維化、抗腫瘤、保護(hù)肝損傷、調(diào)血脂、降血糖、免疫增強(qiáng)、抗氧化作用、抗衰老作用的藥物中的應(yīng)用。
4.含有權(quán)利要求1的化合物的組合物。
5.權(quán)利要求1的化合物，用于藥品、功能食品和食品的原料。
6.權(quán)利要求1化合物的制備方法，其特征為，經(jīng)過(guò)以下步驟將貝母的干燥鱗莖^g，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇提取三次每次3小時(shí)，溶劑用量為 10，10，8，合并濾液，減壓回收溶劑后得浸膏89. Og,將95%乙醇提取后的藥渣再經(jīng)過(guò)體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇提取提取三次每次3小時(shí)，溶劑用量為10，10，8，合并濾液，減壓回收溶劑后得浸膏98. Og,將所得浸膏加適量2L水分散，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取，每種溶劑均萃取三次，回收溶劑后得到石油醚層浸膏2. 2g、三氯甲烷層 3. 5g、乙酸乙酯層5. lg、正丁醇層26. Og,70%提取物正丁醇萃部分26. Og經(jīng)硅膠吸附柱色譜(拌樣硅膠用量35. Og ；空白硅膠用量150. Og)，以三氯甲烷-甲醇系統(tǒng)QOO 1-1 1)梯度洗脫，每300ml收集一份，得到流份Fr. 1-216，在洗脫至氯仿-甲醇8 1時(shí)得到流份Fr. 108至Fr. 114，經(jīng)薄層分析將其合并為Fr. 108-1142. 6g;在洗脫至氯仿-甲醇5 1時(shí)得到流份Fr. 141至Fr. 145，經(jīng)薄層分析將其合并為Fr. 141-1451. 7g;在洗脫至氯仿-甲醇4 1時(shí)得到流份Fr. 146至 Fr. 169，經(jīng)薄層分析將其合并為Fr. 146-1693. 2g，F(xiàn)r. 108-114經(jīng)ODS開(kāi)放柱，依次用甲醇-水1 9，3 7,5 5,7 3,9 1洗脫， 每個(gè)梯度，洗脫溶劑用量為500ml，其中甲醇-水7 3洗脫部分得到浸膏1.2g，將這部分樣品溶于甲醇，上制備型HPLC，以75 %甲醇-水溶劑做為流動(dòng)相，進(jìn)行制備，得到化合物 318. 2mg，保留時(shí)間72. 5min,Fr. 141-145 經(jīng)ODS 開(kāi)放柱，依次用甲醇-水 1 9，3 7，5 5，6 4，7 3，9 1 洗脫，每個(gè)梯度，洗脫溶劑用量為500ml，，其中甲醇-水6 4洗脫部分得到浸膏0.7g，將這部分樣品溶于甲醇，上制備型HPLC，以69. 5%甲醇-水溶劑做為流動(dòng)相，進(jìn)行制備，減壓回收溶劑得到化合物229. %ig，保留時(shí)間11. 2min,Fr. 146-169 經(jīng) ODS 開(kāi)放柱，依次用甲醇-水 1 9，3 7，5 5，6 4，7 3，9 1 洗脫，每個(gè)梯度，洗脫溶劑用量為700ml，其中甲醇-水6 4洗脫部分得到浸膏1.8g，將這部分樣品溶于甲醇，上HPLC制備，以30%乙腈-水溶劑做為流動(dòng)相，進(jìn)行制備，減壓回收溶劑得到化合物945. lmg，保留時(shí)間4. 3min, ODS開(kāi)放柱，甲醇-水5 5洗脫部分得到浸膏 1. 3g，將這部分樣品溶于甲醇，上制備型HPLC，以57. 5%甲醇-水溶劑做為流動(dòng)相，對(duì)樣品進(jìn)行分離，由于這部分樣品成分較為復(fù)雜；因此，接峰情況是按照如下條件0-8min收集一份，回收溶劑得到AO. 5g,8-20min收集一份得，回收溶劑得到B 0. 3g,20-32min收集一份， 回收溶劑得到C 0. 05g, 32-37min收集一份，回收溶劑得到D 0. lg, 37-55min收集一份，回收溶劑得到E 0. 08g, 55-75min收集一份，回收溶劑得到F0. Ig,將B溶于甲醇，上HPLC制備，以50%甲醇-水溶劑做為流動(dòng)相，進(jìn)行制備，減壓回收溶劑得到化合物512. Omg，保留時(shí)間43. 7min,化合物66. Omg,保留時(shí)間40. 7min,將C溶于甲醇，上HPLC制備(儀器及參數(shù)設(shè)置同上述安捷倫液相，以53. 5%甲醇-水溶劑做為流動(dòng)相，進(jìn)行制備，減壓回收溶劑得到化合物710. lmg，保留時(shí)間15. 3min)，將D溶于甲醇，上制備型HPLC,以57%甲醇-水溶劑做為流動(dòng)相，進(jìn)行制備，減壓回收溶劑得到化合物125. %ig，保留時(shí)間17. 2min，化合物 814. Omg,保留時(shí)間36. 5min,將F溶于甲醇，上HPLC制備，以55%甲醇-水溶劑做為流動(dòng)相，進(jìn)行制備，減壓回收溶劑得到化合物48. Omg，保留時(shí)間24. 7min。
7.權(quán)利要求1的化合物的檢測(cè)方法，其特征在于，方法如下分析方法=HPLC分析，以質(zhì)譜(MS)檢測(cè)、紫外(UV)檢測(cè)、圓二色譜(CD)檢測(cè)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等為檢測(cè)器，對(duì)照品溶液的配置權(quán)利要求1中留體皂苷類化合物化學(xué)對(duì)照品精密稱取適量，用甲醇配制成適量的對(duì)照品溶液，樣品溶液的配置精密稱取伊貝母藥材樣品(或者含有貝母藥材的藥品、食品等)各適量，用IOOml甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)溶解，經(jīng)裝填ODS的SPE小色譜柱預(yù)處理，甲醇(或乙腈、 乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)洗滌，合并洗脫液，甲醇溶解，定容，過(guò)濾，即得， 色譜流動(dòng)相條件1)乙腈-水梯度洗脫2)甲醇-水梯度洗脫色譜柱十八烷基鍵合硅膠柱測(cè)試方法進(jìn)行HPLC分析，以質(zhì)譜(MS)檢測(cè)、紫外(UV)檢測(cè)、圓二色譜(CD)檢測(cè)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等為檢測(cè)器，以樣品中各化合物的色譜峰面積，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品相應(yīng)色譜峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法或外標(biāo)1點(diǎn)法、外標(biāo)2點(diǎn)法，進(jìn)行定量分析，計(jì)算，即得。
8.權(quán)利要求1的化合物的檢測(cè)方法，其特征在于，方法如下分析方法HPLC分析，以質(zhì)譜(MS)檢測(cè)、紫外(UV)檢測(cè)、圓二色譜(CD)檢測(cè)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等為檢測(cè)器，對(duì)照品溶液的配置權(quán)利要求1中留體皂苷類化合物化學(xué)對(duì)照品精密稱取適量，用甲醇配制成適量的對(duì)照品溶液，樣品溶液的配置精密稱取伊貝母藥材樣品適量，用IOOml甲醇提取，回收提取液，甲醇溶解，經(jīng)裝填ODS的SPE小色譜柱預(yù)處理，甲醇洗滌，合并洗脫液，甲醇溶解，定容，過(guò)濾， 即得，色譜流動(dòng)相條件1)乙腈-水梯度洗脫，洗脫條件如下表 _
全文摘要
本發(fā)明涉及從中藥伊貝母中提取的一組伊貝母中的甾體皂苷類化合物及其制備工藝和其平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰等醫(yī)藥用途，其組合物可在藥物、功能食品和食品使用，所述化合物是從浙貝母、川貝母、伊貝母、湖北貝母、平貝母或安徽貝母藥材基原的貝母屬植物中提取得到的。
文檔編號(hào)A61P39/06GK102504006SQ20111028722
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月26日
發(fā)明者李國(guó)玉, 沈碩 申請(qǐng)人:李國(guó)玉