專利名稱：一種復(fù)合酶-熱水浸提黃柏生物堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制藥或原料加工領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合酶法提取黃柏生物堿的方法。
背景技術(shù)：
黃柏為蕓香科植物黃皮樹chinense Schneid.的干燥樹皮及蕓香科植物黃薜amurense Rupr.的樹皮。是一種用途廣，用量大的中藥材。黃柏臨床用于濕熱瀉痢、黃疸、帶下、熱淋、腳氣、痿甓、骨蒸勞熱、盜汗、遺精、瘡瘍腫毒、濕疹瘙癢。藥理研究表明，黃柏具有調(diào)整心律、降血壓、抗消化道潰瘍、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)和抗病原微生物等作用。黃柏含小檗堿(berberine)、木蘭花堿(magnoflorine)、黃柏堿(phellodendrine)、掌葉防己堿(palmatine),藥根堿(Jatrorrhizine)等多種生物堿及內(nèi)酯、甾醇、粘液質(zhì)等。黃柏生物堿作為黃柏的主要有效成分，對(duì)其應(yīng)用研究越來(lái)越廣泛。目前，黃柏生物堿的提取方法主要有酸水法、石灰乳法、乙醇法、超聲波提取等，生物堿為黃柏主要有效成分，如小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、掌葉防己堿、藥根堿等，均為季銨生物堿，雖都為水溶性生物堿，采用熱水提法，由于黃柏皮性質(zhì)堅(jiān)韌，溶劑無(wú)法穿透進(jìn)入纖維素內(nèi)部，制劑中提取含量不高；另一方面，黃柏粘液含量7% 8%，粘液通常為具有分支結(jié)構(gòu)的雜多糖，與纖維素等同屬多糖類，黃柏提取物中含粘液質(zhì)制成的中藥膠囊，崩解時(shí)限不合格，現(xiàn)有技術(shù)采用石灰乳祛除黏液質(zhì)，但過(guò)濾的時(shí)間長(zhǎng)，生物堿得率較低，而采用酸堿浸提、半仿生提取等可能會(huì)破壞其活性結(jié)構(gòu)。考慮黃柏中生物堿的狀態(tài)和性質(zhì)，特別是幾種生物堿分解點(diǎn)都特別低，隨著溫度增加，小檗堿轉(zhuǎn)化為小檗紅堿等特性，我們認(rèn)為酶處理可提高藥效成分提取率，有助于保持天然產(chǎn)物構(gòu)象，保持成分原有性質(zhì)，也是仿生化提取中藥有效成分的一種方式，克服傳統(tǒng)高溫煎煮對(duì)活性成分的影響，提取溫度接近人體溫度，水解條件溫和，操作簡(jiǎn)便易行，設(shè)備簡(jiǎn)單。用復(fù)合酶澄清提取黃柏，符合中醫(yī)藥理論，故我們采用復(fù)合酶-熱水浸提黃柏生物堿。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要目的是提供一種簡(jiǎn)單易行，提取分離速度快，成本低，效率高，適于大規(guī)模生產(chǎn)的黃柏生物堿有效部位提取工藝。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一種復(fù)合酶-熱水浸提黃柏生物堿的方法，所述方法是將黃柏藥材用復(fù)合酶酶解，具體步驟如下
(1)將檢驗(yàn)合格的黃柏原生藥飲片粉碎成粗粉，備用；
(2)稱取處方量黃柏粗粉，加15倍重量的水浸潤(rùn)，調(diào)溫度30°C 40°C，pH為3.9
4. 5 ；
(3)另取復(fù)合酶加水10倍重量調(diào)勻，緩緩加入黃柏水浸液中，攪勻，保溫160 200min，過(guò)濾，濾液備用；所述復(fù)合酶為每g黃柏取相當(dāng)于酶活力0. 8 I萬(wàn)U的纖維素酶、I. 5 2.5萬(wàn)U的果膠酶，和0. 3 0. 5萬(wàn)U的半纖維素酶的混合物；
(4)將黃柏藥渣繼續(xù)加10倍重量的水，煎煮lh，過(guò)濾；
(5)將步驟(3)和(4)的濾液合并，滅酶，濃縮至規(guī)定量(相當(dāng)于生藥lg/ml)，即得黃柏生物堿提取物。
如上所述的方法，其中，所述的復(fù)合酶為纖維素酶、果膠酶和半纖維素酶混合物，所述復(fù)合酶較優(yōu)的可以由以下組料組成每g黃柏取相當(dāng)于酶活力0. 8 I萬(wàn)U的纖維素酶，I. 5 2. 5萬(wàn)U的果膠酶，0. 3 0. 5萬(wàn)U的半纖維素酶。如上所述的方法，其中，所述復(fù)合酶的酶活測(cè)定方法纖維素酶在35°C、/ H4條件下，I h分解羧甲基纖維素鈉生成I mg還原糖(以葡萄糖計(jì))所需的酶量為一個(gè)纖維素酶活力單位，即IU ;果膠酶在35°C、/7H4條件下，I h分解果膠生成I m g半乳糖醛酸的酶量為一個(gè)果膠酶活力單位，即IU ;半纖維素酶在35°C/7H4條件下，Ih分解木聚糖產(chǎn)生Img還原糖(以木糖計(jì))的酶量定義為一個(gè)半纖維素酶活力單位，即IU。如上所述的方法，其中，沖值以0. 5%稀硫酸、5%Ca(OH)2水溶液調(diào)節(jié)。可見，本方法包括酶促浸提和滅酶濃縮兩個(gè)階段。第一階段主要作用是酶解細(xì)胞表面纖維、半纖維木質(zhì)結(jié)構(gòu)及粘液物，熱水浸提利于生物堿的分離、溶出；第二階段通過(guò)加熱，既具有滅酶活的作用，同時(shí)又濃縮藥材至規(guī)定量。本發(fā)明對(duì)復(fù)合酶的選取及酶解條件的選擇是一關(guān)鍵，申請(qǐng)人經(jīng)大量的實(shí)驗(yàn)研究，選取了以纖維素酶-果膠酶-半纖維素酶的復(fù)合酶作為澄清劑，加入難濾皮類藥材黃柏的水提工藝中。且篩選出最好的酶解條件為酶解溫度35°C，酶解時(shí)間200min，酸堿度為
3.9，纖維素用量為I萬(wàn)U/g，果膠酶用量為2萬(wàn)U/g，半纖維素酶用量為0.4萬(wàn)U/g。如上所述的方法，其中，所述黃柏藥材為蕓香科植物黃皮樹Yhellodendronchinense Schneid.的干燥樹皮及蕓香科植物黃檗/%< 77o￡/e/ ￡/ro/7 amurense Rupr.的干燥樹皮。發(fā)明人是通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，提出復(fù)合酶-熱水浸提黃柏生物堿的方法。其用復(fù)合酶澄清提取黃柏，符合中醫(yī)藥理論，其考慮到了黃柏中生物堿的狀態(tài)和性質(zhì)，特別是幾種生物堿分解點(diǎn)都特別低，隨著溫度增加，小檗堿轉(zhuǎn)化為小檗紅堿等特性，采用酶處理可提高藥效成分提取率，有助于保持天然產(chǎn)物構(gòu)象，保持成分原有性質(zhì)，也是仿生化提取中藥有效成分的一種方式。另外，克服傳統(tǒng)高溫煎煮對(duì)活性成分的影響，提取溫度接近人體溫度，水解條件溫和，操作簡(jiǎn)便易行，設(shè)備簡(jiǎn)單，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明提供了一種提取制備黃柏生物堿有效部位的新方法，對(duì)難濾皮類中藥黃柏增加一項(xiàng)酶解澄清工藝流程，破壞植物細(xì)胞壁，分解除去黏液等雜質(zhì)，提高了有效成分的溶出率，同時(shí)極大加快藥液濾過(guò)速度，提高藥液澄清度，提高制劑的穩(wěn)定性。本發(fā)明的提取方法采用復(fù)合酶對(duì)原料進(jìn)行酶解處理，對(duì)多種酶進(jìn)行了篩選，并優(yōu)化了酶比例，酶反應(yīng)條件，提取分離速度快，提高了有效成分收率和利用率，本發(fā)明制得的黃柏生物堿提取率較通常不加酶熱水浸提法提高60%以上，技術(shù)含量高，工藝簡(jiǎn)單，成本低，對(duì)環(huán)境友好，產(chǎn)量高，效率高，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。另外，本發(fā)明未使用石灰水等堿化措施，提取液澄清，粘度低，產(chǎn)品雜質(zhì)少，后續(xù)處理方便。


圖I黃柏生物堿對(duì)照品的HPLC圖譜 圖2黃柏生物堿未加酶提取的HPLC圖譜 圖3黃柏生物堿加酶提取的HPLC圖譜
其中5個(gè)色譜峰為代表化合物,2、3、4、6、7號(hào)峰分別為木蘭花堿、黃柏堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :
(I)檢驗(yàn)合格的川黃柏(黃皮樹)原生藥飲片，粉碎成粗粉。(2)稱取處方量黃柏粗粉，加15倍重量的水浸潤(rùn)，調(diào)溫度40°C，以0. 5%稀硫酸、5%Ca (OH) 2 水溶液調(diào)為 4. 5。(3)每g黃柏取相當(dāng)于酶活力0.8萬(wàn)U的纖維素酶、I. 5萬(wàn)U的果膠酶，和0. 3萬(wàn)U的半纖維素酶，加水10倍重量調(diào)勻，緩緩加入步驟(2)得到的黃柏水浸液中，攪勻，保溫 160min。(4)九號(hào)篩過(guò)濾，濾液備用。(5)黃柏藥渣繼續(xù)加10倍重量的水，常規(guī)煎煮lh，九號(hào)篩過(guò)濾。(6)濾液合并，滅酶，濃縮至規(guī)定量(相當(dāng)于生藥lg/ml)，即得提取物。經(jīng)復(fù)合酶處理后，用復(fù)合酶提取的黃柏生物堿比單純水浸提提高了 60%。實(shí)施例2
(I)檢驗(yàn)合格的川黃柏(黃皮樹)原生藥飲片，粉碎成粗粉。(2)稱取處方量黃柏粗粉，加15倍重量的水浸潤(rùn)，調(diào)溫度30°C，以0. 5%稀硫酸、5%Ca (OH) 2 水溶液調(diào)為 4. 2。(3)每g黃柏取相當(dāng)于酶活力0. 9萬(wàn)U的纖維素酶、2. 5萬(wàn)U的果膠酶和0. 5萬(wàn)U的半纖維素酶，加水10倍重量調(diào)勻，緩緩加入黃柏水浸液中，攪勻，保溫180min。(4)九號(hào)篩200目過(guò)濾，濾液備用。(5)黃柏藥渣繼續(xù)加10倍重量的水，常規(guī)煎煮lh，九號(hào)篩200目過(guò)濾。(6)濾液合并，滅酶，濃縮至規(guī)定量(相當(dāng)于生藥lg/ml)，即得提取物。經(jīng)復(fù)合酶處理后，用復(fù)合酶提取的黃柏生物堿比單純水浸提提高了 70%。實(shí)施例3
(I)檢驗(yàn)合格的川黃柏(黃皮樹)原生藥飲片，粉碎成粗粉。(2)稱取處方量黃柏粗粉，加15倍重量的水浸潤(rùn)，調(diào)溫度35°C，以0. 5%稀硫酸、5%Ca (OH) 2 水溶液調(diào)為 3. 9。(3)每g黃柏取相當(dāng)于酶活力I萬(wàn)U的纖維素酶、2萬(wàn)U的果膠酶和0. 4萬(wàn)U的半纖維素酶，加水10倍重量調(diào)勻，緩緩加入黃柏水浸液中，攪勻，保溫200min。(4)九號(hào)篩200目過(guò)濾，濾液備用。(5)黃柏藥渣繼續(xù)加10倍重量的水，常規(guī)煎煮lh，九號(hào)篩200目過(guò)濾。(6)濾液合并，滅酶，濃縮至規(guī)定量(相當(dāng)于生藥lg/ml)，即得提取物。
經(jīng)復(fù)合酶處理后，用復(fù)合酶提取的黃柏生物堿比單純水浸提提高了 90%。上述實(shí)施例中，復(fù)合酶的酶活測(cè)定方法如下纖維素酶在35°C、/7H4條件下，I h分解羧甲基纖維素鈉生成I m g還原糖(以葡萄糖計(jì))所需的酶量為一個(gè)纖維素酶活力單位，即IU ;果膠酶在35°C、/7H4條件下，I h分解果膠生成I m g半乳糖醛酸的酶量為一個(gè)果膠酶活力單位；半纖維素酶在35°C/7H4條件下，Ih分解木聚糖產(chǎn)生Img還原糖(以木糖計(jì))的酶量定義為一個(gè)半纖維素酶活力單位。黃柏生物堿的含量檢測(cè)
分別精密稱取木蘭花堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對(duì)照品，采用高效液相色譜法檢測(cè)。色譜條件
色譜柱菲羅門 Gimini C18 (250X4. 6mm, IlOA)
流動(dòng)相乙腈(A)-0.025mol/L NaH2PO4(含 0.0125 mo I /L的十二烷基硫酸鈉(B)，梯度洗脫，梯度洗脫程序?yàn)?5 (A) /65 (B) 0— 15min, 50 (A) /50 (B) 15 — 35 min ;流速1. Oml/min ;柱溫35°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)ZDonm ;進(jìn)樣量20 U I。 黃柏生物堿對(duì)照品的HPLC圖譜，見圖I。黃柏生物堿未加酶提取的HPLC圖譜，見圖2。黃柏生物堿加酶提取的HPLC圖譜，見圖3。黃柏未加酶提取和加酶提取生物堿結(jié)果，見表I。表I
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合酶-熱水浸提黃柏生物堿的方法，其特征在于，所述方法是將黃柏藥材用復(fù)合酶酶解提取黃柏生物堿，具有包括如下步驟 (1)將檢驗(yàn)合格的黃柏原生藥飲片粉碎成粗粉； (2)稱取黃柏粗粉，加15倍重量的水浸潤(rùn)，調(diào)溫度30°C 40°C，pH為3.9 4. 5 ; (3)另取復(fù)合酶加水10倍重量調(diào)勻，緩緩加入黃柏水浸液中，攪勻，保溫160 200min，過(guò)濾，濾液備用；所述復(fù)合酶為每g黃柏取相當(dāng)于酶活力O. 8 I萬(wàn)U的纖維素酶、I. 5 2.5萬(wàn)U的果膠酶和O. 3 O. 5萬(wàn)U的半纖維素酶的混合物；復(fù)合酶的酶活力測(cè)定方法為纖維素酶在35°C、/7H4條件下，I h分解羧甲基纖維素鈉生成I mg還原糖(以葡萄糖計(jì))所需的酶量為一個(gè)纖維素酶活力單位，即IU ;果膠酶在35°C、/7H4條件下，I h分解果膠生成I m g半乳糖醛酸的酶量為一個(gè)果膠酶活力單位，即IU ;半纖維素酶在35°C、/7H4條件下，Ih分解木聚糖產(chǎn)生Img還原糖(以木糖計(jì))的酶量定義為一個(gè)半纖維素酶活力單位，即IU ； (4)將黃柏藥渣繼續(xù)加10倍重量的水，煎煮lh，過(guò)濾； (5)將步驟(3)和(4)的濾液合并，滅酶，濃縮至生藥lg/ml，即得黃柏生物堿提取物。
2.權(quán)利要求I所述的復(fù)合酶-熱水浸提黃柏生物堿的方法，其特征在于， 所述步驟(2)中，調(diào)溫度35°C，pH為3. 9; 所述步驟(3)每g黃柏取相當(dāng)于酶活力I萬(wàn)U的纖維素酶，2萬(wàn)U的果膠酶，0.4萬(wàn)U的半纖維素酶的混合物為復(fù)合酶，加水10倍調(diào)勻，緩緩加入黃柏水浸液中，攪勻，保溫200mino
3.權(quán)利要求I所述的復(fù)合酶-熱水浸提黃柏生物堿的方法，其特征在于， 所述步驟(4)中，用200目篩過(guò)濾； 所述步驟(5)中，用200目篩過(guò)濾。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述黃柏藥材為蕓香科植物黃皮樹Yhellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮或蕓香科植物黃檗Phellodendronamurense Rupr.的干燥樹皮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)合酶-熱水浸提黃柏生物堿的方法，將檢驗(yàn)合格的黃柏原生藥飲片，粉碎成粗粉，備用；稱取處方量黃柏，加15倍水浸潤(rùn)，調(diào)溫度30℃～40℃，pH為3.9～4.5；另每g黃柏取相當(dāng)于酶活力0.8～1萬(wàn)U的纖維素酶、1.5～2.5萬(wàn)U的果膠酶和0.3～0.5萬(wàn)U的半纖維素酶，加水10倍調(diào)勻，緩緩加入黃柏水浸液中，攪勻，保溫160～200min，過(guò)濾，濾液備用；黃柏藥渣繼續(xù)加10倍水，常規(guī)煎煮1h，過(guò)濾，濾液合并，滅酶，濃縮至規(guī)定量(相當(dāng)于生藥1g/ml)，即得黃柏生物堿提取物。本發(fā)明與傳統(tǒng)提取法相比，提取速度快，提高有效成分收率和利用率，大幅降低生產(chǎn)成本，宜于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/00GK102626459SQ20121006843
公開日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者張?zhí)? 張雪梅, 成建國(guó), 文洪宇, 李洪, 楊娟, 陳曦, 黃彥 申請(qǐng)人:重慶市中醫(yī)院