專利名稱：Apoe肽及其用途的制作方法
APOE肽及其用途相關(guān)申請的交叉引用本申請要求享受2010年I月6日提交的美國臨時專利申請第61/292，668號的權(quán)益，本文通過提述并入該申請的全部內(nèi)容。關(guān)于電子提交的文本文件的描述通過提述并入下列電子提交的文本文件的全部內(nèi)容序列表的計算機可讀形式拷貝(文件名C0G0_022_01 W0_SeqList_ST25. txt，數(shù)據(jù)錄入:2011年I月6日，文件大小40千字節(jié))。 發(fā)明領域本發(fā)明涉及包含源自載脂蛋白E(ApoE)的肽二聚體的藥物組合物。本發(fā)明還涉及用所述新組合物來治療多種疾病狀態(tài)，如癌癥和神經(jīng)變性疾病的方法。
背景技術(shù)：
癌癥是一類疾病，其中某一群細胞呈現(xiàn)不受控制的生長、侵入和破壞鄰近組織，以及轉(zhuǎn)移(異常細胞向體內(nèi)其他位置的播散)，或者其中細胞在合適的時間未能發(fā)生程序性細胞死亡(例如凋亡)。癌癥造成的死亡占全世界死亡人數(shù)的大約13%，并且據(jù)美國癌癥學會稱，2007年全世界死于癌癥的人數(shù)達7600萬?，F(xiàn)有的癌癥治療依賴于癌癥的具體類型和涉及的組織，但是包括手術(shù)、化療、放療、免疫治療、單克隆抗體治療、以及其他方法。雖然這些方法在某些病例中獲得了成功，它們受到了不良反應或功效有限的阻礙。例如，通過手術(shù)去除腫瘤來消除癌性組織的功效往往受到癌癥易于侵犯鄰近組織以及轉(zhuǎn)移到身體內(nèi)其他部位的傾向的限制。化療和放療往往受到毒性或?qū)ι眢w內(nèi)其他組織的損傷的限制。由此，癌癥仍然是嚴重的健康問題，對于更好的癌癥治療方法存在需求。炎癥與癌癥的啟動、進展和轉(zhuǎn)移有強烈的關(guān)聯(lián)(Mantovani et al. (2008)Nature, Vol. 454:436-444)。促炎癥介導物如前列腺素、細胞因子、活性氧/氮種類、以及生長因子等等可活化PI3K/Akt信號傳導，后者可增加促生存、增殖和轉(zhuǎn)移過程(Dillon et al. (2007) Oncogene, Vol. 26:1338-1345;Qiao et al. (2008)CellCycle, Vol. 7:2991-2996;Prueitt et al. (2007)International Journal of Cancer,Vol. 120:796-805; Wang and DuBois (2006) Gut, Vol. 55:1 15-122)。在人類癌癥中 PI3K/Akt途徑中的突變是常見的，該突變導致PI3K/Akt信號傳導失調(diào)(Carnero et al. (2008)Curr Cancer Drug Targets, Vol. 8:187-98;Dillon et al, 2007;Yuan and Cantley(2008)Oncogene, Vol. 27:5497-5510)。因此對PI3K/Akt信號傳導軸的藥理學控制是癌癥治療的一個目標。Akt激酶活性受腫瘤阻遏蛋白磷酸酶2A (PP2A)的直接調(diào)控。PP2A起對Akt的蘇氨酸 308 和絲氨酸 473 去憐酸化的功能(Andjelkovic et al. (1996) Proc. Natl. Acad.Sci. , Vol. 93:5699-5704;Resj5 et al. (2002)Cellular Signalling, Vol. 14:231-238)。但是，PP2A活性在人類癌癥中普遍被降低(Chen et al. (2004) CancerCell, Vol. 5:127-136)。癌癥中PP2A活性被遏制的機制之一是與內(nèi)源蛋白抑制物如CIP2A 和 I2PP2A 等形成復合物(Junttila et al. (2007) Cell, Vol. 130:51-62; Li etal. (1996) J. Biol. Chem. , Vol. 271:1 1059-11062)。I2PP2A,又稱 SET，是 PP2A 的強抑制物，已被發(fā)現(xiàn)與AML和急變期CML有牽連(Li et al, 1996;Neviani et al. (2005)Cancer Cell，Vol. 8:355-368)。雖然PP2A活性在多種人類癌癥中被內(nèi)源抑制，但其可以被藥理學地提高，并且是癌癥治療的潛在分子祀(Guichard et al. (2006)Carcinogenesis, Vol. 27:1812-1827;Perrotti and Neviani(2008)Cancer and MetastasisReviews, Vol. 27:159-168;Switzer et al. (2009)Oncogene, Vol. 28:3837-3846)。源自ApoE的肽在炎癥相關(guān)的神經(jīng)病，如阿爾茲海默病、多發(fā)性硬化和創(chuàng)傷性腦損傷中已經(jīng)顯示出富有前景的減輕損傷的效果(Hoane et al. (2009)Journal of Neurotrauma, Vol. 26: 121-129;Li et al. (2006)J Pharmacol ExpTher, Vol. 318:956-965;Wang et al. (2007)Neuroscience,Vol. 144:1324-33;W02006/029028; WO 2003/026479)。炎癥是神經(jīng)疾病和癌癥二者的常見特征，而且PI3K/Akt信號傳導在神經(jīng)變性疾病如阿爾茲海默病中也失調(diào)(Griffin et al. (2005) JNeurochem, Vol. 93:105-17 ;Pei et al. (2003) Acta Neuropathol, Vol. 105:381-92)。此外，PP2A亞單位的表達在阿爾茲海默病患者中降低，這與該病中觀察到的增加的tau高磷酸化 (tau hyperphosphorylation)相一致(Vogelsberg-Ragaglia et al. (2001)ExperimentalNeurology, Vol. 168:402-412)。ApoE肽據(jù)報道還可通過解除SET所致的抑制來增加PP2A活性(見例如W02008/080082)。因此，ApoE肽是治療多種狀況，包括癌癥、炎癥狀況和神經(jīng)變性疾病的一種可行的治療手段。雖然已經(jīng)證明了數(shù)種ApoE肽治療特定狀況的有效性，本領域中仍存在開發(fā)新的具有更高的強度和更寬的安全窗口的源自ApoE的肽的需求。尤其是，最好能開發(fā)出能夠有效治療多種狀況的新的基于ApoE的肽治療劑。發(fā)明概述本發(fā)明至少部分地基于如下發(fā)現(xiàn)，即ApoE肽的二聚化增加它們的生物學活性。因此，本發(fā)明提供與單體ApoE肽相比具有更高的功效的新型ApoE肽治療劑。例如，在一個實施方案中，本發(fā)明的肽二聚體包含第一 ApoE肽和第二 ApoE肽。其中所述第一和第二 ApoE肽通過連接模塊共價連接。在某些實施方案中，所述第一和第二 ApoE肽含有源自天然ApoE全蛋白質(zhì)的LDL受體結(jié)合域的序列。所述第一和第二 ApoE肽可以是相同的或者可以是不同的。在一些實施方案中，所述二聚體的ApoE肽中的至少一個與蛋白轉(zhuǎn)導域綴合，任選地藉由一個或多個連接殘基與蛋白轉(zhuǎn)導域綴合。在其他實施方案中，所述二聚體的第一和第二 ApoE肽各自與蛋白轉(zhuǎn)導域綴合，任選地藉由一個或多個連接殘基與蛋白轉(zhuǎn)導域綴合。所述一個或多個連接殘基可包括半胱氨酸殘基、或者修飾的氨基酸如疊氮高丙氨酸(azidohomoalanine)或炔丙基甘氨酸。所述蛋白轉(zhuǎn)導域可以是源自觸角足(antennapedia)、TAT> SynBl、SynB3、SynB5、和聚精氨酸的妝。本發(fā)明的二聚體中的第一和第二 ApoE肽可以通過連接模塊共價連接。所述連接模塊可包括二硫橋、雙馬來酰亞胺(例如雙馬來酰亞胺-乙燒(bismaleimido-ethane)或雙馬來酰亞胺-己燒(bismaleimido-hexane))、1，4_ 二取代的三唑、以及N, N- 二炔丙胺。本發(fā)明還包括本發(fā)明的ApoE肽二聚體的藥物組合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物包含有效量的如本文中所述的ApoE肽二聚體，和可藥用的擔載體。在一些實施方案中，根據(jù)要治療的具體狀況，所述藥物組合物還可以包含其他的治療化合物。本發(fā)明還提供通過施用有效量的至少一種如本文所述的ApoE肽二聚體用于治療、預防或緩解多種狀況或疾病的方法，所述狀況或疾病包括癌癥、神經(jīng)變性疾病(例如ALS、阿爾茨海默病、帕金森氏病、和亨廷頓氏病)，和炎癥狀況(例如多發(fā)性硬化、炎性腸病、克羅恩氏病、和類風濕性關(guān)節(jié)炎)。本發(fā)明還提供預測或評估用于在患者中治療癌癥的治療性介入的功效的方法。在一個實施方案中，所述方法包括測量來自患者的生物樣品中的SET蛋白的表達水平，并將測得的水平與對照樣品中的SET蛋白表達水平比較，其中測得的SET蛋白表達水平指示所述治療性介入的治療功效。在某些實施方案中，所述治療性介入是如本文所述的ApoE肽或肽二聚體。所述生物樣品可以是，例如，來自實體瘤的腫瘤活檢或從血液樣品分離的單核細胞。在一個實施方案中，所述生物樣品是⑶19+/⑶5+白血病細胞。本發(fā)明還涵蓋用于預測ApoE肽或肽二聚體在患者中治療癌癥的治療功效的試劑 盒。在一個實施方案中，所述試劑盒包含用于測量生物樣品中SET蛋白表達的試劑，以及關(guān)于測量SET蛋白表達以預測或評估ApoE肽或肽二聚體在患者中治療癌癥的功效的說明。附圖簡要說明圖I. COGl 12抑制BV2小膠質(zhì)細胞中LPS誘導的炎癥細胞因子的產(chǎn)生。C0G112針對BV2小膠質(zhì)細胞的NO (綠色方塊)、TNF α (紅色菱形)、和IL-6 (藍色三角)的產(chǎn)生的抑制曲線。與lOOng/mL LPS—道添加化合物至圖上標示的終濃度。24小時后移出培養(yǎng)基并用雙位點ELlSA(BioSource)進行分析，并相對于同一平板上的標準曲線進行定量。圖2.原始批次#313的、經(jīng)還原的、和經(jīng)化學氧化的C0G112的質(zhì)譜。通過用于檢測質(zhì)量的正模式下帶電噴霧離子化的LC/MS獲取了質(zhì)譜。A.原始批次#313的C0G112的質(zhì)譜。B.用二硫蘇糖醇還原后的原始批次#313的C0G112的質(zhì)譜。C.暴露于氧化環(huán)境以形成二聚體的COGl 12的質(zhì)譜。紅色箭頭標示出COGl 12 二硫橋連二聚體的特征峰。圖3. C0G449的NO抑制曲線用圖上標示的終濃度的C0G449與100ng/mL的LPS —道處理BV2小膠質(zhì)細胞。24小時后移出培養(yǎng)基并用雙位點ELISA(Bi0Source)進行分析，并相對于同一平板上的標準曲線進行定量。圖4. BMOE連接的二聚體肽C0G449在CML細胞中活化PP2A。A. 32D_BCR/Abl慢性髓性白血病細胞用C0G449 (I μ M)，C0G445 (I μ Μ) ( 二硫化物連接的COGl 12 二聚體)處理或無處理，并測量ΡΡ2Α活性。B. 32D:BCR/Abl細胞培養(yǎng)物不用化合物處理，或用I μ M C0G449、或5 μ MFTY720處理30分鐘，然后在ΝΡ40裂解緩沖液中裂解。用ΡΡ2Α免疫沉淀試劑盒(Upstate)根據(jù)制造商的說明對PP2A進行免疫沉淀和測定。圖5. A.C0G449對來自4名白血病患者的CLL細胞的細胞毒性的劑量響應曲線。從血液樣品分離人CLL細胞并分析C0G449細胞毒性。將C0G449施加到B-CLL細胞(在96孔板中O. 25xl06個細胞/孔)，72小時后，使用MTS測定(Pharmacia)分析活細胞，以確定有效殺死50%的輸入CLL細胞的C0G449濃度(EC50)。B. C0G445對來自7名患者的CLL細胞或來自5名患者的正常B細胞的劑量效應曲線。分離了人CLL細胞和PBMC并用其測定C0G45的細胞毒性。圖6. A.標示的COG肽對BV2小膠質(zhì)細胞中LPS誘導的一氧化氮產(chǎn)生的劑量響應曲線。B.標示的COG肽抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞生長的劑量響應曲線。C.標示的COG肽抑制U87MG成膠質(zhì)細胞瘤細胞生長的劑量響應曲線。圖7.構(gòu)建ApoE肽二聚體文庫的方法的圖解。PTD=蛋白轉(zhuǎn)導域；ApoE=apoE_模擬域；“X”和“Y”代表不同的連接模塊。圖8.雙馬來酰亞胺偶聯(lián)。A。雙馬來酰亞胺偶聯(lián)反應中涉及的化學轉(zhuǎn)化。在化學合成中摻入的半胱氨酸殘基通過雙馬來酰亞胺化合物如雙馬來酰亞胺乙烷(BMOE)或雙馬來酰亞胺己烷(BMH)被偶聯(lián)在一起。B。BMOE和BMH的化學結(jié)構(gòu)。圖9. “點擊化學”(Click Chemistry)反應中涉及的化學轉(zhuǎn)化。銅催化的3+2縮
合通過形成穩(wěn)定的1，4-二取代三唑而造成偶聯(lián)。A.炔丙基甘氨酸肽與疊氮高丙氨酸肽的異源偶聯(lián)產(chǎn)生異二聚肽。B.同二聚肽可通過用N，N-二炔丙胺偶聯(lián)兩個含疊氮高丙氨酸的單體肽來合成。

圖10. C0G445在乳腺癌細胞系和成膠質(zhì)細胞瘤細胞系中抑制EGF誘導的Akt活化。A.在EGF存在下暴露于標示濃度的C0G445肽U87的成膠質(zhì)細胞瘤細胞的Western印跡分析。用針對活化的EGF受體(P-EGFR)、總EGF受體、活化的I3DKl (P-PDKl)、以及總TOKl的抗體探查印跡。B.對U87細胞中在遞增濃度的C0G445存在下的由EGF誘導的Akt活化的Western印跡和密度測定分析。圖11. C0G45對Akt活化的影響是藉由PP2A來介導的。A.對在有或無岡田酸存在下用標示濃度的C0G45和EGF處理的MDA-MB-231細胞的Western印跡分析。用針對活化Akt (P-Akt)和總Akt的抗體探查印跡。B.對MDA-MB-231細胞中在有和無岡田酸處理的情況下，在遞增濃度的C0G45的存在下EGF誘導的Akt活化的密度測定分析。磷酸化Akt對總Akt的比例相對單獨EGF的對照的比例進行標準化。C.小圖B中所示數(shù)據(jù)的非線性回歸分析。圖12. A. MDA-MB-231細胞用EGF和遞增濃度的C0G445處理后，從該細胞免疫沉淀的總PP2A活性。B. U87細胞在有或無R田酸的條件下用標示濃度的C0G445處理后，對U87細胞中的總c-myc蛋白水平的Western印跡和密度測定分析。C. MDA-MB-231細胞暴露于EGF和兩種不同濃度的C0G445后，從該細胞免疫沉淀PP2A的催化亞單位。探查印跡中的I2PP2A(SET)和PP2A催化亞單位。圖13. A. MDA-MB-231細胞在有或無岡田酸的條件下用EGF和標示濃度的C0G445處理后，對該細胞中磷酸化m-TOR水平的Western印跡和密度測定分析。B. MDA-MB-231細胞在有或無R田酸的條件下用EGF和標示濃度的C0G445處理后，對該細胞中磷酸化GSK-3 β水平的Western印跡和密度測定分析。圖14. A.用MTT還原來度量的C0G445對U87 (空心圓)和MDA-MB-231 (實心圓)細胞的增殖的劑量響應曲線。B.用細胞計數(shù)度量的C0G445對MDA-MB-231細胞的增殖的劑量響應曲線。圖15. SET拮抗作用抑制c-Myc在S62的磷酸化。將Raji細胞用C0G449或溶媒對照處理20小時后裂解。裂解物用Western印跡法使用抗-磷酸-S62抗體和總c_Myc抗體進行分析。*表示p〈0. 05。圖16. SET在CLL中過表達。A.測得的16名CLL患者和6份正常B細胞樣品的SET/ β -肌動蛋白比，顯示B-CLL細胞中SET表達相對正常B細胞顯著增加。顯示了代表性的Western印跡。B.從相同的患者和志愿者樣品分離了 mRNA，并通過qPCR定量SET mRNA。圖17. SET在B細胞淋巴瘤系中過表達。A.從Raji和Ramos細胞以及正常B細胞分離mRNA，并通過qPCR定量SET mRNA。B.顯示來自于小圖A相同的細胞的SET和GAPDH的Western印跡，表明在B細胞淋巴瘤系中相對于正常B細胞SET的表達顯著增加(N004和 N007)。圖18.對SET的沉默可抑制 Raji細胞的生長。利用慢病毒轉(zhuǎn)導導入了針對對照或SET的shRNA，72小時后通過MTT監(jiān)控Raji細胞的生長。Western印跡顯示相對于加載β -肌動蛋白的對照SET被減少了大約一半。圖19. SET可能可預測CLL疾病的進展。相對于通過免疫印跡測定的CLL細胞SET水平評估了從診斷到首先需要治療的時間(“治療前時間”)。將具有高水平的患者與具有較低水平的患者(通過接受者操作特征來確定)進行比較，前者具有統(tǒng)計學上顯著更短的治療前時間(η=226;ρ〈0· 002)。圖20.提議的Mcl-I穩(wěn)定性調(diào)控機制。A. c-myc調(diào)控位點與159-164位的Mcl-I序列的序列同源性，顯示S/T-X-S-S-S/T-P(SEQ ID NO:89)基序的保守。B.提議的Mcl-I調(diào)控復合物的圖示(轉(zhuǎn)引自R. Sears提供的附圖)。圖21.可能調(diào)控Mcl-I穩(wěn)定性的Mcl-I相關(guān)蛋白的免疫共沉淀。與Mcl-I免疫共沉淀的蛋白(SET(A)，PP2A(B)，Pin-l(C)，和軸蛋白1(D))的免疫印跡。I指示輸入上樣對照的泳道，IP指示免疫沉淀泳道。圖22SET拮抗作用降低細胞Mcl-I濃度。將原代人CLL細胞鋪入平板并與標示濃度的C0G449 —起溫育24小時。裂解細胞，進行PAGE并免疫印跡以定量Mcl-I與β -肌動蛋白比O標示ρ〈0· 01) ο圖23. C0G449處理抑制體內(nèi)c_myc依賴性伯基特淋巴瘤Ramos細胞系生長。用溶媒或C0G449肽處理的SCID小鼠中注射IO7個來自伯基特淋巴瘤Ramos細胞系的細胞19天后的腫瘤生長。圖24. A.接受C0G449 (空心方塊)或乳酸林格氏溶液對照(實心方塊)處理的SCID小鼠中Ramos細胞腫瘤異種移植物的腫瘤體積的作圖，處理在第11天當腫瘤達到150-200mm3的可觸及大小時啟動。B.植入后第19天收集的經(jīng)處理和未經(jīng)處理的Ramos腫瘤的最終腫瘤質(zhì)量。林*=ρ〈0· 001，T檢驗。圖25. SET和CIP2A在人原代三陰性乳腺癌(TNBC)中過表達。通過qRT_PCR確定的13份TNBC患者樣品中SET(小圖A)和CIP2A(小圖B)對于正常組織(N)的相對表達。圖26. SET在人乳腺癌細胞系中過表達。通過Western印跡顯示的TNBC細胞系中SET蛋白與肌動蛋白的表達。圖27. C0G449降低eIF4E的磷酸化。U87MG成膠質(zhì)細胞瘤細胞用C0G449 (I μ Μ)或溶媒對照處理20小時，然后用磷酸-特異性抗體和總eIF4E抗體通過Western印跡測定eIF4E的磷酸化。C0G449處理降低了磷酸_eIF4E蛋白對總eIF4E蛋白的比例(n=3)。*表示與溶媒對照相比p〈0.01。圖28. C0G449在乳腺癌細胞中的細胞毒效應。如標示地使細胞系在無血清培養(yǎng)基和C0G449中生長24小時。通過細胞計數(shù)來測量細胞增殖。細胞數(shù)以相對于對照的、未處理的細胞的相對數(shù)表示。
圖29. C0G449與索拉非尼或吉非替尼對三陰性乳腺癌(TNBC)細胞系生長的組合處理。如標示，使MDA-231細胞在亞致死劑量的C0G449、索拉非尼或吉非替尼存在下生長。48小時后，使用MTT測定法定量活細胞。***表示p〈0. 001。圖30. C0G449處理在異種移植物中抑制三陰性乳腺癌(TNBC)腫瘤生長。將4xl06個MDA-MB-231細胞與基質(zhì)膠一起注射到免疫缺損小鼠的第4乳腺中，并從第10天開始每天用10mg/kg C0G449皮下注射處理(小圖A),或者從注射后的第27天起(小圖B)通過尾靜脈靜脈注射lmg/kg來處理小鼠3周。通過游標卡尺測量來測定腫瘤體積。發(fā)明詳述本發(fā)明人先前發(fā)現(xiàn)ApoE合成肽可用于治療多種癌癥。見2009年7月I日提交的WO 2010/002982，將其全部內(nèi)容通過提述并入本文。這里，本發(fā)明人在其先前的工作的基礎上進行了擴展，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)合成ApoE肽的二聚體與其單體的對應物相比展現(xiàn)出增加的生物學活性。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)有特定的一批ApoE肽，它們在活性測定中強度特別高，已經(jīng)·被氧化而形成肽二聚體。進一步的實驗顯示，通過不可逆的連接而形成的ApoE肽二聚體比可逆連接的二聚體還要更強。因此，本發(fā)明提供源自ApoE的受體結(jié)合區(qū)的新的肽二聚體。在一個實施方案中，所述肽二聚體包含第一 ApoE肽和第二 ApoE肽，其中所述第一和第二ApoE肽通過連接模塊共價連接。ApoE肽，又稱COG肽，是來源于天然ApoE全蛋白的肽。本發(fā)明的肽二聚體包含至少兩個ApoE肽或ApoE模擬域。所述ApoE肽或模擬域可源自ApoE全蛋白的LDL受體結(jié)合區(qū)，即全長ApoE蛋白的氨基酸130-150。在某些實施方案中，本發(fā)明的ApoE肽或模擬域可來源于ApoE的至少氨基酸133-140。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述ApoE肽源自ApoE的氨基酸130-149。在又一個實施方案中，ApoE肽源自ApoE的氨基酸133-149。在又一個實施方案中，ApoE肽源自ApoE的氨基酸138-149。如本文中使用的，短語“源自”“衍生自”或“來源于”指含有對來自ApoE蛋白的特定氨基酸序列的至少80%的同一性的肽，或者具有來自 ApoE 蛋白的受體結(jié)合區(qū)的至少 5，6，7,8,9, 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或 20個相鄰氨基酸殘基(例如氨基酸第130-150)的肽。舉例而言，具有對應于氨基酸133-149中發(fā)生一個、兩個或三個點突變或氨基酸修飾的序列的肽可認為是源自ApoE蛋白的氨基酸133-149的。ApoE肽或模擬域可以是含有來自天然ApoE蛋白的氨基酸133-149的5個或更多、10個或更多殘基，或15個或更多殘基的肽的衍生物，包括具有非天然氨基酸替代(如氨基異丁酸和乙基賴氨酸)，和其他可提高所述肽的α螺旋含量的修飾的衍生物。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述肽二聚體的第一和/或第二 ApoE肽具有序列LRVRLASHLRKLRKRLL (SEQ ID NO: 3 (C0G133))。C0G133單體先前被證明對于治療或減低腦缺血或腦炎癥有用。參見美國專利申請公開號2003/0077641A1，該申請于2002年9月23日提交，將其全文并入本文。在另一個實施方案中，所述第一和/或第二 ApoE肽是C0G133的類似物或衍生物。例如，所述第一和/或第二 ApoE肽具有選自下組的序列AS(Aib)LRKL(Aib)KRLL(SEQ ID NO:5 (C0G1410))，LRVRLAS(Aib)LKRLRK(硝基-Arg)LL (SEQ IDN0:4(C0G248))，和 LRVRLAS (Aib) LRKLR(K-Ac) RLL(SEQ ID NO: 35 (C0G345))。可以將其他ApoE類似物或衍生物摻入本發(fā)明的ApoE肽二聚體。例如，先前有很多種ApoE 130-150肽的類似物已經(jīng)被制作出來，并且在基于細胞的測定中測試了它們阻遏炎癥細胞因子和自由基的釋放的活性，還在受體結(jié)合測定中測試了它們的活性。Lynch et al. (2003) J. Biol.Chem. , Vol. 278(4) :48529-33和于2002年9月23日提交的美國專利申請公開流水號2003/0077641A1，于2007年4月17日公告的美國專利No. 7，205，280 ;以及于1999年3月I日提交的美國專利申請流水號09/260，430，本文通過提述并入上述各文獻的全部內(nèi)容。特別地，W02006/029028(本文通過提述并入其全部內(nèi)容)中描述的改進的ApoE模擬物是本發(fā)明的肽二聚體的合適的第一和/或第二 ApoE肽或模擬域。例如，ApoE肽或模擬域可以包括，但不限于
LJWRLASH-(NMe)-LRKLRKRLL-NH2(SEQ ID NO: 42)
Ac-ASH-Aib-RKLRKRLL-NH2(SEQ ID NO: 43)
Ac-AS-Alb-LRKLRKRLL-NH2(SEQ ID NO; 44)
Ac-DS-Aib-LRKLRKRLL-NH2(SEQ ID NO: 45)·
Ac-ASHLRKX-Aib-KRLL^NH2(SEQ ID NO: 46)
Ac-DR-Aib-ASHLRKLRKR-Aib-L-NH2(SEQ ID NO: 47)
Ac-DS-Aib-LRKLRKR^Aib-L-NH2(SEQ ID NO: 48)
Ac-DR-Aib-ASHLRKL-Aib-KRLL-NH2(SEQ ID NO: 49)
Ac-DS-Aib-LRICL-Aib-KRLL-NH2(SEQ ID NO: 50)
Ac-DR-Aib-AS-Aib-LRKLRKRLL-NH2(SEQ ID NO: 51)
Ac-DR-Aib-ASHLRKLRKRLL-NH2(SEQ ID NO: 52)
Ac-CAS-Aib-LRKL-Aib-KRLL-NH2(SEQ ID NO: 53)
Ac-DS-Aib-LRKL-Aib-KRLL-NH2(SEQ ID NO: 54)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLV-NH2(SEQ ID NO 55)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLM-NH2(SEQ ID NO; 56)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KJRLI-NH2(SEQ ID NO: 57)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLA-NH2(SEQ ID NO: 58)
Ac-AS-Aib-LRKJL-Aib-KALL-NH2(SEQ ID NO; 59)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(Om)LL-NH2(SEQ ID NO; 60)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(narg)LL-NH2(SEQ ID NO: 61)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(Iiarg)LL-NH2(SEQ ID NO: 62)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(dmarg)LL-NH2(SEQ ID NO: 63)Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-ARLL-NH2(SEQ ID NO: 64)
Ac-AS~Aib~LRKL~Aib-(ac.I ys)RLL-NH2(S￡Q ID NO: 65)
Ac-AS-Aib~LRKL-Aib-(azlys)RLL-NH2(SEQ ID NO: 66)
Ac-ASii-Aib-RKL-Aib-KRLL-NH2(SEQ ID NO: 07)
Ac-AS^Aib-LRKL-Aib-KRL-(NLe)-NH3(SEQ ID NO: 68)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KR-(NLe)-L-NH2(SEQ ID NO: 69)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KR-(NLe)-(NLe)-NH2(SEQ ID NO: 70)
Ac-AS-Aib^LRKL-Aib-K(Om)L-(NLe)-NH2(SEQ ID NO: 71)·
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(Om)-(NLe)-L-NH2(SEQ ID NO: 72)
Ae-AS-Aft-LRKL-Aib-K(om)-(NLe)-(NLe)-NH2(SEQ ID NO: 73)
Ac-AS-Aib-LRKL-Ai^K(harg)L^(NLe) NH2(SEQ ID NO: 74)
Ac~AS-Aib-LRKL-Aib-K(harg) (NLe)4^NH2(SEQ ID NO; 75)
Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-K(harg)-(NLe)-(NLe)-NH2(SEQ ID NO: 76)
Ac-AS-Aib-L(Om)KL-Aib-KRLL-NH2(SEQ ID NO: 77)
Ac-AS-Aib-L(om)KL-Aib-K(om)LL-NH2(SEQ ID NO; 78)
Ac-AS-Aib-L(Om)KL-AIb-KRL-(NLe)-NH2(SEQ ID NO: 79)
Ac-AS-Aib- L(Om)KL-Aib-KRL-(NLe)-(NLe)-NH2(SEQ ID NO: 80)
Ac-AS-Aib-L(om)KL-Aib-K(om)L-(NLe)-NH2(SEQ ID NO: 81)
Ac-AS-Aib-L(om)KL-Aib-K(om)-(NLe)-(NLe)-NH2(SEQ ID NO: 82)
ac-ashlrklrkrll-nh2 (apoEiss-i49)(seq id no S3、)
Ac-ASHCRKLCKRLL~NH2(SEQ ID NO: 84)
ac-asclrklckrll-nh2(seq id no； 85)
Ac-CSHLRKLCiCRLL-NH2(SEQ ID NO: 86)
Ac-ASHLRKCRKRCL-NH2(SEQ ID NO: 87)
Ac-ASHCRKLRKRCL-NH2(SEQ ID NO: 88)其中(NMe)-L為N-甲基化的亮氨酸，Aib為氨基異丁酸，(orn)為鳥氨酸，(narg)為硝基精氨酸，(NLe)為正亮氨酸，(harg)為高精氨酸，(dmarg)為二甲基精氨酸，(aclys)為乙酰賴氨酸，(azlys)為氮賴氨酸，Ac為乙酰化氨基末端。還考慮到其他源自ApoE蛋白的受體結(jié)合區(qū)的ApoE肽或模擬域。例如，如下的ApoE肽或模擬域是本發(fā)明的肽二聚體的合適的第一和/或第二 ApoE肽或模擬域所述ApoE肽或模擬域包含與ApoE蛋白的氨基酸133-149對應的序列，并保留(即不替代)選自下組中的一個或多個關(guān)鍵殘基S139, R142, K143, L144, K146, R147和L149，但在其他位置上有一個或多個氨基酸替代。在本發(fā)明的特定實施方案中，所述肽二聚體的第一和第二 ApoE肽是相同的。例如，在一個實施方案中，肽二聚體包含第一 ApoE肽和第二 ApoE肽，其中所述第一和第二肽具有序列SEQ ID N0:3(C0G133)。在其他實施方案中，肽二聚體的第一和第二 ApoE肽是不同的。舉例而言，肽二聚體可包含第一 ApoE肽和第二 ApoE肽,其中所述第一 ApoE肽具有序列 SEQ ID N0:3(C0G133)，第二 ApoE 肽具有序列 SEQ ID NO: 5 (C0G1410)。本發(fā)明涵蓋了包含本文所描述的不同ApoE肽的所有排列的肽二聚體。在本發(fā)明的另一個實施方案中，肽二聚體的第一和/或第二 ApoE肽與蛋白轉(zhuǎn)導域(PTD)綴合。PTD是可增強運載物的胞 內(nèi)輸送的小型堿性肽?？梢耘cApoE肽綴合的PTD的一些非限制性實例包括源自觸角足，SynBl, SynB3, SynB5, TAT,和聚精氨酸的肽。例如，可以與第一和/或第二 ApoE肽綴合的示例性PTD序列包括RQIKIffFQNRRMKffKK(SEQ ID NO 8)YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO 9)GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO 36)RRMKffKK (SEQ ID NO 37)RGGRLSYSRRRFSTSTGR(SEQ ID NO 38)RRLSYSRRRF(SEQ ID NO 39)RGGRLAYLRRRffAVLGR(SEQ ID NO 40)RRRRRRRR(SEQ ID NO :41)WKK在特定的實施方案中，所述第一和/或第二 ApoE肽與具有序列RQIKIffFQNRRMKffKK (SEQ ID NO: 8) ; YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 9),或 WKK 的 PTD 綴合。在一個實施方案中，所述第一 ApoE肽通過一個或多個第一連接殘基與第一 PTD綴合。這樣，本發(fā)明的肽二聚體可包含與第一 PTD綴合的第一 ApoE肽和不與PTD綴合的第二 ApoE肽。在這樣的實施方案中，肽二聚體包含兩個ApoE肽或模擬域，和一個PTD。在另一個實施方案中，所述第一 ApoE肽通過一個或多個第一連接殘基與第一 PTD綴合，而所述第二 ApoE肽通過一個或多個第二連接殘基與第二 PTD綴合。在這樣的實施方案中，肽二聚體包含包含兩個ApoE肽或模擬域，和兩個PTD。因此,本發(fā)明的肽二聚體可包含兩個ApoE肽域以及O個、一個或兩個PTD。見實施例3和圖7。二聚體的ApoE肽和PTD可以是本發(fā)明中描述的ApoE肽和PTD的任何組合。在特定的實施方案中，PTD選自源自觸角足或TAT的肽(例如SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9,或WKK序列)，而 ApoE肽選自 COG 133 (SEQ ID NO: 3)，C0G248 (SEQ ID NO: 4)，C0G1410 (SEQ IDNO:5),或C0G345(SEQ ID NO:35)，如實施例3的表II和IV所述。在一個特定的實施方案中，ApoE肽是C0G133(SEQ ID NO: 3)，且PTD具有序列SEQ ID N0:8。在另一個實施方案中，ApoE肽是C0G133(SEQ ID NO: 3)且PTD具有序列WKK。在另一個實施方案中，肽二聚體包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽和所述第二肽通過雙馬來酰亞胺-乙烷共價連接，且所述第一和第二肽具有序列SEQ ID NO: I、SEQ ID NO: 15或SEQ ID N0:90。例如，在一個具體的實施方案中，肽二聚體包含第一肽和第二肽，其中所述第一和第二肽具有序列SEQID NO: I，且其中所述第一肽和所述第二肽通過SEQ ID NO: I的第17位處的半胱氨酸殘基之間的雙馬來酰亞胺-乙烷接頭共價連接(例如，所述肽二聚體是C0G449，見表I)。在另一個具體的實施方案中，肽二聚體包含第一肽和第二肽，其中所述第一和第二肽具有序列SEQID NO: 15，且所述第一肽和所述第二肽通過每個肽的氨基末端處(例如，SEQ ID NO: 15的第I位)的半胱氨酸殘基之間的雙馬來酰亞胺-乙烷接頭共價連接(例如，所述肽二聚體是C0G492，見表I)。在另一個具體的實施方案中，肽二聚體包含第一肽和第二肽，其中所述第一和第二肽具有序列SEQ ID N0:90，且其中所述第一肽和所述第二肽通過SEQ ID NO:90的第4位處的半胱氨酸殘基之間的雙馬來酰亞胺-乙烷接頭共價連接(例如，所述肽二聚體是COG493，見表I)。所述第一和/或第二 ApoE肽可任選地通過一個或多個連接殘基與PTD綴合。如本文中使用的，所謂連接殘基是指至少一個氨基酸或修飾的氨基酸，其能夠發(fā)生反應而交聯(lián)ApoE肽單體形成穩(wěn)定的二聚體。在一些實施方案中，連接殘基適于使用馬來酰亞胺基團(如圖8中描述的那些)來交聯(lián)，或者通過形成穩(wěn)定的1，4- 二取代的三唑(如圖9描述的)來交聯(lián)。示例性的連接殘基包括半胱氨酸、疊氮高丙氨酸和炔丙基甘氨酸。其他合適的連接基團可以由本領域技術(shù)人員來確定?！?br> 本發(fā)明的肽二聚體包含第一 ApoE肽和第二 ApoE肽，其中所述第一和第二 ApoE肽通過連接模塊共價連接。如本文中使用的，所謂“連接模塊”可以是這樣的化合物或分子，其交聯(lián)肽二聚體，使得各肽鏈被至少四個原子分隔開。可以選擇連接基團來形成肽單體之間的接頭的不同長度。例如，可以選擇連接模塊使得各肽鏈相隔至少6個原子，至少8個原子，至少10個原子，或者至少12個原子。連接模塊可以是天然ApoE序列中找不到的異源氨基酸，如多余的半胱氨酸殘基或修飾的氨基酸，如疊氮高丙氨酸或炔丙基甘氨酸。在一些實施方案中，連接模塊可以包括通過與肽鏈中的氨基酸所起的交聯(lián)反應而產(chǎn)生的分子或化合物。例如，在特定的實施方案中，連接模塊選自二硫橋、雙馬來酰亞胺、1，4- 二取代三唑、和N，N- 二炔丙胺。所述雙馬來酰亞胺可包括但不限于雙馬來酰亞胺-乙烷或雙馬來酰亞胺-己烷。在一些實施方案中，所述連接模塊不是肽鍵。在肽二聚體包含不與PTD綴合的ApoE肽的實施方案中，兩個ApoE肽可以這樣連接，使得第一 ApoE肽的羧基末端與第二 ApoE肽的氨基末端連接(例如直接連接)?；蛘撸瑑蓚€ApoE肽可以這樣連接,使得兩個ApoE肽彼此處于相反方向。例如,第一 ApoE肽的羧基末端可以與第二 ApoE肽的羧基末端連接，或者第一 ApoE肽的氨基末端可以與第二 ApoE肽的氨基末端連接。這樣的連接可以通過在第一和第二 ApoE肽的合適的末端添加一個或多個能夠進行交聯(lián)反應的氨基酸殘基(例如半胱氨酸、疊氮高丙氨酸、或炔丙基甘氨酸殘基)來實現(xiàn)。舉例而言，添加到第一和第二 ApoE肽二者的氨基末端的半胱氨酸殘基將產(chǎn)生這樣的二聚體，其中第一和第二 ApoE肽的氨基末端相互連接(見例如實施例2中的C0G492)。在肽二聚體包含至少一個與PTD綴合的ApoE肽的實施方案中，可以通過將ApoE-PTD綴合物中的至少一個連接殘基與另一個未綴合的ApoE肽的羧基或氨基末端處的氨基酸交聯(lián)來形成二聚體。如果兩個ApoE肽都與PTD綴合，則優(yōu)選地通過將每個ApoE-PTD綴合物中的至少一個連接殘基交聯(lián)，使得兩條肽鏈通過內(nèi)部氨基酸殘基連接在一起來形成二聚體。可以將ApoE肽或模擬域摻入多聚體中，使得一個ApoE多聚體包含三個或更多個ApoE肽或模擬域。所述多聚體中的一個或多個ApoE肽可以如本文中所述的那樣與PTD綴合。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種ApoE三聚體，包含第一 ApoE肽、第二 ApoE肽，和第三ApoE肽，其中所述第一、第二和第三ApoE肽通過連接模塊共價連接?？紤]到本發(fā)明范圍內(nèi)的其他ApoE多聚體。本發(fā)明的肽可以通過如本領域已知的標準技術(shù)來產(chǎn)生。本發(fā)明的肽可以附接于多種標記模塊，如放射性標記物、重原子標記物和熒光標記物,用于檢測和示蹤。突光標記物包括但不限于螢光素(Iuciferin)、突光素(fluorescein)、曙紅、Alexa Fluor、Oregon Green>Rhodamine Green、四甲基羅丹明、Rhodamine RecUTexas Red、香豆素和NBD熒光團，QSY 7、dabcyl和dabsyl生色團，BODIPY、Cy5等等。本領域技術(shù)人員能夠容易地對本文中公開的肽進行修飾以提高與這些肽相關(guān)的功能活性。例如，可以將本發(fā)明的肽二聚體化學修飾或綴合到其他分子，以提高溶解性、血清穩(wěn)定性等參數(shù)，同時保持功能活性。尤其是，可將二聚體的第一和/或第二 ApoE肽的N末端乙?；?或?qū)⑵銫末端酰胺化，或者可以將二聚體進一步與增加血清穩(wěn)定性的分子 綴合、復合(complex)或融合(fuse)，這樣的分子包括但不限于白蛋白、免疫球蛋白及其片段、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂蛋白、脂質(zhì)體、α-2-巨球蛋白和α-I-糖蛋白，PEG和右旋糖酐。這樣的分子在美國專利6，762，169中有詳細描述，通過提述并入其全部內(nèi)容。本發(fā)明的肽二聚體的ApoE肽還可以包括本文中所述的肽的保守變體。如本文中使用的，所謂保守變體是指氨基酸序列中不會對肽的生物學功能產(chǎn)生不利影響的改變。對于替代、插入或缺失來說，如果被改變的序列阻止或阻斷與該肽相關(guān)的生物學功能，則稱替代、插入或缺失對肽產(chǎn)生不利影響。例如，可以改變肽的總電荷、結(jié)構(gòu)或輸水/親水性質(zhì)而不對生物學活性產(chǎn)生不利影響。因此，可以改變氨基酸序列，例如改變使得肽更加疏水或者親水，而不對該肽的生物學活性產(chǎn)生不利影響。一般而言，所述肽的保守替代變體、類似物和衍生物與公開的序列，SEQ ID NO:3,4, 5,和35，將具有至少約55%，至少約65%，至少約75%,至少約80%，至少約85%，至少約90%，至少約95%，或至少約96%至99%的氨基酸序列同一性。相對于這些序列的同一性或同源性在此定義為將序列比對好，并且視需要引入缺口(gap)，以實現(xiàn)最大百分比的同一性，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分的情況下，候選序列中與已知肽相同的氨基酸殘基的百分比。N端、C端或內(nèi)部的延伸，缺失，或者對序列的插入不應視為影響同源性。因此，本發(fā)明的肽二聚體的第一和/或第二 ApoE肽包括具有SEQ ID N0:3，4，5和35中公開的氨基酸序列的分子，其具有治療肽的至少約3，4，5,6, 10，15或更多個氨基酸殘基的連續(xù)序列的片段；此類肽的氨基酸序列變體，其中氨基酸殘基已經(jīng)插入到公開的序列的N端或C端或序列之內(nèi)；以及公開的序列或它們的如上定義的片段的氨基酸序列變體，它們已經(jīng)被另一個殘基替代?？紤]的變體還包括通過例如同源同組、定點誘變或者PCR誘變等而含有預定的突變的變體，以及其他動物物種的相應肽，包括但不限于家兔、大鼠、豬、牛、綿羊、馬和非人靈長類物種，以及其中所述肽已經(jīng)通過取代、化學、酶學或其他合適的方式用天然氨基酸之外的模塊(例如可檢測的模塊，如酶或放射性同位素)共價修飾。交聯(lián)肽以形成肽二聚體的方法是本領域技術(shù)人員已知的，可包括但不限于通過馬來酰亞胺基團偶聯(lián)，和使用“點擊化學”偶聯(lián)(參見實施例3和附圖8-9)。本領域技術(shù)人員無需過多勞動即可確定其他用于共價連接本文公開的ApoE肽以形成肽二聚體的方法本發(fā)明的二聚體的ApoE肽可以是游離形式或者鹽的形式，當鹽可藥用時。這些包括鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳等的無機鹽。也可以制成所述肽的各種有機鹽，包括但不限于與乙酸、丙酸、丙酮酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水楊酸等成的鹽。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽二聚體與可藥用的擔載體組合使用。由此，本發(fā)明還提供適合施用于受試者的藥物組合物。這樣的組合物包含與可藥用的擔載體組合的有效量的本發(fā)明的ApoE肽二聚體。所述擔載體可以是液體，使得組合物適合于胃腸外施用，或者可以是固體，即配制用于口服施用的片劑或藥丸。此外，擔載體可以是可霧化的液體或固體的形式，使得組合物適于吸入。當胃腸外施用時，組合物應當是無熱原的，并且處于合適的胃腸外擔載體中。作為替代，活性劑可以使用已知方法包埋在脂質(zhì)體中來配制?？梢允褂帽绢I域中已知的技術(shù)來進行用于鼻內(nèi)施用的本發(fā)明的肽二聚體的制備。本發(fā)明的肽二聚體還可以配制為用于表面施用，例如以乳膏或凝膠的形式。表面施用對于治療皮膚癌或炎癥性皮膚狀況特別有用。在其他實施方案中，ApoE肽二聚體可以配制為用于直腸施用，例如以栓劑的形式。在一些實施方案中，ApoE肽二聚體的直腸施用對于結(jié)直腸癌、炎性腸病或克羅恩氏病的治療可能是優(yōu)選的?！?br> 本發(fā)明的肽二聚體的藥物制備物還可任選地包含可藥用的稀釋劑或賦形劑。本發(fā)明的ApoE肽二聚體可以包含進一步的修飾或者加以配制，以便特異性地靶向特定組織，例如發(fā)炎的組織或者癌性腫瘤。例如，可以將ApoE肽二聚體與可定位到腫瘤細胞的其他肽綴合，這樣的其他肽例如有美國專利6，380，161、美國專利申請公開號2003/0232013、WO 2009/155556和W02009/143023中公開的那些肽。并且/或者，可以將ApoE肽二聚體包埋到脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體可包含尋靶配體以便將脂質(zhì)體定位到特定的組織或腫瘤部位。本發(fā)明的ApoE肽二聚體的有效量是這樣的量，與沒有該肽的情況下相比，其可減少與癌癥相關(guān)的至少一種癥狀或病態(tài)，例如腫瘤大小、腫瘤生長、癌細胞的擴散、癌細胞的數(shù)目、以及生存。ApoE肽二聚體的有效量還可以是這樣的量，與沒有該化合物的情況下相t匕，其可減少小膠質(zhì)細胞活化(即減少小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性和神經(jīng)調(diào)節(jié)性化合物的量)。有效量(以及施用方式)，將基于個體來確定，并且將以所使用的肽二聚體的具體組成為基礎，同時考慮受試者(身材、年齡、一般健康狀況)、所治療的具體狀況(例如癌癥、神經(jīng)變性病癥、炎癥狀況)、要治療的癥狀的嚴重程度、所追求的結(jié)果、所使用的具體的擔載體或藥物配方、施用路徑、以及本領域技術(shù)人員容易想到的其他因素。本領域普通技術(shù)人員可使用本領域已知的技術(shù)來確定有效量。本文中描述的肽二聚體的治療有效量可以使用體外測試、動物模型、或本領域已知的其他劑量-響應研究來加以確定。本發(fā)明的ApoE肽二聚體可以急性施用(即在發(fā)病時，或者在導致特定狀況得到確診的事件之后不久)，或者可以預防性施用(例如，在計劃好的手術(shù)之前，或者在出現(xiàn)特定狀況的征象或癥狀之前)，或者可以在特定疾病或狀況的過程中施用，以減輕或緩解原本會發(fā)生的癥狀發(fā)展。施用的時機和時間間隔根據(jù)受試者的癥狀而改變，施用間隔可以為數(shù)小時到數(shù)天，時程可以以小時計，以天計，以周計或者更長，可以由本領域技術(shù)人員來確定。典型的每日給藥方案可以是從0.01 μ g/kg體重每日，從大約lmg/kg體重每日，從大約10mg/kg體重每日，從大約100mg/kg體重每日，從大約1，000mg/kg體重每日。根據(jù)要施用的具體ApoE肽二聚體的不同，劑量可以為約lmg/kg到約500mg/kg體重每日之間，優(yōu)選約25mg/kg到約400mg/kg體重姆日之間，或更優(yōu)選約50mg/kg到約250mg/kg體
重每日之間。本發(fā)明提供通過施用有效量的至少ー種如本文所述的ApoE肽ニ聚體來在有需要的受試者中治療癌癥的方法。在特定的實施方案中，所述至少ー種ApoE肽ニ聚體包含選自下組的序列SEQ ID NO: 1，3，4，5，6，7，10，11，12，13，14，15，35，90，其有效片段和變體。ApoE肽ニ聚體可減少一種或多種與癌癥相關(guān)的癥狀，包括但不限于腫瘤形成、腫瘤生長、癌性細胞數(shù)目、癌性細胞對健康組織的擴散、以及生存減少。可以用本發(fā)明的肽ニ聚體和方法來治療的癌癥包括，但不限于各種形式的白血病(CLL、CML、ALL、AML)，乳腺癌，卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌、腦癌(例如膠質(zhì)細胞瘤)、皮膚癌(黑素瘤和非黑素瘤)、頭頸癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、胃癌、食道癌、膽囊癌、肝癌、淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤)、以及肉瘤。在一個實施方案中，所述ApoE肽ニ聚體能減少在多種癌癥中異?；罨男盘杺鲗緩?例如Akt途徑)的活化(見實施例5)。ApoE肽還可活化PP2A (實施例2、5和10)。PP2A據(jù)報道可負調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞活動性，而內(nèi)皮細胞活動性是癌癥中的血管新生和腫瘤轉(zhuǎn)移所必需的(Gabel et al, 1999, Otolaryngol Head Neck Surg. 121:463-468; Young, MR. , 1997, Adv Exp Med Biol. 407:3 11-318)。岡田酸對PP2A 的抑制通過破壞細胞骨架網(wǎng)絡而增加細胞活動性，從而增強腫瘤細胞的侵襲性質(zhì)。因此，本發(fā)明的肽ニ聚體可通過活化PP2A而降低腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和癌癥相關(guān)的血管新生。在本發(fā)明的一個實施方案中，ApoE肽的施用増加受試者體內(nèi)癌細胞中的PP2A活性。在另ー個實施方案中，ApoE肽的施用降低受試者體內(nèi)癌細胞中的Akt激酶活性。在又一個實施方案中，ApoE肽的施用誘導受試者體內(nèi)癌細胞中的細胞毒性。本發(fā)明還提供ー種用于治療白血病的方法，包括以一定的量施用至少ー種ApoE肽ニ聚體，所述量與沒有該肽ニ聚體的情況下相比可減少該疾病的癥狀。在一個實施方案中，所述白血病是慢性髓性白血病(CML)。SET( BP I2PP2A)是ー種內(nèi)源PP2A負調(diào)節(jié)物，它在CML中過表達并抑制PP2A，從而保持致癌的BCR/ABL激酶途徑的活化(Neviani etal. (2005)Cancer Cell. 8:355-368)。因此，施用本發(fā)明的ApoE肽ニ聚體可活化PP2A，然后PP2A可自由地對細胞擴增和生存的調(diào)節(jié)物進行去磷酸化并遏制BCR/ABL激酶的致癌活性，從而減少白血病生成。在一個實施方案中，所述白血病是慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。在優(yōu)選的實施方案中，ApoE肽ニ聚體的施用減少受試者體內(nèi)的CD5+B細胞數(shù)。在另ー個實施方案中，所述白血病是急性淋巴細胞性白血病(ALL)。本發(fā)明還涵蓋通過對受試者施用有效量的至少ー種ApoE肽ニ聚體來治療受試者中的乳腺癌的方法。在一個實施方案中，所述乳腺癌以Her2表達為特征。在另ー個實施方案中，所述乳腺癌以雌激素受體的表達為特征。在另ー個實施方案中，所述乳腺癌以孕酮受體的表達為特征。本發(fā)明的ApoE肽ニ聚體可以用來治療乳腺癌的三種主要亞型中的任ー種腔內(nèi)腫瘤(ER+/HER2-)、Her2擴增腫瘤(HER2+)、或者三陰性乳腺癌(TNBC，ER-/PR-/HER2-)。在特定的實施方案中，要用本發(fā)明的ApoE肽ニ聚體治療的乳腺癌是三陰性乳腺癌，其特征是缺少雌激素受體、孕酮受體、以及HER2受體的表達。ApoE肽ニ聚體的施用優(yōu)選在它們的施用之后減少腫瘤生長。本發(fā)明的ApoE肽ニ聚體可單獨用來治療癌癥或者與其他常用于治療癌癥的治療劑組合使用，這樣的治療劑例如化療劑(苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺)，皮質(zhì)類固醇(強的松，強
17的松龍)、氟達拉濱、噴司他丁、克拉屈濱、伊馬替尼(Gleevec)、達沙替尼(Sprycel)、激素治療(他莫昔芬、芳香酶抑制劑)、索拉非尼、吉非替尼、和放射。在一些實施方案中，ApoE肽二聚體與索拉非尼或吉非替尼聯(lián)用來治療癌癥。如本文中使用的，“與……聯(lián)用”是指施用ApoE肽二聚體和其他治療劑使得它們的作用在時間上重疊。因此，ApoE肽二聚體可以與其他治療劑同時使用或者在施用所述治療劑之前或之后施用。本發(fā)明提供一種用于預測或評價用于在患者中治療癌癥的治療性介入的功效的方法。在一個實施方案中，所述方法包括測量來自患者的生物樣品中SET蛋白的表達水平，并比較測得的水平與對照樣品中SET蛋白的表達水平，其中測得的SET蛋白的表達水平指示所述治療性介入的治療功效。在特定的實施方案中，所述治療性介入是本發(fā)明的ApoE肽或肽二聚體。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ApoE模擬肽和肽二聚體結(jié)合SET (即I2PP2A)并解除其對內(nèi)源PP2A的抑制，從而增加細胞中PP2A的活性。不限于任何具體理論，認為這種由ApoE肽或肽二聚體誘導的PP2A活性增加觸發(fā)凋亡，導致癌細胞的細胞毒性。因此，過表達SET蛋白的癌細胞對ApoE肽誘導的細胞毒性特別敏感。由此，本發(fā)明包括一種預測ApoE肽或肽二聚體在患者中治療癌癥的治療功效的方法，該方法是通過測量來自患者的生物樣品中SET蛋白的表達水平，并將測得的水平與對照樣品中SET蛋白的表達水平比較來進行的，其 中測得的SET蛋白的表達水平指示ApoE肽或肽二聚體的治療功效。在一個實施方案中，測得的相對于對照樣品為至少2倍的SET表達水平指示ApoE肽或肽二聚體在所述患者中治療癌癥的治療功效。在一些實施方案中，測得的相對于對照樣品為至少4倍、至少5倍、至少8倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、或至少20倍的SET表達水平指示ApoE肽或肽二聚體在所述患者中治療癌癥的治療功效。在一個實施方案中，所述方法可預測ApoE肽或肽二聚體在患者中治療乳腺癌的治療功效。在另一個實施方案中，所述方法可預測ApoE肽或肽二聚體在患者中治療三陰性乳腺癌(雌激素受體陰性、孕酮受體陰性，以及HER2受體陰性)的治療功效。在另一個實施方案中，所述方法可預測ApoE肽或肽二聚體在患者中治療B細胞淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤)的治療功效。在又一個實施方案中，所述方法可預測ApoE肽或肽二聚體在患者中治療白血病(例如CML或CLL)的治療功效。SET表達可以通過評估SET蛋白或SET轉(zhuǎn)錄物的水平來測定。SET表達可以通過本領域已知的方法來測量，這樣的方法包括但不限于Northern印跡、PCR、RT-PCR、Western印跡、免疫測定(例如ELISA或多重測定(multiplexedassays))、2D凝膠電泳、和雜交。在一個實施方案中，測量SET蛋白表達。在特定實施方案中，所述用于預測ApoE肽療法在患者中治療癌癥的功效的方法還包括在評估了患者的生物樣品中的SET表達后，對該患者施用至少一種ApoE肽或肽二聚體。本文中描述的任何ApoE肽或其二聚體都適用于該方法。例如,在一些實施方案中，對患者施用具有選自SEQ ID N0:l、3、4、5、6、7、10、ll、12、13、14、15、35、90及其有效片段和變體的序列的ApoE肽或其二聚體。在另一個實施方案中，本發(fā)明還包括根據(jù)所述患者的生物樣品中的SET蛋白的表達水平來調(diào)整ApoE肽或肽二聚體的具體類型或者ApoE肽或肽二聚體的劑量。可以在一段特定的時間內(nèi)或者整個治療期內(nèi)多次測量患者中的SET表達水平。所述生物樣品可以使任何包含癌性細胞的組織樣品。例如，所述生物樣品可以包括，但不限于來自實體瘤(例如乳腺癌、淋巴瘤、肉瘤等)的活檢，或者從血液分離的外周血單個核細胞(PBMC)。在一個實施方案中，所述生物樣品是CD19+/CD5+白血病細胞。對照樣品可以使任何含有正?；蚍伟┘毎慕M織樣品，例如從正常的年齡匹配的患者分離的PBMC，或者從要治療的患者或從正常的、年齡匹配的對照患者獲得的非癌性組織(例如乳腺、淋巴、皮膚等等)。本發(fā)明還涵蓋用于預測或評估ApoE肽或肽ニ聚體用于在患者中治療癌癥的治療功效的試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒包含用于測量生物樣品中SET蛋白表達的試劑，以及關(guān)于測量SET蛋白表達以預測或評估ApoE肽或肽ニ聚體用于在患者中治療癌癥的治療功效的說明。在一些實施方案中，用于測量SET表達的試劑可包括SET特異性抗體、ELISA試劑、以及用于擴增和檢測SET mRNA的引物和探針。在其他實施方案中，所述試劑盒還可包括ー個或多個標準化對照。例如，標準化對照可以是外源添加的、天然不存在于樣品中的RNA或蛋白，或者其可為已知在特定的生物樣品或細胞中組成性表達的蛋白質(zhì)或RNA，例如β_肌動蛋白。在這樣的實施方案中，所述試劑盒可進一歩提供用于檢測和定量所述標準化対照的試劑(抗體、引物、探針等)。在一些實施方案中，所述試劑盒還可以包括ー套參照值，可用來與測得的SET表達水平比較。本發(fā)明提供一種用于在有需要的受試者中降低膠質(zhì)細胞活化或小膠質(zhì)細胞活化的方法，該方法是通過對所述受試者施用至少ー種本發(fā)明的ApoE肽ニ聚體來實施的。在一個實施方案中，所述小膠質(zhì)細胞活化與中樞神經(jīng)(CNS)炎癥、創(chuàng)傷性腦損傷、腦缺血或腦水腫相關(guān)。因此，本發(fā)明和組合物可用于預防、遏制或降低作為急性或慢性CNS疾病的一部分發(fā)生的CNS中膠質(zhì)細胞的活化。本發(fā)明方法和肽ニ聚體的效果可以在細胞或組織水平評估(例如通過組織學或形態(tài)測量手段)，或者通過評價受試者的神經(jīng)學狀態(tài)來評估。膠質(zhì)細胞活化的遏制或降低可通過多種方法來評估，這對本領域技術(shù)人員而言是顯而易見的；ー種這樣的方法是測量已知由活化的膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的化合物的產(chǎn)生或存在，并將這樣的測量值與相同化合物在對照情況下的水平相比較?；蛘?，本發(fā)明的方法和肽ニ聚體遏制、降低或防止小膠質(zhì)細胞活化的效果可以通過比較經(jīng)過處理的受試者和對照受試者中CNS疾病的體征和/或癥狀來加以評估，其中這樣的體征和/或癥狀與小膠質(zhì)細胞的活化相關(guān)或者繼發(fā)于小膠質(zhì)細胞的活化。本發(fā)明的方法和肽ニ聚體可用于預防、治療或緩解與急性CNS損傷相關(guān)的神經(jīng)學體征和癥狀。如本文中使用的，所謂急性CNS損傷包括但不限于卒中(由血栓形成、栓塞或血管收縮造成的)、閉合性頭部外傷、全腦缺血(例如由于任何原因，包括心肌梗塞、心律不齊、出血性休克、以及冠狀動脈旁路搭橋術(shù)后的腦損傷，造成的系統(tǒng)性低血壓而導致的缺血)、局灶性缺血、以及顱內(nèi)出血。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的出血性損傷可以是局灶性或全局性狀況的結(jié)果。全局性缺血在流向全腦的血流停止一段時間(例如在心臟停搏過程中)時發(fā)生。局灶性缺血在腦的一部分的正常血流被剝奪(例如在血栓栓塞性腦血管堵塞、創(chuàng)傷性腦損傷、水腫和腦腫瘤中)時發(fā)生。由于腦缺血導致的CNS損傷大多發(fā)生在缺血狀況之后數(shù)小時甚至數(shù)天內(nèi)，并繼發(fā)于受損組織的細胞毒性產(chǎn)物的釋放。本發(fā)明的方法和肽ニ聚體還可用于預防、治療或緩解與影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(包括CNS)的炎癥狀況相關(guān)的神經(jīng)學體征和癥狀，包括但不限于多發(fā)性硬化、血管炎、急性播散性腦脊髄炎和格-巴ニ氏綜合征。在此方面，本發(fā)明的ApoE肽ニ聚體可以單獨使用或者與其他已知的抗炎藥或細胞因子聯(lián)用以配制成用于治療CNS炎癥狀況的藥物組合物。
在另ー個實施方案中，本發(fā)明提供在有需要的受試者中減少神經(jīng)元細胞死亡的方法，包括對受試者使用有效量的至少ー種本文中描述的ApoE肽ニ聚體。在一些實施方案中，神經(jīng)元細胞死亡與谷氨酸興奮性中毒(glutamate excitotoxicity)相關(guān)。先前發(fā)現(xiàn)C0G133単體肽顯著抑制與N-甲基-D天冬氨酸暴露相關(guān)的神經(jīng)元細胞死亡和鈣內(nèi)流(見例如美國專利公開號2003/0077641A1，茲通過提述并入其全部內(nèi)容)。因此，本發(fā)明的肽ニ聚體為改良的用于治療與NMDA受體過刺激介導的谷氨酸興奮性中毒相關(guān)的疾病的治療組合物提供了基礎。例如，人們已經(jīng)將谷氨酸興奮性中毒與下述狀況關(guān)聯(lián)起來山黧豆中毒(neurolathyrism),肌萎縮側(cè)索硬化(ALS) (Doble (1999) Pharmacol.Ther.，Vol. 81:163-221)，精神分裂癥(Nguimfack (2002) Encephale, Vol. 28:147-153)、亨廷頓舞蹈癥、帕金森氏病(Nguimf ack, 2002; Myti lineou et al. (1997) J. Neurochem. , Vol. 68:33-39;Klopman and Sedykh(2002)BMC Pharmacol. , Vol.2:8;Le andLipton(2001)Drugs Aging, Vol. 18:717-724),雙相型障礙(Farber et al. (2002)Mol. Psychiatry, Vol. 7:726-733),人和動物中的實驗性自身免疫腦炎(EAE)中的多發(fā)性硬化(Paul and Bolton(2002)J. Pharmacol. Exp. Ther. , Vol. 302:50-57)> 抑郁癥、卒中(Le and Lipton，2001)、癲癇和遺傳性神經(jīng)代謝疾病d_2-羥基戊ニ酸尿病(Kolker et al. (2002) Eur. J. Neurosci. , Vol. 16:21-28),以及阿爾茨海默病(Bi etal. (2002) Neuroscience, Vol. I 12:827-840; Bi et al. (2002) J. Neurol. Sci. , Vol. 200:11-18)和創(chuàng)傷性腦損傷(Rao et al. (2001) Brain Res. ,Vol. 911:96-100; Regneret a I. (2001)J.Neurotrauma, Vol. 18:783-792;Xu and Luo (200 I)Chin.J. TraumatoI. , Vol. 4:135-138)。因此，本發(fā)明包括公開的肽ニ聚體在用于治療任何上述疾病或病癥的方法和藥物制劑中的應用，以及在含有其他可用于治療所述各種病癥的已知化合物的聯(lián)合治療組合物中的應用。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的肽ニ聚體可以用于在有需要的受試者中治療山黧豆中毒、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、亨廷頓氏病、帕金森氏病、或精神分裂癥。利魯唑(Riluzole)(力如太(RILUTEK) ,Rhone-Poulenc)是一種具有谷氨酸
拮抗性質(zhì)的物質(zhì)，用于肌萎縮側(cè)索硬化中的神經(jīng)保護治療，已經(jīng)在臨床試驗中測試用于治療亨廷頓氏病和帕金森氏病(Schiefer et al. (2002)Mov. Disord. , Vol. 17:748-757;Doble, 1999) Jchiefer及其同事最近證實利魯唑在亨廷頓氏病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中延長生存時間并改變核包涵體的形成。因此，考慮到本發(fā)明的肽ニ聚體可能的NMDA拮抗作用，這些肽ニ聚體可以單獨地或者與其他谷氨酸拮抗劑如利魯唑聯(lián)合用于治療ALS、亨廷頓氏病和帕金森氏病的藥物制劑中。L-司來吉蘭(L-Deprenyl)是單胺氧化酶(MAO)-B的抑制劑,其可延遲帕金森氏病失能的出現(xiàn)和體征和癥狀的進展，并且被預測可針對谷氨酸受體活化的下游事件發(fā)揮保護作用(Mytilineou et al，1997)。MAO-B抑制劑，多巴胺受體拮抗劑，如左旋多巴，以及NMDA受體拮抗劑都已經(jīng)顯示具有抗帕金森作用，而且還已經(jīng)顯示多種藥物的組合能夠協(xié)同地提高這些藥物的抗帕金森作用(Klopman and Sedykh，2002)。因此，考慮到本發(fā)明的肽ニ聚體的可能的NMDA拮抗作用，這些肽可以單獨地或者與其他NMDA拮抗劑、MAO-B抑制劑如L-司來吉蘭，多巴胺受體激動劑如左旋多巴聯(lián)合用于治療帕金森氏病的藥物制劑中。已發(fā)現(xiàn)谷氨酸興奮性中毒導致的自由基產(chǎn)生與精神分裂癥的發(fā)病機制有牽連(Nguimfack, 2002)。因此，研究者們已經(jīng)開始考察用ALS、帕金森氏病和亨廷頓氏病等其他神經(jīng)疾病的治療中使用的抗氧化物質(zhì)來治療精神分裂癥?？紤]到本發(fā)明的肽二聚體很可能具有NMDA受體拮抗性質(zhì)并且能夠用來抑制由谷氨酸興奮性中毒導致的自由基產(chǎn)生，這些肽可以單獨地或者與其他抗氧化物質(zhì)聯(lián)合用于治療精神分裂癥的藥物制劑中。本發(fā)明還包括用于在有需要的受試者中治療、預防或緩解多發(fā)性硬化的癥狀的方法，所述方法是通過對所述受試者施用有效量的至少一種本發(fā)明的ApoE肽二聚體來進行的。從對免疫治療的應答，以及實驗性自身免疫腦炎(EAE)的動物模型的存在可以確定多發(fā)性硬化(MS)是一種免疫介導的疾病。參見例如Mix et al. (2004) J. NeuroimmunoL, Vol. 151 (1-2) : 158-70，Anderson, et al. (2004)，Ann. Neurol, Vol. 55 (5) : 654-9，和Ni et al. (2004) Mult. Scler. ,Vol. 10(2) : 158-64。目前用于反復性和弛張性 MS 的治療藥干擾素(IFN) β-lb，IFN-β-Ia和乙酸格拉默(克帕松(COPAXONE) ，Teva)具有應對MS的免疫學病理生理的作用機制(Dhib-Jalbut (2002)Neurology, Vol. 58:S3_S9)。例如，干擾素結(jié)合細胞表面特異性受體，引發(fā)信號傳導途徑的級聯(lián)，最終導致分泌抗病毒、抗增殖、和免疫調(diào)節(jié)性基因產(chǎn)物的分泌。乙酸格拉默，一種合成分子，抑制髓磷脂堿性蛋白反應性T細胞的活化并誘導產(chǎn)生以抗炎作用為特征的T細胞庫。一些目前上市的治療 藥，包括IV免疫球蛋白(GAMAGARD ，Baxter)，甲氨蝶呤((RHEUMATREX ，American Cyanamid),和硫唑嘌呤(IMURAN⑧，GlaxoSmithKline),已經(jīng)作為與已獲批準的治療聯(lián)用的復發(fā)性-弛張性多發(fā)性硬化治療藥接受了評估(Calabresi (2002)Neurology, Vol. 58: S10-S22)?？紤]到 NMDA 受體拮抗劑美金剛(NAMENDA_ ，Merz)已經(jīng)被證明可防止血腦屏障的破壞和恢復血腦屏障以及減少與EAE致病機制相關(guān)的體內(nèi)癥狀(Paul and Bolton, 2002),本發(fā)明的肽二聚體可以單獨地或者與其他NMDA受體拮抗劑聯(lián)合，或者作為干擾素或乙酸格拉默的附加用于治療人體中的MS。本發(fā)明涵蓋通過對受試者施用至少一種如本文所述的ApoE肽二聚體來在有需要的受試者中治療、預防或緩解類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎或多關(guān)節(jié)型幼年類風濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀的方法?，F(xiàn)有的關(guān)節(jié)炎治療手段包括與腫瘤壞死因子結(jié)合的肽和蛋白質(zhì)。依那西普(ENBREL ,Amgen)是一種二聚體融合蛋白，由人75kd腫瘤壞死因子受體的胞外配體結(jié)合部分及與之連接的人IgGl Fe部分構(gòu)成。阿達木單抗(HUMIRA ,Abbott)是一種重組人IgGl單克隆抗體。腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白已經(jīng)在延緩類風濕性關(guān)節(jié)炎和其他風濕性疾病的癥狀的進展和減輕其癥狀方面顯示了優(yōu)秀的結(jié)果。因此，本發(fā)明的肽二聚體可以單獨地或者與其他藥物聯(lián)合用于治療類風濕性疾病，包括例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、多關(guān)節(jié)幼年型類風濕性關(guān)節(jié)炎、和銀屑病關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的方法和ApoE肽二聚體還可用來治療、預防或緩解與慢性神經(jīng)疾病(包括但不限于阿爾茨海默病(AD)和HIV相關(guān)腦病)相關(guān)的神經(jīng)體征和癥狀。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)ApoE肽二聚體特別強地遏制小膠質(zhì)細胞活化，為本發(fā)明的肽二聚體提供了在任何涉及小膠質(zhì)細胞活化的神經(jīng)疾病的治療中發(fā)揮作用的機會。例如，小膠質(zhì)細胞在AD中表達活化標志物，暗示AD中的關(guān)鍵的炎癥事件牽涉小膠質(zhì)細胞。這樣的活化的小膠質(zhì)細胞在淀粉樣斑塊附近積聚(Griffin et al. (1995) J. Neuropath. Exp. Neurol.，Vol. 54:276)。小膠質(zhì)細胞也在療癇中活化(Sheng et al. (1994) J. Neurochem, Vol. 63:1872) 已經(jīng)證明淀粉樣蛋白β肽的攝取和致病作用被NMDA受體拮抗劑所阻斷(Bi etCN 102917727 A
書
明
說
18/34 頁
al. , 2002) ο其他研究提示抗炎癥藥物可延遲AD的發(fā)病或進展(Breitner et al. (1995)Neurobiol. Aging, Vol. 16:523;Rogers et al. (1993)Neurology, Vol. 43:1609) 因此，本發(fā)明的肽ニ聚體可単獨地或者與其他NMDA受體拮抗劑或其他已知的用于治療AD的藥物，尤其是抗炎藥物聯(lián)合在人體AD的治療組合物或方法中使用。本發(fā)明包括通過對受試者施用有效量的本發(fā)明的ApoE肽ニ聚體來在有需要的受·試者中治療、預防或緩解細菌性膿毒病的方法。已經(jīng)證明，在體內(nèi)膿毒癥動物模型中，單體型ApoE受體結(jié)合肽可提供針對外周中(periphery) LPS誘導的細胞因子產(chǎn)生的保護。參見美國專利公開號2003/0077641 Al，茲通過提述并入其全部內(nèi)容。因此，本發(fā)明的肽ニ聚體可以單獨地或者與其他已知的抗炎性細胞因子和抗體聯(lián)合用于治療膿毒癥的組合物和方法中。已知炎癥過程介導動脈粥樣硬化過程的ー個方面，參見例如Hansson (1994) BasicRes. Cardiol. , Vol. 89:41;Berliner et al. (1995)Circulation, Vol. 91:2488;Watanabeet al. (1997) Int. J. Cardiol.，Vol. 54:551。已知血管壁上的巨噬細胞局部地分泌ApoE (雖然個體中由巨噬細胞分泌的量與由肝臟產(chǎn)生的ApoE的量相比是微不足道的)。在經(jīng)典的動脈粥樣硬化模型中，ApoE發(fā)揮從血流中去除膽固醇并將它輸送到巨噬細胞或肝臟的功能。但是已經(jīng)清楚，血管壁處的巨噬細胞分泌的ApoE減少動脈粥樣硬化斑塊的形成，而不依賴于任何脂質(zhì)代謝效應。例如，ApoE缺陷小鼠被普遍承認是高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化疾病的模型。對這樣的小鼠提供分泌ApoE的巨噬細胞可急劇降低動脈粥樣硬化斑塊的形成。Linton et al. (1995) Science, Vol. 267:1034。反過來，將野生型小鼠的巨噬細胞替換為ApoE缺陷的巨噬細胞可加速動脈粥樣硬化性改變，盡管該動物的肝臟仍然產(chǎn)生ApoE。Fazio et al. (1997)Proc. Natl. Acad. Sci.，Vol. 94:4647。在動脈粥樣硬化中，有假說稱ApoE通過某種受體介導的事件下調(diào)血管壁附近的巨噬細胞活化。這樣的巨噬細胞活化下調(diào)阻斷或干擾與動脈粥樣硬化斑塊形成相關(guān)的事件級聯(lián)，從而減少或減慢動脈粥樣硬化病灶的形成。已知與動脈粥樣硬化相關(guān)的事件級聯(lián)包括平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞増殖，以及泡沫細胞形成。有證據(jù)證明ApoE下調(diào)所有這些過程。因此ApoE影響體內(nèi)的動脈粥樣硬化的存在和進展，而不依賴于其對脂質(zhì)的效果。動脈粥樣硬化的進展可以通過測量動脈粥樣硬化斑塊的量或大小、或者被動脈粥樣硬化病灶阻塞的血管的百分比，或這樣的斑塊的生長速率來加以評估。動脈粥樣硬化是指動脈內(nèi)膜的增厚和動脈粥樣硬化斑塊中脂質(zhì)的累積。本發(fā)明提供通過施用一種或多種本發(fā)明的肽ニ聚體來在有需要的受試者中治療動脈粥樣硬化或減少動脈粥樣硬化斑塊的形成的方法?？梢杂帽痉矫鎭碇委煹臓顩r包括冠狀動脈、對CNS供血的動脈如頸動脈、外周循環(huán)或內(nèi)臟血液循環(huán)動脈的動脈粥樣硬化；以及腎動脈疾病。施用，例如胃腸外施用可以是部位特異性的，或者可以施用到全身血流中。在一些實施方案中，肽ニ聚體可以與額外的抗動脈粥樣硬化藥(包括HMG-CoA還原酶抑制劑，又稱他汀類)聯(lián)用。適用于本發(fā)明的方法的他汀類包括，例如，洛伐他汀(MEV ACOR , Merck)、辛伐他汀(ZOCOR , Merck)、普伐他汀(PRAVACHOL , BristolMyers Squibb)、羅蘇伐他汀(CRESTOR , AstraZeneca)、氣伐他 」’(LESCOL , Novartis)和阿托伐他汀(LIPITOR , Warner-Lambert)。本發(fā)明還提供了通過施用有效量的至少ー種本發(fā)明的ApoE肽ニ聚體來在有需要
22的受試者中治療、預防或緩解炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀的方法。在本發(fā)明的方法的實施中，治療肽和/或其衍生物可以單獨使用或者與其他活性成分聯(lián)用。如果期望，可用一種或多種通常用于治療炎性腸病的藥劑來作為本發(fā)明的方法和組合物中的治療肽的替代或者附加。這樣的藥劑包括生物藥(例如inflixamab, adelimumab,和 CDP-870)，小分子免疫調(diào)節(jié)物(例如 VX 702、SCIO 469、doramapimod、RO 30201 195、SCI0323、DPC 333、pranalcasan、霉酚酸酯、和merim印odib)，非留類親免疫因子依賴性免疫抑制劑(例如環(huán)孢霉素A，他克莫司，吡美莫司，和ISAtx247)，5-氨基水楊酸(例如美沙拉秦、柳氮磺吡啶、巴柳氮二鈉、和奧柳氮鈉)，DMARD (例如甲氨蝶呤和硫唑嘌呤)以及阿洛司瓊。受益于本發(fā)明的組合物和方法的合適的受試者包括雄性和雌性哺乳動物受試者，包括人，非人靈長類，和非靈長類哺乳動物。受試者包括獸類(veterinary)(伴侶動物)受試者，以及家畜和外來物種(exotic species)。
下面的實施例用于例示本發(fā)明，不應解釋為對本發(fā)明構(gòu)成限制。
實施例實施例I. 二硫化物二聚體的形成增強ApoE肽的細胞毒活性我們先前已經(jīng)顯示，通過對apoE模擬性C0G133肽(LRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ IDNO:3))添加蛋白轉(zhuǎn)導域(PTD)，如觸角足(觸角足)肽，可增強其抗炎癥活性。通過化學合成制備了一系列C0G133與PTD綴合的融合肽。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)在BV2細胞中，在用 LPS 刺激之后，具有序列 RQIKIWFQNRRMKWKCLRVRLASHLRKLRKRLL (SEQ ID NO: I)的 COGl 12可有效地遏制NO, TNFa和IL-6的產(chǎn)生，IC50分別為2InM, 58nM,和12nM(圖I)。這些結(jié)果展示了 C0G112的一個顯著的安全窗，其中有效的抑制發(fā)生在12-58nM的濃度，而LD50高于其超過120倍，為7μΜ。在測試多種化合物針對CLL細胞的細胞毒性的過程中，我們發(fā)現(xiàn)C0G112具有220ηΜ的ED50。這些數(shù)據(jù)是使用批號313的C0G112肽產(chǎn)生的。當批號313C0G112肽的庫存耗盡后，我們開始使用新合成的C0G112 (批號411)，發(fā)現(xiàn)ED50降低到I. 2 μ Μ。雖然這一批比仍然比缺少觸角足PTD的apoE模擬C0G133更強，但比批號313的活性低。為了確定這兩批C0G112之間任何可能的結(jié)構(gòu)差異，我們利用正檢測模式下的帶電噴霧離子化的液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)技術(shù)測定了來自這兩個不同批次的C0G112。對于來自批號313的COGl 12，觀察到了一個質(zhì)荷比(M/Z)為1126. 3的主峰，以及M/Z=1800. 9、1286. 6、和1001. 5的峰(圖2A中的紅色箭頭)。據(jù)分析，M/Z 1800. 9的峰來自一個帶5個正電荷的二聚體化肽的質(zhì)量+5質(zhì)子形式(表示為[Μ+5ΗΓ/5)，1286.6的峰來自[Μ+7ΗΓ/7種類。實際上，該二聚體預期有 M/Z=1801. 3,1501. 2,1286. 9,1126. 2、100L 1,901. I 的峰，而單體肽預期有 Μ/Ζ=1501. 6、1126. 4,901. 3,751. 3、和 644. I 的峰。為了確證這一發(fā)現(xiàn)，我們用二巰蘇糖醇處理來自批次313的COGl 12以將二硫化物還原成游離巰基，制備了還原型的C0G112，并重復了 LC/MS分析(圖2Β)。在該還原型的肽中，觀察至IJ Μ/Ζ=1501. O、1126. 4. 901. 3,751. 3和644. 2的峰，與單體肽預期的峰很好地吻合。通過在氧化性條件下攪拌單體并純化二聚體(又稱為C0G445，以區(qū)分C0G112的二聚體形式和單體形式)來強迫形成二硫化物，確認了二聚體是C0G112的活性形式。通過LC/MS 分析 C0G445 給出了 Μ/Ζ=1800· 5,1501. 3,1286. 6,1126. I、1001. O、和 901. 2 的 MS 峰(圖2C)，其中1800. 5、1286. 6和1001. O處的峰是該肽的二聚體形式所獨有的，從而確認了該化合物的二硫橋。確認了 C0G445的二聚體結(jié)構(gòu)之后，我們接下來評估了該肽在BV2細胞測定中的NO釋放并對其進行了 CLL細胞毒性細胞測定。在BV2測定中，我們確認了 NO釋放的IC50為20nM, CLL細胞的細胞毒性的ED50為ΙΙΟηΜ。對于C0G445，重要的是先前的ED50值(例如220nM)是利用單體的分子量4502而不是二聚體的真實分子量9004來報道的。基于C0G445的真實分子量進行校正后，CLL細胞毒性的ED50值被降低到ΙΙΟηΜ。實施例2不可還原的COGl 12 二聚體肽活化PP2A并且對癌細胞具有細胞毒性在發(fā)現(xiàn)C0G112作為二硫化物連接的二聚體發(fā)揮活性之后，我們探尋了穩(wěn)定化COGl 12的二聚體狀態(tài)的方法。我們首先在稀溶液中用5倍摩爾過量的雙馬來酰亞胺乙烷(BMOE)處理還原型COG112肽。通過加入醚沉淀出肽，過濾收集肽，洗滌去除未反應的BMOE，·然后在真空下干燥。將BMOE連接的肽溶解在緩沖液中并與I. 5-2. O倍摩爾過量的新鮮還原的C0G112混合。通過HPLC檢測交聯(lián)情況直到反應完成，產(chǎn)生的肽-BMOE-接頭-肽二聚體用醚沉淀，收集、洗滌、并通過反相HPLC純化到98%的純度。通過MS確認該肽的身份(稱之為C0G449)，并對其進行BV2N0釋放測定法測定。如圖3所示，我們觀察到使用C0G449從BV2小膠質(zhì)細胞釋放一氧化氮的IC50為9. 4nM，相比于C0G445 ( 二硫化物連接的COGl 12 二聚體)活性提高大約2倍。為了進一步評估C0G449的效果，我們測量了穩(wěn)定的二聚體化C0G449化合物在32D:p210BCE/Abl慢性髓性白血病細胞中活化PP2A的能力。用C0G445或C0G449處理后，由于PP2A的活化，導致磷酸的釋放相對于未處理的對照細胞增加(圖4A)。然而，C0G449處理增加該速率(rate)的程度比C0G445更高，這提示有可能會發(fā)現(xiàn)C0G449及其他穩(wěn)定的二聚體肽具有更高的CLL細胞殺滅強度。C0G449還顯示比FTH720 ( —種先前證明可活化PP2A 的物質(zhì)(Neviani et al. (2007) J Clin Invest, Vol. I 17:2408-2421))更強的 PP2A活化。32D:p210BGK/Abl慢性髓性白血病細胞不用化合物處理、用IyM C0G449處理，或者用5 μ M FTH720處理。我們觀察到，用C0G449單獨處理后，與未處理的對照相比，ΡΡ2Α的相對比活性(磷酸釋放/分鐘/單位蛋白)穩(wěn)健地增加約45%，并且與FTY720相比有大約20%的活化(圖4Β)。根據(jù)在含血清的培養(yǎng)基中ΡΡ2Α的活化以及在BV2測定中對NO的強力抑制，我們測定了 C0G445和C0G449針對源自患者的CLL細胞和正常B細胞的細胞毒性(圖5)。從CLL患者收集血液，使用RosetteS印( )人B細胞富集雞尾酒根據(jù)制造商的說明分離⑶5+/⑶19+CLL細胞，并用COG化合物進行處理。將化合物施加于B-CLL細胞(96孔板中，2. 5x10s個細胞/孔)，然后處理細胞72小時。處理期之后，利用MTS測定法(Pharmacia)評估活細胞以確定可有效殺死50%的輸入CLL細胞的COG化合物的濃度(EC50)。和PP2A活化以及NO釋放的數(shù)值一樣，C0G449相比于C0G445顯示了更高的效力，如下面的表I所列。C0G445和C0G449處理來自志愿者的正常B細胞的細胞毒性的EC50值要高出將近200倍(高于10 μ M)。為了更充分地了解COG肽的PTD域和apoE域在抗CLL細胞毒活性中所起的作用，我們利用具有HIV-TAT PTD的其他化合物(C0G226)以及具有改變的apoE序列的肽(C0G1410和C0G248)，如表I中所示。值得注意的是觸角足(ANTP)或TAT PTD分別將COG1410的效カ從5. 7 μ M增加到I. O μ M和I. 4 μ Μ。此外有趣的是，與ANTP連接的C0G1410 (C0G120)與C0G112單體相比作為單體的效カ更高，COG 120和COG 112的EC50值分別為I. O μ M和I. 4 μ M0該結(jié)果提示，構(gòu)建含有改變的apoE域以及ANTP或TAT PTD域的ニ聚體肽可能進ー步提高肽的效カ。這些數(shù)據(jù)表明，apoE模擬化合物針對新鮮分離的人B-CLL細胞顯示強效和選擇性的細胞毒活性，并具有寬的安全范圍。 我們還評估了這些不同的肽抑制BV2小膠質(zhì)細胞在LPS刺激下誘導的ー氧化氮產(chǎn)生的功效(作為抗炎活性的量度)，以及在大鼠中耐受的最大劑量(表I和圖6A)。對于LPS測定，EC50是導致LPS刺激后BV2細胞的一氧化氮釋放的50%抑制的化合物濃度。對于小鼠毒性，MTD是能夠通過靜脈注射給藥而不導致24小時后死亡的最大化合物劑量。ApoE肽ニ聚體，特別地，在抗炎測定中顯示出顯著的效カ(圖6A)。將ApoE域與蛋白轉(zhuǎn)導域偶聯(lián)進一步增強了ニ聚體的效力。接下來，我們考察了ー種ApoE肽ニ聚體與其單體形式對MDA-MB-231乳腺癌細胞系的增殖的效力。MDA-MB-231細胞用不同濃度的C0G435(單體；SEQ ID NO: 90)或C0G493 (ΒΜ0Ε連接的COG 435 ニ聚體)肽處理48小吋。肽處理之后，利用MTT測定法定量細胞。結(jié)果如圖6B所示，表明ApoE模擬肽的ニ聚體形式對乳腺癌細胞的細胞毒性顯著高于單體形式。為了確定ApoE肽ニ聚體是否對其他類型的癌癥具有細胞毒性，我們評價了三種不同的ApoE BMOE連接的肽ニ聚體(C0G449, C0G492, C0G493;見表I)對U87MG成膠質(zhì)細胞瘤細胞的生長特征的影響。使用多種濃度的C0G449，C0G492, C0G493或索拉非尼來處理U87MG成膠質(zhì)細胞瘤細胞，并使用MTT來定量活細胞。使用索拉非尼作為陽性對照，因為它已被報道對成膠質(zhì)細胞瘤細胞有細胞毒性(Yang et al. (2010)Mol CancerTher. ,Vol. 9(4) :953-962)。圖6C所示的劑量響應曲線顯示每一種ニ聚體肽對U87MG細胞都有細胞毒性。這ー系列實驗證明ApoE肽對三種不同類型的癌細胞具有細胞毒性。有趣的是，這些ApoE肽的ニ聚體形式誘導癌細胞的細胞毒作用的效カ大大強于単體形式。
權(quán)利要求
1.一種肽二聚體，其包含第一 ApoE肽和第二 ApoE肽，其中所述第一和第二 ApoE肽通過連接模塊共價連接，并且其中所述第一和第二 ApoE肽含有源自ApoE蛋白的氨基酸133-149的序列。
2.權(quán)利要求I的肽二聚體，其中所述連接模塊選自下組二硫橋、雙馬來酰亞胺、1，4- 二取代的三唑、和N，N- 二炔丙胺。
3.權(quán)利要求2的肽二聚體，其中所述雙馬來酰亞胺是雙馬來酰亞胺-乙烷或雙馬來酰亞胺_己燒。
4.權(quán)利要求I的肽二聚體，其中所述第一和第二ApoE肽是相同的。
5.權(quán)利要求4的肽二聚體，其中所述第一和第二ApoE肽是具有選自下組的序列的肽LRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ ID NO:3),AS (Aib)LRKL(Aib)KRLL(SEQ ID NO: 5), LRVRLAS(Aib)LKRLRK(硝基-Arg)LL(SEQ ID NO:4)，和 LRVRLAS(Aib)LRKLR(K-Ac)RLL(SEQ ID NO:35)。
6.權(quán)利要求I的肽二聚體，其中所述第一和第二ApoE肽是不同的。
7.權(quán)利要求I的肽二聚體，其中所述第一ApoE肽通過一個或多個第一連接殘基與第一蛋白轉(zhuǎn)導域綴合。
8.權(quán)利要求7的肽二聚體，其中所述第一蛋白轉(zhuǎn)導域選自下組源自觸角足的肽、TAT、SynBl、SynB3、SynB5、和聚精氨酸。
9.權(quán)利要求8的肽二聚體，其中所述第一蛋白轉(zhuǎn)導域具有序列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQID N0:8)、YGRKKRRQRRR(SEQ ID 勵9)、或歷1(。
10.權(quán)利要求7的肽二聚體，其中所述一個或多個第一連接殘基是半胱氨酸、疊氮高丙氨酸、或炔丙基甘氨酸。
11.權(quán)利要求7的肽二聚體，其中所述第一和第二ApoE肽是具有選自下組的序列的肽LRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ ID NO:3)，AS(Aib)LRKL(Aib)KRLL(SEQ ID NO:5)，LRVRLAS(Aib)LKRLRK(硝基-Arg)LL(SEQ ID NO:4)，和 LRVRLAS(Aib)LRKLR(K-Ac)RLL(SEQ ID NO:35)。
12.權(quán)利要求7的肽二聚體，其中所述第二ApoE肽通過一個或多個第二連接殘基與第二蛋白轉(zhuǎn)導域綴合。
13.權(quán)利要求12的肽二聚體，其中所述第二蛋白轉(zhuǎn)導域選自下組源自觸角足的肽、TAT、SynBU SynB3, SynB5、和聚精氨酸。
14.權(quán)利要求13的肽二聚體，其中所述第二蛋白轉(zhuǎn)導域具有序列RQIKIffFQNRRMKffKK(SEQ ID NO:8)，YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:9)，或 WKK。
15.權(quán)利要求12的肽二聚體，其中所述一個或多個第二連接殘基是半胱氨酸、疊氮高丙氨酸、或炔丙基甘氨酸。
16.權(quán)利要求12的肽二聚體，其中所述第一和第二ApoE肽是具有選自下組的序列的肽LRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ ID NO:3), AS (Aib)LRKL(Aib)KRLL(SEQ IDNO: 5), LRVRLAS (Aib) LKRLRK(硝基-Arg) LL(SEQ ID NO:4),和 LRVRLAS (Aib) LRKLR(K-Ac)RLL(SEQ ID NO:35)。
17.一種藥物組合物，包含有效量的權(quán)利要求I的肽二聚體以及可藥用的擔載體。
18.一種在有需要的受試者中治療癌癥的方法，包括對受試者施用權(quán)利要求17的組合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述癌癥是白血病、淋巴瘤或乳腺癌。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述乳腺癌是三陰性乳腺癌。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述白血病是慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、或急性淋巴細胞性白血病(ALL)。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述組合物與第二癌癥治療組合施用。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述第二癌癥治療是索拉非尼或吉非替尼。
24.一種用于在有需要的受試者中降低神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化、小膠質(zhì)細胞活化、或神經(jīng)元細胞死亡的方法，該方法包括對所述受試者施用權(quán)利要求17的組合物。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述小膠質(zhì)細胞活化與CNS炎癥、創(chuàng)傷性腦損傷、腦缺血或腦水腫相關(guān)。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述神經(jīng)元細胞死亡與谷氨酸興奮性中毒相關(guān)。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述受試者已經(jīng)被診斷為患有山黧豆中毒、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、亨廷頓氏病、帕金森氏病，或精神分裂癥。
28.一種在有需要的受試者中治療動脈硬化或減少動脈硬化性斑塊形成的方法，該方法包括對受試者施用權(quán)利要求17的組合物。
29.一種用于在有需要的受試者中治療、預防或緩解細菌性膿毒病的癥狀的方法，該方法包括對受試者施用權(quán)利要求17的組合物。
30.一種用于在有需要的受試者中治療、預防或緩解多發(fā)性硬化的癥狀的方法，該方法包括對受試者施用權(quán)利要求17的組合物。
31.一種用于在有需要的受試者中治療、預防或緩解類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、或多關(guān)節(jié)型幼年類風濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀的方法，該方法包括對受試者施用權(quán)利要求17的組合物。
32.一種用于在有需要的受試者中治療、預防或緩解炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病、或潰瘍性結(jié)腸炎的癥狀的方法，該方法包括對受試者施用權(quán)利要求17的組合物。
33.一種用于在有需要的受試者中治療、預防或緩解阿爾茨海默病的癥狀的方法，該方法包括對受試者施用權(quán)利要求17的組合物。
34.一種肽二聚體，其包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽和第二肽通過雙馬來酰亞胺-乙烷共價連接，且其中所述第一和第二肽具有序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 15或SEQID N0:90。
35.一種預測或評價用于治療癌癥的治療性介入的功效的方法，該方法包括 測量來自患者的生物樣品中SET蛋白的表達水平；并 將測得的水平與SET蛋白在對照樣品中的表達水平比較， 其中測得的SET蛋白的表達水平指示治療性介入的治療功效。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述治療性介入是ApoE肽或肽二聚體。
37.權(quán)利要求36的方法，其中測得的相對于對照樣品為至少2倍的SET表達水平指示ApoE肽或肽二聚體在所述患者中治療癌癥的治療功效。
38.權(quán)利要求35的方法，其還包括對所述患者施用至少一種ApoE肽或肽二聚體。
39.權(quán)利要求35的方法，其中所述生物樣品是來自實體瘤的腫瘤活檢。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述實體瘤是乳腺癌或淋巴瘤。
41.權(quán)利要求35的方法，其中所述生物樣品是外周血單核細胞。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述生物樣品是⑶19+/⑶5+白血病細胞。
43.一種試劑盒，其包括用于測量生物樣品中的SET蛋白表達的試劑，和關(guān)于測量SET蛋白表達以用于預測或評估ApoE肽或肽二聚體在患者中治療癌癥的功效的說明。
全文摘要
本發(fā)明提供包含ApoE衍生的肽二聚體的新型藥物組合物。特別地，本發(fā)明的ApoE肽二聚體包含至少兩個ApoE模擬域，并且能夠包含一個或多個蛋白轉(zhuǎn)導域。還公開了通過施用本發(fā)明的藥物組合物治療多種狀況，如癌癥、炎癥狀況和神經(jīng)變性疾病的方法。
文檔編號A61K38/16GK102917727SQ201180012673
公開日2013年2月6日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月6日
發(fā)明者M.P.維特克, D.J.克里斯滕森 申請人:克格諾西有限公司