專利名稱：牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高含量地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物及其提取、制造方法。
背景技術(shù)：
在日本藥典第15版中規(guī)定，牛蒡子為牛蒡Arctum lappa Linne(Compositae)的果實(shí)，作為銀翹散、祛風(fēng)解毒湯、消風(fēng)散等處方的配伍生藥，其本質(zhì)上歸類于專門作為醫(yī)藥品而使用的成分。牛蒡子含有約7%的歸類于木脂素苷(lignan glycoside)的牛蒡子苷以及約 0. 6%的作為其苷元的牛蒡子苷元。根據(jù)文獻(xiàn)報道，近年來，諸如PANC-I、AsPC-I、BxPC-I、KP_3這些來源于胰腺癌的細(xì)胞即使在極度營養(yǎng)缺失狀態(tài)下也體現(xiàn)出強(qiáng)的耐性，消除其耐性有可能成為癌治療的全新的生化方法(專利文獻(xiàn)1)。另據(jù)報告稱，使用胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-I對能夠消除低營養(yǎng)狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞生存能力的物質(zhì)進(jìn)行篩選時，發(fā)現(xiàn)牛蒡子苷元是有效的(非專利文獻(xiàn)1)。在先專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本特開2002-065^8號公報非專利文獻(xiàn)1 :S. Awale, J. Lu, S. K. Kalauni, Y. Kurashima, Y. Tezuka, S. Kadota, H. Esumi，Cancer Res.，2006，66(3)，1751—175
發(fā)明內(nèi)容
對于目前所知的牛蒡子而言，牛蒡子中的牛蒡子苷元含量較低，約為0.6%，并且難溶于水。因此，通過以往實(shí)施的熱水提取法來制造高含量地含有牛蒡子苷元的提取物是極其困難的。因此，期望提供一種能夠?qū)嶋H向生物體給藥的形態(tài)并且高含量地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物。于是，本發(fā)明的問題在于提供高含量地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物及其制造方法。為了解決上述問題，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了著眼于生藥自身存在的酶即β -葡萄糖苷酶，并利用該酶反應(yīng)將牛蒡子苷轉(zhuǎn)換為牛蒡子苷元的技術(shù)、將轉(zhuǎn)換后的牛蒡子苷元有效提取的技術(shù)、以及高含量地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物。第一發(fā)明為牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物，所述提取物含有3%以上的牛蒡子苷元。第二發(fā)明為牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，利用牛蒡子自身存在的β -葡萄糖苷酶，將牛蒡子苷通過酶轉(zhuǎn)換為牛蒡子苷元，并進(jìn)行提取。第三發(fā)明為牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，在上述任一發(fā)明中，將牛蒡子苷通過酶轉(zhuǎn)換為牛蒡子苷元后，加入乙醇進(jìn)行提取。第四發(fā)明為牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，在上述任一發(fā)明中，提取后濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥或者噴霧干燥來制造。第五發(fā)明為牛蒡子苷元高含量的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，在上述任一發(fā)明中，提取后濃縮，然后添加糊精進(jìn)行噴霧干燥。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供具有抗腫瘤效果的、高含量地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物。特別是，可以預(yù)期對胰腺癌患者給藥后，抑制腫瘤增殖和抗腫瘤效果。并且，可以提高制造時的產(chǎn)率。


圖1為酶轉(zhuǎn)換有效性結(jié)果的分析色譜；圖2為使用培養(yǎng)細(xì)胞(CAPAN-I)的細(xì)胞毒性評價；圖3為使用培養(yǎng)細(xì)胞(PANC-I)的細(xì)胞毒性評價；圖4為使用培養(yǎng)細(xì)胞(PSN-I)的細(xì)胞毒性評價；圖5為腫瘤模型動物(CAPAN-1異種移植瘤(Xenografts))中的抗腫瘤性評價；圖6為腫瘤模型動物(PSN-1異種移植瘤)中的抗腫瘤性評價；圖7為人血中牛蒡子苷元(AG)的血中濃度變化；圖8為人血中牛蒡子苷元的葡萄糖醛酸結(jié)合物(AGG)的血中濃度變化。
具體實(shí)施例方式以下針對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。所公開的條件僅為一個例子，本發(fā)明并不受其限制。本申請發(fā)明的牛蒡子提取物經(jīng)過生藥切制工序、提取工序、固液分離工序、濃縮工序、干燥工序來制造。(生藥切制工序)將作為原料的牛蒡子切制成適于提取的大小。對于作為原料的生藥來講，植物的各種部位和礦物、動物等具有各種大小、形狀、硬度，需要根據(jù)其特質(zhì)來進(jìn)行切制。粒度越細(xì)，越能促進(jìn)酶反應(yīng)，提取物收率也上升，但與之相反，有時酶反應(yīng)過快而導(dǎo)致工藝管理困難，或者在后續(xù)工序中對正確的固液分離產(chǎn)生影響。因此，希望本發(fā)明中使用的生藥的粒度切成碎塊的程度。(提取工序)提取工序是中藥提取物粉末制造工序中對質(zhì)量最為重要的工序，該工序決定中藥提取物粉末的質(zhì)量。本申請發(fā)明中，提取工序分為酶反應(yīng)工序和有機(jī)溶劑提取工序兩個階段來實(shí)施。(酶反應(yīng)工序)本工序是本申請發(fā)明發(fā)現(xiàn)的最為重要的工序，是將牛蒡子中含有的牛蒡子苷通過酶轉(zhuǎn)換為牛蒡子苷元的工序。在前一工序中準(zhǔn)備好的Ikg牛蒡子碎塊中加入7升水，在20 40°C進(jìn)行攪拌等， 經(jīng)過大約1小時。通過該工序，牛蒡子苷經(jīng)酶轉(zhuǎn)換為牛蒡子苷元，使牛蒡子苷元的含量顯著提升。該提取方法稱作冷浸提取。并且，從反應(yīng)速度的觀點(diǎn)來看，酶反應(yīng)的峰值溫度為37 40°C是理想的，但是，從質(zhì)量控制方面來看，反應(yīng)速度過快有時也會導(dǎo)致工藝管理困難。因此，在小規(guī)模情況下，希望在20 25°C進(jìn)行大約1小時的提取，但是，在工業(yè)規(guī)模情況下，根據(jù)攪拌裝置的能力和溫度控制的能力，可適宜設(shè)定為在30°C進(jìn)行30分鐘、在 37°C進(jìn)行15分鐘等。另外，由于超過60°C后會出現(xiàn)酶失活，因此不能使用溫度在60°C以上的以往的熱水加熱法。(有機(jī)溶劑提取工序)該工序?yàn)樵谂］蜃榆赵蔀楦吆康臓顟B(tài)下進(jìn)行加熱回流來對牛蒡子提取物進(jìn)行提取的工序。此處，由于牛蒡子苷元具有難溶于水的性質(zhì)，因此，通過添加溶劑可以使收率提高。具體方法如下向完成酶反應(yīng)工序的溶液(牛蒡子碎塊Ikg+水7升)中加入3升溶劑，并進(jìn)一步加熱回流1小時。此處，從安全性方面出發(fā)，適宜的溶劑為乙醇。乙醇量越多，則牛蒡子苷元的溶解度越高，收率也會隨之上升，但是溶解出很多不需要的油脂類，導(dǎo)致濃縮工序的負(fù)荷增大，因此，可根據(jù)情況適當(dāng)決定投放量。并且，該工序中的加熱回流還兼?zhèn)淞藴缇蜌⒕?固液分離工序)該工序?yàn)閺奶崛∫褐袑⑻崛⊥甑纳庍M(jìn)行分離的工序。固液分離方式有過濾法、 沉降法等，工業(yè)上理想的方法使用離心分離方式。(濃縮工序)該工序?yàn)樵诟稍镏叭コ崛∫褐械娜軇┑墓ば?。采用減壓濃縮法，以使得所得提取物的提取液不會進(jìn)一步長時間暴露在高溫下。該工序中，濃縮至如下濃度使下一工序的干燥可以適當(dāng)進(jìn)行，并且在將干燥提取物粉末進(jìn)行制劑的情況下可以得到適當(dāng)?shù)闹苿┨匦?。并且，由于牛蒡子苷元具有難溶于水的特性，因此附著在干燥工序的制造裝置內(nèi)的量很多，最終收率大幅降低。而通過添加糊精，可以防止附著在制造裝置上。相對于濃縮液的固體成分，添加量為20%左右為宜。(干燥工序)該工序?yàn)槭固崛〕龅奶崛∥锍蔀榉勰畹墓ば?。已知的干燥法有冷凍干燥和噴霧干燥，通常如果為實(shí)驗(yàn)室水平，則采用前者，而如果為大批量生產(chǎn)水平，則使用后者。通過上述制造工藝，可以得到牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物。
(牛蒡子提取物粉末調(diào)配制劑)通過上述操作得到的提取物粉末能夠以其原狀直接使用，但是通常來講，加入在食品及/或醫(yī)藥品中使用的通常的賦形劑(例如結(jié)晶纖維素、蔗糖脂肪酸酯、乳糖等)，通過例如干式造粒法或濕式造粒法造粒并進(jìn)行制造，通過該種操作得到的造粒物可以直接使用，還可以將它們作為進(jìn)一步采用壓片機(jī)的壓縮成型物來使用。另外，由于提取物粉末具有特有的澀味，因此從服用上講，優(yōu)選制成將提取物粉末進(jìn)行掩蔽的制劑，也可以制成通過包覆劑進(jìn)行包覆的薄膜包衣劑。另外，從成分穩(wěn)定性的觀點(diǎn)出發(fā)，或者作為可以簡單攝取的形態(tài)，還可以將上述提取物粉末或者上述造粒物直接填充在硬膠囊或者軟膠囊中來攝取。(試驗(yàn))牛蒡子苷元的酶轉(zhuǎn)換有效性試驗(yàn)在提取工序的酶反應(yīng)工序(冷浸提取)中，實(shí)施牛蒡子苷是否經(jīng)酶轉(zhuǎn)換成牛蒡子苷元的評價。比較例1取牛蒡子粗粉(過18號篩)0. lg，加入50%甲醇50mL，加熱1小時后，進(jìn)行過濾。試驗(yàn)例1取牛蒡子粗粉(過18號篩)0. lg，加入25mL水，振蕩混合，在室溫(20°C )放置1 小時后，加入25mL甲醇，進(jìn)行過濾。在以下分析條件下，通過HPLC法對試驗(yàn)例1和比較例1得到的濃縮液進(jìn)行測定。〔牛蒡子苷元含量測定方法〕色譜柱YMC-PackProC18 AS-307-3 (3 μ m, 4. 6mm ID X 7. 5cm)柱溫30°C檢測UW80nm(圖1中每組色譜圖上方的那條色譜流出曲線)，UV230nm(圖1中每組色譜圖下方的那條色譜流出曲線)流速0. 8mL/min進(jìn)樣量5μ L、10yL流動相Α液/0.05Μ磷酸二氫鈉溶液乙腈混合液(5:1);B液/0.05Μ磷酸二氫鈉溶液乙腈混合液(1 1)梯度洗脫條件0 10min/B 液 20%、10 25min/B 液 40%[比較例1]如表1所示，生藥原料中牛蒡子苷及牛蒡子苷元的含量分別為6.88% 及0. 58%，牛蒡子苷元/牛蒡子苷含量比(以下稱作AG/A)為0.08。[試驗(yàn)例1]如表1所示，牛蒡子苷及牛蒡子苷元含量分別為0.15%及3.80%，AG/ A比為25. 33，牛蒡子苷元含量明顯上升。另外，如圖1所示，生藥原料中，牛蒡子苷基本上定量地轉(zhuǎn)換成牛蒡子苷元。表1
生藥原料粒度酶轉(zhuǎn)換處理牛蒡子苷含量 (%)牛蒡子苷元含量 (%)AG/A 比比較例1粗粉無6.880.580.08試驗(yàn)例1粗粉有(22°C)0.153.8025.33實(shí)施例實(shí)施例1 (通過切碎、冷浸提取制造牛蒡子提取物)將300g牛蒡子碎塊加入1.5L水(22°C )中并攪拌1小時后，進(jìn)一步加熱回流1小時。同樣進(jìn)行過濾，用0. 5L水進(jìn)行清洗，將合并后的提取液(1. 5L)冷凍干燥。如表2所示，對生藥碎塊進(jìn)行冷浸提取后的提取物中，牛蒡子苷及牛蒡子苷元含量分別為 10. 1M4.8%，AG/A 比為 0. 48。實(shí)施例2 (通過切碎、冷浸提取、添加乙醇制造牛蒡子提取物)將200g牛蒡子碎塊加入IL水(22°C )中并攪拌1小時后，加入0. 45L乙醇并進(jìn)一步加熱回流1小時。使用4張絲網(wǎng)(100目金屬網(wǎng))進(jìn)行過濾，用30%乙醇0.5L進(jìn)行清洗，將混合后提取液(1.5L)冷凍干燥。如表2所示，對生藥切碎物進(jìn)行冷浸提取后的提取物的牛蒡子苷及牛蒡子苷元含量分別為13. 3%及11. 4%, AG/A比為0. 86。與實(shí)施例1相比，牛蒡子苷元含量大幅上升， 這可以推測是由于通過添加乙醇溶解了牛蒡子苷元。實(shí)施例3 6(通過中等規(guī)模、噴霧干燥制造牛蒡子提取物)將2kg牛蒡子碎塊加入14L水(37°C )中并攪拌1小時后，加入6L乙醇并進(jìn)一步加熱回流1小時。對該液體進(jìn)行離心分離，將得到的提取液大約16L減壓濃縮，添加相對于提取物固體成分0 50%的糊精，進(jìn)行噴霧干燥。由于牛蒡子苷元難溶于水，因此在噴霧干燥工序中由于附著所致的損失很大，提取物收率降至5% (實(shí)施例3)。因此，通過添加糊精(實(shí)施例3 6)可以防止附著在設(shè)備上，制備出流動性優(yōu)異的噴霧干燥提取物。提取物收率從5%上升至20%左右。作為添加量，添加相對于濃縮液的固體成分的20%左右為宜。實(shí)施例7 (通過中等規(guī)模、噴霧干燥制造牛蒡子提取物)將2kg牛蒡子碎塊加入14L水(22°C )中并攪拌1小時后，加入6L乙醇并進(jìn)一步加熱回流1小時。對該液體進(jìn)行離心分離，將得到的約16L提取液減壓濃縮，添加相對于提取物固體成分20%的糊精，進(jìn)行噴霧干燥。牛蒡子苷及牛蒡子苷元含量分別為7. 及6. 3%,AG/A比為0. 89，可以再現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室中的結(jié)果，得到大量的提取物。實(shí)施例8 (通過工業(yè)規(guī)模、噴霧干燥制造牛蒡子提取物)將80kg牛蒡子碎塊加入保溫在30°C的560L水中并攪拌30分鐘后，加入乙醇并升溫至85°C，進(jìn)一步加熱30分鐘來提取。對該液體進(jìn)行離心分離，得到處理后的提取液。合并重復(fù)兩次該操作所得提取液，減壓濃縮，添加相對于提取物固體成分20%的糊精， 進(jìn)行噴霧干燥。牛蒡子苷及牛蒡子苷元含量分別為6. 8%及5. 9%,AG/A比為0. 87，可以再現(xiàn)中等規(guī)模時的結(jié)果，得到31. 5kg提取物粉末(含有20%糊精)。比較例2 (通過切碎、熱水提取制造牛蒡子提取物)將300g牛蒡子碎塊(過8. 6號篩)加入1. 5L熱水(80°C )中并加熱回流1小時后，在熱的時候使用4張絲網(wǎng)(100目金屬網(wǎng))進(jìn)行過濾。用0.5L水進(jìn)行清洗，將合并后的提取液(1.4L)冷凍干燥。將該生藥原料使用通常的水作為提取溶劑，進(jìn)行加熱提取所得熱水提取的提取物中，牛蒡子苷及牛蒡子苷元含量分別為29. 2%及0. 92%, AG/A比為0. 03。由于AG/A比率進(jìn)一步降低，因此可以確認(rèn)牛蒡子苷元難以轉(zhuǎn)移至提取物。表 權(quán)利要求
1.一種牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物，所述提取物含有3%以上的牛蒡子苷元。
2.一種牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，利用牛蒡子自身存在的β -葡萄糖苷酶，將牛蒡子苷通過酶轉(zhuǎn)換為牛蒡子苷元，并進(jìn)行提取。
3.如權(quán)利要求2所述的牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于， 將牛蒡子苷通過酶轉(zhuǎn)換為牛蒡子苷元后，加入乙醇進(jìn)行提取。
4.如權(quán)利要求2或3所述的牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法，其特征在于，提取后濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥或者噴霧干燥來制造。
5.如權(quán)利要求2 4中任一項(xiàng)所述的牛蒡子苷元含量高的牛蒡子提取物的制造方法， 其特征在于，提取后濃縮，然后添加糊精進(jìn)行噴霧干燥。
全文摘要
本發(fā)明提供高含量地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物及其制造方法，以及用于胰腺癌的治療。利用牛蒡子自身存在的酶、即β-葡萄糖苷酶，將牛蒡子苷通過酶轉(zhuǎn)換為牛蒡子苷元，加入乙醇進(jìn)行提取、濃縮之后，進(jìn)行冷凍干燥或者噴霧干燥，由此提供高濃度地含有牛蒡子苷元的牛蒡子提取物。
文檔編號A61P35/00GK102365092SQ201080014729
公開日2012年2月29日 申請日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者三好千香, 與茂田敏, 大窪敏樹, 山本惠一, 江角浩安, 門田重利 申請人:國立大學(xué)法人富山大學(xué), 客樂諧制藥株式會社, 日本國立癌癥研究中心