專利名稱：一種磷酸鋁佐劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磷酸鋁佐劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著免疫學(xué)研究的不斷深入及基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，活載體疫苗、 DNA疫苗和蛋白質(zhì)疫苗等新型疫苗的研究取得了可喜的進(jìn)步。這些新型疫苗純度高、特異性強(qiáng)，但免疫原性弱，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不夠強(qiáng)，因此，應(yīng)用佐劑來增強(qiáng)其免疫原性或增強(qiáng)宿主對(duì)抗原的保護(hù)性應(yīng)答就顯得尤為重要。
隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，多肽疫苗及亞單位疫苗不斷涌現(xiàn)，無論在數(shù)量上還是質(zhì)量上對(duì)疫苗佐劑的要求都愈來愈高。人們?cè)趯ふ倚滦妥魟┑耐瑫r(shí)，對(duì)常規(guī)佐劑的改良研究也更加重視起來。雖已涌現(xiàn)不少新型佐劑，但大多尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段。所以目前在疫苗產(chǎn)業(yè)中鋁佐劑是最傳統(tǒng)最重要也是應(yīng)用最多的疫苗佐劑。鋁佐劑的作用機(jī)理主要是在組織中形成抗原貯藏庫，產(chǎn)生顆粒性抗原來促進(jìn)抗原提呈給免疫細(xì)胞，使抗原滯留，緩慢釋放，從而吸引活性淋巴細(xì)胞，激活補(bǔ)體系統(tǒng)。鋁鹽佐劑成本低、使用方便，是生物制品生產(chǎn)中應(yīng)用最廣的一種佐劑，也是最早被美國食品藥物監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于人類疫苗的佐劑。自1926年Glermy首先應(yīng)用鋁鹽黏附白喉類毒素至今已廣泛應(yīng)用于人獸疫苗。鋁佐劑通常在人用疫苗中含量為0. 5mg/ 劑量，WHO推薦最高不超過1. 25mg/劑量。鋁佐劑包括氫氧化鋁佐劑和磷酸鋁佐劑。天然的氫氧化鋁有上百種存在形式，例如Α1(0Η)3、Α1203 ·Η20、Α100Η等.而商品化的氫氧化鋁佐劑，實(shí)際上是Al (OH)3的不完全脫水產(chǎn)物，即纖維狀結(jié)晶形態(tài)的偏氫氧化鋁AlO(OH)，氫氧化鋁佐劑(分子式為AlO(OH))的等電點(diǎn)為11. 4，在生理?xiàng)l件(人體內(nèi))時(shí)帶正電荷，可較好地吸附帶負(fù)電荷的蛋白疫苗，如流感疫苗，乙肝疫苗等。而磷酸鋁佐劑的等電點(diǎn)依賴于磷酸根和羥基的比例，完全沒有磷酸根時(shí)(分子式Al (OH)3)等電點(diǎn)為9. 6，完全沒有羥基時(shí)(分子式AlPO4)等電點(diǎn)為4.0，商業(yè)化的磷酸鋁佐劑的等電點(diǎn)一般為5. 0，在生理?xiàng)l件時(shí)帶負(fù)電荷，可較好地吸附帶正電荷的蛋白疫苗，如HPV疫苗等。中國專禾IjCN2006800090340、CN2006800475728、CN2006800476098 公開了磷酸鋁佐劑具有下列技術(shù)特征粒徑0.5-20um;P/Al 0. 3-1. 2 (優(yōu)選0. 8-1. 2)；等電點(diǎn) (PZC) 4. 0-7. 0 (優(yōu)選5. 0-6. 5，最優(yōu)5. 7)；以沉淀法生產(chǎn)。中國專利CN028149335公開了磷酸鋁佐劑具有下列技術(shù)特征其為Al (0H)X(P04) y，其中各陰離子化合價(jià)和乘以其摩爾分?jǐn)?shù)是-3，P/A1 0.3-0.99 ；以沉淀法生產(chǎn)。但現(xiàn)有的磷酸鋁佐劑在均一性和包載能力方面缺陷，影響了此佐劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液應(yīng)答水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種穩(wěn)定性高、均一性好和包載能力強(qiáng)的磷酸鋁佐劑及其制備方法，以應(yīng)用此佐劑可誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的體液應(yīng)答水平，同時(shí)有利于在疫苗的生產(chǎn)過程中，可減少佐劑和疫苗的添加量，降低疫苗的毒副作用。為此，本發(fā)明公開了一種磷酸鋁佐劑，其特征在于粒徑200-4500nm;多分散性系數(shù) 0. 01-1. 0 ；等電點(diǎn) 4. 0-6. 0。在一實(shí)施例中，所述磷酸鋁佐劑，其特征在于粒徑200-800nm;多分散性系數(shù) (PDI)O. 10-0. 50 ；等電點(diǎn)(PZC)4. 2-5. 8 ；其中最優(yōu)選粒徑200 300nm ；多分散性系數(shù) (PDI)O. 15 0. 35 ；等電點(diǎn)(PZC)4. 5 5. 5。

在一實(shí)施例中，所述磷酸鋁佐劑中鋁離子濃度為5620ug/ml，磷離子的濃度為 5174ug/ml, P/A1 比為 0. 92。另一方面，本發(fā)明還公開了所述磷酸鋁佐劑的制備工藝，包括下列步驟a)采用蠕動(dòng)泵將0. 06mol/L氯化鋁與0. 06mol/L磷酸二氫鈉的混合溶液和 0. 5mol/L強(qiáng)堿溶液分別以相應(yīng)的流速泵入反應(yīng)器中，攪拌，其中氯化鋁與磷酸二氫鈉溶液和強(qiáng)堿溶液的流速比為5 2 15 2;b)收集混懸液，靜置，棄去上清夜，離心，得沉淀；c)洗滌沉淀、溶解即得磷酸鋁佐劑溶液。所述強(qiáng)堿可為氫氧化鈉或氫氧化鉀；在一些實(shí)施方式中，所述氯化鋁與磷酸二氫鈉溶液的流速為75ml/min，氫氧化鈉溶液的流速控制在10 30ml/min，優(yōu)選其中氯化鋁與磷酸二氫鈉溶液的流速為75ml/min，氫氧化鈉溶液的流速20ml/min在另一方面，本發(fā)明還公開了一種疫苗組合物，其特征在于其包含不超過1. 25mg/ 劑量的本發(fā)明所述磷酸鋁佐劑；所述疫苗為帶正電荷的蛋白疫苗，如HPV疫苗。本發(fā)明所述磷酸鋁佐劑穩(wěn)定性高、均一性好和包載能力強(qiáng)，以應(yīng)用此佐劑可誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的體液應(yīng)答水平，同時(shí)有利于在疫苗的生產(chǎn)過程中，可減少佐劑和疫苗的添加量， 降低疫苗的毒副作用，其效果優(yōu)于現(xiàn)有商品化佐劑。本發(fā)明所述方法工藝簡(jiǎn)單，能得到性質(zhì)穩(wěn)定、分散均一、批間差小的磷酸鋁佐劑，解決磷酸鋁佐劑批間差異大的問題。


圖1、磷酸鋁佐劑透射電鏡圖；圖2、蛋白包封率檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1磷酸鋁佐劑的制備方法1、溶液配制1. 1氯化鋁溶液(0. 06mol/L)和磷酸二氫鈉溶液(0. 06mol/L)的配制稱量28. 9716g 的 AlCl3. 6H20 和 18. 7212g 的 NaH2PO4. 2H20,純水溶解并定容至 2L，即得濃度為ο. 06mol/L的氯化鋁和磷酸二氫鈉溶液。1. 2氫氧化鈉溶液(0. 5mol/L)的配制 稱量40g的NaOH，純水溶解并定容至2L，即得濃度為0. 5mol/L的氫氧化鈉溶液。1. 3除菌除熱源采用超濾儀(截留分子量8KD或10KD)進(jìn)行超濾。用0. 22 μ m囊式濾器過濾除菌。2、磷酸鋁佐劑的制備工藝分別采用蠕動(dòng)泵將氯化鋁與磷酸二氫鈉的混合溶液和氫氧化鈉溶液以一定的流速泵入容積為600mL的玻璃反應(yīng)器中，反應(yīng)器至于磁力攪拌器上，以恒定的速度攪拌。其中氯化鋁與磷酸二氫鈉溶液的流速為75ml/min，氫氧化鈉溶液的流速控制在10 30ml/min。棄去初始的750ml混懸液，收集后續(xù)混懸液，靜置5小時(shí)后，棄去上清夜，SOOOrpm 離心15min，得沉淀，用蒸餾水洗滌3次。將沉淀分散于一定體積純水中，即得某濃度范圍的磷酸鋁佐劑溶液。將不同流速的制備的磷酸鋁分別標(biāo)記為75/15、75/15. 5、75/15、75/16、 75/16. 5,75/17,75/17. 5,75/18,75/18. 5,75/19,75/19. 5、75/20、75/25、75/30。將制備的各組磷酸鋁懸浮液進(jìn)行12rC、30min濕熱滅菌。然后4°C條件下保存。3、鋁佐劑的檢測(cè)分別測(cè)定各組磷酸鋁佐劑的等電點(diǎn)、粒徑、HPV18L1蛋白包封率、透射電鏡下形態(tài)等指標(biāo)，以購自Accuratechemical公司的磷酸鋁佐劑(Ad ju-Phos )作為對(duì)照。形態(tài)將樣品稀釋后，滴加入磷鎢酸染色(也可不染色)，室溫?fù)]干，于透射電鏡測(cè)定樣品的粒子形態(tài)。磷酸鋁佐劑透射電鏡照片見圖1 ；粒徑將樣品適當(dāng)稀釋后，采用Marven公司的粒度與表面電位分析儀測(cè)定樣品的粒子直徑和多分散性系數(shù)(PDI)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見表1。表1.從氯化鋁出發(fā)制備的鋁佐劑在水溶液中的粒子直徑
權(quán)利要求
1.一種磷酸鋁佐劑，其特征在于其粒徑200-4500nm ；多分散性系數(shù)0. 01-1. 00 ；等電點(diǎn) 4. 0-6. O0
2.如權(quán)利要求1所述的磷酸鋁佐劑，其特征在于其粒徑200-800nm；多分散性系數(shù) 0. 10-0. 50 ；等電點(diǎn) 4. 2-5. 8。
3.如權(quán)利要求1所述的磷酸鋁佐劑，其特征在于其粒徑200 300nm；多分散性系數(shù) 0. 15 0. 35 ；等電點(diǎn) 4. 5 5. 5。
4.權(quán)利要求1所述磷酸鋁佐劑的制備方法，包括下列步驟a)采用蠕動(dòng)泵將0.06mol/L氯化鋁與0. 06mol/L磷酸二氫鈉的混合溶液和0. 5mol/ L強(qiáng)堿溶液分別以相應(yīng)的流速泵入反應(yīng)器中，攪拌，其中氯化鋁與磷酸二氫鈉溶液和強(qiáng)堿溶液的流速比為5 2 15 2 ；b)收集混懸液，靜置，棄去上清夜，離心，得沉淀；c)洗滌沉淀、溶解即得磷酸鋁佐劑溶液。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述強(qiáng)堿溶液為氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述氯化鋁與磷酸二氫鈉溶液的流速為 75ml/min，氫氧化鈉溶液的流速控制在10 30ml/min。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述氯化鋁與磷酸二氫鈉溶液的流速為 75ml/min,氫氧化鈉溶液的流速20ml/min。
8.一種疫苗組合物，其特征在于其包含不超過1. 25mg/劑量的權(quán)利要求1所述磷酸鋁佐劑。
9.如權(quán)利要求8所述疫苗組合物，其特征在于所述疫苗為帶正電荷的蛋白疫苗。
10.如權(quán)利要求9所述疫苗組合物，其特征在于所述帶正電荷的蛋白疫苗為HPV疫苗。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磷酸鋁佐劑及其制備方法。本發(fā)明公開了一種磷酸鋁佐劑，其特征在于粒徑200-4500nm；多分散性系數(shù)0.01-1.00；等電點(diǎn)4.0-6.0。本發(fā)明所述磷酸鋁佐劑穩(wěn)定性高、均一性好和包載能力強(qiáng)，以應(yīng)用此佐劑可誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的體液應(yīng)答水平，同時(shí)有利于在疫苗的生產(chǎn)過程中，可減少佐劑和疫苗的添加量，降低疫苗的毒副作用，其效果優(yōu)于現(xiàn)有商品化佐劑。本發(fā)明所述方法工藝簡(jiǎn)單，能得到性質(zhì)穩(wěn)定、分散均一、批間差小的磷酸鋁佐劑，解決磷酸鋁佐劑批間差異大的問題。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102188701SQ201010123850
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者刁美娟, 張高峽, 沈瓊, 王蘭創(chuàng), 郭慧麗 申請(qǐng)人:上海澤潤生物科技有限公司