專利名稱：一種可替代氫氧化鋁的新型疫苗佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，特別是用于疫苗產(chǎn)品中的穩(wěn)定性保護(hù)配方和一種可替代氫氧化鋁的新型疫苗佐劑。
背景技術(shù)：
疫苗制品是應(yīng)用普通的或以基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及各種動(dòng)物和人源的組織和液體等生物材料制備的，用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。疫苗制品不同于一般醫(yī)用藥品，它是通過刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫物質(zhì)(如抗體)才發(fā)揮其功效，在人體內(nèi)出現(xiàn)體液免疫、細(xì)胞免疫或細(xì)胞介導(dǎo)免疫。它是人類對(duì)事物認(rèn)識(shí)的深入和科技的進(jìn)步所帶來的產(chǎn)物，是人類抵御外界不利因素的威脅、提高健康質(zhì)量的一大利器。從最早的10世紀(jì)時(shí)中國(guó)人發(fā)明的用于預(yù)防天花的人痘接種法，到現(xiàn)代微生物學(xué)、免疫學(xué)和分子生物及其他學(xué)科的發(fā)展而產(chǎn)生的滅活疫苗、減毒活疫苗、多肽疫苗、單克隆抗體等，人類已經(jīng)在疫苗制品領(lǐng)域跨出了一大步。然而隨著疫苗制品的不斷推廣，其自然屬性所造成應(yīng)用局限性也不斷的暴露出來。大多數(shù)疫苗制品在單獨(dú)狀態(tài)下，其半衰期都比較短，尤其是在溫度的催化下，其半衰期更是隨著溫度的升高而直線下降。因而，大多數(shù)疫苗制品都需要一個(gè)合適的保存條件，以維持其穩(wěn)定性，其中所處的液體環(huán)境對(duì)穩(wěn)定性的維持更起著尤為關(guān)鍵的作用。而液體環(huán)境的酸堿度、離子強(qiáng)度以及其他一些維持穩(wěn)定的成分(如一些糖類分子、氨基酸組分、酯類等)的加入都可能影響疫苗制品穩(wěn)定周期，因此，尋找一個(gè)合適的制劑配方來保護(hù)疫苗制品在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸過程中的穩(wěn)定性對(duì)于疫苗制品本身的應(yīng)用與推廣有著極為重要的意義。同時(shí)，對(duì)于疫苗類的生物制品而言，其單一的有效成分在進(jìn)行免疫提呈的過程中，受到各種生物途徑的影響 ，使得其無法實(shí)現(xiàn)預(yù)期的免疫效果，因此需要一些可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疫苗抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的佐劑作為輔助。而目前最為常用的疫苗佐劑為氫氧化鋁佐劑，此外還有脂多糖、細(xì)胞因子、明礬等。這些物質(zhì)主要通過改變抗原的物理形狀，延長(zhǎng)抗原在機(jī)體內(nèi)保留時(shí)間；刺激單核吞噬細(xì)胞對(duì)抗原的提呈能力；刺激淋巴細(xì)胞分化，增加擴(kuò)大免疫應(yīng)答能力等機(jī)制來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。長(zhǎng)期以來氫氧化鋁廣泛被用于病毒疫苗佐劑，在人類疫苗史上的應(yīng)用已超過70年，但是其所帶來的副反應(yīng)也屢見不鮮。大量的文獻(xiàn)報(bào)道顯示，氫氧化鋁佐劑作為疫苗佐劑在使用過程中存在很多疫苗安全隱患:局部的過敏性反應(yīng)、局部組織的刺激反應(yīng)、引起皮膚淋巴組織增生癥、急性類肉瘤狀病、引起巨噬細(xì)胞肌筋膜炎及慢性疲勞、神經(jīng)系統(tǒng)毒性、海灣戰(zhàn)爭(zhēng)綜合征相關(guān)性、自閉癥相關(guān)性、克羅恩氏病相關(guān)性等等。隨著疫苗接種范圍的不斷推廣，嬰幼兒成為了很多疫苗的接種對(duì)象，而嬰幼兒身體系統(tǒng)發(fā)育的不完善，勢(shì)必增加其對(duì)氫氧化鋁佐劑的副反應(yīng)的敏感性，特別對(duì)嬰幼兒認(rèn)知發(fā)育可能有不良影響，從而有可能釀成悲劇。因此，疫苗佐劑的安全性是其使用推廣的前提和基礎(chǔ)。(《國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志》2013年2月第40卷第I期，題目“疫苗中鋁佐劑的危害性研究進(jìn)展”)
在自然界中，有許多化學(xué)物質(zhì)對(duì)疫苗制品都有著穩(wěn)定劑和佐劑的作用。但是，鑒于疫苗制品使用的對(duì)象為人體，在選擇制劑配方的配伍、配比過程中，不僅要考慮所添加成分穩(wěn)定劑和佐劑的作用，更要考慮其對(duì)人體是否有毒、有害，是否會(huì)引起人體的不良、過敏反應(yīng)。因此，探尋一種安全、低廉、具有穩(wěn)定劑和佐劑功能的疫苗佐劑，對(duì)于疫苗制品的推廣和應(yīng)用具有重大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可替代氫氧化鋁的新型疫苗佐劑，該佐劑可以作為疫苗生產(chǎn)過程中的穩(wěn)定劑，用于保護(hù)疫苗生產(chǎn)的中間品、半成品、成品的穩(wěn)定性；具有疫苗佐劑的功能，又能增強(qiáng)疫苗的免疫活性，并安全可靠，且價(jià)格低廉，適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明是一種可替代氫氧化鋁的新型疫苗佐劑，該疫苗佐劑含有海藻糖、具有酸堿度緩沖能力的緩沖物、氯化鎂、硫酸鎂、氨基酸；具體配方組份為海藻糖含量為20-200克/升，具有酸堿度緩沖能力的緩沖液濃度為5-40毫摩爾/升，氯化鎂含量為1-4克/升，硫酸鎂含量為2-8克/升，氨基 酸含量為1-20克/升。本發(fā)明新型疫苗佐劑中的具有酸堿度緩沖能力的緩沖物，包括，但不局限于，磷酸鹽緩沖物、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖物、枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖物、氨-氯化銨緩沖物、醋酸-醋酸鈉緩沖物。本發(fā)明新型疫苗佐劑中的氨基酸包括:但不局限于，L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸。本發(fā)明新型疫苗佐劑配制方法如下:取海藻糖溶于水中，待完全溶解后，依次加入具有酸堿度緩沖能力的緩沖液、氯化鎂、硫酸鎂、氨基酸，調(diào)節(jié)溶液酸堿度，加水定容。本發(fā)明新型疫苗佐劑溶液酸堿度為6.0-9.0。本發(fā)明新型疫苗佐劑含有海藻糖、具有酸堿度緩沖能力的緩沖物、氯化鎂、硫酸鎂、氨基酸；該疫苗佐劑具有穩(wěn)定性保護(hù)功能，既作為疫苗的穩(wěn)定劑，又具有疫苗佐劑的功能，能增強(qiáng)疫苗的免疫活性，對(duì)于疫苗制品的推廣和應(yīng)用具有重大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明的新型疫苗佐劑適用于各種病毒疫苗和蛋白疫苗。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果:本發(fā)明新型疫苗佐劑含有海藻糖、具有酸堿度緩沖能力的緩沖物、氯化鎂、硫酸鎂、氨基酸；是一種可替代氫氧化鋁的新型疫苗佐劑，配方中所用物質(zhì)均為常用藥用化學(xué)物質(zhì)組成，該疫苗佐劑具有穩(wěn)定性保護(hù)功能，既作為疫苗的穩(wěn)定劑，又具有疫苗佐劑的功能，能增強(qiáng)疫苗的免疫活性，對(duì)于疫苗制品的推廣和應(yīng)用具有重大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，是一種安全可靠、且價(jià)格低廉、適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的疫苗佐劑。


圖1是疫苗佐劑對(duì)腸道病毒71型(EV71)滅活疫苗原液在37°C下熱穩(wěn)定性結(jié)果。圖2是疫苗佐劑對(duì)腸道病毒71型(EV71)滅活疫苗半成品的在56°C高溫下熱穩(wěn)定性結(jié)果。圖3是疫苗佐劑處理的腸道病毒71型(EV71)滅活疫苗原液在透射電子顯微鏡結(jié)果(試驗(yàn)組)。圖4是疫苗佐劑處理的腸道病毒71型(EV71)滅活疫苗原液在透射電子顯微鏡結(jié)果(對(duì)照組)。
具體實(shí)施方案下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但本發(fā)明內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例1新型疫苗佐劑對(duì)腸道病毒71型(EV71)滅活疫苗的穩(wěn)定性保護(hù) A、新型疫苗佐劑的配制
取海藻糖80克溶于700毫升水中，然后按次序加入三羥甲基氨基甲烷緩沖物12克、氯化鎂2克、硫酸鎂4克、L-半胱氨酸2克、L-精氨酸5克、L-谷氨酸8克、甘氨酸10克混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.2，加水定容至1000毫升。

B、新型疫苗佐劑對(duì)腸道病毒71型(EV71)滅活疫苗原液的在37°C下熱穩(wěn)定性保護(hù)作用
取腸道病毒71型(EV71)滅活疫苗原液與疫苗佐劑液按體積比1:1混勻。將混勻后的液體放置于37°C下，分別在0、1、3、6月取樣，用雙抗體夾心法檢測(cè)腸道病毒71型滅活疫苗抗原含量的變化，同時(shí)以不用疫苗制劑處理的腸道病毒71型滅活疫苗原液作為試驗(yàn)對(duì)照，以放置于4度的用疫苗制劑配方處理的腸道病毒71型滅活疫苗原液作為陽性對(duì)照。雙抗體夾心法檢測(cè)抗原含量的方法如下:包被抗體為兔抗腸道病毒71型的多克隆抗體，使用濃度為1.2微克/毫升，100微升/孔，4°C孵育20小時(shí)左右，洗板三次；1%牛血清白蛋白封閉I小時(shí)，洗板三次；加入待檢樣品37°C孵育I小時(shí)，洗板四次；1:1000加入小鼠抗腸道病毒71型的單克隆抗體，洗板四次；1:1500加入辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白的酶標(biāo)抗體，洗板四次；加入底物鄰苯二銨顯色15分鐘，加入反應(yīng)終止液，酶標(biāo)儀測(cè)量光吸收A49tl值。并以陰性對(duì)照吸光度值(扣除空白對(duì)照吸光度值)的2.1倍為臨界值(Cutoff)作為疫苗抗原效價(jià)的判定標(biāo)準(zhǔn)。(陰性對(duì)照吸光度值小于0.05
時(shí)按0.05計(jì)算，大于0.05按實(shí)際值計(jì)算)
疫苗佐劑對(duì)腸道病毒71型(EV71)滅活疫苗原液的在37°C下熱穩(wěn)定性保護(hù)結(jié)果如圖1。用疫苗制劑配方處理的試驗(yàn)組在37°C下放置6個(gè)月，其抗原含量仍維持不變；而未用疫苗制劑配方處理的對(duì)照組在3個(gè)月的時(shí)候抗原含量明顯下降，到6個(gè)月時(shí)抗原含量無法檢測(cè)到。C、新型疫苗佐劑對(duì)腸道病毒71型(EV71)滅活疫苗半成品的在56°C高溫下熱穩(wěn)定性保護(hù)作用
取腸道病毒71型滅活疫苗半成品與疫苗佐劑配方液按體積比1:1混勻。將混勻后的液體放置于56°C高溫下，分別在12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、96小時(shí)取樣，用雙抗體夾心法檢測(cè)腸道病毒71型滅活疫苗抗原含量的變化，同時(shí)以不用疫苗制劑配方處理的腸道病毒71型滅活疫苗半成品作為對(duì)照。疫苗佐劑對(duì)腸道病毒71型滅活疫苗半成品的在56°C下熱穩(wěn)定性保護(hù)結(jié)果如圖2。試驗(yàn)組在48小時(shí)內(nèi)仍具有良好的熱穩(wěn)定性；而對(duì)照組在36小時(shí)時(shí)抗原含量開始下降。D、疫苗佐劑處理的腸道病毒71型滅活疫苗原液在透射電子顯微鏡下的表現(xiàn) 取腸道病毒71型滅活疫苗原液與疫苗佐劑配方液按體積比1:1混勻。將混勻后的液
體放置于4°C下放置12個(gè)月，同時(shí)以不用疫苗制劑配方處理的腸道病毒71型滅活疫苗原液作為試驗(yàn)對(duì)照。將試驗(yàn)組和對(duì)照組的樣品通過磷鎢酸負(fù)染，在透射電子顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，經(jīng)過疫苗佐劑配方處理的腸道病毒71型滅活疫苗原液在4°C下放置12個(gè)月后，其在電鏡下狀態(tài)如圖3，病毒顆粒呈球形，電鏡照片背景清楚，直徑為25-30納米，病毒亞單位清晰可見，少數(shù)病毒為空心顆粒。這與高度純化的微小核糖核酸病毒呈大規(guī)模聚集或晶格樣排列不同，在疫苗佐劑配方液中，病毒顆粒呈散在性分布排列，不大規(guī)模聚集、也不呈晶格狀排列，有利于病毒抗原位點(diǎn)的暴露。同時(shí)，從對(duì)照組的電鏡照片看出(見圖4)，未經(jīng)過疫苗佐劑配方液處理的疫苗原液經(jīng)4°C下放置12個(gè)月后，其在電鏡下未找到完整的病毒顆粒，說明病毒顆粒已經(jīng)遭到分解、破壞。實(shí)施例2新型疫苗佐劑對(duì)腸道病毒71型滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用
A、新型疫苗佐劑的配制
取海藻糖80克溶于700毫升水中，然后按次序加入三羥甲基氨基甲烷緩沖物12克、氯化鎂2克、硫酸鎂4克、L-半胱氨酸2克、L-精氨酸5克、L-谷氨酸8克、甘氨酸10克混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.2，加水定容至1000毫升。B、腸道病毒71型滅活疫苗制劑的配制
將所配制疫苗佐劑與抗原含量為1280EU/毫升(EU，Elisa單位)腸道病毒71型滅活疫苗以1:1的比例混勻，配制成抗原含量為640EU/毫升的腸道病毒71型滅活疫苗制劑。C、腸道病毒71型滅活疫苗制劑的免疫
將配制好的抗原含量為640EU/毫升的腸道病毒71型滅活疫苗制劑作為試驗(yàn)組，以含有氫氧化鋁佐劑抗原含量為640EU/毫升的腸道病毒71型滅活疫苗作為陽性對(duì)照組，以單純只含有抗原含量為640EU/毫升的腸道病毒71型滅活疫苗最為陰性對(duì)照組，免疫清潔級(jí)的BALB/c小鼠，每個(gè)組為20只。同時(shí)設(shè)立5只小鼠的空白組。

免疫方案:共免疫一次，在每只小鼠腹腔注射接種0.5毫升。在初次免疫一個(gè)月后,通過心臟主動(dòng)脈無菌采血,分離血清。D、間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè)小鼠血清抗-EV71 (腸道病毒71型)抗體IgG (免疫球蛋白G)水平
將腸道病毒71型抗原用包被稀釋液稀釋至I微克/毫升，包被至96孔酶標(biāo)板上，100微升/孔，4°C過夜，洗板三次；加入含有1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，200微升/孔，37°C放置I小時(shí)，洗板三次；將血清經(jīng)倍比稀釋后，加入酶標(biāo)板上，每孔100微升，同時(shí)設(shè)立陰性孔和空白孔，37°C放置I小時(shí)，洗板三次；加入二抗(辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG),每孔100微升，37°C放置30分鐘，洗板三次；加入顯色液，每孔100微升，避光放置20分鐘；加終止液，每孔100微升；在酶標(biāo)儀上讀板，測(cè)出各個(gè)酶標(biāo)板孔中的OD值(吸光度值)，以所得陰性孔平均OD值的2.1倍作為抗體效價(jià)的閾值進(jìn)行抗體效價(jià)計(jì)算。試驗(yàn)結(jié)果如下(見表I):
在進(jìn)行一針免疫后，試驗(yàn)組誘導(dǎo)的抗-EV71抗體IgG水平為254.9 ;氫氧化鋁陽性對(duì)照組誘導(dǎo)的抗-EV71抗體IgG水平為374.1 ;陰性對(duì)照組誘導(dǎo)的抗-EV71抗體IgG水平為17.3;而空白組誘導(dǎo)的抗-EV71抗體IgG水平為零。試驗(yàn)組、氫氧化鋁陽性對(duì)照組的抗-EV71抗體IgG平均水平高于陰性組(P〈0.05，t檢驗(yàn))。同時(shí)以抗體效價(jià)大于等于100作為閾值計(jì)算小鼠EV71抗體陽轉(zhuǎn)率，試驗(yàn)
組抗體陽轉(zhuǎn)率為95%，氫氧化鋁陽性對(duì)照組抗體陽轉(zhuǎn)率為85%，陰性組抗體陽轉(zhuǎn)率為10%，試驗(yàn)組、氫氧化鋁陽性對(duì)照組小鼠EV71抗體陽轉(zhuǎn)率顯著高于陰性對(duì)照組(P〈0.01，卡方檢驗(yàn))，試驗(yàn)組與氫氧化鋁陽性對(duì)照組之間的小鼠EV71抗體陽轉(zhuǎn)率差異不顯著(P>0.05，卡方檢驗(yàn))。說明所用的佐劑配方具有增強(qiáng)疫苗免疫效果的佐劑作用。表I疫苗佐劑增強(qiáng)EV71滅活疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗-EV71抗體IgG水平的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種可替代氫氧化鋁的新型疫苗佐劑，其特征在于疫苗佐劑含有海藻糖、具有酸堿度緩沖能力的緩沖物、氯化鎂、硫酸鎂、氨基酸，配方組份為海藻糖含量為20-200克/升，具有酸堿度緩沖能力的緩沖液濃度為5-40毫摩爾/升，氯化鎂含量為1-4克/升，硫酸鎂含量為2-8克/升，氨基酸含量為1-20克/升。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述新型疫苗佐劑，其特征在于具有酸堿度緩沖能力的緩沖物包括，磷酸鹽緩沖物、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖物、枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖物、氨-氯化銨緩沖物、醋酸-醋酸鈉緩沖物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述新型疫苗佐劑，其特征在于疫苗佐劑配制方法為:取海藻糖溶于水中，待完全溶解后，依次加入具有酸堿度緩沖能力的緩沖液、氯化鎂、硫酸鎂、氨基酸，調(diào)節(jié)溶液酸堿度，加水定容。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述新型疫苗佐劑，其特征在于溶液酸堿度為6.0-9.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述新型疫苗佐劑，其特征在于既作為疫苗的穩(wěn)定劑，又具有疫苗佐劑的功能，能增強(qiáng)疫苗的免疫活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述新型疫苗佐劑，其特征在于疫苗佐劑適用于各種病毒疫苗和蛋白疫 苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，特別是用于疫苗產(chǎn)品中的穩(wěn)定性保護(hù)配方和一種可替代氫氧化鋁的新型疫苗佐劑。新型疫苗佐劑含有海藻糖、具有酸堿度緩沖能力的緩沖物、氯化鎂、硫酸鎂、氨基酸。本發(fā)明新型疫苗佐劑不僅具有穩(wěn)定劑的作用，又具有疫苗佐劑的功能，能增強(qiáng)疫苗的免疫活性，對(duì)于疫苗制品的推廣和應(yīng)用具有重大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，是一種安全可靠、且價(jià)格低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的疫苗佐劑。
文檔編號(hào)A61K47/36GK103110943SQ201310077868
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月11日
發(fā)明者高孟, 周康鳳, 毛江森, 姜云水, 王靜華, 羅永能, 陳科達(dá), 王一虎, 高麗美, 朱蓮, 潘海華, 顧春燕, 陳悅青, 莊昉成, 毛子安 申請(qǐng)人:浙江普康生物技術(shù)股份有限公司