專利名稱：含有鋁、寡核苷酸和聚陽離子的佐劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及疫苗佐劑及其組合的領域。
背景技術：
佐劑包含在許多現(xiàn)有疫苗中。迄今為止，鋁鹽，特別是氫氧化鋁或磷酸鋁是最常用的佐劑。雖然它們常用作單獨佐劑，但也與其它非鋁佐劑混合，例如FENDRIX 產(chǎn)品包含磷酸鋁加上3d MPL的佐劑，CERVARIX 產(chǎn)品的佐劑是氫氧化鋁加上3d MPL0 本發(fā)明的目的是提供一種包含鋁鹽的改良佐劑組合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種包含鋁鹽、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物的免疫佐齊 。寡核苷酸和聚合物理想地彼此結合，形成復合物。本發(fā)明還提供了一種免疫原性組合物，其包含(i)本發(fā)明的佐劑和(ii) 一種免疫原。免疫原可以吸附在佐劑中的鋁鹽上；吸附在佐劑中的寡核苷酸/聚合物復合物上；和/或不吸附在鋁鹽或復合物上。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明的免疫佐劑的方法，包括一個混合鋁鹽和免疫刺激性寡核苷酸及聚陽離子聚合物的步驟。在另選方法中，鋁鹽、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物在形成復合物前混合。例如，鋁鹽可與寡核苷酸混合，然后加入聚合物；或鋁鹽可與聚合物混合，然后加入寡核苷酸。復合物可在寡核苷酸和聚合物接觸后形成。本發(fā)明還提供了一種制備免疫原性組合物的方法，其包括一個混合(i)本發(fā)明的佐劑和(ii) 一種免疫原的步驟。免疫原、鋁鹽、寡核苷酸和聚合物可以任何順序混合。例如，本發(fā)明提供了一種制備本發(fā)明免疫原性組合物的方法，包括步驟混合(i)鋁鹽和(ii)免疫原；然后混合鹽/免疫原混合物、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明免疫原性組合物的方法，包括步驟混合(i)通常為復合物形式的免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物，和(ii)免疫原；然后將寡核苷酸/聚合物/免疫原混合物與鋁鹽混合。在一個優(yōu)選實施方式中，免疫原吸附在鋁鹽(例如氫氧化鋁佐劑)上，然后吸附的免疫原與寡核苷酸/陽離子聚合物復合物混合。本發(fā)明還提供一種藥盒，其裝有(i)含有本發(fā)明的佐劑的第一容器，和(ii)含有免疫原和/或另一種佐劑的第二容器。本發(fā)明還提供一種藥盒，其裝有(i)含有鋁鹽的第一容器；和(ii)含有免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物的第二容器。第一和第二容器之一或兩者都可以包含一種免疫原。因此，可合并(例如在使用時)兩個容器的內(nèi)容物，形成本發(fā)明的佐劑或免疫原性組合物。這些試劑盒可包含第三個容器，其含有免疫原和/或另一種佐劑。鋁鹽本發(fā)明的佐劑包含至少一種鋁鹽。合適的鋁鹽包括獨立稱作氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是常規(guī)名稱，但僅為使用方便，因為其均不是出現(xiàn)的實際化合物的準確描述(例如參見參考文獻I第9章)。本發(fā)明可采用通常用作佐劑的任何"氫氧化物"或"磷酸鹽"佐劑。優(yōu)選使用氫氧化鋁佐劑。稱為"氫氧化鋁"的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽(通常至少部分為晶體)?？刹捎眉t外(IR)光譜將式AlO (OH)代表的羥基氧化鋁與其它鋁化合物，如氫氧化鋁Al (OH)3區(qū)別開，具體區(qū)別是lOTOcnr1處存在吸收條帶和3090-3100( ^處存在強肩[參考文獻I的第9章]。半峰高處衍射帶的寬度(WHH)反映了氫氧化鋁佐劑的結晶程度，結晶不佳的顆粒因晶體尺寸較小而顯示更強的譜線增寬。表面積隨WHH的增加而增加，WHH值較大的佐劑顯示吸附抗原的能力較強。氫氧化鋁佐劑通常呈纖維形態(tài)(例如，如電子透射顯微圖中所見)。在文獻2中報導了 1-10 μ m范圍內(nèi)的平均粒徑。氫氧化鋁佐劑的pi通常約11，即在生理 PH下佐劑本身具有表面正電荷。據(jù)報道，pH 7. 4時氫氧化鋁佐劑的吸附容量為I. 8-2. 6毫克蛋白質(zhì)/毫克Al+++。稱為"磷酸鋁"的佐劑一般是羥基磷酸鋁，也常常含有少量硫酸鹽(即羥基磷酸硫酸鋁)?？赏ㄟ^沉淀獲得這些佐劑，沉淀期間的反應條件和濃度影響磷酸根取代所述鹽中羥基的程度。羥基磷酸鹽的P04/A1摩爾比通常為O. 3-1.2。羥基磷酸鹽因存在羥基而有別于嚴格的A1P04。例如，3164CHT1的IR光譜帶(例如，當加熱至200°C時)表明存在結構性羥基[參考文獻I的第9章]。I],磷酸鋁佐劑的P04/A13+摩爾比通常為O. 3-1. 2，優(yōu)選為O. 8-1. 2，更優(yōu)選為O. 95±0. I。磷酸鋁通常是無定形的，尤其是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是P04/A1摩爾比為O. 84-0. 92的無定形的羥基磷酸鋁，包含O. 6mg Al3Vml0磷酸鋁通常是顆粒(如在透射電子顯微圖上觀察到的板狀形態(tài))。在吸附任意抗原后顆粒直徑一般是
O.5-20 μ m (如約5-10 μ m)。據(jù)報道，pH 7. 4時磷酸鋁佐劑的吸附容量為O. 7-1. 5毫克蛋白質(zhì)/毫克Al+++。磷酸鋁的零電點(PZC)與磷酸對羥基的取代程度逆相關，這種取代程度可能取決于用于通過沉淀制備鹽的反應條件和反應物濃度。也通過改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(更多磷酸根=更多酸性PZC)或加入緩沖劑如組氨酸緩沖劑(使PZC堿性更強)改變PZC。本發(fā)明所用的磷酸鋁的PZC通常為4. 0-7. 0，更優(yōu)選為5. 0-6. 5，例如約為5. 7。還可使用氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。在這種情況下，磷酸鋁比氫氧化鋁多，例如重量比為至少2 1，例如彡5 I、彡6 I、彡7 I、彡8 I、彡9 I等。因此，本發(fā)明的佐劑可包含(i)氫氧化鋁、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物；(ii)磷酸鋁、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物；或(iii)氫氧化鋁、磷酸鋁、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物。本發(fā)明的藥物組合物中Al+++的濃度通常小于10mg/ml,例如< 5mg/ml、i^ 4mg/ml、(3mg/mK 2mg/mK lmg/ml 等。優(yōu)選范圍是 O. 3-lmg/ml。免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物本發(fā)明使用免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物。它們彼此理想結合，形成顆粒復合物，其通常是TLR9激動劑。已知免疫刺激性寡核苷酸是有用的佐劑。它們通常含有CpG基序(一種二核苷酸序列，其含有與鳥苷連接的未甲基化的胞苷)，其佐劑效果如文獻3-8中所述。含有TpG基序、回文結構序列、多重連續(xù)胸苷核苷酸(例如TTTT)、多重連續(xù)胞苷核苷酸(例如CCCC)或聚(dG)序列的寡核苷酸也稱作免疫刺激物，如雙鏈RNA—樣。雖然這些不同的免疫刺激性寡核苷酸任一種都可用于本發(fā)明，優(yōu)選使用含脫氧肌苷和/或脫氧尿苷的寡脫氧核苷酸[9]，理想地是含脫氧肌苷和脫氧胞苷的寡脫氧核苷酸。含肌苷的寡脫氧核苷酸可以包含CpI基序(一種二核苷酸序列，含有與肌苷連接的胞苷)。寡脫氧核苷酸可包含一個以上(例如2，3，4，5，6或以上)的CpI基序，這些可以是直接重復(例如包含序列(CI)x，其中X是2，3，4，5，6或以上)或彼此間隔(例如包含序列(CIN) X，其中X是2，3，4，5，6或以上，其中N獨立代表一個或多個核苷酸)。胞苷殘基理想不甲基化。寡核苷酸通常可具有10-100個核苷酸，例如15-50個核苷酸，20_30個核苷酸，或25-28個核苷酸。通常其為單鏈。寡核苷酸可僅包含天然核苷酸，僅包含非天然核苷酸，或其混合物。例如，其可包含一個或多個硫代磷酸酯鍵，和/或一個或多個核苷酸可具有2’ -O-甲基修飾。用于本發(fā)明的優(yōu)選寡核苷酸是單鏈脫氧寡核苷酸，具有26核苷酸序列5’-(IC)13-3’(SEQ ID N0:1)。該寡脫氧核苷酸與聚陽離子聚合物形成穩(wěn)定復合物，得到良好佐劑。聚陽離子聚合物理想的是聚陽離子肽，例如陽離子抗菌肽。聚合物可包含一個或多個亮氨酸殘基和/或一個或多個賴氨酸殘基。聚合物可包含一個或多個精氨酸殘基。其可包含這些氨基酸之一的至少一種直接重復，例如一個或多個Leu-Leu 二肽序列，一個或多個Lys-Lys 二肽序列，或一個或多個Arg-Arg 二肽序列?？砂辽僖粋€(優(yōu)選多個，例如2或3個)Lys-Leu 二肽序列,和/或至少一個(和優(yōu)選多個例如2或3個)Lys-Leu-Lys三肽序列。肽可包含序列R1-XZXZxXZX-R2，其中x是3，4，5，6或7 ;每個X是獨立的帶正電的天然和/或非天然氨基酸殘基；每個Z獨立地是氨基酸殘基L，V，I，F(xiàn)或W況和R2獨立選自-H，-NH2, -COCH3，或-C0H。在一些實施方式中，X-R2是肽C-末端氨基酸殘基的酰胺、酯或硫酯。也可見參考文獻10。聚陽離子肽通常具有5-50個氨基酸，例如6-20個氨基酸，7-15個氨基酸或9_12
個氨基酸。肽可僅包含天然氨基酸，僅包含非天然氨基酸，或兩者的混合物。可包含L-氨基酸和/或D-氨基酸。L-氨基酸是典型的。肽可具有天然N-端(NH2-)或修飾的N-末端，例如羥基、乙?；取ｋ目删哂刑烊籆-端(-C00H)或修飾的C-末端，例如羥基、乙?；?。這些修飾可促進肽的穩(wěn)定性。優(yōu)選用于本發(fā)明的肽是11肽KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO :2 ;參考文獻11)，全部都是L-氨基酸?？蓪-末端脫酰胺化，可羥基化C-末端。優(yōu)選的肽是H-KLKL5KLK-0H，全部都是L-氨基酸。寡肽是已知的抗菌肽[12]、嗜中性粒細胞活化物[13]和佐劑[14]，與免疫刺激性寡核苷酸形成穩(wěn)定復合物，得到良好佐劑。最優(yōu)選的免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物的最優(yōu)選的混合物是TLR9激動劑，稱作IC31 [15-17]，其是寡脫氧核苷酸SEQ ID NO :1和聚陽離子寡肽SEQ ID NO :2的吸附性復合物。、
可以不同比例混合寡核苷酸和寡肽，但通常它們以肽摩爾過量混合。摩爾過量可至少是 5 1，例如 10 1,15 1,20 1,25 1,30 ；1,35 1,40 I 等。約 25 : I 的摩爾比是理想的[18，19]。以此過量比混合可形成寡核苷酸和寡肽的不溶性顆粒復合物。復合物可與本文所述的鋁鹽混合。寡核苷酸和寡肽通常在水性條件下混合，例如寡核苷酸溶液可與寡肽溶液以所需比例混合?？赏ㄟ^在水中或緩沖液中溶解干燥的(例如凍干的)物質(zhì)，形成可隨后混合的儲液，制備兩種溶液。可用參考文獻20公開的方法分析復合物。典型的是平均直徑在I μ m_20 μ m之間的復合物。聚精氨酸和CpG寡脫氧核苷酸類似地形成復合物[21]?？蓪秃衔锞S持在水性懸液中，例如水中或緩沖液中。用于復合物的典型緩沖液 是磷酸鹽緩沖液(例如磷酸緩沖鹽水)、Tris緩沖液、Tris/山梨醇緩沖液、硼酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、組氨酸緩沖液等。另選的，有時凍干復合物?？呻x心水性懸液中的復合物，將其與團塊介質(zhì)分開(例如通過吸取、傾潷等)。如需要，然后可將這些復合物重懸浮于另一種介質(zhì)中。鋁鹽、寡核苷酸和聚合物的混合可方便地通過將鋁鹽的水性懸液與寡核苷酸/聚合物復合物的水性懸液混合，制備本發(fā)明的佐劑組合物。通常鹽和復合物各自維持液體形式，因此提供了一種共同配制的簡單途徑。在一些實施方式中，一種或多種懸液包含免疫原，因此混合提供了本發(fā)明的免疫原性組合物。在其它實施方式中，液體都不含免疫原，因此混合的產(chǎn)物(即本發(fā)明的佐劑組合物)隨后可于免疫原混合，得到本發(fā)明的免疫原性組合物。當兩種液體混合時，混合體積比可以變化(例如在20 1-1 20之間，在10 1-1 10之間，在5 1-1 5之間，在2 1-1 2之間，等)，但理想的是約I : I?？蛇x擇兩種懸液中的組分濃度，從而在混合物后得到理想的最終濃度，例如兩者都可以2x強度制備，從而I : I混合能得到最終所需的濃度。也可以其它方式制備佐劑組合物，例如通過離心鋁鹽，然后將沉淀重懸浮于復合物懸液中，通過離心復合物然后將沉淀重懸浮于鋁鹽懸液中等?？墒褂霉押塑账岷途坳栯x子聚合物的不同濃度，例如文獻15、18、19或22中所用的任何濃度。例如，聚陽離子寡肽可以1100 μ M, 1000 μ M, 350 μ Μ, 220 μ Μ，200 μ Μ，110 μ Μ，100 μ Μ, 11 μ Μ, 10 μ Μ, I μ Μ，500ηΜ, 50ηΜ 等存在。寡核苷酸可以 44ηΜ, 40ηΜ, 20ηΜ, 14ηΜ,
4.4ηΜ，4ηΜ，2ηΜ等存在。小于2000ηΜ的聚陽離子寡肽濃度是典型的。以I : 25的摩爾比混合SEQ ID NO 1 & 2，本發(fā)明的三個實施方式中以mg/ml計的濃度因此為O. 311 & 1.322，或 O. 109 & O. 463，或 O. 031 和 O. 132。鋁鹽和免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物的復合物通常都是顆粒狀的。鋁鹽佐劑的平均粒徑通常為1-20 μ m級別[2，23]。這也是IC31 中所見的復合物的粒徑范圍。當合并這些顆粒時，鹽顆粒的粒徑可以基本于復合物的平均粒徑相同。然而在其它實施方式中，鹽顆粒的平均粒徑可比復合物的平均粒徑小。在其它實施方式中，鹽顆粒的平均粒徑可比復合物的平均粒徑大。當平均粒徑不同時，較大的粒徑可以大至少I. 05x e.g. I. lx，I.2x, I. 3x, I. 4x, I. 5x, 2x, 2. 5x, 3x或更多倍。如果鹽或復合物具有一定范圍粒徑的顆粒，但是平均粒徑不同，范圍可以重疊或不重疊。因此，最大的鹽顆?？尚∮谧钚〉膹秃衔镱w粒，或最大的復合物顆?？尚∮谧钚〉柠}顆粒。由于顆粒通常會太大以至于不能過濾滅菌，本發(fā)明佐劑組合物的滅菌通常是通過在無菌條件下制備鋁鹽和復合物，然后在無菌條件下將其混合實現(xiàn)的。例如，可過濾滅菌復合物的組分，然后在無菌條件下混合，形成無菌復合物。然后可將這些無菌復合物與高壓滅菌(無菌)的鋁鹽佐劑混合，得到無菌佐劑組合物。然后該無菌佐劑可與無菌免疫原混合，得到適用于施給病人的免疫原性組合物。鋁鹽顆粒的密度通常與免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物的復合物的密度不同，意味著這兩種顆粒可根據(jù)密度分離，例如蔗糖梯度。含有鋁鹽、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物的組合物還可有用地包含(i)緩沖液，例如組氨酸緩沖液，例如IOmM組氨酸緩沖液和/或(ii)5-15mg/ml氯化鈉，例如9mg/ml氯化鈉。包含組氨酸緩沖液的組合物可有用地具有6. 0-7. 4之間的pH，例如6. 3-7. O之間，或約6. 5。藥物組合物本發(fā)明的佐劑組合物通常包含除了鋁鹽、寡核苷酸和聚合物以外的組分，例如它們通常含有一種或多種藥學上可接受的組分。這些組分還可存在于本發(fā)明的免疫原性組合物中，可能來自佐劑組合物或另一種組合物。對這類組分的充分討論參見參考文獻24。組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。疫苗優(yōu)選應基本不含(如< 10yg/ml)含汞物質(zhì)，如不含硫柳汞。更優(yōu)選無汞的疫苗。特別優(yōu)選無防腐劑的疫苗，在流感疫苗中可包含琥珀酸α-生育酚以替代含汞化合物。為了控制張力，組合物可包含生理鹽如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，其濃度可為l-20mg/ml?？梢源嬖诘钠渌}包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和/或氯化鎂等。組合物可具有200m0sm/kg-400m0sm/kg的滲透壓，例如240-360m0sm/kg,也可以是 280_330m0sm/kg 或 290_310m0sm/kg。組合物的pH通常為5. 0-8. 1，更典型為6. 0-8. 0，例如6. 5-7. 5，或者7. 0-7. 8。該組合物優(yōu)選無菌。該組合物優(yōu)選無熱原，如每劑量含有< 1EU(內(nèi)毒素單位，標準量度)，優(yōu)選每劑量< O. IEU0該組合物優(yōu)選不含谷蛋白。一種有用的組合物包含組氨酸緩沖液(例如IOmM組氨酸緩沖液)、氯化鈉(例如9mg/ml氯化鈉)和氫氧化招佐劑(例如2mg/ml Al+++)。免疫原性組合物可含有一次免疫的物質(zhì)，或者可含有多次免疫的物質(zhì)(即‘多劑量’藥盒)。多劑量配置有用地含有防腐劑。作為多劑量組合物中包含防腐劑的替代方案(或補充方案)，所述組合物可包含在裝有無菌接頭以取出物質(zhì)的容器中。在給藥時，本發(fā)明組合物通常是水性形式。疫苗的給藥劑量體積一般為約O. 5ml,雖然有時可將一半劑量(即約O. 25ml)給予兒童。在本發(fā)明的一些實施方式中，可以更高劑量給予組合物，例如，約1ml，例如混合兩個O. 5ml的體積后。免疫原 可對動物施用本發(fā)明的佐劑組合物聯(lián)合免疫原，以誘導免疫應答。本發(fā)明可與大量免疫原聯(lián)用，用于治療或預防各種疾病。免疫原可引起抵抗病毒病(例如由于衣殼或非衣殼病毒)、細菌病(例如由于革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌)、真菌病、寄生蟲病、自身免疫病、或任何其它疾病的免疫應答。免疫原還可用于免疫治療，例如治療腫瘤/癌癥，阿爾茨海默氏病、或成癮。免疫原可采取各種形式，例如全生物體、外膜囊泡、蛋白質(zhì)、糖、脂多糖、偶聯(lián)物(例如載體或半抗原的偶聯(lián)物，或載體和糖或脂多糖的偶聯(lián)物)等。免疫原可引發(fā)針對流感病毒，包括A和B型流感病毒的免疫應答。目前可以獲得各種形式的流感病毒免疫原，通?；诨畈《净驕缁畈《?。滅活疫苗可基于全病毒顆粒、裂解病毒顆?；蚧诩兓谋砻婵乖Ａ鞲锌乖部梢圆《倔w形式出現(xiàn)。血凝素是現(xiàn)有滅活疫苗中的主要免疫原，且參照一般由SRID測定的HA水平來標準化疫苗劑量。現(xiàn)有的疫苗一般含有約15 μ g HA/毒株，但也可使用更低的劑量，例如兒童或大流行情況下，或者是使用佐劑時。分數(shù)劑量如1/2 (即7. 5yg HA/毒株)、1/4和1/8以及較高劑量(如3x或9x劑量[25，26])已有應用。因此，組合物可包含O. 1-150 μ g HA/流感毒株，優(yōu)選O. 1-50 μ g,例如 O. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、0. 1-7. 5 μ g、0. 5-5 μ g 等。具體劑量包括例如，約45、約30、約15、約10、約7. 5、約5、約3. 8、約3. 75、約I. 9、約I. 5等/株。通常包含質(zhì)量 基本相同的每種毒株的HA，例如每種毒株的HA質(zhì)量在每種毒株平均HA質(zhì)量的正負10 %之內(nèi)，優(yōu)選平均值的正負5%之內(nèi)。對于活疫苗，利用組織培養(yǎng)感染劑量中值(TCID5tl)而非HA含量來衡量劑量，且TCID5tl—般為IO6-IO8 (優(yōu)選為IO6 5-IO7 5)/毒株。除了使用SPF雞蛋作為病毒生長的培養(yǎng)基外(從感染雞蛋的尿囊液中收集病毒)，還可使用支持流感病毒復制的細胞系。細胞系通?？梢允遣溉閯游飦碓吹?，例如MDCK。甲型流感病毒免疫原通常來自任何合適的HA亞型毒株，例如HI, H3, H5, H7, H9等，例如HlNl，H3N2和/或H5N1毒株。免疫原可引發(fā)針對念珠菌，例如白色念珠菌的免疫應答。例如，免疫原可以是β-葡聚糖，其可與載體蛋白偶聯(lián)。葡聚糖可包含β_1，3和/或β_1，6鍵。合適的免疫原包含文獻27和28中公開的那些。免疫原可引發(fā)針對鏈球菌，例如無乳鏈球菌(S. agalactiae)、肺炎鏈球菌、和化膿鏈球菌的免疫應答。例如，免疫原可以是莢膜糖，其可與載體蛋白偶聯(lián)。對于無乳鏈球菌，糖可以來自血清型Ia，Ib, II，III，和/或V的一種或多種。對于肺炎鏈球菌，糖可來自血清型1，3，4，5，68，7 ，抑，14，18(，19 ，和/或23 的一種或多種。除了(或代替)莢膜糖免疫原，可用多肽免疫原引發(fā)抗鏈球菌的保護性免疫應答，例如包含RrgB，如文獻29中公開的。免疫原可引發(fā)針對葡萄球菌，包括金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌的免疫應答。例如，免疫原可包含IsdA抗原、IsdB抗原、ClfA抗原、ClfB抗原、SdrD抗原、Spa抗原、EsxA抗原、EsxB抗原、Sta006抗原、溶血素和/或StaOll抗原。合適的金黃色葡萄球菌及其組合如文獻30所述。免疫原可引起針對腦膜炎球菌(腦膜炎奈瑟氏菌)的免疫應答。例如，免疫原可以是莢膜糖，其可偶聯(lián)于載體蛋白。莢膜糖對于抵抗腦膜炎血清組A，C，W135和/或Y特別有用。除了(或代替)莢膜糖免疫原，可用多肽免疫原和/或外膜囊泡引發(fā)保護性抗腦膜炎免疫應答，特別用于抵抗血清組B，如文獻31所述。有用的血清組B的抗原在下文進一步詳述。免疫原能引起針對肝炎病毒，例如甲肝病毒、乙肝病毒和/或丙肝病毒的免疫應答。例如，免疫原可以是乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。然而在一些實施方式中，免疫原不是HBsAg (參見文獻32)。免疫原可引發(fā)針對呼吸道合胞病毒的免疫應答。免疫原可以來自A組RSV和/或B組RSV。合適的免疫原可包含F(xiàn)和/或G糖蛋白或其片段，例如文獻33和34中所述的。免疫原可引發(fā)針對衣原體，包括沙眼衣原體和肺炎衣原體的免疫應答。合適的免疫原包括那些文獻35-41所述的。免疫原可引發(fā)針對大腸桿菌，包括腸道外病原菌的免疫應答。合適的免疫原包括文獻42-45所述的那些。免疫原可引發(fā)針對冠狀病毒，例如人SARS冠狀病毒的免疫應答。合適的免疫原可包含突起糖蛋白。
免疫原可引發(fā)針對幽門螺桿菌的免疫應答。合適的免疫原包括CagA[46_49]，VacA [50，51]，和 / 或 NAP [52-54]。免疫原可引發(fā)針對狂犬病病毒的免疫應答。合適的免疫原是滅活的狂犬病毒[55，RabAvert ]。免疫原可引發(fā)針對人乳頭瘤病毒的免疫應答。有用的免疫原是LI衣殼蛋白，其可裝配形成稱作病毒樣顆粒(VLP)的結構?？赏ㄟ^在酵母細胞(例如釀酒酵母(S. cerevisiae))或昆蟲細胞(例如夜蛾(Spodoptera)細胞，如草地貪夜蛾(S. frugiperda),或果蜆(Drosophila)細胞)中重組表達LI產(chǎn)生VLP。在酵母細胞中，質(zhì)粒載體可攜帶LI基因；在昆蟲細胞中，桿狀病毒載體可攜帶LI基因。更優(yōu)選地，該組合物包含來自HPV-16和HPV-18毒株的L1VLP。已證明這種二價組合非常有效[56]。除了 HPV-16和HPV-18毒株外，也可能包含來自HPV-6和HPV-Il毒株的L1VLP。免疫原可引發(fā)針對腫瘤抗原，例如MAGE-I，MAGE-2, MAGE-3 (MAGE-A3), MART-I/Melan A，酪氨酸酶，gplOO，TRP-2等的免疫應答。免疫原可引發(fā)針對肺癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌等的免疫治療性應答。免疫原可引發(fā)針對與載體蛋白偶聯(lián)的半抗原的免疫應答，其中半抗原是濫用的藥物[57]。例子包括但不限于鴉片、大麻、安非他命、可卡因、巴比妥、苯乙哌啶酮、甲乙啶酮、水化氯醛、甲喹酮、苯二氮類、LSD、尼古丁、抗膽堿能藥、精神抑制藥、色胺、其它擬精神病藥物、鎮(zhèn)靜劑、苯環(huán)己哌啶、西洛西賓、揮發(fā)性亞硝酸鹽和其它包括生理和/或心理依賴性藥物?？梢允褂酶鞣N免疫原。B血清組腦膜炎球菌本發(fā)明的佐劑可用于增強針對腦膜炎球菌的免疫應答，特別是針對血清組B的腦膜炎球菌(“NmB”)。合適的引發(fā)抗-NmB反應的免疫原包括多肽抗原、脂寡糖和/或膜囊泡。腦膜炎球菌多肽抗原一種組合物可包含一種或多種腦膜炎多肽抗原。例如，一種組合物可包含一種多肽抗原，選自287，NadA, NspA, HmbR, NhhA, App, 0mp85，和/或fHBP。這些抗原可有用地作為純化的多肽，例如重組多肽存在?？乖瓋?yōu)選在施給對象后引發(fā)殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。本發(fā)明的組合物可包含287抗原。287抗原作為基因NMB2132包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[58]的公布的基因組序列中(GenBank登錄號GI =7227388 ;本文的SEQ IDNO 3) 0之后已公布了來自許多菌株的287抗原序列。例如，287的等位基因形式如文獻59的圖5和15所示，以及例如文獻60的實施例13和圖21 (其中的SEQ ID 3179到3184)。已報道了許多287抗原的免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選287抗原包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :3具有50%或以上的相同性(例如60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99· 5%或以上)；和 / 或(b)包含SEQ ID NO :3至少η個連續(xù)氨基酸的片段，其中’ η’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250 或更多)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO :3的表位。本發(fā)明最有用的287抗原可在施給對象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO 3組成的腦膜炎多肽結合。有利的用于本發(fā)明的287抗原可在施給對象后弓I發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。
本發(fā)明的組合物可包含NadA抗體。NadA抗原作為基因NMB1994包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[58]的公布的基因組序列中(GenBank登錄號GI =7227256 ;本文的SEQID NO :4)。迄今已經(jīng)公布了來自許多菌株的NadA抗原序列，已經(jīng)詳細公開了作為奈瑟氏菌粘附素的蛋白活性。已報道了許多NadA的免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選Nad多肽包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO 4具有50%或以上的相同性(例如60%,65%,70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99. 5 %或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO :4至少η個連續(xù)氨基酸的片段，其中’η’是7或更多(例如 8，10，12，14，16，18,20,25,30,35,40,50,60,70,80,90,100，150,200,250 或更多)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO :4的表位。本發(fā)明最有用的NadA抗原可在施給對象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO :4組成的腦膜炎多肽結合。有利的用于本發(fā)明的NadA抗原可在施給對象后引發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。SEQ ID NO :6是這樣的一個片段。本發(fā)明的組合物可包含NspA抗原。NspA抗原作為基因NMB0663包括在腦膜炎B血清組菌株MC58[58]的公布的基因組序列中(GenBank登錄號GI =7225888 ;本文中的SEQID NO 5) 0先前文獻61和62提到該抗原。之后已公布了來自許多菌株的NspA抗原序列。已報道了許多NspA的免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選NspA多肽包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID勵5具有50%或以上的相同性(例如60%，65%，70%，75%，80%，85 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 %，99 %，99. 5 % 或以上)；和 / 或
(b)包含SEQ ID NO 5至少η個連續(xù)氨基酸的片段，其中’ η’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250 或更多)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO 5的表位。本發(fā)明最有用的NspA抗原可在施給對象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO :5組成的腦膜炎多肽結合。有利的用于本發(fā)明的NspA抗原可在施給對象后弓I發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。本發(fā)明的組合物可包含腦膜炎HmbR抗原。全長HmbR序列作為基因NMB1668包括在腦膜炎B血清組菌株MC58 [58]的公布的基因組序列中(本文的SEQ ID N0:12)。本發(fā)明可使用包含HmbR全長序列的多肽，但常用含有部分HmbR序列的多肽。因此在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的HmbR序列可包含與SEQ ID NO :12具有i %序列相同性的氨基酸序列，其中i值是50，60，70，80，90，95，99或以上。在其它實施方式中，本發(fā)明的HmbR序列可包含SEQ ID NO : 12的至少j個連續(xù)氨基酸的片段，其中j值是7，8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250 或以上。在其它實施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的HmbR序列可包含一氨基酸序列，⑴其與SEQ ID NO 12具有序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO 12至少j個連續(xù)氨基酸的片段。優(yōu)選j個氨基酸的片段包含來自SEQ ID NO:12的表位。這些表位通常包含位于HmbR表面上的氨基酸。有用的表位包括涉及HmbR與血凝素結合的氨基酸表位，因為與這些位點結合的抗體能夠封閉細菌與宿主血凝素結合的能力。HmbR的拓撲學及其關鍵功能性殘基如文獻63所述。本發(fā)明最有用的HmbR抗原可在施給對象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO : 12組成的腦膜炎多肽結合。有利的用于本發(fā)明的HmbR抗原可在施給對象后弓I發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。本發(fā)明的組合物可包含NhhA抗體。NhhA抗原作為基因NMB0992包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[58]的公布的基因組序列中(GenBank登錄號GI =7226232 ;本文的SEQID NO 6) 0自從例如文獻59和64已公布了來自許多菌株的NhhA抗原序列，也已報道了許多NhhA的免疫原性片段。它也稱為Hsf。本發(fā)明所用的優(yōu)選NhhA抗原包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID勵6具有50%或以上的相同性(例如60%，65%，70%，75%，80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或以上);和 /或(b)包含SEQ ID NO :6至少η個連續(xù)氨基酸的片段，其中’η’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250 或更多)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO :6的表位。本發(fā)明最有用的NhhA抗原可在施給對象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO :6組成的腦膜炎多肽結合。6.有利的用于本發(fā)明的NhhA抗原可在施給對象后弓I發(fā)殺菌性抗腦膜炎抗體。本發(fā)明的組合物可包含App抗原。App抗原作為基因NMB1985包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[58]的公布的基因組序列中(GenBank登錄號GI =7227246 ;本文的SEQ IDNO 7) 0之后已公布了來自許多菌株的App抗原序列。已報道了許多App的免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選App多肽包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :7具有50%或以上的相同性(例如 60 %，65 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96%，97%，98%，99%，99. 5%或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO :7至少η個連續(xù)氨基酸的片段，其中’ η，是 7 或更多(例如 8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250或更多)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO :7的表位。本發(fā)明最有用的App抗原可在施給對象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO 7組成的腦膜炎多肽結合。有利的用于本發(fā)明的App抗原可在施給對象后引發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。本發(fā)明的組合物可包含0mp85抗原。0mp85抗原作為基因NMB0182包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[58]的公布的基因組序列中(GenBank登錄號GI =7225401 ;本文的SEQID NO 8) ο之后已公布了來自許多菌株的0mp85抗原序列。0mp85的其它信息可見文獻65和66。已報道了許多0mp85的免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選Omp抗原包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID勵8具有50%或以上的相同性(例如60%，65%，70%，75%，80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或以上);和/或(b)包含SEQ ID NO :8至少η個連續(xù)氨基酸的片段，其中’η’是7或更多(例如8，10，12，14，16，18，20，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250 或更多)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO :8的表位。本發(fā)明最有用的0mp85抗原可在施給對象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO :8組成的腦膜炎多肽結合。有利的用于本發(fā)明的0mp85抗原可在施給對象后弓I發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。本發(fā)明的組合物可包括至少一種腦膜炎H因子結合蛋白(fHBP)。已經(jīng)仔細確定了fHBP抗原的特征。它也曾被稱作蛋白“741 [文獻60的SEQ ID 2535 & 2536，‘NMB1870’，‘GNA1870’ [文獻 67-69]，‘P2086’，‘LP2086’ 或 ‘0RF2086’ [70-72]。它是一種天然脂蛋白，表達于所有腦膜炎球菌血清組中。fHBP序列分為三種不同變體[73]已發(fā)現(xiàn)對給定家族產(chǎn)生的血清對同一家族產(chǎn)生殺細菌活性，但對表達另兩個家族之一的菌株無活性，即存在家族內(nèi)、而非家族間交叉保護。本發(fā)明的組合物可包含單個fHBP變體，但有利地包含來自兩種或三種變體的fHBP[73]。有利的用于本發(fā)明的fHBP抗原可在施給對象后引發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。當組合物含有一種fHBP變體時,其可包含以下之一(a)包含第一氨基酸序列的第一多肽，其中第一氨基酸序列包含一條氨基酸序列，其⑴與SEQ ID NO 9具有至少a%的序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO 9的至少x個連續(xù)氨基酸片段組成；(b)包含第二氨基酸序列的第二多肽，其中第二氨基酸序列包含一條氨基酸序列，其⑴與SEQ ID NO :10具有至少13%的序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO : 10的至少y個連續(xù)氨基酸片段組成；(C)包含第三氨基酸序列的第三多肽，其中第三氨基酸序列包含一條氨基酸序列，其⑴與SEQ ID NO 11具有至少c%的序列相同性，和/或(ii)由SEQ ID NO 11的至少z個連續(xù)氨基酸片段組成。當組合物包含兩種不同的腦膜炎fHBP抗原時，其可包含組合(i)如上定義的第一和第二多肽；(ii)如上定義的第一和第三多肽；或(iii)如上定義的第二和第三多肽。優(yōu)選第一和第三多肽的組合。第一和第二多肽可以是一條多肽的一部分(融合多肽)，該多肽包含第一和第二氨基酸序列。當組合物包含三種不同的腦膜炎fHBP抗原時，其可包含組合如上定義的第一、第二和第三多肽，這些可以是一條多肽(融合多肽)的部分，所述多肽包含第一、第二和第三氨基酸序列。這種三重fHBP融合蛋白公開于文獻74和75，例如本文的SEQ ID NO :17。當一種組合物含有兩種不同的腦膜炎球菌fHBP抗原時，雖然它們彼此可以有一些共有序列，但第一、第二、和第三多肽具有不同的fHBP氨基酸序列。包含第一氨基酸序列的多肽在施給對象時，能引起包含抗體的抗體應答，該抗體與氨基酸序列為SEQ ID NO :9的野生型腦膜炎球菌蛋白(MC58)結合。在一些實施方式中，這些抗體中的一些或全部不與具有氨基酸序列SEQ ID NO: 10的野生型腦膜炎球菌蛋白，或具有氨基酸序列SEQ ID NO : 11的野生型腦膜炎球菌蛋白結合。包含第二氨基酸序列的多肽在施給對象時，能引起包含抗體的抗體應答，該抗體與氨基酸序列為SEQ ID NO :10的野生型腦膜炎球菌蛋白(2996)結合。在一些實施方式中，這些抗體中的一些或全部不與具有氨基酸序列SEQ ID NO :9的野生型腦膜炎球菌蛋白，或具有氨基酸序列SEQ ID NO : 11的野生型腦膜炎球菌蛋白結合。包含第三氨基酸序列的多肽在施給對象時，能引起包含抗體的抗體應答，該抗體與氨基酸序列為SEQ ID NO=Il的野生型腦膜炎球菌蛋白(M1239)結合。在一些實施方式中，這些抗體中的一些或全部不與具有氨基酸序列SEQ ID NO :9的野生型腦膜炎球菌蛋白，、或具有氨基酸序列SEQ ID NO :10的野生型腦膜炎球菌蛋白結合。在一些實施方式中，SEQ ID NO 9的至少x個連續(xù)氨基酸的片段不應該還存在于SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11內(nèi)。類似的，SEQ ID NO : 10的至少y個連續(xù)氨基酸的片段不應該還存在于SEQ ID NO :9或SEQ ID NO : 11內(nèi)。類似的，SEQ ID NO 11的至少z個連續(xù)氨基酸的片段不應該還存在于SEQ ID NO :9或SEQ ID NO : 10內(nèi)。在一些實施方式中，當來自SEQ ID NO :9-11之一的片段作為連續(xù)序列與其它兩個SEQ ID NO比對時，片段與其它兩條SEQ ID NO中的每一條之間的相同性小于75%，例如小于70%，小于65%，小于60%
坐寸οa 的值是至少 80，例如 82，84，86，88，90，92，94，95，96，97，98，99 或以上。b 的值是至少 80，例如 82，84，86，88，90，92，94，95，96，97，98，99 或以上。c 的值是至少 80，例如 82，84，86，88，90，92，94，95，96，97，98，99或以上。a、b、和c值可以相同或不同。在一些實施 方式中，a、b和c是相同的。X 值至少為 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250)。 y 值至少為 7，例如 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250)。z 值至少為 7，例如
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250)。x、y、和 z 值可以相同或不同。在一些實施方式中，X、y和z是相同的。片段優(yōu)選包含來自各SEQ ID NO:序列的表位。其他有用片段缺少各SEQ ID NO:C末端的一個或多個氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個)和/或SEQID NO :N末端的一個或多個氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多個)，而保
留其至少一個表位。在一些實施方式中，fHBP多肽在例如N-末端半胱氨酸處脂化。對于脂化fHBP，與半胱氨酸結合的脂類通常包含棕櫚?；?，例如三棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酸(Pam3Cys)、二棕櫚酰-S-半胱氨酸(Pam2Cys)、N-乙?；?二棕櫚酰-S-甘油基半胱氨酸)等。一種組合物可包含一種以上的腦膜炎多肽抗原。例如，組合物可包含三種多肽一種包含SEQ ID NO : 13，一種包含SEQ ID NO : 14，第三種包含SEQ ID NO : 15或26 (見文獻31和76)。這種三種多肽的組合覆蓋了五種抗原，對于針對血清組B的腦膜炎球菌的保護特別有利。一種另選的組合物可包含第一多肽，其包含SEQ ID NO : 13 ;第二多肽，包含SEQID NO: 15 ;和第三多肽，包含SEQ ID NO 17. 一種另選的組合物可包含第一多肽，其包含SEQ ID NO : 13 ;第二多肽，包含SEQ ID NO : 15 ;和第三多肽，包含SEQ ID NO: 18。一種另選的組合物可包含第一多肽，其包含SEQ ID NO 13 ;第二多肽，包含SEQ ID NO 26 ;和第三多肽，包含SEQ ID NO 170 一種另選的組合物可包含第一多肽，其包含SEQ ID N0:13;第二多肽，包含SEQ ID NO :26 ;和第三多肽，包含SEQ ID NO 180腦膜炎球菌脂寡糖一種組合物可包含一種或多種腦膜炎脂寡糖(LOS)抗原。腦膜炎LOS是基于葡糖胺的磷脂，發(fā)現(xiàn)于細菌外膜的外側(cè)單層。其包含脂A部分和核心寡糖區(qū)域，脂A部分作為膜內(nèi)的疏水錨定位點。寡糖核心中的異源性產(chǎn)生了對不同腦膜炎菌株的結構和抗原多樣性，被用于將菌株分成12種免疫型(LI到L12)。發(fā)明可用來自任何免疫型，例如來自LI，L2，L3, L4, L5, L6, L7 和 / 或 L8 的 LOS。L2和L3 α -鏈天然包含乳糖-N-新四糖(LNnT)。當發(fā)明使用來自L2或L3免疫型的LOS時，該LNnT可以不存在。可方便地使用工程改造破壞在α鏈中合成LNnT的能力的突變菌株方便地實現(xiàn)這種缺失。已知通過敲除負責相關生物合成添加的酶來實現(xiàn)該目的[77，107]。例如，LgtB酶的敲除阻止了 LNnT末端半乳糖的加入，并且阻止了下游α鏈末端唾液酸的添加。LgtA酶的敲除阻止了 LNnT的N-乙酰葡糖胺的加入，和下游的添加。LgtA敲除可以伴隨LgtC敲除。類似的，LgtE和/或GalE酶的敲除阻止了內(nèi)部半乳糖的加入。LgtF的敲除阻止了 H印I殘基上葡萄糖的加入?？墒褂眠@些敲除中的任一或組合，來破壞L2，L3，L4，L7或L9免疫型菌株中的LNnT四糖。優(yōu)選敲除至少LgtB。因為這提供了保留有用的免疫原性而除去LNnT表位的L0S。除此之外，或可代替的，破壞LNnT表位的突變，敲除galE基因也提供了有用的修飾L0S，一種脂質(zhì)A脂肪轉(zhuǎn)移酶基因也可類似被敲除[78]?？蓮腖OS除去至少一種伯位O-連接的脂肪酸[79]。還可使用每個LOS分子上仲位?；湐?shù)目減少的LOS [80]。LOS通常包括 至少 GlcNAc-H印2 磷酸乙醇胺-KDO2-脂 A 結構[81]。LOS 可包括 GlcNAc β l_3Gal β l_4Glc三糖，而缺少LNnT四糖。可包含各種形式的LOS。可以其純化形式使用。其可與載體蛋白偶聯(lián)。當LOS偶聯(lián)時，偶聯(lián)可通過LOS中的脂A部分，或可以通過任何其它合適的基團，例如其KDO殘基。如果不存在LOS的脂A基團，則需要這樣的另選連接。LOS的偶聯(lián)技術如例如文獻79、81、82,83等所述。這些偶聯(lián)物的有用載體蛋白包括細菌毒素，如白喉或破傷風毒素，或其類毒素或變體。LOS可來自具有固定(即不可相變)的LOS免疫型的菌株(例如基因工程改造的腦膜炎菌株)，如文獻84所述。例如，可固定L2和L3L0S免疫型。這些菌株可具有在免疫型之間切換的速率，這種速率比原始野生型菌株相比降低了 2倍以上(甚至> 50倍)。文獻84公開了如何通過修飾IgtA和/或IgtG基因產(chǎn)物實現(xiàn)這種結果。例如對于L3，LOS在與其庚糖11殘基上結合的GlcNac殘基上可被O-乙酰化[85]。一種免疫原性組合物可包含一種以上類型的L0S，例如來自腦膜炎球菌免疫型L2和L3的LOS。例如，可使用文獻86中公開的LOS組合。LOS抗原可在施給對象后引發(fā)殺菌性抗腦膜炎球菌抗體。膜囊泡組合物可包含腦膜炎球菌外膜囊泡。這些包括任何由腦膜炎球菌外膜的破壞或發(fā)泡形成包含外膜蛋白組分的囊泡而獲得的脂蛋白體囊泡。因此該術語包括OMV(有時稱為“小泡”)、微囊泡(MV[87])和“天然 OMV” ( “N0MV” [88]))。MV和NOMV是天然產(chǎn)生的膜囊泡，在細菌生長時自發(fā)形成，釋放到培養(yǎng)基中。MV可以通過以下方法獲得在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)奈瑟球菌，將全細胞與肉湯培養(yǎng)基中較小的MV分離(例如，通過過濾或低速離心，只沉淀細胞而不沉淀較小囊泡)，然后從細胞耗盡的培養(yǎng)基中收集MV (例如，通過過濾、差速離心或MV聚集，通過高速離心沉淀MV)。通?？筛鶕?jù)培養(yǎng)基中產(chǎn)生的MV的量選擇用于生產(chǎn)MV的菌株，例如文獻89和90描述了具有高MV產(chǎn)量的奈瑟氏囷。
從細菌人工制備0MV，可以利用去污劑處理(例如用脫氧膽酸鹽)或通過非去污劑方式(例如參見參考文獻91)進行制備。形成OMV的技術包括用膽酸鹽去污劑(例如，石膽酸、鵝脫氧膽酸、烏索脫氧膽酸、脫氧膽酸、膽酸、烏索膽酸等的鹽，優(yōu)選用脫氧膽酸鈉[92和93]處理奈瑟球菌)在不會沉淀去污劑的充分高的pH下[94]處理細菌。其它技術基本可以在沒有去污劑存在的情況下[91]利用如超聲、均化、微流化、氣穴化、滲透壓休克、研磨、法式壓制、混合等技術進行。不使用或使用低去污劑的方法可以保留有用的抗原，如NspA[91]。因此一種方法可以使用含有約O. 5%或更低如約O. 2%、約O. 1%、< O. 05%或O濃度的脫氧膽酸鹽的OMV提取緩沖液。參考文獻95描述了一種制備OMV的有用過程，涉及對粗OMV進行超濾，代替高速離心。該過程可以涉及在超濾后進行超離心的步驟。與本發(fā)明使用的囊泡可以從任何腦膜炎球菌菌株進行制備。所述囊泡通常來自血、清組B菌株，但是也可能從除B以外的血清組進行制備(例如，參考文獻94描述了一種血清組A的過程)，如A、C、W135或Y。所述菌株可以屬于任何血清型(例如，I、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亞型和任何免疫型(例如，LI ；L2 ；L3 ;L3，3，7 ;L10等)。腦膜炎球菌可以來自任何適當譜系，包括高侵襲性與超毒力譜系，如以下7種超毒力譜系中任一種亞組I、亞組III、亞組IV UET 5復合物、ET 37復合物、A4簇、譜系3。通過多位點酶電泳(MLEE)對這些進行了定義，但是也可以使用多位點序列分型(MLST)對腦膜炎球菌分類[參考文獻96]。例如，MLST測得ET 37復合物是ST 11復合物，ET 5復合物是ST-32 (ET-5)，品系3是ST 41/44等。囊泡可從具有下列亞型之一的菌株制得P1. 2 ；P1. 2,5 ；P1. 4 ；P1. 5 ；P1. 5,2 ；PL 5，c ；P1. 5c, 10 ；P1. 7，16 ；P1. 7，16b ；P1. 7h，4 ；P1. 9 ；P1. 15 ；P1. 9，15 ；P1. 12，13 ；P1. 13 ；PL 14 ；P1. 21，16 ；P1. 22，14。用于本發(fā)明的囊泡可從野生型腦膜炎球菌菌株或突變腦膜炎菌株獲得。例如，文獻97公開了用修飾的fur基因從腦膜炎奈瑟球菌制備囊泡。文獻105教導nspA表達可隨同時敲除PorA與cps而上調(diào)。參考文獻105-107描述了用于生產(chǎn)OMV的腦膜炎奈瑟球菌進一步的敲除突變體。參考文獻98公開了 fHBP被上調(diào)的囊泡。參考文獻99描述了從表達6種不同PorA亞型的修飾菌株進行囊泡構建。也可以使用通過敲除參與LPS生物合成的酶而獲得的具有低內(nèi)毒素水平的奈瑟球菌突變體[100，101]。這些或其它突變體均可以與本發(fā)明一起使用。因此與本發(fā)明使用的菌株在一些實施方式中可以表達多于一種的PorA亞型。之前已構建出6價和9價PorA菌株。菌株可表達2、3、4、5、6、7、8或9種PorA亞型P1. 7，16 ；P1. 5-1,2-2 ；P1. 19，15-1 ；P1. 5-2,10 ；P1. 121. 13 ；P1. 7-2,4 ；P1. 22，14 ；P1. 7-1,1 和 /或PI. 18-1,3,6。在其它實施方式中,可以下調(diào)菌株中PorA的表達,例如,PorA的量相對于野生型水平(例如相對于H44/76菌株)減少了至少20% (例如，彡30%、彡40%、彡50%、彡60%、彡70%、彡80%、彡90%、彡95%等)，或甚至被敲除，如參考文獻108所述。在一些實施方式中，菌株可以高表達(相對于相應的野生型菌株)某些蛋白質(zhì)。例如，菌株可以高表達NspA、蛋白287 [102]、fHBP [98]、TbpA和/或TbpB [103]、銅、鋅超氧化物歧化酶[103]、HmbR等。在一些實施方式中，腦膜炎球菌可以包括如參考文獻104-107描述的一個或多個敲除和/或高表達突變。下調(diào)和/或敲除的優(yōu)選基因包括(a) Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB> GalE、HtrB/MsbB、LbpA> LbpB> LpxK> Opa> Opc> PilC、PorB> SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB [104] ； (b)CtrA、CtrB, CtrC、CtrD, FrpB, GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB,LpxK、Opa, Opc, PhoP、PilC、PmrE, PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB[105]；
(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、Ga IE、LbpA、LpbB、Opa、Op c、PilC、PorB、Si aA、Si aB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB[106];和(d) CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB 和 / 或 SynC[107]。在使用突變菌株時，在一些實施方式中，可以具有一個或多個或全部下列特征(i) LgtB和/或GalE下調(diào)或敲除，以截短腦膜炎球菌LOS ； (ii) TbpA上調(diào)；(iii) NhhA上調(diào)；(iv)0mp85 上調(diào);(v) LbpA 上調(diào)；(vi)NspA 上調(diào)；(vii)PorA 敲除；(viii)FrpB 下調(diào)或敲除；(ix)Opa下調(diào)或敲除；(X)Opc下調(diào)或敲除；(xii) cps基因復合體缺失。截短的LOS可以不 包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，其可以為半乳糖缺陷型L0S。所述LOS可以沒有α鏈。如果LOS存在于囊泡中，可以對囊泡進行處理，以將其LOS與蛋白質(zhì)組分連接起來(“內(nèi)泡”偶聯(lián)[107])。本發(fā)明可與不同菌株的囊泡混合物一起使用。例如，參考文獻108公開了含多價腦膜炎球菌囊泡組合物的疫苗，含有衍生自具有所用國家的普遍性血清亞型的腦膜炎球菌菌株的第一囊泡，和衍生自無需具有所用國家普遍性的血清亞型菌株的第二囊泡。參考文獻109也討論了不同囊泡的有用組合。在一些實施方式中，可使用各來自L2和L3免疫型菌株的組合物。吸附鋁鹽佐劑是吸附性的，即免疫原可通過各種機制吸附在鹽上。然而在一些情況下，免疫原和鋁鹽佐劑都存在于組合物中而未吸附，這是由于免疫原的固有性質(zhì)，或由于在配制時采用的步驟(例如在配制時使用適當?shù)膒H來防止發(fā)生吸附)。優(yōu)選的免疫刺激性寡核苷酸和陽離子聚合物復合物也是吸附性的。因此在鋁鹽和復合物的混合物中，對于免疫原有許多吸附的機會免疫原可吸附于鋁鹽，吸附于寡核苷酸/聚合物復合物，或者兩者都吸附(以不同比例)，或?qū)烧叨疾晃?。本發(fā)明覆蓋了所有這些安排。例如，在一個實施方式中，免疫原可吸附于鋁鹽，吸附的免疫原/鹽可再與寡核苷酸/聚合物復合物混合。在另一個實施方式中，免疫原可吸附于寡核苷酸/聚合物復合物，吸附的免疫原/復合物然后可與鋁鹽混合。在另一個實施方式中，兩種免疫原可分別吸附于寡核苷酸/聚合物復合物和鋁鹽，然后混合兩種吸附的組分。在一些情況下，免疫原可改變其吸附狀態(tài)，例如通過pH或溫度的改變，或在與組分混合后?？乖隗w外[110]和體內(nèi)[111]從鋁鹽上解吸是已知的。可能發(fā)生一種吸附的顆粒解吸，然后重新吸附到不同的吸附性顆粒上，從而導致例如免疫原從鋁鹽佐劑轉(zhuǎn)移到復合物上，或相反。在一些實施方式中，單個抗原分子或復合物可同時吸附于鋁鹽和復合物上，形成兩種吸附性顆粒之間的橋梁。如果免疫原吸附在吸附性組分上，不需要所有免疫原都吸附。可能發(fā)生這種情況是由于免疫原在吸附和溶解相之間的固有平衡，或由于吸附表面飽和。因此，組合物中的免疫原可完全或部分吸附，吸附部分可以是一種或多種不同的吸附性組分(例如鋁鹽和/或寡核苷酸/聚合物復合物)。在這種情況下，吸附部分可以是該免疫原在組合物中總量的至少 10% (以重量計)，例如〉20%，> 30%, > 40%, > 50%, > 60%, > 70%, > 80%, >90%，> 95%，> 98%或以上。在一些實施方式中，免疫原完全吸附，即在通過離心將批量液體介質(zhì)與復合物分開后，在上清液中檢測不到。然而，在其它實施方式中，沒有一種特定的免疫原吸附。在一些情況下，可能復合物的免疫刺激性寡核苷酸和/或聚陽離子聚合物成分能夠吸附在鋁鹽上。雖然優(yōu)選復合物在與鋁鹽混合后保持完整。而且，為了避免復合物吸附于鋁鹽(和相反)，有用的是鋁鹽和復合物具有類似的O電荷點(等電點)，即彼此差IpH內(nèi)。因此，有用的復合物具有10-12的PZC，可有用地與具有約11的PZC的氫氧化鋁佐劑混合。組合物或藥盒組分的包裝適用于本發(fā)明佐劑組合物、免疫原性組合物和藥盒組分的容器包括藥瓶、注射器(如一次性注射器)等。這些容器應無菌?？蓪⑷萜靼b在一起成為藥盒，如裝在同一個盒子里。
組分裝在藥瓶中時，藥瓶可由玻璃或塑料材料制成。在將組合物加入藥瓶之前，優(yōu)選對其進行滅菌。為了避免膠乳過敏對象可能產(chǎn)生的問題，藥瓶優(yōu)選用無膠乳塞子密封，且優(yōu)選所有包裝材料均不含膠乳。藥瓶可包含單一劑量的疫苗，或者可以包含一個以上劑量(‘多劑量’藥瓶)，如10個劑量。有用的藥瓶由無色玻璃制成。與鈉鈣玻璃相比，更優(yōu)選硼硅酸鹽玻璃。藥瓶可具有由丁基橡膠制成的瓶塞。藥瓶可以有適合的帽(如Luer鎖)，以便將注射器插入該帽。瓶帽可以位于密封層或覆蓋物內(nèi)側(cè)，以便在去除密封層或覆蓋物后才能接觸到該帽。藥瓶，特別是多劑量藥瓶可裝有允許無菌地取出其內(nèi)含物的瓶帽。某組分包裝到注射器中時，該注射器可連有針頭。如果未連接針頭，可隨注射器提供單獨的針頭以便組裝和使用。這種針頭可裝在護罩中。注射器的活塞可帶有抑止裝置，以防止活塞在吸出時偶然脫出。注射器可以有乳膠橡膠帽和/或活塞。一次性注射器含有單次劑量的疫苗。注射器通常帶有頂帽，以在連接針頭前密封頂端，頂帽可由丁基橡膠制成。如果注射器和針頭分開包裝，則針頭優(yōu)選裝有丁基橡膠護罩。有用的注射器是以商品名"Tip-Lok" "^銷售的注射器。容器可標注有半劑量體積，以利于遞送給兒童。例如，含有O. 5ml劑量的注射器可標有O. 25ml體積的標記。通常多組分產(chǎn)品包含多于對象給藥所需的材料，以便在材料傳送中出現(xiàn)損失時，仍可以得到完全的最終劑量體積。因此獨立的容器可包含過度灌裝的材料，例如超過5-20%體積的材料。治療方法和免疫原性組合物的施用 本發(fā)明組合物適合給予人類對象，本發(fā)明提供了在對象中產(chǎn)生免疫應答的方法，包括將本發(fā)明的免疫原性組合物給予對象的步驟。本發(fā)明也提供一種在對象中產(chǎn)生免疫應答的方法，包括混合本發(fā)明藥盒中容器內(nèi)容物和將混合的內(nèi)容物給予對象的步驟。本發(fā)明還提供本發(fā)明的組合物或藥盒用作藥物，例如使對象產(chǎn)生免疫應答。本發(fā)明還提供了使用鋁鹽、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物生產(chǎn)在對象中引起免疫應答的藥物。該藥物可聯(lián)合免疫原給予。
本發(fā)明還提供了使用鋁鹽、免疫刺激性寡核苷酸、聚陽離子聚合物和免疫原生產(chǎn)在對象中引起免疫應答的藥物。這些方法和應用通常用于產(chǎn)生抗體應答，優(yōu)選保護性抗體應答?？梢愿鞣N方式給予本發(fā)明組合物。有用的免疫途徑是肌肉內(nèi)注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)、口服、粘膜、舌下、皮內(nèi)、經(jīng)皮、透皮等?？捎冒凑毡景l(fā)明制備的免疫原性組合物治療兒童和成年人。對象可小于I歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接受疫苗的對象可以是老年人(如彡50歲，彡60歲，優(yōu)選> 65歲)、幼年(如< 5歲)、住院對象、健康護理人員、軍隊服務人員和軍人、懷孕婦女、慢性疾病患者、免疫缺陷對象和去國外旅行的人。鋁鹽佐劑可在嬰兒中常規(guī)使用，在該年齡組中IC31 也是有效的[22，112]。然而所述疫苗不僅適用于這些人群，還可用于更廣 泛的人群?？赏ㄟ^單劑量方案或多劑量方案進行治療。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同途徑給予各種劑量，例如采用胃腸道外初次免疫和粘膜加強免疫、粘膜初次免疫和胃腸道外加強免疫等。對于首次免疫對象，給予一個以上的劑量(一般是兩個劑量)特別有效。一般以至少I周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約12周、約16周等)的間隔給予多個劑量。概述術語“包含”包括“包括”以及“由……組成”，例如，“包含”X的組合物可以僅由X組成或可以包括其它物質(zhì)，例如X+Y。術語“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的組合物可能完全不含Y。有需要時，“基本上” 一詞可以從本發(fā)明的定義中去掉。與數(shù)值X相關的術語“約”是可選的并表示例如x±10%。除非另有說明，包括混合兩種或多種組分的步驟的過程不要求任何特定的混合順序。因此，組分可以任何順序混合。在有三種組分時，可將兩種組分相互合并，然后可將合并物再與第三種組分混合等。將動物(具體是牛)材料用于培養(yǎng)細胞時，其應獲自未患傳染性海綿狀腦病(TSE)，具體是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來源。總之，優(yōu)選在完全不含動物來源材料的情況下培養(yǎng)細胞。在將化合物作為組合物的一部分給予機體時，該化合物可另外由合適的前藥替代。當細胞底物用于再造或反向遺傳學方法時，或用于培養(yǎng)病毒時，優(yōu)選批準用于人類疫苗生產(chǎn)的細胞底物，例如Ph Eur總綱5. 2. 3所述的細胞底物。在一些實施方式中，本發(fā)明不包含或使用包含氨基酸序列SEQ ID N0:16的免疫原的組合物。在一些實施方式中，當組合物中存在含有氨基酸序列SEQ ID N0:16的免疫原時，鋁鹽佐劑通常是氫氧化鋁，和/或組合物可包含至少一種其它和不同的腦膜炎免疫原。
具體實施例方式佐劑用標準方法制備氫氧化鋁佐劑懸液。如文獻19所述制備了 IC31復合物。通過將氫氧化鋁佐劑與IC31復合物混合制備佐劑組合。將單獨的佐劑(Al-H，IC31)及其混合物(A1-H+IC31)與來自不同病原體的抗原混合，并在各種動物模型中進行測試?？墒褂酶鞣N順序混合Al-H、IC31和抗原。目前測試的抗原來自病原體，包括腦膜炎奈瑟氏菌血清組A/B/C/W135/Y、腸道外致病性大腸桿菌(E. coli)、化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、呼吸道合胞病毒和金黃色葡萄球菌(S. aureus)。這些研究主要使用多肽抗原，但也使用糖抗原(腦膜炎球菌血清組A，C，W135 & Y ，和白色念珠菌)。腦膜炎球菌⑴文獻31中公開的組成“5CVMB”疫苗的三種多肽 中添加氫氧化鋁和/或IC31佐劑。編碼的多肽具有氨基酸序列SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO :15(見文獻31 &76)。在第一組試驗中，9組小鼠接受10μ g抗原、3mg/ml氫氧化鋁和不同劑量的IC31。各組接受以下9種組合物，組7-9與組1-6接受相同的抗原，但配方不同
權利要求
1.一種免疫原性組合物，其特征在于，包含α)免疫佐劑，所述佐劑包含鋁鹽、免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物，其中寡核苷酸和聚合物彼此結合形成復合物；和(ii)引發(fā)針對細菌病或真菌病的保護性免疫應答的免疫原。
2.一種包含鋁鹽、免疫刺激寡核苷酸、和聚陽離子聚合物的免疫佐劑，其特征在于，寡核苷酸和聚合物彼此結合形成復合物。
3.如權利要求2所述的佐劑，其特征在于，所述鋁鹽是氫氧化鋁。
4.如權利要求2所述的佐劑，其特征在于，所述鋁鹽是磷酸鋁。
5.如權利要求2-4中任一所述的佐劑，其特征在于，所述寡核苷酸是單鏈，具有10-100個核苷酸。
6.如權利要求5所述的佐劑，其特征在于，所述寡核苷酸是5'-(IC)13-3'。
7.如權利要求2-6中任一項所述的佐劑，其特征在于，所述聚陽離子聚合物是肽。
8.如權利要求7所述的佐劑，其特征在于，所述肽包含一個或多個Leu-Leu二肽序列，一個或多個Lys-Lys 二肽序列，和/或一個或多個Arg-Arg 二肽序列。
9.如權利要求7或8所述的佐劑，其中所述肽含有一個或多個Lys-Leu二肽序列和/或一個或多個Lys Leu-Lys三肽序列。
10.如權利要求7-9中任一項所述的佐劑，其特征在于，所述肽具有5-50個氨基酸。
11.如權利要求10所述的佐劑，其特征在于，所述肽具有氨基酸序列KLKLLLLLKLK。
12.如權利要求2-11中任一項所述的佐劑，其特征在于，所述寡核苷酸和聚合物以I 25的摩爾比存在。
13.如權利要求2-12中任一項所述的佐劑，其特征在于，所述鋁鹽和復合物都是平均粒徑為1-20 μ m的顆粒。
14.如權利要求2-13中任一項所述的佐劑，其特征在于，所述佐劑是無菌的。
15.—種制備如權利要求14所述佐劑的方法，其包括過濾滅菌免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物；在無菌條件下混合過濾滅菌的免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物形成無菌復合物；和混合無菌復合物和無菌鋁鹽。
16.一種免疫原性組合物，其特征在于，包含(i)如權利要求2-14中任一項所述的佐劑和(ii)免疫原。
17.一種制備權利要求16所述的免疫原性組合物的方法，其特征在于，包括步驟混合(i)如權利要求2-14中任一項所述的鋁鹽和(ii)免疫原。
18.如權利要求I或權利要求16所述的組合物，或權利要求17所述的方法，其特征在于，所述免疫原(a)吸附在鋁鹽上，和/或(b)吸附在復合物上。
19.一種藥盒，所述藥盒包括(i)含有如權利要求2-14中任一項所述的佐劑的第一容器，和(ii)含有免疫原和/或另一種佐劑的第二容器。
20.一種藥盒，所述藥盒包括(i)含有鋁鹽的第一容器；和(ii)含有免疫刺激性寡核苷酸和聚陽離子聚合物的復合物的第二容器。
21.如權利要求20所述的藥盒，其特征在于，第一和第二容器中的一個或兩個包含一種免疫原。
22.如權利要求16或18所述的組合物，或權利要求17所述的方法，或權利要求19或權利要求21所述的藥盒，其特征在于，所述免疫原是B群血清型腦膜炎球菌。
23.一種含有如權利要求2-14任一所述的佐劑的水性組合物，其特征在于，，與(i)緩沖液，例如組氨酸緩沖液和/或(ii)5-15mg/ml氯化鈉組合在一起。
全文摘要
一種免疫佐劑，其包含鋁鹽、免疫刺激寡核苷酸、和聚陽離子聚合物，其中寡核苷酸和聚合物理想的彼此結合形成復合物。佐劑可包含在含免疫原的組合物中，例如該免疫原能夠引發(fā)對細菌病或真菌病的保護性免疫應答。
文檔編號A61K39/095GK102740882SQ201080048143
公開日2012年10月17日 申請日期2010年8月27日 優(yōu)先權日2009年8月27日
發(fā)明者D·奧黑根, M·帕勞羅, R·帕普奧利 申請人:諾華有限公司