專利名稱：聚乳酸基/20nm磷酸鈣復合支架材料及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種聚乳酸基/納米磷酸鈣復合支架材料，特別是涉及聚乳酸基 /20nm磷酸鈣復合支架材料及其制備方法。
背景技術：
利用組織工程技術修復骨組織是生物醫(yī)學工程領域的一個重大進步，可降解多孔 支架材料是實現(xiàn)這一組織工程技術的核心要素之一。作為骨組織工程支架，它必須有良好 的生物相容性，合適的孔徑和孔隙率，可降解性以及一定的機械強度。目前國內外骨組織 工程應用較廣泛的多孔支架材料主要有兩類材料組成，一類是天然生物大分子或者人工合 成的生物可降解聚合物，例如膠原，殼聚糖，聚乳酸，聚酯等。另外一類是無機及生物衍 生材料，例如羥基磷灰石，磷酸三鈣等。這種復合支架主要是根據(jù)天然骨中納米級的羥 基磷灰石晶體和膠原基質緊密的結合在一起，產(chǎn)生高度復雜而有序的結構作為骨的主要結 構框架這一原理而構造的。由于羥基磷灰石HAP與人體骨的無機成分基本一致，其生物相 容性、界面生物活性均優(yōu)于各類醫(yī)用鈦、硅橡膠及植骨用碳素材料，還有極好的骨傳導性和 與骨結合的能力，加上無毒副作用，無致癌作用，所以被廣泛用作骨修復材料和骨填充材 料。但是HAP的質地太脆，制成的材料容易碎裂，機械性能不佳，而聚乳酸類聚合物的加入 能夠改善材料的性能。將聚乳酸類聚合物和HAP用合適的制備方法得到骨組織工程材料， 既能提高力學性能和誘導成骨特性，又能控制材料的生物降解速度。因此，聚乳酸基/磷 酸鈣復合多孔支架已被多數(shù)學者采用。(S.-S.Kim et al. Poly (lactide-co-glycolide) / hydroxy鄰atite composite scaffoldsfor bone tissue engineering. Biomaterials 27 (2006) 1399-1409. D丄ickorish et al. A three-phase, fully resorbable, polyester/ calcium phosphate scaffold for bonetissue engineering -Evolution of scaffold design Biomaterials 28(2007) 1495-1502.)。然而，隨著檢測技術和納米科學的發(fā)展， 人們發(fā)現(xiàn)人體的硬組織由許多分散尺寸在20-40nm的磷酸鈣顆粒分散在有機質中而構 成。20-40nm磷酸鈣由于組成和結構尺寸和骨中的無機相尤為接近，(R. K. Tang，L. J. Wang， C. A. 0rme， T. Bonstein， P. J. Bush and G. H. Nancollas， Dissolution at the Nanoscale: Self-Preservation of Biominerals. Angew. Chem. ， Int. Ed. ， 2004， 43， 2697.)，已被證明 具有極良好的生物相容性，以及促進周圍細胞生長分化的能力比其他更大尺寸的磷酸鈣要 強很多，有利于骨組織的修復。(Y. R. Caial. Role of hydroxyapatite薩oparticle size in bone cell proliferation. J. Mater. Chem. ， 2007， 17， 3780-3787)已經(jīng)有研究提出了 20nm左右磷酸鈣球形顆粒的制備方法，但是如何將這種磷酸鈣應用于骨組織工程的研究和 應用中是材料制備過程中的一個新問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種力學性能優(yōu)異、生物相容性好，具有很強引導新骨生 成能力的聚乳酸基/20nm磷酸鈣支架材料及其制備方法。
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本發(fā)明提供的聚乳酸基/20nm磷酸鈣復合支架材料，是聚乳酸類聚合物與平均 粒徑為20nm磷酸鈣納米顆粒的復合物，所述組分中20nm磷酸鈣顆粒聚乳酸按質量比為 1 : 100 40 : 100，復合支架材料孔徑尺寸為100 450 iim，孔隙率為85-98% ;所述的 聚乳酸類聚合物可以是聚L-乳酸(PLLA)，聚D， L-乳酸(PDLLA)或聚L-乳酸-羥基乙酸 共聚物(PLGA)的一種。 本發(fā)明中提供的聚乳酸基/20nm磷酸鈣復合支架材料制備方法，其中的20nm磷 酸牽丐是米用文獻(Y. R. Cai al. Role of hydroxyapatite nanoparticle size in bone cellproliferation. J. Mater. Chem. ，2007， 17,3780-3787)報道的方法合成，用加入不同量 的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)制備不同尺寸的磷酸鈣球形顆粒，20nm磷酸鈣能均勻分 散在聚乳酸類聚合物中。 本發(fā)明中提供的聚乳酸基/20nm磷酸鈣復合支架材料的制備步驟如下 1、在20 30°C的反應溫度下，往含有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和磷酸氫二
鈉溶液的體系中緩慢滴加含鈣離子的溶液，其中用濃度為1M的堿溶液調節(jié)pH值為9 11，
并不斷攪拌。CTAB在最終溶液中的濃度為3X10—、，保證加入磷酸根離子的量與加入鈣離
子的量的摩爾比為Ca : p=l 1.67 : 1。反應20-24小時后抽濾除上清液，得到的沉
淀用去離子水反復沖洗至沒有CTAB為止，放入4(TC真空干燥箱烘干，得到平均直徑為20nm
的磷酸鈣納米顆粒。 2、將聚乳酸類聚合物PLLA， PDLLA或PLGA的一種溶解在二氧六環(huán)溶液中，攪拌，制 成質量含量10 25%的聚合物溶液。 3、在上述聚合物溶液中，按重量比20nm磷酸鈣顆粒聚乳酸為1 : 100 40 : 100加入20nm磷酸鈣納米顆粒，攪拌均勻，得到聚乳酸聚合物與納米磷酸鈣的混合液。
4、將粒徑100 400 ii m的氯化鈉NaCl顆粒置于玻璃模具中，使顆粒密集成堆，表 面平整。把模具放在7(TC的飽和水蒸氣中3.5h，取出壓平晾干。逐滴加入聚乳酸聚合物與 納米磷酸鈣的混合液，保持真空度0. 02 0. 03MPA去除氣泡。 5、將整個模具在_251:低溫條件下預凍3h以上，再放入真空冷凍干燥機中冷凍干 燥。 6、將凍干后得到的支架置于7(TC的去離子水中浸泡48h，每10h換一次水，直至浸
泡后的水中檢測不到cr。 7、取出成型物，干燥后，放在室溫下的真空干燥箱中干燥，即得聚乳酸類/20nm磷 酸鈣復合支架材料。 本發(fā)明聚乳酸基/20nm磷酸鈣支架材料，其孔徑尺寸范圍在100 450ym，孔隙 率為85 98% 。加入的20nm磷酸f丐顆粒對孔徑?jīng)]有影響。20nm磷酸f丐納米顆粒的加入， 不僅可以改善復合體系的細胞粘附特性(納米粒子的粒徑越小，比表面越大，表面能越高， 能對細胞產(chǎn)生特殊親和能力)，比普通尺寸的磷酸鈣顆粒更能促進細胞的增值生長，有更強 的生物相容性，并對骨髓間充質細胞往成骨細胞的分化有很強的引導作用。因此聚乳酸基 /20nm磷酸鈣支架材料可望作為骨組織修復材料。


圖1為聚乳酸基/20nm磷酸f丐支架及上面的20nm磷酸f丐顆粒的SEM圖
圖2為聚乳酸/20nm磷酸鈣支架和純聚乳酸支架的紅外圖 圖3為細胞在聚乳酸/普通磷酸鈣和聚乳酸/20nm磷酸鈣支架上培養(yǎng)的增值情況
圖4為細胞在聚乳酸/普通磷酸鈣和聚乳酸/20nm磷酸鈣支架上培養(yǎng)誘導14天 后的分化情況(堿性磷酸酶)。
具體實施方式

實施例1 首先在保持溫度25t:的環(huán)境下，往含有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和磷酸氫 二鈉溶液的體系中緩慢滴加含鈣離子的溶液，其中用濃度為1M的堿溶液調節(jié)pH值為9 ll，并不斷攪拌。CTAB在最終溶液中的濃度為3X10—、，保證加入磷酸根離子的量與加入鈣 離子的量的摩爾比為Ca : p=l 1.67 : 1。反應20小時后，反復抽濾洗滌，然后真空干 燥得到平均粒徑為20nm的磷酸鈣顆粒。將12份20nm磷酸鈣顆粒加入到540份預先配好 的含20% PLLA的二氧六環(huán)溶液中，攪拌均勻，得到混合液。將粒徑為100 400 ii m的氯化 鈉NaCl顆粒置于玻璃模具中，使顆粒密集成堆，表面平整。把模具放在7(TC的飽和水蒸氣 中3.5h，取出壓平晾干。按質量比為NaCl :混合液=1 : l逐滴加入上面得到的混合液， 保持真空度0. 02-0. 03MPA去除氣泡。放在_251:低溫條件下預凍3h以上，再放入真空冷 凍干燥機中冷凍干燥。將凍干后得到的支架置于7(TC的去離子水中浸泡48h，每10h換一 次水，直至浸泡后的水中檢測不到C1—，取出成型物，干燥后，放在室溫下的真空干燥箱中干 燥，即得聚乳酸基/20nm磷酸鈣復合多孔支架。 該支架材料中的各組分占總質量的百分比為聚合物90X，20nm磷酸鈣10%。加 入的20nm磷酸鈣顆粒對孔徑和孔隙率沒有影響(圖1)。
實施例2 20nm磷酸鈣的合成同實施例1，將12份20nm磷酸鈣顆粒加入到192份預先配好 的含25% PDLLA的二氧六環(huán)溶液中，攪拌均勻，得到混合液。將質量比為NaCl :混合液= 1 : 1的粒徑為100-400 ym的氯化鈉NaCl顆粒置于玻璃模具中，使顆粒密集成堆，表面平 整。把模具放在7(TC的飽和水蒸氣中3.5h，取出壓平晾干。逐滴加入上面得到的混合液， 保持真空度0. 02-0. 03MPA去除氣泡。放在_251:低溫條件下預凍3h以上，再放入真空冷 凍干燥機中冷凍干燥。將凍干后得到的支架置于7(TC的去離子水中浸泡2天，每10h換一 次水，直至浸泡后的水中檢測不到C1—，取出成型物，干燥后，放在室溫下的真空干燥箱中干 燥，即得聚乳酸基/20nm磷酸鈣復合多孔支架。 該支架材料中的各組分占總質量的百分比為聚合物80X，20nm磷酸鈣20X。加 入的20nm磷酸鈣顆粒對孔徑和孔隙率沒有影響(圖1)
實施例3 20nm磷酸鈣的合成同實施例1，將12份20nm磷酸鈣顆粒加入到340份預先配好 的含10% PLGA的二氧六環(huán)溶液中，攪拌均勻，得到混合液。將質量比為NaCl :混合液= 1 : 1的粒徑為100 400iim的氯化鈉NaCl顆粒置于玻璃模具中，使顆粒密集成堆，表面 平整。把模具放在7(TC的飽和水蒸氣中3. 5h，取出壓平晾干。逐滴加入上面得到的混合液， 保持真空度0. 02 0. 03MPA去除氣泡。放在_251:低溫條件下預凍3h以上，再放入真空冷 凍干燥機中冷凍干燥。將凍干后得到的支架置于7(TC的去離子水中浸泡2天，每10h換一次水，直至浸泡后的水中檢測不到cr，取出成型物，干燥后，放在室溫下的真空干燥箱中干
燥，即得聚乳酸基/20nm磷酸鈣復合多孔支架。 該支架材料中的各組分占總質量的百分比為聚合物60X，20nm磷酸鈣40X。加 入的20nm磷酸f丐顆粒對孔徑和孔隙率沒有影響。
實施例4 本發(fā)明的聚乳酸基/20nm磷酸鈣復合支架與聚乳酸/普通磷酸鈣支架上的細胞培 養(yǎng)對比試驗的步驟和條件如下 細胞增殖實驗中，兩種支架用70%乙醇消毒并用磷酸鹽緩沖液多次沖洗，然后在 支架中種上2X 106個/毫升的人體骨髓間充質干細胞，2小時后加入3毫升細胞培養(yǎng)液。 培養(yǎng)24個小時后轉到灌流培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)。每2-3天換一次培養(yǎng)液。在分別培養(yǎng)了1天、5 天和9天后，取出支架，凍在-20°C的雙蒸水中。支架中的細胞數(shù)量通過DNA含量的檢測而 換算得到。結果參見圖3，從圖中可以看出，在5天和9天的時間點，細胞在聚乳酸基/20nm 磷酸鈣復合支架上的細胞數(shù)比聚乳酸/普通磷酸鈣支架上的要多，說明了本發(fā)明的支架材 料更能促進細胞的增值生長。 在細胞分化(堿性磷酸酶)實驗中，以上述培養(yǎng)細胞的方式在支架中灌流培養(yǎng)14 天后，加入聚乙二醇辛基苯基醚(2%)后在4t:過夜，得到的細胞裂解物加入堿性磷酸酶實 驗專用的顯色試劑，吸收強度在520nm下的光譜儀中測定。堿性磷酸酶的數(shù)值在與標準物 的對照量化后得到。結果參見圖4，由圖可見在聚乳酸基/20nm磷酸鈣復合支架上培養(yǎng)的細 胞堿性磷酸酶含量要高很多，這是細胞分化的檢測指標之一，可以初步得出本發(fā)明的支架 材料對骨髓間充質細胞的分化有很強的引導作用。
權利要求
一種聚乳酸基/20nm磷酸鈣復合支架材料，所述支架材料是聚乳酸類聚合物與平均粒徑為20nm的磷酸鈣納米顆粒的復合物，其特征在于所述組分中20nm磷酸鈣顆?！镁廴樗岬馁|量比為1∶100～40∶100，復合支架材料孔徑尺寸為100～450μm，孔隙率為85-98％，所述聚乳酸類聚合物為聚L-乳酸、聚D，L-乳酸或聚L乳酸-羥基乙酸共聚物的一種。
2. 權利要求1所述的聚乳酸基/20nm磷酸鈣復合支架材料的制備方法，步驟如下(1) 、20nm磷酸鈣納米顆粒的制備在20 3(TC的反應溫度下，往含有十六烷基三甲基溴化銨和磷酸氫二鈉溶液的體系 中緩慢滴加含鈣離子的溶液，其中用濃度為1M的堿溶液調節(jié)pH值為9 ll，并不斷攪拌； 十六烷基三甲基溴化銨在最終溶液中的濃度為3X10—、，加入磷酸根離子的量與加入鈣離 子的量的摩爾比為Ca : P = 1 1. 67 : 1 ;反應20-24小時后抽濾除上清液，得到的沉淀 物用去離子水反復沖洗至沒有十六烷基三甲基溴化銨為止，沖洗后的沉淀物放入4(TC真空 干燥箱烘干，得到平均直徑為20nm的磷酸鈣納米顆粒。(2) 、將聚L-乳酸、聚D， L-乳酸或聚L乳酸-羥基乙酸共聚物的一種溶解在二氧六環(huán) 溶液中，攪拌，制成質量含量10 25%的聚合物溶液；(3) 、在步驟(2)的聚合物溶液中，加入由步驟(1)制得的20nm磷酸鈣納米顆粒，所述 加入20nm磷酸鈣顆粒聚乳酸按重量比為1 : 100 40 : 100，攪拌均勻，得到聚乳酸聚 合物與納米磷酸鈣的混合液；(4) 、將粒徑為100 400 ii m的氯化鈉顆粒置于玻璃模具中，使顆粒密集成堆，表面平 整。把模具放在7(TC的飽和水蒸氣中3. 5h，取出壓平晾干；逐滴加入由步驟(3)得到的混 合液，保持真空度0. 02 0. 03MPA去除氣泡；(5) 、將整個模具在-25t:低溫條件下預凍3h以上，再放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥；(6) 、將凍干后得到的支架置于7(TC的去離子水中浸泡48h，每10h換一次水，直至浸泡 后的水中檢測不到Cl—;(7) 、取出成型物，干燥后，放在室溫下的真空干燥箱中干燥，即得聚乳酸基/納米磷酸 鈣復合支架材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚乳酸基/20nm磷酸鈣復合支架材料及其制備方法，所述組分乳酸類聚合物與20nm磷酸鈣納米顆粒的質量比為100∶1～100∶40，復合支架材料孔徑尺寸為100～450μm，孔隙率為85-98％；采用十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)作為添加劑合成的20nm磷酸鈣納米顆與聚乳酸類聚合物為材料制備成復合多孔支架；所述聚乳酸類聚合物為聚L-乳酸、聚D，L-乳酸、聚L乳酸-羥基乙酸共聚物；本發(fā)明復合多孔支架比普通尺寸的磷酸鈣顆粒更能促進細胞的增值生長，有更強的生物相容性，可望作為骨組織修復材料。
文檔編號A61L27/46GK101773690SQ20101012229
公開日2010年7月14日 申請日期2010年3月11日 優(yōu)先權日2010年3月11日
發(fā)明者唐?？? 胡晴虹 申請人:浙江大學