專利名稱：一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物及其制備方法，具體地講涉及一種治療皮膚病的藥物組合物及其制備方法。

背景技術(shù)：
鮮紅斑痣(Port wine Stains，PWS)是一種不易自然消退的先天性真皮淺層毛細血管畸形，多發(fā)于兒童[林曉曦，王煒，祁佐良，等.葡萄酒色斑增生機制的研究[J].實用美容整形外科雜志，2000，11(3)127-129.]。目前，鮮紅斑痣的治療手段主要有手術(shù)治療、脈沖激光和光動力學(xué)療法，其中手術(shù)治療因其術(shù)后容易產(chǎn)生感染、瘢痕、損毀性皮膚改變及皰疹[周展超.鮮紅斑痣的治療進展[J].國際皮膚性病學(xué)雜志.2008，34(3)149-151.]，而脈沖激光和光動力學(xué)療法往往結(jié)合血卟啉、癌光啉等光敏劑治療鮮紅斑痣皮膚病。
但是，現(xiàn)階段所使用的光敏劑，由于其對病變血管網(wǎng)的破壞作用存在限度，且僅對輕度型鮮紅斑痣色素的消退有明顯改善作用，對治療重度型鮮紅斑痣往往效果甚微，因此要取得一定效果則需要增加患者的治療次數(shù)，給患者帶來經(jīng)濟及身心上的多重負擔；另外，現(xiàn)階段在治療鮮紅斑痣皮膚病中往往會出現(xiàn)一定程度的光敏反應(yīng)；使得治療存在暗毒性較高，安全度低的缺陷。


發(fā)明內(nèi)容
本申請人經(jīng)過多年努力，發(fā)現(xiàn)了一種用于治療鮮紅斑痣的新型光敏劑；本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種新型光敏劑藥物組合物-該藥物組合物對輕度型、重度型病變均有效，療效較高、暗毒性及毒副作用較低、安全度大，且與光動力的協(xié)同作用較強，無需做過敏實驗，即可實現(xiàn)對鮮紅斑痣的標本兼治。
本發(fā)明的另一個目的在于提供該藥物組合物的制備方法。
本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物，包括按重量份計的1～100份金絲桃素和藥用載體。
本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物，包括按重量份計的1～100份金絲桃素和10～10000份藥用載體。
本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物，包括按重量份計的50～99份金絲桃素和40～9000份藥用載體。
本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物，包括按重量份計的20～80份金絲桃素和250～350份藥用載體。
本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物，包括按重量份計的60～90份金絲桃素和200～300份藥用載體。
其中，藥用載體為從稀釋劑、潤濕劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、乳化劑、防腐劑、增溶劑、溶劑和基質(zhì)中選出的任意一種或幾種化合物。
所述稀釋劑為淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、甘露醇和山梨醇； 所述潤濕劑為蒸餾水、乙醇、丙二醇和丙三醇； 所述黏合劑為羧甲基纖維素、海藻酸鈉、瓊脂、阿拉伯膠、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、卡波姆、聚維酮、明膠和聚乙二醇； 所述崩解劑為干淀粉、羧甲淀粉鈉和交聯(lián)聚維酮； 所述潤滑劑為硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、微粉硅膠、滑石粉和聚乙二醇； 所述乳化劑為硬脂酸甘油酯、羊毛脂、甘油脂肪酸酯、卵磷脂、泊洛沙姆、聚山梨酯和脂肪酸山梨坦、硬脂酸、十二烷基硫酸鈉和甘油； 所述防腐劑為羥苯乙酯、硫柳汞、苯甲醇、三氯叔丁醇和尼泊金； 所述增溶劑為吐溫； 所述溶劑為乙醇和蒸餾水； 所述基質(zhì)為甘油、凡士林、液體石蠟、聚乙二醇，硬脂酸、單硬脂酸甘油酯和氫化植物油。
本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物的制備方法，包括以下步驟 (1)、金絲桃素的提取及純化 a)、粗提 以(貫葉連翹粉)∶V(濃度為60％～100％的乙醇)為1∶20～40的比例將二者混合，超聲處理15～25分鐘，于70℃～90℃下回流1.5～2.5小時過濾，保留濾液；同樣條件，用乙醇將其濾渣再提取2～4次，合并濾液，濃縮干燥，即得金絲桃素浸膏。
b)、大孔樹脂提純 將步驟a)所得浸膏與濃度為15％～35％的乙醇混合，超聲處理15～30分鐘溶解，過濾，調(diào)至濃度為5～7mg/mL，將大孔吸附樹脂與此藥液按質(zhì)量比為1～2∶1的比例混合，用大孔吸附樹脂分離提純，控制吸附流速1.5～2.5床體積/小時，控制樹脂柱徑高比為1∶5～7，水洗3～5倍樹脂體積，水洗速度為0.5～3床體積/小時；再換以流量為4～6床體積濃度為50％～70％的乙醇洗脫，洗脫速度為1～3床體積/小時，收集洗液，濃縮干燥得金絲桃素粗品； c)、分離純化 用200～300目細硅膠裝柱，硅膠柱質(zhì)量為金絲桃素粗品的10～50倍，干法上樣按氯仿與甲醇的體積比為90～95∶1的比例洗脫，TLC跟蹤流出液，收集金絲桃素為單點的流份；所得流份于60～75℃、0.08～0.10MPa真空度條件下，濃縮3～4.5h烘干，烘干后用150～250mL丙酮溶解過濾，濾液過硅膠柱，將收集的流出液濃縮干燥后得金絲桃素純品； (2)、藥物組合物的制備 于金絲桃素中，加入至少一種所述藥用載體制成醫(yī)藥上可接受的劑型。
本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物的制備方法，優(yōu)選下述步驟 a)、粗提 以M(貫葉連翹粉)∶V(濃度為60％的乙醇)為1∶30的比例將二者混合，超聲處理20分鐘，80℃回流2小時，過濾，保留濾液；同樣條件下，用乙醇將所得濾渣再提取3次，合并濾液，濃縮干燥，即得金絲桃素浸膏。
b)、大孔樹脂精制 將步驟a)所得浸膏與濃度為30％的乙醇混合，超聲處理20分鐘溶解，過濾，調(diào)至濃度為6mg/mL，以大孔吸附樹脂與藥液的體積比為2∶1的比例混合，通過S898型大孔吸附樹脂分離提純，控制吸附流速為2.0床體積/小時，控制樹脂柱徑高比為1∶5，用3倍樹脂體積水洗，水洗速度為3床體積/小時；再換以流量為5床體積濃度為50％的乙醇洗脫，洗脫速度為2床體積/小時，收集洗液，濃縮干燥得金絲桃素粗品。
c)、分離純化 用300目細硅膠裝柱，硅膠柱質(zhì)量為金絲桃素粗品的40倍，干法上樣，以氯仿與甲醇的體積比為95∶1的比例洗脫，TLC跟蹤流出液，收集金絲桃素為單點的流份；所得流份于60℃、0.08MPa真空度條件下，濃縮3.5h烘干，烘干后用200mL丙酮溶解過濾，濾液過硅膠柱，將收集的流出液濃縮干燥后得金絲桃素純品。
2)、藥物組合物的制備 于金絲桃素純品中，加入至少一種所述藥用載體制成醫(yī)藥上可接受的劑型。
除另有說明外，本申請所說份為重量份計。
另外，本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物，其中組合物中所添加的金絲桃素純度要求在90％以上；藥用載體除上述列舉的外，也可選擇醫(yī)藥上其他常規(guī)藥用載體。
本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物，可以將藥物組合物與任意選自同金絲桃素有相同活性的藥物、光敏劑、血管損傷類藥物和線粒體損傷藥物混合使用。
上述組分及制備方法是通過大量實驗確定的，而且采用上述組分及制備方法使得本發(fā)明制備的藥物組合物療效較高、暗毒性及毒副作用較低，與光動力療法的協(xié)同作用較強，無需做過敏試驗，即可實現(xiàn)對鮮紅斑痣皮膚疾病標本兼治。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的藥物組合物具有以下有益效果 1、本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物，對輕度型及重度型病變均有效，療效顯著且毒副作用低，可很好的與光動力療法結(jié)合用于鮮紅斑痣皮膚病的治療，實現(xiàn)對鮮紅斑痣標本兼治； 2、本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物制備方法簡單，可以制成多種形式的藥物產(chǎn)品，方便患者使用； 3、本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物可以減少患者治療次數(shù)，從而在很大程度上減輕患者的身心負擔及經(jīng)濟負擔； 4、本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物，可以很好地結(jié)合電穿孔技術(shù)對患者給藥，藥物的透過率可提高20倍，而且無明顯皮膚損傷； 5、本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物，光敏劑在體內(nèi)代謝快，避光時間短，安全度大； 6、本發(fā)明的一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物，無過敏反應(yīng)，不需要做過敏試驗，且暗毒性低。



圖1是正常及PDT后雞冠的外觀變化 a、激光對照組；b、給藥HY1mg/kg后立即光照；c、HY0.3mg/kg組光照后1d； d、HY0.3mg/kg組光照后7d；e、HY0.3mg/kg組14d；f、HY1mg/kg組光照后1d； g、HY1mg/kg組光照后7d；h、HY1mg/kg組光照后14d；i、HY3mg/kg組光照后1d； j、HY3mg/kg組光照后7d；k、HY3mg/kg組光照后14d；l、血卟啉陽性對照組光照后1d； m、血卟啉陽性對照組光照后7d；n、血卟啉陽性對照組光照后14d。
圖2是正常及PDT后雞冠HE組織病理變化(HE×400) A、正常雞冠(HE×400)；B、單純激光照射雞冠(HE×400)；C、HY(1mg/kg)-PDT組光照后7d后(HE×400)；D、HY(3mg/kg)-PDT組光照后7d后(HE×400)；E、血卟啉陽性對照組7d后(HE×400)；F、HY(1mg/kg)-PDT組光照后14d(HE×400)；G、HY(3mg/kg)-PDT組光照后14d(HE×400)；H、血卟啉陽性對照組14d后(HE×400)； 圖3是試驗1中檢測金絲桃素與提取物中其他成份分離的HPLC色譜圖。

具體實施例方式 以下通過試驗例來進一步闡述本發(fā)明提供的藥物的有益效果，這些試驗例包括了本發(fā)明藥物的藥學(xué)試驗和臨床療效觀察試驗。
[試驗1]金絲桃素的提取及純化 1.1、粗提 I、將貫葉連翹粉碎過篩，以以V(濃度為100％的乙醇)∶M(貫葉連翹粉)為20∶1將二者混合，超聲處理20min，控制溫度為70℃，回流2h后過濾，保留濾液；同樣條件下，將濾渣用乙醇重復(fù)提取2次，合并濾液，濃縮、干燥，即得金絲桃素浸膏。
II、將貫葉連翹粉碎過篩，以濃度為80％的乙醇與貫葉連翹的質(zhì)量比為30∶1的比例將二者混合，超聲處理20min，控制溫度為80℃，回流2h后過濾，保留濾液；同樣條件，將濾渣用乙醇重復(fù)提取3次，合并濾液，濃縮、干燥，即得金絲桃素浸膏。
III、將貫葉連翹粉碎過篩，以V(濃度為100％的乙醇)∶m(貫葉連翹粉)＝40∶1的比例將二者混合，超聲處理20min，90℃回流2h后過濾，保留濾液；同樣條件，將濾渣用乙醇重復(fù)提取4次，合并濾液，濃縮、干燥，即得金絲桃素浸膏。
選擇乙醇濃度、乙醇倍數(shù)、提取溫度、提取次數(shù)四個因素進行考察，選用L9(34)表安排實驗，考察指標為提取物濃縮后由HPLC檢查，因素、水平表如表1 表1 因素水平表 1.1.1提取金絲桃素的優(yōu)選方法 1.1.2儀器與藥品 LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本，SHIMADZU公司)，SPD-10A紫外可見光檢測器；十萬分之一電子天平(德國，Sartorius公司)，RE-201c恒溫水油浴鍋(鞏義市予華儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司)，KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器廠)。金絲桃素對照品(成都普瑞法科技開發(fā)公司，純度99.1％，批號081204)；甲醇(色譜純，韓國SK Chemicals)，水為純化水，無水乙醇、氨水均為分析純。
1.1.3方法與結(jié)果 色譜條件色譜柱Boston pHlex ODS C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相甲醇∶水(85∶15，氨水調(diào)PH至9.5)；流速1mL·min-1；檢測波長588nm；進樣量20μL。此色譜條件下，金絲桃素與提取物中其他成分有較好的分離度，見圖3。
對照品貯備液的制備精密稱取金絲桃素對照品9.01mg，加入20mL二甲基亞砜中，完全溶解后轉(zhuǎn)入250mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，精密吸取1.00mL上述溶液到10.0mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為3.60μg·mL-1的對照品貯備液。
線性關(guān)系考察精密吸取上述對照品貯備液0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL，置于5.00mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，得不同濃度的對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件，每個濃度3次，每次進樣20μL，測得峰面積積分值。以對照品的進樣濃度(x)為橫坐標，峰面積積分值(y)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y＝59503x+1266，r＝0.9997。結(jié)果表明，金絲桃素進樣濃度在0.14～3.60μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。
精密度試驗精密量取對照品貯備液1.00mL，于5.0mL棕色容量瓶中，以甲醇定容至刻度，按“2.1”項下方法項下色譜條件進樣20μL，連續(xù)進樣5次，測定峰面積。結(jié)果6次測定峰面積RSD為1.82％，表明儀器精密度良好。
從貫葉連翹中提取金絲桃素優(yōu)選方法的確定取9個正交實驗所得的金絲桃素提取液，按(2)項下方法制備供試品溶液，按(1)項下色譜條件進行測定，計算含量，結(jié)果詳見表2。
表2 正交實驗結(jié)果

結(jié)果計算 A的K1＝0.0233+0.0448+0.0308＝0.0989 A的K2＝0.0269+0.0234+0.0239＝0.0742 A的K3＝0.0097+0.0113+0.0143＝0.0353 B的K1＝0.0233+0.0269+0.0097＝0.0599 B的K2＝0.0448+0.0234+0.0113＝0.0816 B的K3＝0.0308+0.0239+0.0143＝0.0690 C的K1＝0.0233+0.0239+0.0113＝0.0585 C的K2＝0.0448+0.0269+0.0143＝0.0860 C的K3＝0.0308+0.0234+0.0097＝0.0639 D的K1＝0.0233+0.0234+0.0143＝0.0610 D的K2＝0.0488+0.0239+0.0097＝0.0784 D的K3＝0.0308+0.0269+0.0113＝0.0690 用K1’、K2’、K3’分別表示K1、K2、K3的平均值， A的K1’＝K1/3＝0.0330 K2’＝K2/3＝0.0247 K3’＝K3/3＝0.0118 B的K1’＝K1/3＝0.1970 K2’＝K2/3＝0.0265 K3’＝K3/3＝0.0230 C的K1’＝K1/3＝0.0195 K2’＝K2/3＝0.0287 K3’＝K3/3＝0.0213 D的K1’＝K1/3＝0.0203 K2’＝K2/3＝0.0261 K3’＝K3/3＝0.0230 R的值為K1’、K2’、K3’中的最大值減去最小值，表示各個因素對實驗結(jié)果的影響程度大小，R值越大表明其對應(yīng)的因素對結(jié)果的影響就越大。
A的R＝0.0212；B的R＝0.0068；C的R＝0.0092；D的R＝0.0058。從9個實驗提取結(jié)果看出，最佳提取條件為A1B2C2D2其提取率最高，根據(jù)正交表計算的結(jié)果得出，最佳條件也為A1B2C2D2，因此條件乙醇濃度60％，乙醇倍數(shù)30倍，提取溫度80℃，提取3次為提取率最高的優(yōu)選提取條件。
1.2、大孔樹脂精制 將步驟a)所得浸膏與濃度為30％的乙醇混合，超聲處理20min溶解，過濾，調(diào)至濃度為6mg/mL，以大孔吸附樹脂與藥液的體積比為2∶1的比例將二者混合，通過S898型大孔吸附樹脂分離提純，控制吸附流速為2.0床體積/小時，控制樹脂柱徑高比為1∶5，水洗3倍樹脂體積，水洗速度為3床體積/小時；再換以流量為5床體積濃度為50％的乙醇洗脫，洗脫速度為2床體積/小時，收集洗液，濃縮干燥得金絲桃素粗品，HPLC法檢查純度為0.5％～7％。
1.3、分離純化 用300目細硅膠裝柱，硅膠柱體積為金絲桃素粗品的40倍，干法上樣，以氯仿與甲醇的體積比為95∶1的比例洗脫，TLC跟蹤流出液，收集金絲桃素為單點的流份；所得流份于60℃、0.08MPa真空度條件下，濃縮3.5h烘干，烘干后用200mL丙酮溶解過濾，濾液過硅膠柱，將收集的流出液濃縮干燥后得金絲桃素純品，HPLC法檢查純度為97.7％。
[試驗2]給藥并525nm激光照射鮮紅斑痣模型羅曼雞雞冠的實驗研究 2.1試驗材料及儀器 選擇金絲桃素純度為95.1％(HPLC)，HY藥物組合物為[實施例1]-[實施例8]制備的不同劑型的藥物組合物，血卟啉(購自上海紅綠光敏劑研究所，批號20090225)；YK-LED-PDT綠光525nm光動力美容儀(江西新余順興科技開發(fā)有限公司)，BX51雙筒光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS)，BP101十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius)；羅曼雞，雄性，6月齡，體重(2±0.2)kg，36只，由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實驗動物中心提供。實驗過程中善待實驗動物，嚴格遵守實驗動物科學(xué)與管理的有關(guān)規(guī)定。
2.2實驗分組 選取健康6月齡雄性羅曼雞36只，根據(jù)隨機數(shù)表法將動物隨機分為6組，每組6只，對雞冠單側(cè)進行激光照射，未處理一側(cè)作為自身對照?？瞻讓φ战M，動物既不給藥也不激光照射；激光對照組，動物只激光照射，不給藥；血卟啉1mg/kg陽性對照組，動物給血卟啉并激光照射；HY0.3mg/kg組，動物給HY 0.3mg/kg后立即激光照射；HY1mg/kg組，動物給HY1mg/kg后立即激光照射；HY3mg/kg組，動物給HY3mg/kg后立即激光照射。
2.3PDT處理 羅曼雞翼下靜脈注射20mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，在雞冠上劃出直徑2cm的圓形區(qū)域，用濃度為75％的乙醇清潔雞冠表面，黑布遮蓋其余部分并固定雞冠。根據(jù)實驗分組各組給藥劑量，于翼下靜脈注射給藥后立即給予525nm的激光照射，照射時間為20min，激光劑量為功率密度100mW/cm2。機器每次運行激光照射前后檢測輸出功率，其波動范圍＜±5％。
2.4觀察和取材 PDT處理后，每天進行觀察并照相記錄，觀察雞冠色澤變化、表皮是否有白斑、是否水腫、表面是否組織壞死、是否有結(jié)痂、結(jié)痂是否脫落、脫落的時間分布等。在處理后第7d及14d各組各處死3只動物，切取雞冠組織塊，用濃度為10％的甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，進行組織病理檢查及計算各組毛細血管減少率。
毛細血管減少率的計算方法為選取HE染色切片，隨機選取5個高倍(40×10倍)鏡視野，計算出血管平均數(shù)，以未處理側(cè)雞冠的血管平均數(shù)減去處理側(cè)雞冠的血管平均數(shù)，為毛細血管減少數(shù)。計算公式 毛細血管減少率＝(處理側(cè)毛細血管減少的平均數(shù)/對照測毛細血管的平均數(shù))×100％ 2.5原位凋亡末端標記(Tunel)檢測雞冠內(nèi)皮細胞凋亡的情況 雞冠組織取材方法及切取組織塊同“2.3”，常規(guī)石蠟包埋切片后，保存不脫蠟的白片，按照Tunel試劑盒說明書，常規(guī)脫蠟水化，蛋白酶消化，雙氧水阻斷，Tunel反應(yīng)混合液(sigma公司)，用濃度為10％的正常羊血清封閉后，用結(jié)合有過氧化酶的抗體，進行信號轉(zhuǎn)換，DAB顯色后用蘇木素復(fù)染，干燥封片后顯微鏡下觀察，陽性細胞可見棕黃色深染細胞核，用Imageproplus5.0圖像分析軟件計算呈陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的平均百分率作為凋亡細胞指數(shù)(AI)，再進行組間比較。
2.6給藥并激光照射后雞冠損傷效應(yīng)分級 給藥并照射激光后雞冠外觀大體變化和病理分級如表3。
表3 給藥并照射激光后雞冠損傷效應(yīng)分級
2.7統(tǒng)計學(xué)分析 計數(shù)資料分析以均數(shù)加減標準差(

±s)表示，評價多組數(shù)據(jù)的差異采用單因素方差分析，以上數(shù)據(jù)資料分析均由統(tǒng)計軟件包(SPSS11.5)完成。以P＜0.05及P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果(1)(肉眼)觀察雞冠外觀的變化 激光對照組雞冠的外形及色澤均無明顯變化；血卟啉組及HY給藥組再光照后，雞冠激光照射處均出現(xiàn)明顯水腫、起泡現(xiàn)象。
實驗后1d，HY0.3mg/kg組雞冠呈中間皺縮水腫，為輕度損傷；HY1mg/kg組雞冠表皮皺縮，呈淺黃褐色水腫，為中度損傷；HY3mg/kg組雞冠呈紫紅中間圈狀白色變化，為重度損傷；血卟啉陽性對照組雞冠表皮呈暗紅及輕微泛白。實驗后7d，HY0.3mg/kg組雞冠光照處淺棕色結(jié)痂，為中度損傷；HY1mg/kg組雞冠表皮白色包繞黑色結(jié)痂，為中度損傷；HY3mg/kg組雞冠表皮外周表皮白色壞死，中間深黑色結(jié)痂，嚴重壞死，為重度損傷；血卟啉陽性對照組雞冠表皮黃褐點狀相間結(jié)痂，為中度損傷。實驗14d，HY0.3mg/kg組雞冠光照處深棕色結(jié)痂，為重度損傷；HY1mg/kg組雞冠表皮深褐色結(jié)痂，為重度損傷；HY3mg/kg組雞冠照射處外部表皮白色壞死及深黑色結(jié)痂、壞死為極重度損傷；血卟啉陽性對照組雞冠整個光照處表皮黑色結(jié)痂，為極重度損傷。各給藥組結(jié)痂顏色變?yōu)樯詈谏Y(jié)痂變硬，雞冠無破潰，結(jié)痂無脫落；結(jié)果見圖1。
(2)雞冠的組織病理變化 空白對照組和激光對照組，病理檢查可見表皮正常，真皮淺層血管清晰，有擴張的毛細血管，內(nèi)皮細胞完整，內(nèi)皮下有不連續(xù)的平滑肌層，管腔較大；HY1mg/kg組，在光照7d后處死動物檢查，表皮正常，雞冠真皮淺層細胞增生，淺潰瘍、水腫，輕微凝固性壞死(缺血性壞死)；血卟啉陽性對照組及HY3mg/kg組，表皮細胞增生，真皮淺層毛細血管減少，血管中紅細胞減少，潰瘍、水腫，嚴重凝固性壞死(缺血性壞死)。光照14d后，HY1mg/kg組，表皮細胞不完整，真皮淺層毛細血管數(shù)目減少；血卟啉陽性對照組及HY3mg/kg組，鱗狀上皮細胞明顯增生，伴角化不全，真皮淺層毛細血管管壁水腫，伴血管內(nèi)皮灶性缺失，偶見紅細胞，大面積嚴重凝固性壞死(缺血性壞死)，結(jié)果見圖2。
(3)毛細血管減少率 從雞冠的毛細血管減少率可以看出，空白對照組7d與14d有一定差異，系因每次處死不同動物，動物個體差異造成的；激光對照組7d與14d也有明顯差別，可能是由于單純激光對雞冠的損傷較小，雞冠自身對輕微的損傷有修復(fù)作用；與空白對照組相比，單純激光組在7d時毛細血管減少率有顯著性差異，14d無顯著性差異(P＜0.05)，說明單純激光未給藥對雞冠皮膚影響不大。
在7d和14d時，HY各給藥組及血卟啉組與空白對照組及激光對照組相比，毛細血管減少率均有顯著性差異(P＜0.01)，表明HY在525nm激光激發(fā)下能明顯破壞雞冠毛細血管網(wǎng)，結(jié)果見表4。
表4 各組雞冠處理后毛細血管減少率(

±s，n＝3)

注與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與激光對照組相比△△P＜0.01。
(4)TUNEL染色法檢查金絲桃素對雞冠細胞凋亡的影響 以TUNEL染色法觀察HY靜脈給藥后在525nm激光照射下對雞冠皮膚內(nèi)皮細胞凋亡的影響，對照組細胞排列整齊，細胞核藍染，核質(zhì)均勻。而光照后雞冠細胞核黃染較多，且有的細胞核出現(xiàn)空泡或核固縮。從凋亡細胞指數(shù)可以看出，激光對照組與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，其為激光照射對雞冠表皮產(chǎn)生了一定的損傷，但損傷不大；HY各給藥組及血卟啉組分別與空白對照組相比，凋亡指數(shù)均有顯著差異(P＜0.01)，且HY藥物組合物1mg/kg及HY藥物組合物3mg/kg引起雞冠皮膚凋亡的能力較血卟啉組強，表明HY藥物組合物在525nm激光激發(fā)下能明顯導(dǎo)致雞冠內(nèi)皮細胞的凋亡，結(jié)果見表5。
表5 各組雞冠處理后細胞凋亡指數(shù)(

±s，n＝3)
注與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與激光對照組相比△△P＜0.01。
結(jié)果表明在本實驗中，HY靜脈給藥在525nm對雞冠的作用，HY 0.3mg/kg對血管的損傷不夠，HY3mg/kg在對真皮層毛細血管損傷的同時也嚴重損傷了表皮，均不是理想的給藥劑量，HY1mg/kg在對雞冠真皮層毛細血管損傷的同時對表皮的損傷較輕，為理想的鮮紅斑痣雞冠模型治療劑量；與血卟啉相比，HY對雞冠表皮的損傷較血卟啉輕，且同樣能起到損傷真皮毛細血管的目的，這說明HY藥物組合物在給藥的副作用及減輕后期的光毒性等方面較傳統(tǒng)光敏劑血卟啉更有優(yōu)勢。
[試驗3]黃斑變性的動物藥理實驗 3.1試驗材料 選擇金絲桃素純度為95.1％(HPLC)；健康新西蘭大耳白兔，清潔級，體重2.5～3.5kg，雌雄不限，個體體重與平均差異不超過20％，由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實驗動物中心提供。實驗過程中善待實驗動物，嚴格遵守實驗動物科學(xué)與管理的有關(guān)規(guī)定。
3.2藥品制備 精密稱取金絲桃素純品6mg，以m(金絲桃素粉)∶V(無水乙醇)＝1∶2的比例將二者混合，完全溶解后，加5mg吐溫-80增溶，攪拌溶解，用三乙胺調(diào)PH值至7.5，最后用注射用水定容到100.0mL，過濾除菌，分裝即得棕紅色澄清水溶液，冰箱4℃保存。
3.3操作方法 取健康新西蘭大耳白兔25只，按隨機數(shù)表法分為5組HY0.3mg/kg組、HY1mg/kg組、HY3mg/kg組、單純激光照射對照組，單純藥物對照組，每組5只。HY各給藥組動物，用復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，使用濃度為3％的戊巴比妥耳緣靜脈注射麻醉后，將兔固定在裂隙燈顯微鏡前，三面鏡下選擇照光部位。耳緣靜脈注射HY注射液后立即給予525nm激光照射10min，功率密度50Mw/cm2，光斑直徑1.5～1.6mm。治療后進行間接檢眼鏡觀察、熒光眼底造影和組織學(xué)檢測。
單純激光照射對照組，檢眼鏡下眼底觀察、熒光眼底造影和組織學(xué)未見視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜病變；HY0.3mg/kg組，檢眼鏡下眼底觀察、熒光眼底造影和組織學(xué)檢查可見輕微的脈絡(luò)毛細血管光動力閉塞；HY1mg/kg組，檢眼鏡下眼底觀察到，實驗即刻視網(wǎng)膜無明顯顏色改變，1天后視網(wǎng)膜白色樣變，表明色素沉著偶有部分視網(wǎng)膜脫離及水腫，光學(xué)顯微鏡下見脈絡(luò)膜毛細血管閉塞，視細胞膜外節(jié)排列紊亂，空泡化，部分RPE細胞層排列失去正常連接性，熒光眼底造影觀察到，實驗1天后在照射區(qū)域出現(xiàn)低熒光，低熒光范圍和照光范圍接近，在低熒光區(qū)周圍包繞高熒光；HY3mg/kg組，視網(wǎng)膜呈強白色，熒光眼底造影滲漏明顯，光照部位呈高熒光，組織學(xué)見RPE層排列紊亂，外顆粒層細胞固縮，血管中大量血栓。
結(jié)果表明在525nm激光照射下能對新西蘭大耳白兔眼睛造成明顯的黃斑損傷，且隨著HY劑量的增大而增大。
另外，將[實施例1]至[實施例8]制備的不同劑型的藥物組合物，按上述試驗方法在525nm激光照射下對新西蘭大耳白兔進行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在525nm激光照射下能對新西蘭大耳白兔眼睛造成明顯的黃斑損傷，且隨著HY劑量的增大而增大。
[試驗4]金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞的作用 4.1實驗標本新鮮人鮮紅斑痣標本；實驗藥物金絲桃素純品，純度要求大于90％，實測值金絲桃素94.5％(HPLC)，將HY用0.5％二甲亞砜溶解后用于細胞實驗。
4.2人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與鑒定 無菌條件下取新鮮鮮紅斑痣標本，用PBS液漂洗干凈后用眼科剪剪成1.5mm×1.5mm大小的組織塊，放入預(yù)冷的生理鹽水(含青霉素50u/ml)中。在超凈臺中用注射器吸取生理鹽水反復(fù)沖洗，膠原酶37℃消化8～10min。將消化液一并注入離心管中，900r/min離心5min，收集細胞。將細胞懸浮于含50％FBS的DMEM中，以5×104個/ml的細胞密度接種于纖維連接蛋白鋪層的培養(yǎng)皿；用倒置顯微鏡進行細胞形態(tài)學(xué)觀察從鮮紅斑痣組織分離純化出CD31+細胞，在纖維連接蛋白鋪層上6h開始貼壁，細胞呈梭形，7d生長融合呈鋪路石狀，CD31-免疫磁珠黏附于細胞上，檢測可發(fā)現(xiàn)CD31、vWF表達呈陽性，當細胞達到80％～90％融匯后才能用于本試驗。
4.3在525nm激光照射下金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞的影響 采用四甲基偶氮唑藍(methylthiazoletetrazol imumm，MTT)法檢查在525nm下金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞抑制的影響 取細胞融合達到80％～90％的內(nèi)皮細胞，將待檢測的細胞棄去培養(yǎng)液，加入適量的0.25％胰蛋白酶消化吹打分散細胞后，加入含MTT0.5mg/ml的無血清培養(yǎng)液100ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸出各孔液體，調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL。按200ul/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，6h后對各孔細胞進行隨機分組空白對照組；激光對照組，細胞只給激光照射，不給藥；金絲桃素給藥并激光照射組10ng/ml、100ng/ml、1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、1mg/ml、3mg/ml、10mg/ml，在給藥后立即用525nm激光照射10min，激光劑量為功率密度50mW/cm2每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。在培養(yǎng)結(jié)束前加入含有0.1mol/L HCl的異丙醇100ul，振蕩溶解15min，測定525nm波長下各孔吸光值(OD525)，計算細胞的生長抑制率 生長抑制率(％)＝(1-實驗組平均OD525值/對照組平均OD525值)×100％ 4.4在525nm激光照射下金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞毛細小血管形成的影響 取細胞融合達到80％～90％的內(nèi)皮細胞，與Matrigel(Becton-Dickenson)在4℃融化2～3小時后以0.125ml/孔的量置于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，在鋪細胞前，將凝膠聚合至少1小時。在處理前將人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞鋪在孔中，以粘著、分化和建立毛細血管網(wǎng)。將各孔隨機分為空白對照組；激光對照組，細胞只給激光照射，不給藥；金絲桃素給藥并激光照射組10ng/ml、100ng/ml、1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、1mg/ml、3mg/ml、10mg/ml，在給藥后立即用525nm激光照射10min，激光劑量為功率密度50mW/cm2每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。用MTT法測定細胞存活力。
4.5、在525nm激光照射下金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞釋放丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)、超(過)氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)和內(nèi)皮素(endothelium，ET)的影響 選取金絲桃素3個濃度進行實驗1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml，另設(shè)空白對照組及激光對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔，細胞處理方式同3.1，分別收集各孔細胞培養(yǎng)板細胞培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書測定培養(yǎng)液中MDA、SOD、LDH、ET含量。
4.6在525nm激光照射下金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體的影響 4.6.1人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體的提取及其形態(tài)觀察 取處理后的細胞懸液2ml，經(jīng)預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖液洗滌3次，在4℃下以每毫升加9ml冷的0.25mol/L蔗糖液的比例，將懸液與蔗糖液都放入離心管，沿管璧小心加入等量的濃度為0.34mol/L蔗糖液覆蓋于上層，離心后，分離上清和沉淀，于沉淀中加入10ml 0.25mol/L蔗糖液，以1000g(3500rpm)離心10min(重復(fù)2次)，分別收集上清和沉淀(上清疏松部分為質(zhì)膜，沉淀為細胞核)，合并各管上清液3300g(6600r/min)離心10min，分別收集上清和沉淀，沉淀中加入10ml 0.25mol/L蔗糖液懸浮，3300g離心10min(重復(fù)2次)，分別收集上清和沉淀(此為線粒體粗品)。合并各管上清液，16300g(1350r/min)離心20min，收集上清和沉淀，于沉淀中加入10min 0.25mol/L蔗糖液懸浮，16300g離心20min(重復(fù)2次)，分離上清和沉淀(此為溶酶體)，合并上清液再以100000g(33000r/min)離心30min，分離上清和沉淀，此沉淀為微粒體。取沉淀2滴于載玻片上，用0.2％詹納綠B染色20min，用相差顯微鏡觀察，線粒體呈綠色。
4.7在525nm激光照射下金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體琥珀酸脫氫酶、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的測定 選取金絲桃素濃度1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml進行實驗，另設(shè)空白對照組及激光對照組，細胞處理方式同3.1。取相應(yīng)細胞的線粒體懸液1ml，按試劑盒上說明進行。琥珀脫氫酶活力用酶的比活性U/mg protein表示，每毫克蛋白每分鐘使反應(yīng)體系的吸光度降低0.01為1個酶活性單位。酶的比活性＝(ΔOD值÷0.01)÷反應(yīng)時間÷取樣量中的蛋白毫克數(shù)。
Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的測定，按照試劑盒上的測定，ATP酶活力單位(μmol Pi/mgprotein·hour)每小時每毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷(Pi)的量定為1個ATP酶活力單位。ATP酶活力＝[(測定管OD-對照管OD)/標準管OD×標準管濃度]×反應(yīng)體系中樣本稀釋倍數(shù)×6÷取樣量中的蛋白含量。
4.8在525nm激光照射下金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體膜通透性的影響 用UV2401PC紫外分光光度計檢測線粒體525nm處吸光度(optical density，OD)OD525值的變化來測定膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放。線粒體(1mg/ml)加入測定介質(zhì)(200mmol/L蔗糖，10mmol/L Tris-3嗎啉基丙磺酸，5mmol/L Tris-琥珀酸鹽，1mmol/L Tris-磷酸，10μmol/L乙二醇四乙酸酯-Tris，2μmol/L魚藤酮，1mg/L寡霉素，pH 7.4)中，25℃孵育2min，測定OD540；用不同量HY1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml在525nm激光誘導(dǎo)線粒體后測定OD525值變化。OD525值越小，表明膜通透性越大；OD525值越大，表明膜通透性越小。
4.9金絲桃素結(jié)合PDT對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體膜膜電位(ΔΨm)的影響 人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞處理方法同“4.3”取單細胞懸液與陽離子染料JC-1混勻，使其終濃度為10μg/ml，37℃孵育20min，然后用Hank’s液洗兩次，用流式細胞儀進行檢測，激發(fā)波長為520nm，發(fā)射波長為595nm，用熒光強度比值F520/F595表示膜電位ΔΨm。
4.10統(tǒng)計學(xué)分析計數(shù)資料分析以均數(shù)加減標準差(

±s)表示，評價多組數(shù)據(jù)的差異采用單因素方差分析，以上數(shù)據(jù)資料分析均由統(tǒng)計軟件包(SPSS11.5)完成。以P＜0.05及P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
4.11實驗結(jié)果 a.在525nm下金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞抑制率 用MTT法檢查HY在525nm激光下對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞抑制率，激光對照組與空白對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，表明激光照射對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞會產(chǎn)生一定的抑制作用；各HY給藥組與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)在525nm激光照射下對鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞能產(chǎn)生明顯的抑制、致細胞凋亡作用，于空白對照組及激光對照組相比有顯著差異，且在HY劑量10ng/ml～100ug/ml范圍內(nèi)對細胞的抑制呈劑量依賴，當HY濃度達到1mg/ml以上后，細胞抑制率無明顯增加，劑量達到飽和。表明HY對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞的抑制作用在100ug/ml以下呈劑量遞增，當HY濃度大于1mg/ml，隨著HY濃度增加抑制作用無明顯提高，結(jié)果見表6。
表6 不同濃度金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞抑制率的影響(

±s，n＝6)
注與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與激光對照組相比△△P＜0.01。
b.在525nm下金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞毛細管狀血管形成的影響 用MTT法檢查HY在525nm激光下對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞抑制率，激光對照組與空白對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，表明激光照射對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞會產(chǎn)生一定的抑制作用；各HY給藥組與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)在525nm激光照射下對鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞能產(chǎn)生明顯的抑制、致細胞凋亡作用，與空白對照組及激光對照組相比有顯著差異，且在HY劑量10ng/ml～100ug/ml范圍內(nèi)對細胞的抑制呈劑量依賴，當HY濃度達到1mg/ml以上后，細胞抑制率無明顯增加，劑量達到飽和。表明，HY對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞的抑制作用在100ug/ml以下呈劑量遞增，當HY濃度大于1mg/ml時，隨著HY濃度增加抑制作用無明顯提高，結(jié)果見表7。
表7 不同濃度金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞毛細管狀小管抑制率的影響(

±s，n＝6)
注與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與激光對照組相比△△P＜0.01。
c.在525nm激光照射下金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞釋放丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)、超(過)氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)和內(nèi)皮素(endothelium，ET)的影響 細胞液中MDA、SOD、LDH、ET的值，激光對照組、空白對照組相比無明顯差異。MDA與SOD的值各給藥組與空白對照組、激光對照組相比均有顯著差異(P＜0.01)，其中HY100ug/ml組對MDA與SOD的抑制作用尤其明顯；LDH和ET的值，HY1ug/ml組，與空白對照組、激光對照組相比有顯著差異(P＜0.05)，HY10ug/ml組與HY100ug/ml組與空白對照組、激光對照組相比有顯著差異(P＜0.01)?？芍?，HY各給藥組在525nm激光照射下對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞MDA、SOD、LDH、ET有顯著抑制作用。結(jié)果見表8。
表8 金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞MDA、SOD、LDH、ET的影響(

±s，n＝6)
注與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與激光對照組相比△△P＜0.01。
d.在525nm激光照射下金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體琥珀酸脫氫酶、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響 525nm激光照射下金絲桃素對人紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體琥珀酸脫氫酶、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響可以看出，激光對照組與空白對照組相比無明顯差異，表明激光對以上3種酶的影響不大；HY各給藥組對人鮮紅斑痣線粒體中以上3種酶的表達均有明顯抑制作用，其中HY1ug/ml組與空白對照組、激光對照組相比有顯著差異(P＜0.05)，HY10ug/ml組和HY100ug/ml組與空白對照組、激光對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，HY100ug/ml組對3種酶的抑制作用最強。結(jié)果見表9。
表9 金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體琥珀酸脫氫酶、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響(

±s，n＝6)
注與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與激光對照組相比△△P＜0.01。
e.在525nm激光照射下金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體膜通透性及膜電位(ΔΨm)的影響 從實驗結(jié)果可以看出，525nm激光照射下金絲桃素對人紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體膜通透性及膜電位(ΔΨm)均能產(chǎn)生明顯的抑制作用，激光對照組與空白對照組相比無明顯差異；HY各給藥組，與空白對照組、激光對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，其中HY100ug/ml組對以上2個指標的抑制作用最強。結(jié)果見表10。
表10 金絲桃素對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體膜通透性及膜電位(ΔΨm)的影響(

±s，n＝6)
注與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與激光對照組相比△△P＜0.01。
結(jié)論在525nm激光照射下HY劑量從10ng/ml到10mg/ml對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞生長能產(chǎn)生明顯的抑制作用，并能明顯抑制鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞毛細管狀小管形成；對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞釋放MDA、SOD、LDH、ET；抑制人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體釋放琥珀酸脫氫酶、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶；降低人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體膜通透性及膜電位(ΔΨm)。HY對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞線粒體最佳作用濃度為1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml。以上結(jié)果說明，在525nm激光照射下HY能對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，其作用機制與HY對內(nèi)皮細胞的線粒體損損傷有關(guān)。
另外，將[實施例1]至[實施例8]制備的不同劑型的藥物組合物，按上述試驗方法進行試驗驗證，結(jié)果表明在525nm激光照射下金絲桃素藥物組合物能對人鮮紅斑痣內(nèi)皮細胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，其作用機制與HY對內(nèi)皮細胞的線粒體損損傷有關(guān)。
[試驗5]金絲桃素的急性毒性作用 5.1試驗材料實測值金絲桃素純度95.1％(HPLC)；健康昆明小鼠，清潔級，7～8周齡，體重18～22g，個體體重與平均差異不超過20％，同批體重差異小于4g，由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實驗動物中心提供。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后進入實驗。實驗過程中善待實驗動物，嚴格遵守實驗動物科學(xué)與管理的有關(guān)規(guī)定。
5.2藥品制備精密稱取5mg金絲桃素與10mg無水乙醇，將二者混合完全溶解后，于其中加入5mL吐溫-80增溶，攪拌溶解后，用三乙胺調(diào)PH值至7，最后用注射用水定容到100.0mL，過濾除菌，分裝即得棕紅色澄清水溶液，冰箱4℃保存。
5.3操作方法 5.3.1動物飼養(yǎng)給藥方法 實驗前動物先喂養(yǎng)5天，選健康的動物(去掉體重過輕、過重及行動遲緩，反應(yīng)遲鈍的動物)。動物尾靜脈注射給藥，按“不等濃度等溶”方法給藥，在給藥之前禁食12～16小時，不禁水。
5.3.2預(yù)實驗 用2只動物(雌)在20mg/kg、200mg/kg、2000mg/kg劑量連續(xù)給藥，若在2000mg/kg給藥后死亡，則換2只新動物，從200mg/kg開始給藥，連續(xù)劑量增加的系數(shù)是1.8，一直到出現(xiàn)動物死亡為止，得到Dmin。在Dmin的基礎(chǔ)上遞減劑量，得到D0％，再取2只新動物(雌雄各半)在Dmin的基礎(chǔ)上給藥，連續(xù)劑量增加的系數(shù)是1.15，直到2只動物全部死亡。再對劑量進行細分，在有動物死亡到動物全部死亡的劑量間細分，每組取4只動物，直到得到4/4的動物死亡，求到Dmax即D100％，金絲桃素靜脈注射對小鼠的Dmin＝1680mg/kg，Dmax5650mg/kg。
5.3.3正式實驗 用公式1/k＝(N-1)×(Dmax/Dmin)1/2 1/k＝組間比值N---分組數(shù) 在D100％和D0％之間取N(一般在6-10之間)組，本實驗給藥組取7組，組間距最好以等1g值為比值，具體的操作把D100％和D0％的值換算成對數(shù)，再按等對數(shù)距離分組。80只小鼠，隨機分為8個組，分為7個HY給藥組及一個空白對照組，每組10只，雌雄各半，HY給藥組分別為5650mg/kg、4623.81mg/kg、3775.72mg/kg、3083.19mg/kg、2517.68mg/kg、2055.89mg/kg、1680mg/kg及對照組。給藥組HY注射液尾靜脈注射給藥，對照組給予等量注射用水，給藥當天詳細觀察給藥后動物的反應(yīng)情況，然后每天上午8點，下午14點各觀察一次，持續(xù)觀察14天動物的不良反應(yīng)和死亡情況。記錄各組動物死亡情況，數(shù)據(jù)用改良寇氏(Korbor)法進行計算LD50。對死亡的動物立即進行尸檢，取肉眼有異的臟器進行病理學(xué)檢查，觀察14天后，處死剩下存活動物進行尸檢，取肉眼有異的臟器進行病理學(xué)檢查。同時對實驗動物于給藥前、給藥后第3、7、14天稱量體重，觀察存活動物體重變化的趨勢并于對照組進行比較。
5.3.4實驗結(jié)果 動物死亡多發(fā)生在給藥后2h至6h內(nèi)，表現(xiàn)為對刺激反應(yīng)減弱或消失，呼吸困難，心跳減弱，直至死亡。對死亡動物立即解剖，肉眼觀內(nèi)臟器官未見明顯異常。各組存活動物亦見類似癥狀，但較輕。存活動物當日或次日即可進食，觀察14天，體重隨周齡增長，未見其他毒性反應(yīng)。HY靜脈給藥小鼠的半數(shù)致死量LD50＝3177.45mg/kg，Dmin＝1680mg/kg，Dmax＝5650mg/kg。動物死亡時間分布及死亡率見表11。分別與給藥前，給藥后3天、7天、14天稱重小鼠體重見表2，發(fā)現(xiàn)各組存活的小鼠的體重沒有顯著性差異，體重隨周齡增長，給藥組較對照組體重增長緩慢，結(jié)果見表12。
表11 動物在死亡情況的時間點分布及死亡率(

±s)
表12 SLW對小鼠的體重影響(

±s)
結(jié)果表明金絲桃素靜脈給藥對小鼠的急性毒性較小LD50＝3177.45mg/kg，Dmin＝1680mg/kg，Dmax＝5650mg/kg，且對存活動物的體重影響不大。
另外，將[實施例1]至[實施例8]制備的不同劑型的藥物組合物，按上述試驗方法進行試驗驗證，結(jié)果表明給藥對小鼠的急性毒性較小LD50＝3165.45mg/kg，Dmin＝1660mg/kg，Dmax＝5630mg/kg；LD50＝3155.45mg/kg，Dmin1650mg/kg，Dmax＝5530mg/kg；LD50＝3145.45mg/kg，Dmin＝1650mg/kg，Dmax＝5620mg/kg；LD50＝3155.45mg/kg，Dmin＝1650mg/kg，Dmax＝5620mg/kg；LD50＝3145.45mg/kg，Dmin＝1640mg/kg，Dmax＝5530mg/kg；LD50＝3065.45mg/kg，Dmin＝1560mg/kg，Dmax＝5530mg/kg；LD50＝3045.45mg/kg，Dmin＝1540mg/kg，Dmax＝5420mg/kg；LD50＝3235.45mg/kg，Dmin＝1552mg/kg，Dmax＝5543mg/kg且對存活動物的體重影響不大。
[試驗6]皮膚光毒性實驗 6.1試驗材料金絲桃素純度要求大于90.0％，實測值金絲桃素純度95.1％(HPLC)；健康昆明小鼠，清潔級，7～8周齡，體重18～22g，個體體重與平均差異不超過20％，同批體重差異小于4g，由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院實驗動物中心提供。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后進入實驗。實驗過程中善待實驗動物，嚴格遵守實驗動物科學(xué)與管理的有關(guān)規(guī)定。
6.2藥品制備精密稱取金絲桃素純品加入適量乙醇使其完全溶解，加5mL吐溫-80增溶，攪拌溶解后，用三乙胺調(diào)PH值至7～8，最后用注射用水定容到100.0mL，過濾除菌，分裝即得棕紅色澄清水溶液，冰箱4℃保存。
6.3操作方法實驗前動物先喂養(yǎng)5天，選健康的動物(去掉體重過輕、過重及行動遲緩，反應(yīng)遲鈍的動物)。取小鼠42只隨機分為7組，每組6只，對照組不給藥，其余6組每組均尾靜脈注射1mg/kg金絲桃素注射液，于給藥后即刻、1、2、3、5、7天中午12點～14點給予自然陽光照射2小時，觀察皮膚光毒反應(yīng)。
6.4實驗結(jié)果 ①對照組無明顯躁動不安表現(xiàn)，耳朵、四肢和尾部無發(fā)紅、腫脹等反應(yīng)。
②即刻組動物煩躁，頻繁舔前足，耳朵、四肢和尾部發(fā)紅、明顯腫脹。
③1天組不安，舔前足，耳朵、四肢和尾部有發(fā)紅、明顯腫脹。
④2天組略有不安，耳朵、四肢和尾部有輕微發(fā)紅、明顯腫脹。
⑤3天組無明顯不安，耳朵、四肢和尾部有非常輕微發(fā)紅、明顯腫脹。
⑥5天組無明顯不安，耳朵、四肢和尾部無發(fā)紅、明顯腫脹。
⑦7天組無明顯不安，耳朵、四肢和尾部無發(fā)紅、明顯腫脹。
另外，將[實施例1]至[實施例8]制備的不同劑型的藥物組合物，按上述試驗方法進行試驗驗證，結(jié)果表明本發(fā)明的藥物組合物治療鮮紅斑痣疾病具有以下特點①藥物組合物與光動力的協(xié)同作用強，療效高，大幅度提高臨床治療的效率和減輕患者在治療期間的痛苦；②光敏劑在體內(nèi)代謝快，避光時間短，一般僅為2～3天(對小鼠而言)，對人的避光時間會適當延長，安全度大；③無過敏反應(yīng)，不需要做過敏試驗；④暗毒性低。
[試驗7]臨床試驗 (一)研究病例及判定方法 1病例來源本課題研究對象來自第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚科在2009年2月至12月就診鮮紅斑痣患者32例。2患者一般情況根據(jù)病變顏色及增生情況將皮損分為三種類型，見表13。不同病變位置的統(tǒng)計，見表14。
表13 鮮紅斑痣患者病變類型分類(n＝32)
患者納入標準患者均無心、肝、腎等重要器官功能障礙；均為非癱痕體質(zhì)；皮損均未接受過任何方法的治療。
患者排除標準排除有心、肝、腎等重要功能障礙者；排除有癱痕體質(zhì)者；排除曾有治療史者；排除處于急性病發(fā)作期或其他感染性疾病患者；排除處于妊娠期的婦女患者；排除合并有其他血管瘤或綜合征患者。分組情況將24例鮮紅斑痣患者隨機分為4個組，每組8人HY 2.5mg/kg組，HY 5mg/kg組，HY 10mg/kg組和血卟啉5mg/kg組(陽性對照組)。
7.1金絲桃素溶液制備精密稱取純度為95.2％(HPLC)的金絲桃素純品7mg，以M(金絲桃素粉)∶V(無水乙醇)為1∶2的比例將二者混合，完全溶解，加6mg吐溫-80增溶，攪拌溶解后，用三乙胺調(diào)pH值至7.8，最后用注射用水定容到100.0mL，過濾除菌，按照等比稀釋分裝即得2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL的金絲桃素棕紅色澄清水溶液，冰箱4℃保存。
7.2血卟啉溶液制備血卟啉(上海紅綠光敏劑研究所，批號20090225)，將濃度為10mg/mL的血卟啉注射液用注射用水稀釋至濃度為1mg/mL的血卟啉溶液，冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?br> 7.3儀器設(shè)備YK-LED-PDT綠光525nm光動力美容儀(江西新余順興科技開發(fā)有限公司)，BP101萬分之一電子分析天平(德國Sartorius) 7.4治療方法分別將金絲桃素及血卟啉稀釋至濃度為10ug/ml，在患者前臂屈側(cè)皮試，觀察20min，陰性者方可給藥。患者取臥位，用雙層黑布遮蓋非照光區(qū)域和眼睛。患者按照分組推注相應(yīng)藥物，推注前后用生理鹽水沖洗管道，保證藥物完全進入血管內(nèi)，藥物推入后立即給予525nm激光照射，照光前后檢測輸出功率，其波動范圍＜±5％。光纖末端與病灶間的距離約為6～10cm，光斑直徑為8～10cm，根據(jù)患者患部皮膚光照反應(yīng)確定激光能量密度，以患部皮膚變色發(fā)白為依據(jù)，每個光斑的照射時間為20～30min，照光功密度為80～120mW/cm2。術(shù)后嚴格避光7天，1個月內(nèi)避免陽光直接照射，每4周治療1次。
7.5療效判定根據(jù)病變的消退程度將療效分為四級，為方便統(tǒng)計分析，對各級療效進行打分，如表15。同一患者取單一部位的治療區(qū)進行療效評估。
表15 療效分級標準
7.6療效評估方法患者術(shù)后1個月復(fù)診1次，達I級療效者，連續(xù)隨訪3個月，無復(fù)發(fā)者判為治愈；達II級療效或II級以下療效者繼續(xù)給予PDT治療，總治療次數(shù)不超過3次。在完成最后一次治療的3個月后進行療效評估。通過患者的隨訪、復(fù)查及治療前后的照片對比，對其療效及并發(fā)癥的發(fā)生情況進行評估。
7.7療效觀察結(jié)果 7.7.1治療率統(tǒng)計不同治療組治療后按療效評估方法評估療效，不同療效分級百分率結(jié)果見表16。
表16 各給藥組不同療效分級百分率(n＝8)
從結(jié)果可以看出，HY給藥劑量為5mg/kg與HY10mg/kg治療有效率相當，但HY10mg/kg治愈率最高，而金絲桃素與血卟啉在相同劑量下(5mg/kg)，金絲桃素治療有效率比血卟啉好。表明作為靜脈給藥的光敏劑，在相同情況下HY的治療效果優(yōu)于血卟啉。
7.7.2術(shù)后反應(yīng) 術(shù)后不良反應(yīng)表現(xiàn)為紅腫、結(jié)痂、色素沉著與瘢痕，其中，紅腫、結(jié)癡及癱痕發(fā)生在光照后治療的局部，色素沉肴，發(fā)生于全身可見光的部位。大多數(shù)患者在術(shù)后1周內(nèi)紅腫自行消退，2～4周脫痂，發(fā)生色素沉著，隨訪3個月仍未完全消退，HY10mg/kg組1例發(fā)生輕度增生性癱痕。結(jié)果見表17。
表17 術(shù)后不良反應(yīng)發(fā)生率(n＝8)

結(jié)論金絲桃素作為光敏劑能有效治療鮮紅斑痣，且發(fā)生如紅腫、結(jié)痂等可以恢復(fù)的不良反應(yīng)，其不良反應(yīng)發(fā)生率較血卟啉沒有明顯差異。
(二)、研究病例及判定方法 同等條件，按(一)研究病例及判定方法，將[實施例1]至[實施例8]制備的藥物組合物分別對粉紅型，紫紅型及增厚型病變進行治療，治愈情況如表18 表18 不同比利金絲桃素與藥用載體對不同程度鮮紅斑痣的治愈 另外，不經(jīng)過過敏實驗，直接將上述組分與光動力療法結(jié)合對上述鮮紅斑痣病變患者治療，治愈狀況如表19所示 表19 療效分級標準
結(jié)果表明上述藥物組合物與光動力可以發(fā)生很好的協(xié)同作用，且輕度型、重度型病變均有效，另外隨訪患者沒有發(fā)現(xiàn)類似暗毒性及毒副作用引起的異常反應(yīng)。
注以上試驗所稱HY均指本發(fā)明的金絲桃素藥物組合物；另外，實施例所用無水乙醇均為分析純級，乙醇含量為99.7％。
實施例1 (1)金絲桃素的提取 a)、粗提 以M(貫葉連翹粉)∶V(濃度為60％的乙醇)為1∶20的比例將二者混合，超聲處理15min，控制溫度為70℃，回流1.5h后過濾，保留濾液；同樣條件，用乙醇將所得濾渣再提取2次后，合并濾液，濃縮干燥，即得金絲桃素浸膏。
b)、大孔樹脂精制 將步驟a)所得浸膏與濃度為15％的乙醇混合，超聲處理15min溶解，過濾，調(diào)至濃度為5mg/mL，通過S898型大孔吸附樹脂分離提純以大孔吸附樹脂與藥液的體積比為1∶1的比例將二者混合，控制吸附流速為1.5床體積/小時，控制樹脂柱徑高比為1∶5，水洗3倍樹脂體積，水洗速度為0.5床體積/小時；再換以流量為4床體積濃度為50％的乙醇洗脫，洗脫速度為1床體積/小時，收集洗液，濃縮干燥得金絲桃素粗品。
c)、分離純化 以60目粗硅膠與金絲桃素粗品的體積比為1∶1的比例拌樣，用200目細硅膠裝柱，硅膠柱體積為金絲桃素粗品的10倍，以氯仿-甲醇的體積比為90∶1的比例洗脫，TLC跟蹤流出液，收集金絲桃素為單點的流份；所得流份于60℃、0.08MPa真空度條件下，濃縮3h烘干，烘干后用150mL丙酮溶解過濾，濾液過硅膠柱，將收集的流出液濃縮干燥后得金絲桃素純品。
(2)、藥物組合物的制備 金絲桃素1mg、無水乙醇1.9mg、硬脂酸0.1mg、羥苯乙酯0.5mg、甘油1.5mg、硬脂酸甘油酯1.5mg、卡波姆0.5mg、白凡士林0.2mg、液體石蠟0.8mg、羧甲基纖維素鈉0.2mg、十二烷基硫酸鈉0.8mg和蒸餾水2mg。
軟膏劑的制備 將1mg金絲桃素研細后通過60目篩，溶于二甲基亞砜中備用。取上述重量份的硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林和液狀石蠟加熱融化為油相。另將甘油和蒸餾水加熱至90℃，于其中加入十二烷基硫酸鈉及羥苯乙酯溶解作為水相。然后將水相慢慢倒入油相中，邊加邊攪拌，直至冷凝，即得乳膏型機制；將溶解于無水乙醇的金絲桃素溶液加如上述機制中，攪拌均勻即得本實施例的軟膏劑。
實施例2 金絲桃素的提取同上實施例1；本實施例注射劑的制備 99mg金絲桃素；于其中加入1000mg無水乙醇、2000mg甘油、800mg水；另加5200mg吐溫-80增溶，攪拌溶解后，用三乙胺調(diào)PH值至7，最后用注射用水定容到7500.0mL，過濾除菌，分裝即得棕紅色澄清水溶液，冰箱4℃保存即得注射劑。
實施例3 金絲桃素的提取同上實施例1； 本實施例片劑的制備 (2)、藥物組合物的制備 將100mg金絲桃素粉碎成細粉，加入500mg乳糖、800mg淀粉、700mg糊精、3500mg羥丙基纖維素；500mg滑石粉；4000mg包衣預(yù)混劑歐巴代OY-C-7000A混合制成顆粒，并干燥，壓制成片。
實施例4 金絲桃素的提取同上實施例1； 本實施例膠囊劑的制備 膠囊劑的制備50mg金絲桃素；10mg的乳糖、10mg羥丙基纖維素、3mg淀粉、7mg糊精、4mg滑石粉、6mg硬脂酸鎂，將上述重量份的原料混合，粉碎成粉，裝入明膠中制成膠囊。
實施例5 金絲桃素的提取同上實施例1；本實施例乳劑的制備 20mg金絲桃素；10mg硬脂酸鈉、20mg硬脂酸鎂、30mg甘油脂肪酸酯、20mg甘油脂肪酸酯、40mg卵磷脂、50mg泊洛沙姆、10mg羊毛脂、5mg聚山梨酯、5mg脂肪酸山梨坦、10mg甲基纖維素、10mg羧甲基纖維素、20mg海藻酸鈉和20mg瓊脂，將上述重量份的原料混合乳化制成乳劑。
實施例6 金絲桃素的制備同上實施例1； 注射劑的制備 80mg金絲桃素；于其中加入50mg無水乙醇、70mg甘油和140mg水，另加入90mg吐溫-80增溶，攪拌溶解后，用三乙胺調(diào)pH值至8，最后用注射用水定容到600ml，過濾除菌，分裝即得棕紅色澄清水溶液，冰箱4℃保存。
實施例7 金絲桃素的提取同上實施例1；片劑的制備 60mg金絲桃素粉碎成細粉，加入10mg乳糖、20mg淀粉、70mg糊精、5mg硬脂酸鎂、35mg羥丙基纖維素；45mg滑石粉、15mg包衣預(yù)混劑歐巴代OY-C-7000A混合制成顆粒，并干燥，壓制成片。
實施例8 金絲桃素的提取同上實施例1； 膠囊劑的制備 90mg金絲桃素；10mg的乳糖、120mg淀粉、50mg糊精、60mg羥丙基纖維素、30mg滑石粉、30mg硬脂酸鎂，將上述重量份的原料混合，粉碎成粉，裝入明膠中制成膠囊。
以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對其限制，盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員閱讀本申請后，參照上述實施例對本發(fā)明進行種種修改或變更，但這些修改或變更，均在申請待批本發(fā)明的權(quán)利申請要求保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物，其特征在于包括按重量份計的1～100份金絲桃素和藥用載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其特征在于包括按重量份計的1～100份金絲桃素和10～10000份藥用載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其特征在于包括按重量份計的50～99份金絲桃素和40～9000份藥用載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其特征在于包括按重量份計的20～80份金絲桃素和250～350份藥用載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其特征在于包括按重量份計的60～90份金絲桃素和200～300份藥用載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5任一權(quán)利要求的藥物組合物，其特征在于所述藥用載體為從稀釋劑、潤濕劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、乳化劑、防腐劑、增溶劑、溶劑和基質(zhì)選出任意一種或幾種助劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥物組合物，其特征在于
所述稀釋劑為淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、甘露醇和山梨醇；
所述潤濕劑為蒸餾水、乙醇、丙二醇和丙三醇；
所述黏合劑為羧甲基纖維素、海藻酸鈉、瓊脂、阿拉伯膠、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、卡波姆、聚維酮、明膠和聚乙二醇；
所述崩解劑為干淀粉、羧甲淀粉鈉和交聯(lián)聚維酮；
所述潤滑劑為硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、微粉硅膠、滑石粉和聚乙二醇；
所述乳化劑為硬脂酸甘油酯、羊毛脂、甘油脂肪酸酯、卵磷脂、泊洛沙姆、聚山梨酯和脂肪酸山梨坦、硬脂酸、十二烷基硫酸鈉和甘油；
所述防腐劑為羥苯乙酯、硫柳汞、苯甲醇、三氯叔丁醇和尼泊金；
所述增溶劑為吐溫；
所述溶劑為乙醇和蒸餾水；
所述基質(zhì)為甘油、凡士林、液體石蠟、聚乙二醇，硬脂酸、單硬脂酸甘油酯和氫化植物油。
8.權(quán)利要求1～7的任一權(quán)利要求的藥物組合物的制備方法，包括步驟
(1)金絲桃素的提取及純化
a)、粗提
將貫葉連翹粉的質(zhì)量與濃度為60％～100％的乙醇的體積比為1∶20～40的比例混合，超聲處理15～25分鐘，70℃～90℃回流1.5～2.5小時，過濾，保留濾液；同樣條件，用乙醇將其濾渣再提取2～4次，合并濾液，濃縮干燥，即得金絲桃素浸膏。
b)、大孔樹脂提純
將步驟a)所得浸膏與濃度為15％～35％的乙醇混合，超聲處理15～30分鐘溶解，過濾，調(diào)至濃度為5～7mg/mL，將大孔吸附樹脂與此藥液按體積比為1～2∶1的比例混合，用大孔吸附樹脂分離提純，控制吸附流速1.5～2.5床體積/小時，控制樹脂柱徑高比為1∶5～7，3～5倍樹脂體積水洗，水洗速度為0.5～3床體積/小時；再換以流量為4～6床體積濃度為50％～70％的乙醇洗脫，洗脫速度為1～3床體積/小時，收集洗液，濃縮干燥得金絲桃素粗品；
c)、分離純化
用200～300目細硅膠裝柱，硅膠柱體積為金絲桃素粗品的10～50倍，干法上樣按氯仿與甲醇的體積比為90～95∶1的比例洗脫，TLC跟蹤流出液，收集金絲桃素為單點的流份；所得流份于60～75℃、0.08～0.10MPa真空度條件下，濃縮3～4.5h烘干，烘干后用150～250mL丙酮溶解過濾，濾液過硅膠柱，將收集的流出液濃縮干燥后得金絲桃素純品；
(2)、藥物組合物的制備
于金絲桃素純品中，加入至少一種所述藥用載體制成醫(yī)藥上可接受的劑型。
9.權(quán)利要求8的藥物組合物的制備方法，包括步驟
(1)金絲桃素的提取及純化
a)、粗提
將貫葉連翹粉的質(zhì)量與濃度為60％的乙醇的體積比為1∶30的比例混合，超聲處理20分鐘，80℃回流2小時后過濾，保留濾液；同樣條件，用乙醇將所得濾渣再提取3次，合并濾液，濃縮干燥，即得金絲桃素浸膏；
b)、大孔樹脂提純
將步驟a)所得浸膏與濃度為30％的乙醇混合，超聲處理20min溶解，過濾，調(diào)至濃度為6mg/mL，以大孔吸附樹脂與藥液的體積比為2∶1的比例將二者混合，通過S898型大孔吸附樹脂分離提純，控制吸附流速為2.0BV/h，控制樹脂柱徑高比為1∶5，水洗3倍樹脂體積，水洗速度為3BV/h；再換以流量為5BY濃度為50％的乙醇洗脫，洗脫速度為2BV/h，收集洗液，濃縮干燥得金絲桃素粗品。
c)、分離純化
用300目細硅膠裝柱，硅膠柱體積為金絲桃素粗品的40倍，以氯仿與甲醇的體積比為95∶1的比例洗脫，干法上樣TLC跟蹤流出液，收集金絲桃素為單點的流份；所得流份于60℃、0.08MPa真空度條件下，濃縮3.5h烘干，烘干后用200mL丙酮溶解過濾，濾液過硅膠柱，將收集的流出液濃縮干燥后得金絲桃素純品；
2)、藥物組合物的制備
于金絲桃素純品中，加入至少一種所述藥用載體制成醫(yī)藥上可接受的劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療鮮紅斑痣的藥物組合物及其制備方法，其中金絲桃素的提取純化通過步驟a)粗提；b)大孔樹脂精制；c)分離純化得到，然后將得到的金絲桃素，以一定比例與藥用載體混合制備所述藥物組合物，本發(fā)明的藥物組合物具有下述特點輕度型、重度型病變均有效，療效較高、暗毒性及毒副作用較低、安全度大，且與光動力的協(xié)同作用較強，無需做過敏實驗，即可實現(xiàn)對鮮紅斑痣的標本兼治。
文檔編號A61K31/122GK101744795SQ201010122029
公開日2010年6月23日 申請日期2010年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
發(fā)明者孟德勝, 盧來春, 李卓恒, 傅若秋, 陳亮, 溫悅, 胡大強, 吳畏, 趙艷艷, 李曉曦 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院