專利名稱：：一種流行性乙型腦炎疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及流行性乙腦疫苗的方法，其步驟如下選用10-14日齡、重量在12-15克的健康地鼠，使用乙醚處死，清洗并消毒鼠尸；無菌取腎，剪碎，經(jīng)胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)液分散細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，分裝培養(yǎng)瓶，置37°C士rC培養(yǎng)3-4天。細(xì)胞長滿單層后接入毒種和培養(yǎng)液，毒種使用量為每100cm2細(xì)胞接種lml毒種。病毒培養(yǎng)液主要包括MEM培養(yǎng)液90-95X，小牛血清3-5X，7.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.6。經(jīng)澄清過濾后加入終濃度為0.3%人血白蛋白制成。選擇細(xì)胞生長良好的細(xì)胞瓶，棄去培養(yǎng)液，用緩沖液沖洗去除小牛血清，緩沖液沖洗量800-1000ml/瓶，沖洗完畢后每瓶加入1000ml病毒感染液，立即置32-34t:溫室繼續(xù)培養(yǎng)。種毒16-18小時(shí)后進(jìn)行換液，加入維持液1500-2500m1/瓶，置32-34。C溫室繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。收獲前檢查細(xì)胞病變，選擇細(xì)胞瓶內(nèi)細(xì)胞病變75%以上的細(xì)胞瓶進(jìn)行收集，將細(xì)胞瓶進(jìn)行超聲，使細(xì)胞從瓶壁上脫落下來收集到10-15萬不銹鋼罐內(nèi)，搖勻即為病毒收獲液。病毒收獲后用14000r/min的連續(xù)流冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心，流速為1500-2000m1/min，然后用0.5um及0.22um的濾芯過濾。按1:4000的比例加入P-丙內(nèi)酯置2_8°C7天滅活。將病毒收獲液濃縮60倍左右，通過凝膠柱層析，0.02MpH7.2的PBS洗脫，檢測(cè)波長為280nm，收集第一峰，即為純化后原液。用0.22um的膜除菌過濾，然后加入0.3-0.5%人血白蛋白作為保護(hù)劑，加入總濃度為60ug/ml的硫柳汞防腐。病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml，按抗原含量不少于收獲液的四倍配制半成品。各項(xiàng)檢驗(yàn)項(xiàng)目經(jīng)檢測(cè)后，結(jié)果顯示均符合國家藥典標(biāo)準(zhǔn)。三種方法制備乙腦疫苗的工藝異同點(diǎn)如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>以上對(duì)本發(fā)明的描述不具有限制性，如果本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員受其啟示，在不脫離本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)的情況，作出本發(fā)明的其它結(jié)構(gòu)變形和實(shí)施方式，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求一種流行性乙型腦炎疫苗的制備方法，其特征在于步驟如下(1)、選用10-14日齡、重量在12-15克的健康地鼠，使用乙醚處死，清洗并消毒鼠尸；無菌取腎，剪碎，經(jīng)胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)液分散細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，分裝培養(yǎng)瓶，置37℃±1℃培養(yǎng)3-4天；(2)、選擇細(xì)胞生長良好的細(xì)胞瓶，棄去培養(yǎng)液，用緩沖液沖洗去除小牛血清，緩沖液沖洗量800-1000ml/瓶，沖洗完畢后每瓶加入1000ml病毒感染液，立即置32-34℃溫室繼續(xù)培養(yǎng)；(3)、種毒16-18小時(shí)后進(jìn)行換液，加入維持液1500-2500ml/瓶，置32-34℃溫室繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)；收獲前檢查細(xì)胞病變，選擇細(xì)胞瓶內(nèi)細(xì)胞病變75％以上的細(xì)胞瓶進(jìn)行收集，將細(xì)胞瓶進(jìn)行超聲，使細(xì)胞從瓶壁上脫落下來收集到10-15萬不銹鋼罐內(nèi)，搖勻即為病毒收獲液；(4)、病毒收獲后用14000r/min的連續(xù)流冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心，流速為1500-2000ml/min，然后用0.5um及0.22um的濾芯過濾，按1∶4000的重量比例加入β-丙內(nèi)酯置2-8℃7天滅活；(5)、將病毒收獲液濃縮60倍左右，通過凝膠柱層析，0.02MpH7.2的PBS洗脫，檢測(cè)波長為280nm，收集第一峰，即為純化后原液；用0.22um的膜除菌過濾，然后加入0.3-0.5％人血白蛋白作為保護(hù)劑，加入總濃度為60ug/ml的硫柳汞防腐，病毒蛋白含量31.1-74.22ug/ml，按抗原含量不少于收獲液的四倍配制半成品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流行性乙型腦炎疫苗的制備方法，其特征在于所述的病毒培養(yǎng)液包括MEM培養(yǎng)液90-95X，小牛血清3-5X，7.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.6，經(jīng)澄清過濾后加入終濃度為0.3%人血白蛋白制成。全文摘要本發(fā)明涉及一種流行性乙型腦炎疫苗的制備方法，包括細(xì)胞培養(yǎng)、病毒繁殖和疫苗制備工藝。細(xì)胞長滿單層后接入毒種和培養(yǎng)液，毒種使用量為每100cm2細(xì)胞接種1ml毒種。病毒培養(yǎng)液主要包括MEM培養(yǎng)液90-95％，小牛血清3-5％，7.5％碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.6。經(jīng)澄清過濾后加入終濃度為0.3％人血白蛋白制成。本發(fā)明采用SA14-14-2減毒株生產(chǎn)乙腦純化疫苗，該減毒株比P3毒株生產(chǎn)的疫苗更加安全有效。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、用減毒株制備純化疫苗安全性好。2、用β-丙內(nèi)酯滅活病毒滅活效果好，滅活劑自然降解無殘留。3、柱層析純化性質(zhì)溫和，對(duì)病毒損傷小。文檔編號(hào)A61K39/12GK101732708SQ20091015452公開日2010年6月16日申請(qǐng)日期2009年11月10日優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日發(fā)明者姚偉,沈吉友,蘇波申請(qǐng)人:浙江天元生物藥業(yè)股份有限公司