基于dc的hcv病毒表位疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及利用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 為胰島細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 丙型肝炎病毒（HCV)是引起慢性肝病的主要病原體之一，全世界約有HCV感染者 1. 7億-2. 0億，我國人群HCV感染率約3. 2 %，估計(jì)全國感染者在4000萬以上。HCV感染后， 約50 % -85 %轉(zhuǎn)為慢性肝炎，其中20 % -30 %發(fā)展為肝硬化，部分轉(zhuǎn)為肝細(xì)胞肝癌（HCC)，嚴(yán) 重危害人類健康，已成為全球性的、嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。迄今為止，尚缺乏理想的抗病毒 治療措施，干擾素治療也不令人滿意。由于HCV病毒變異率高，以保護(hù)性抗體為主的預(yù)防性 HCV疫苗的研究步履維艱。因此，尋求抗HCV疫苗和有效抗病毒藥物一直是研究的熱點(diǎn)。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中，HCV病毒疫苗的制備方法為：對(duì)HCVNS3區(qū)和HCVNS5區(qū)抗原蛋白的氨 基酸序列進(jìn)行了分析，倆個(gè)多肽鏈的鏈的氨基酸序列分別為：HCVNS3:pvsylkgssg(10個(gè)氨 基酸殘基）HCVNS5: nmvyattsrs (10個(gè)氨基酸殘基），多肽純度為95 % -99. 99 %，采用Fmoc 固相法結(jié)合成線性多肽疫苗，經(jīng)脫鹽及HPLC純化后得到抗原肽，溶于醫(yī)學(xué)蒸餾水制成疫苗 溶液。通過該方法制備的HCV病毒疫苗由于是多肽溶于水溶液制備而成的，因此，性狀不夠 穩(wěn)定，免疫原性較弱，特異性不強(qiáng)，不能很好引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，殺傷HCV病毒；另外，由 于缺乏一些免疫輔助因子的表達(dá)，不能夠很好的調(diào)節(jié)HCV病毒的機(jī)體免疫機(jī)制，不能改善 HCV病毒引起的肝臟免疫耐受的現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中HCV病毒疫苗性狀不穩(wěn)定、免疫 原性較弱、特異性不強(qiáng)等缺陷，提供一種性狀穩(wěn)定，免疫原性及特異性強(qiáng)的基于DC的HCV病 毒表位疫苗。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種基于DC的HCV病毒表位疫 苗的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
[0006] 獲取未成熟DC ;
[0007] 加入HCV病毒抗原多肽與未成熟DC共培養(yǎng)；
[0008] 再加入腫瘤壞死因子-a和白介素或脂多糖繼續(xù)培養(yǎng)，至DC成熟且負(fù)載上HCV病 毒抗原多肽。
[0009] 在本發(fā)明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述白介素為白介 素-1。
[0010] 在本發(fā)明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死因 子-a的濃度為l-10ng/ml、白介素-1的濃度為5-15ng/ml、脂多糖的濃度為l-10ng/ml。 [0011] 在本發(fā)明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死因 子-a的濃度為濃度為5ng/ml、白介素-1的濃度為8ng/ml。
[0012] 在本發(fā)明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死因 子-a的濃度為濃度為lOng/ml、白介素-1的濃度為5ng/ml。
[0013] 在本發(fā)明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死因 子- a的濃度為濃度為lng/ml、白介素-1的濃度為15ng/ml。
[0014] 在本發(fā)明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，加入腫瘤壞死因 子-a和白介素或脂多糖后繼續(xù)培養(yǎng)未成熟DC和HCV病毒抗原多肽7-13天。
[0015] 在本發(fā)明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述HCV病毒抗原多 肽由多肽鏈HCVNS3和HCVNS5合成。
[0016] 在本發(fā)明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，所述HCV病毒抗原多 肽與未成熟DC在含有粒-巨噬細(xì)胞因子和白介素-4的培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)。
[0017] 在本發(fā)明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗的制備方法中，加入腫瘤壞死因 子-a和白介素或脂多糖后繼續(xù)培養(yǎng)未成熟DC和HCV病毒抗原多肽7-13天。
[0018] 本發(fā)明還提供一種基于DC的HCV病毒表位疫苗，由上述基于DC的HCV病毒表位 疫苗制備方法所獲得。
[0019] 實(shí)施本發(fā)明提供的基于DC的HCV病毒表位疫苗及其制備方法，可以達(dá)到以下有益 效果：通過本發(fā)明獲得的基于DC的HCV病毒表位疫苗不僅性狀較穩(wěn)定，而且免疫原性及特 異性較強(qiáng)，能夠很好的調(diào)節(jié)HCV病毒的機(jī)體免疫機(jī)制，改善HCV病毒引起的肝臟免疫耐受的 現(xiàn)象。
【附圖說明】
[0020] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0021] 圖1為采用ELISA法檢測經(jīng)疫苗刺激小鼠后小鼠機(jī)體血清中的白細(xì)胞介 素-12(IL-12)水平；
[0022] 圖2中從左至右分別為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)四中，腫瘤初始示意圖以及接種現(xiàn)有HCV病毒 疫苗后，每間隔2d所得到的腫瘤示意圖；
[0023] 圖3中從左至右分別為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)四中，腫瘤初始示意圖以及接種實(shí)施例1提供 的基于DC的HCV病毒表位疫苗后，每間隔2d所得到的腫瘤示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0025] 本發(fā)明提供的一種基于DC的HCV病毒表位疫苗，其制備方法包括以下步驟：
[0026] 1)將CD34+和/或CD14 +單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為未成熟DC ;
[0027] 2)待未成熟DC濃度小于或等于5 X IO5個(gè)/ml時(shí)，加入HCV病毒抗原多肽與未成 熟DC共培養(yǎng)；
[0028] 3)再加入腫瘤壞死因子-a和白介素或脂多糖繼續(xù)培養(yǎng)7-13天，至DC成熟且DC 負(fù)載上HCV病毒抗原多肽。
[0029] 在步驟1)中，本發(fā)明提供的將CD34+和/或CD14 +單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為未成熟DC 的方法為：將CD34+和/或CD14 +單核細(xì)胞接種到含粒-巨噬細(xì)胞和白介素-4的培養(yǎng)基中 并在37°C，CO2濃度為5%的條件下誘導(dǎo)6-9天后，即可獲得未成熟DC，未成熟DC的表型和 功能均不完善，不能誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)。當(dāng)然可以理解的是，本發(fā)明獲得未成熟DC的途 徑也并不局限于此，通過現(xiàn)有技術(shù)中的誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)單核細(xì)胞獲得的未成熟DC同樣適用 于本發(fā)明。
[0030] 其中，⑶34+單核細(xì)胞可以從骨髓、臍帶血或脾臟等分離得到；⑶14 +細(xì)胞從人外 周血分離得到的。由于從臍帶血中純化出CD34+單核細(xì)胞費(fèi)用昂貴；骨髓采集不易，而且 容易污染，患者比較痛苦，擴(kuò)增費(fèi)用昂貴；而脾臟來源受限等使得CD34+單核細(xì)胞獲取較困 難；因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選采用從人外周新鮮血液中分離篩選出CD14 +單核細(xì)胞，從新鮮 血液中獲取，相比經(jīng)過冷庫儲(chǔ)存或者培養(yǎng)傳代之后的CD14+單核細(xì)胞，從新鮮血液中提取的 CD14 +單核細(xì)胞離體時(shí)間不長，其細(xì)胞活性和狀態(tài)的減弱或者形態(tài)改變程度都較少，更加利 于獲取DC。
[0031]由于DC有簇狀生長的習(xí)慣，濃度太高，集結(jié)成團(tuán)，位于中心的DC不易成熟，影響 HCV病毒抗原的負(fù)載，從而影響疫苗的免疫效果，因此，DC濃度不易過高，在該步驟中，未成 熟DC在培養(yǎng)基中的濃度小于或等于5 X IO5個(gè)/ml ;
[0032] 步驟2)中，HCV病毒抗原多肽由多肽鏈HCVNS3和HCVNS5通過Fmoc固相法結(jié)合而 成，具體合成步驟為現(xiàn)有技術(shù)，在此不再贅述。由于多肽純度與DC負(fù)載的抗原量成正比，因 此，多肽純度越高，DC負(fù)載的抗原量越高，在本發(fā)明中，優(yōu)選地，多肽純度為95% -99. 99%; 多肽鏈的氨基酸序列為HCVNS3 :pvsylkgssg(10個(gè)氨基酸殘基）和HCVNS5 :nmvyattsrs(10 個(gè)氨基酸殘基）。
[0033] 由于未成熟DC表達(dá)能介導(dǎo)DC攝取抗原的一些膜受體如Fc受體等，因而相比成 熟DC擁有更強(qiáng)的抗原攝取、加工和處理能力，因此，步驟2)中利用未成熟DC與HCV病毒抗 原多肽共培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)HCV病毒抗原多肽的預(yù)負(fù)載，促進(jìn)提高HCV病毒抗原多肽負(fù)載量，同時(shí)， 未成熟DC經(jīng)抗原致敏可至成熟。
[0034] 在步驟3)中，由于白介素和脂多糖功能均具有促進(jìn)DC細(xì)胞成熟的功能，因此在該 步驟中采用其中一種即可。由于DC細(xì)胞成熟后會(huì)分泌白介素-1，因此，在該步驟中，優(yōu)先 采用白介素-1來促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟，起到反饋誘導(dǎo)的作用。白介素-1由活化的巨噬細(xì)胞 所產(chǎn)生，機(jī)體免疫細(xì)胞受抗原刺激后產(chǎn)生；而腫瘤壞死因子-a由體內(nèi)免疫細(xì)胞（如T淋 巴細(xì)胞、T細(xì)胞雜交瘤、T淋巴樣細(xì)胞系以NK細(xì)胞等）分泌的一種單核因子，由于白介素-1 和腫瘤壞死因子-a由不同細(xì)胞產(chǎn)生，因此，同時(shí)添加白介素-1和腫瘤壞死因子-a對(duì)未 成熟DC的刺激作用較強(qiáng)，能夠促進(jìn)DC成熟的同時(shí)提高HCV病毒抗原多肽的負(fù)載率，并且能 夠穩(wěn)定DC的抗原提呈性；優(yōu)選地，腫瘤壞死因子-a的濃度為l-l〇ng/ml、白介素的濃度為 5-15ng/ml、脂多糖的濃度為l-10ng/ml。
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