一種水貂犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)疫苗及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水貂犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)疫苗及其制備方法與應(yīng)用，屬 于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水貂病毒性腸炎是由細(xì)小病毒引起水貂一種急性、烈性和高度接觸性傳染病，主 要以劇烈腹瀉為主要特征，1949年由加拿大學(xué)者Schofield發(fā)現(xiàn)本病，1952年Will證明本 病的病原為細(xì)小病毒，此后蔓延到世界各國。1981年姜廷秀等報道了我國發(fā)生水貂病毒性 腸炎；1984年高云等報道山東發(fā)生水貂病毒性腸炎。以后該病逐漸蔓延全國，給養(yǎng)貂業(yè)帶 來巨大的經(jīng)濟損失。
[0003] 犬瘟熱是由副粘病毒科犬瘟熱病毒引起的急性、熱性、傳染性極強的高度接觸性 傳染病。水貂、狐貍、貉等毛皮動物對該病毒易感染，本病已廣泛存在于包括中國在內(nèi)的所 有毛皮動物養(yǎng)殖國家，對毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)威脅極大。
[0004] 隨著養(yǎng)貂業(yè)的發(fā)展，國內(nèi)目前用于預(yù)防水貂犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎的疫苗主要 是水貂犬瘟熱活疫苗和水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗，對于規(guī)模化養(yǎng)殖場，單苗的使用給 免疫接種帶來了很大工作量。而直接用水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗稀釋水貂犬瘟熱活疫 苗會造成犬瘟熱病毒的失活，導(dǎo)致犬瘟熱的免疫失敗。一方面，要制備出水貂細(xì)小病毒性腸 炎滅活疫苗-水貂犬瘟熱活疫苗二聯(lián)苗需要選擇合適的水貂細(xì)小病毒性滅活方法，既使其 喪失活性，同時保持病毒免疫原性，又要避免滅活后殘留的滅活劑影響犬瘟熱病毒活疫苗 活性。另一方面，還要保證兩種疫苗在同時免疫時不發(fā)生免疫抑制或產(chǎn)生免疫干擾。基于 以上兩點，目前尚沒有水貂犬瘟熱活疫苗和水貂細(xì)小病毒腸炎滅活疫苗的二聯(lián)疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種水貂犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)疫苗及其 制備方法和應(yīng)用，所采取的技術(shù)方案如下：
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種水貂犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)疫苗，該疫苗主要 由水貂犬瘟熱活疫苗和水貂細(xì)小病毒滅活疫苗、疫苗佐劑和保護劑組成；其中，水貂犬瘟熱 活疫苗和水貂細(xì)小病毒滅活疫苗是按照每頭份1 :1的比例組成。
[0007] 優(yōu)選地，所述水紹犬痕熱活疫苗，抗原為犬痕熱病毒（Canine distemper virus，⑶V)全病毒、經(jīng)改良或嵌合的⑶V病毒，⑶V基因缺乏病毒或弱毒病毒的一種或任意 幾種的組合；所述水貂細(xì)小病毒滅活疫苗抗原為水貂細(xì)小病毒和/或含MEV免疫原性氨基 酸序列的多肽或亞單位。
[0008] 更優(yōu)選地，所述犬瘟熱病毒全病毒，為⑶V3-CL毒株，于2015年6月10日保藏在 位于北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 10768 ; 所述細(xì)小病毒，為MEVB毒株。
[0009] 優(yōu)選地，所述水貂犬瘟熱病毒抗原含量為Kf5~IO6'°TCID 5。/頭份，所述水貂細(xì)小 病毒抗原的含量為1〇5'°~10 7'°tcid5。/頭份。
[0010] 優(yōu)選地，所述疫苗佐劑為水貂細(xì)小病毒滅活疫苗組分中的成份，主要化學(xué)成分為 氫氧化鋁膠；所述保護劑為水貂犬瘟熱活疫苗組分中的成份，為NZ胺，谷氨酸單鉀鹽，水解 乳蛋白，蔗糖或明膠的一種或幾種的組合物。
[0011] 更優(yōu)選地，所述保護劑為耐熱保護劑，是由如下質(zhì)量百分比濃度的物質(zhì)：15%~ 25%蔗糖、1 %~5%明膠、1 %~3%水解乳蛋白、0? 1 %~0? 3%谷氨酸單鉀鹽、1 %~5% NZ 胺，余量為注射用水，通過高壓滅菌、微孔濾芯過濾除菌、混合制備而成。該保護劑能保證犬 瘟熱凍干苗在2~8°C保存期在15個月以上。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述疫苗的制備方法，該方法的步驟如下：
[0013] 1)利用胰酶-EDTA細(xì)胞分散液對Vero細(xì)胞進行消化處理，再按1傳3~5的比例 進行傳代，分別加含有8-10%小牛血清的細(xì)胞生長液，在37°C下培養(yǎng)至形成細(xì)胞層，再將 犬瘟熱病毒⑶V3-CL毒株用細(xì)胞維持液進行3-5倍稀釋，按照1-1. 5%的比例接種在上述 Vero單層細(xì)胞中，37°C吸附lh，棄掉吸附液，加入細(xì)胞生長液置于37°C下培養(yǎng)，當(dāng)80%以上 細(xì)胞出現(xiàn)典型細(xì)胞病變（CPE)時，收獲作為生產(chǎn)用毒種；棄去已長滿的Vero細(xì)胞的培養(yǎng)液， 利用PBS清洗2次后將上述生產(chǎn)用毒種利用MEM細(xì)胞維持液做5倍的稀釋后，再按照5 %的 比例接種在單層Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶中，37°C下吸附Ih后加入細(xì)胞維持液，在35-37°C下連續(xù)培 養(yǎng)4d，當(dāng)細(xì)胞CPE達到70%以上時，置于-20°C凍結(jié)，再融化后收獲培養(yǎng)物，獲得制苗毒液， 在將制苗毒液與保護劑按4:1的比例混合均勻后凍干，檢驗合格后，獲得犬瘟熱活疫苗，在 2-8°C以下保存，有效期達15個月以上；
[0014] 2)利用胰酶-EDTA細(xì)胞分散液對CRFK細(xì)胞進行消化處理，再按1傳3~5進行傳 代，分別加含有8-10%小牛血清的細(xì)胞生長液，在37°C下培養(yǎng)至形成細(xì)胞層，再將細(xì)小病 毒MEVB毒株用細(xì)胞維持液進行稀釋后，按照2 %的比例同步接種于CRFK細(xì)胞懸液中，置于 37°C下培養(yǎng)3-4d后，80%以上細(xì)胞出現(xiàn)典型CPE時收獲，-20°C保存作為生產(chǎn)用毒種；將所 得的生產(chǎn)用毒種按1-2 %的比例接種到CRFK細(xì)胞懸液中在35-37°C下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)4d后，70 % 以上細(xì)胞出現(xiàn)典型CPE時，置于-20°C凍結(jié)，再融化后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，獲得制苗毒液，檢驗 合格后，將制苗毒液進行滅活處理，處理后再進行中和處理，將所得的滅活毒苗與鋁膠佐劑 按9:1的比例混合均勻，檢驗合格后在2-8°C保存，獲得細(xì)小病毒滅活疫苗；所述制苗毒液 的滅活處理，是采用BEI處理或甲醛處理；所述BEI處理，處理條件為：BEI濃度l-3mM，滅活 時間48h，滅活溫度37°C ;所述甲醛處理，處理條件為：甲醛溶液濃度0. 08-0. 12%，滅活時 間48h，滅活溫度37°C;所述中和處理，在采用BEI滅活的情況下，中和劑為IM硫代硫酸鈉， 使用劑量為BEI使用量的10%，中和時間為24h ;采用甲醛進行滅活處理時，采用生理鹽水 進行稀釋，使甲醛濃度降低至0.05%以下；
[0015] 3)將步驟1)冷藏的犬瘟熱活疫苗和步驟2)冷藏的細(xì)小病毒滅活疫苗取出置于室 溫，并細(xì)小病毒滅活疫苗搖晃均勻，再按照頭份數(shù)1:1的比例將細(xì)小病毒滅活疫苗與犬瘟 熱活疫苗混合均勻，獲得水貂犬瘟熱-細(xì)小病毒性腸炎二聯(lián)疫苗。
[0016] 所述任一疫苗用于水貂和狐貍的犬瘟熱和細(xì)小病毒性腸炎的免疫。
[0017] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述疫苗的使用方法，該方法的步驟如下：
[0018] 1)將2~8°C保存的水貂犬瘟熱活疫苗和在2_8°C冷藏的水貂細(xì)小病毒性腸炎活 疫苗取出置于室溫，并將水貂細(xì)小病毒性腸炎滅活疫苗導(dǎo)入水貂犬瘟熱活疫苗瓶內(nèi)，混合 均勻；
[0019] 2)將水貂犬瘟熱活疫苗與水貂細(xì)小病毒性腸炎活疫苗按照每頭份1:1的比例混 合均勻，獲得二聯(lián)疫苗；
[0020] 3)在2h內(nèi)將步驟2)所得二聯(lián)疫苗免疫接種到水貂體內(nèi)，接種量為1.0 ml/只水 貂。
[0021] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所疫苗制備的試劑盒。
[0022] 本發(fā)明獲得的有益效果如下：
[0023] -方面本發(fā)明選擇的滅活方法，既保證了水貂細(xì)小病毒喪失活性，同時保持病毒 免疫原性，又避免滅活后殘留的滅活劑影響犬瘟熱病毒。另一方面，本發(fā)明所制備的二聯(lián)疫 苗保證了兩種疫苗在同時免疫時不發(fā)生免疫抑制或產(chǎn)生免疫干擾。另外，本發(fā)明所制備的 二聯(lián)疫苗的保存條件均為2~8°C下冷藏，其中水貂犬瘟熱活疫苗部分在2~8°C下有效期 可達15個月以上。在使用上，本發(fā)明制備的二聯(lián)疫苗將滅活苗部分同時作為活疫苗的稀釋 液，采用稀釋針頭，利用凍干苗的真空負(fù)壓狀態(tài)，快速、便捷實現(xiàn)兩種疫苗的聯(lián)合和凍干苗 的稀釋雙重效果。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0025] 以下實施例所用材料、試劑、方法和儀器，未經(jīng)特殊聲明，均為本領(lǐng)域中常規(guī)材料、 試劑、方法和儀器，均可以通過商業(yè)渠道獲得。
[0026] 所用犬痕熱病毒（Canine distemper virus, (DV)全病毒，為⑶V3-CL毒株，于 2015年6月10日保藏在位于北京朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏編號為：CGMCC NO. 10768。
[0027] 實施例1水貂犬瘟熱活疫苗的制備：
[0028] 1.制苗用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)：將生產(chǎn)水貂犬瘟熱病毒用Vero細(xì)胞經(jīng)胰酶一EDTA 細(xì)胞分散液消化，按1 :3進行傳代；分別加含8%~10%小牛血清的細(xì)胞生長液于37°C培 養(yǎng)，形成良好細(xì)胞單層時，用于繼續(xù)傳代或接種病毒。
[0029] 2.細(xì)胞毒種的繁殖：將水貂犬瘟熱活疫苗CDV3-CL株毒種用細(xì)胞維持液進行3~ 5倍稀釋，按1 %~1. 5%的比例接種于生長良好的Vero單層