專利名稱：一種hpv多肽/dc混合疫苗及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及Toll樣受體(TLR)的激動(dòng) 劑，作為一種HPV11E7表位肽特異性DC疫苗的佐劑，以期用于尖銳濕疣和宮頸癌的防 治。
背景技術(shù)：
人類乳頭瘤病毒(HPV)可引起我國目前高發(fā)的性傳播性疾病一尖銳濕疣以及 HPV高相關(guān)性宮頸癌。尖銳濕疣的病原體主要為HPV6和11型，復(fù)發(fā)率高，頑固難治； 而宮頸癌至今療效和預(yù)后不佳，且逐年出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，兩者均成為嚴(yán)重危害患者、家 庭、乃至社會(huì)的重大隱患。盡管宮頸癌預(yù)防性疫苗已在多個(gè)國家上市，并顯示了較理想的療效。然而，目 前多數(shù)HPV治療性疫苗對(duì)人類機(jī)體細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)激活較有限，臨床試驗(yàn)也并未達(dá)到預(yù) 期結(jié)果。由于HPV感染患者機(jī)體免疫力往往比較低下，不足以激發(fā)有效的細(xì)胞免疫清除 病毒感染，而臨床上又缺乏高效、特異性的抗HPV藥物，因此，如何增強(qiáng)HPV蛋白的免 疫原性、促進(jìn)抗原的呈遞以及尋找高效的佐劑等來提高機(jī)體的特異性抗病毒免疫是HPV 疫苗研究中需迫切解決的關(guān)鍵問題。Toll樣受體(TLR)是存在于樹突狀細(xì)胞(DC)等抗原提呈細(xì)胞上的病原相關(guān)模 式識(shí)別受體。當(dāng)病原體感染機(jī)體時(shí)，TLR識(shí)別相應(yīng)的配體而活化，通過不同的細(xì)胞內(nèi)信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而在機(jī)體抗感染的天然免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮至關(guān)重要 的作用。參與機(jī)體抗病毒免疫的主要有四種TLRs 以polyI:C (PIC)為激動(dòng)劑的TLR3 ； 以咪喹莫特等為激動(dòng)劑的TLR7/8 ；以CpG為激動(dòng)劑的TLR9。近來發(fā)現(xiàn)某些TLR激動(dòng) 劑可明顯上調(diào)病毒抗原肽引起DC分化及功能成熟，從而引發(fā)更強(qiáng)的抗原特異性細(xì)胞免疫 應(yīng)答，因此認(rèn)為TLRs在激發(fā)機(jī)體特異性抗病毒免疫、清除病毒感染的過程中也可能起著 關(guān)鍵作用。而其激動(dòng)劑也可能作為重要的免疫佐劑來上調(diào)各種預(yù)防性或治療性疫苗的作 用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種HPV多肽/DC混合疫苗，所述的混合疫苗，主 要由一份HPV11E77_15，一份體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BM-DC)，一份 CpG(TLR9激動(dòng)劑)作為佐劑組成。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種HPV多肽/DC混合疫苗的制備方法，通過以下 技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1)從小鼠骨髓提取樹突狀細(xì)胞(BM-DC)，進(jìn)一步體外培養(yǎng)；(2)先與免疫原性最強(qiáng)的一段HPV11E7CTL表位肽(HPV11E77_15， TLKDIVLDL)共孵育；(3)再分別與TLR配體CpG等共孵育，以促進(jìn)DC成熟；
(4)檢測(cè)孵育后DC表面標(biāo)志改變以確認(rèn)其成熟度；(5)上述刺激成熟的DC疫苗可用于免疫小鼠。本發(fā)明將TLR配體與HPV11E7多肽聯(lián)合使用可促進(jìn)DC的成熟度，尤其聯(lián)用 CpG后可提高T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF- α和IFN_ Y的水平。因此認(rèn)為TLR9激動(dòng)劑 CpG對(duì)HPV11E7CTL表位肽在小鼠模型中的免疫應(yīng)答具有一定程度的上調(diào)作用，可作為 免疫佐劑以提高HPV11E7表位肽特異性的DC疫苗的免疫效應(yīng)。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有疫苗的 不足，用TLR激動(dòng)劑(CpG)作為免疫佐劑，以提高HPV11E7表位肽特異性的DC疫苗的 免疫效應(yīng)，用于尖銳濕疣和宮頸癌的防治。


圖1為BM-DC在TLR激動(dòng)劑刺激下分化成熟。圖2為BM-DC經(jīng)TLR激動(dòng)劑刺激后在體內(nèi)增強(qiáng)T細(xì)胞HPVl 1Ε7特異性細(xì)胞因
子分泌。圖3為BM-DC經(jīng)TLR激動(dòng)劑刺激后在體外增強(qiáng)T細(xì)胞HPVl 1Ε7特異性細(xì)胞因
子分泌。圖1-3中的每一個(gè)數(shù)據(jù)表示至少三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。圖中肽指HPV11E7CTL表位肽組。其中TNF-α指腫瘤壞死因子α，IFN-Y
指Y干擾素。Δ表示和對(duì)照組相比有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.05)?！硎竞投嚯慕M相比有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ρ < 0.05)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例1小鼠骨髓來源的HPVl 1Ε7多肽/DC混合疫苗的制備1)方法將小鼠脛骨和股骨的骨髓吹打成細(xì)胞懸液，加入氯化銨裂解紅細(xì)胞，用含 murine GM-CSF (10ng/ml)、muring IL-4 (lng/ml)及 10 %胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液 3ml/孔重懸后培養(yǎng)于六孔板。48小時(shí)后，棄去全部培養(yǎng)液，加2ml/孔培養(yǎng)液和細(xì)胞因 子。48小時(shí)后，收集全部細(xì)胞，重懸后分為5組，各加不同刺激劑共孵育48小時(shí)(1) 肽(20 μ g/ml)和咪喹莫特(2 μ g/ml)，(2)肽(20 μ g/ml)和 PIC (20 μ g/ml)，(3)肽 (20 μ g/ml)和 CpG (20 μ g/ml)，(4)肽(20 μ g/ml)，(5))空白對(duì)照(不加任何成分)， 其中TLR配體均為肽加入2小時(shí)之后再加入。2) DC形態(tài)觀察DC分離培養(yǎng)第3天時(shí)倒置顯微鏡下即可見DC呈典型的集落樣生長，經(jīng)第5天 加入抗原肽及TLR配體沖擊48小時(shí)后，于第7天倒置顯微鏡下可見DC懸浮生長，突觸 明顯增多，呈典型的樹突狀突起。實(shí)施例2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC的表面分子標(biāo)記變化的鑒定1)方法DC 培養(yǎng)的第 7 天，將 DC (1 X IO5 個(gè) /IOOul)與 FITC 標(biāo)記的鼠 CD40、CD80、CDllc和PE標(biāo)記的CD86、Iab抗體共孵育30分鐘后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。2)結(jié)果
經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，CDllc陽性細(xì)胞占81.3%。于第5天和第7天行流式細(xì)胞 儀分析DC表型，結(jié)果參見圖1，圖1是BM-DC與HPVl 1E7多肽及TLR激動(dòng)劑共同孵 育48小時(shí)后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面標(biāo)志CD40、CD80、CD86及MHCII(I_Ak)以
確定其成熟度。該結(jié)果提示僅用抗原肽沖擊后，DC成熟度均較未沖擊組稍有增高，但加入TLR 配體處理后，各處理組較對(duì)照組及抗原肽組均提高顯著，尤其以CD40和CD86較明顯。 其中CD40 咪喹莫特組和PIC組與肽組及對(duì)照組相比均有顯著差異(P < 0.05)CD86 咪喹莫特組、PIC組和CpG組與對(duì)照組相比均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P <0.05)，其中咪喹莫特組、PIC組與肽組相比亦有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P <0.05)。而CD80與MHC II(I-Ak)各組之間相比較均未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)施例3小鼠接種疫苗及免疫學(xué)特性觀察1)接種方法將5組不同處理后的DC用PBS洗至少2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為3X 105/200 μ 1/ 只，注射入小鼠腹腔(6只Χ5組)。之后每隔1周注射1次，共計(jì)注射3次。2)小鼠荷瘤的免疫治療模型方案(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))將小鼠用DC免疫3次，于第3次免疫后的第2天，在每只小鼠左側(cè)腹股溝皮下 接種Β16細(xì)胞(1Χ 105/200 μ1/只)。接種腫瘤后的第19天，處死全部小鼠，制備脾細(xì) 胞懸液，貼壁2小時(shí)后，收集懸浮細(xì)胞，用含mUringIL-2(20U/ml)和10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液重懸后培養(yǎng)于六孔板(約7X 106/ml)，每孔加入肽(20 μ g/ml)，以行 細(xì)胞因子的檢測(cè)。3)體外實(shí)驗(yàn)將HPV11E7CTL表位肽和TLR配體處理后的5組DC分別與未經(jīng)任何處理的小 鼠脾細(xì)胞(約2.1 X 1073ml/孔)以1 17混合培養(yǎng)。4)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞在體內(nèi)外分泌細(xì)胞因子水平(TNF- α和IFN_ Y )取脾細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后的培養(yǎng)液上清，用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞因子，具體 步驟參照試劑盒說明書(mTNF- α ELISA Kit, BIOSOURCE ； mIFN_ Y ELISA Kit, BIOSOURCE)，ELISA板在450nm處讀取，并參照標(biāo)準(zhǔn)曲線確定細(xì)胞因子的濃度。5)免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果a.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將各組小鼠處死，取脾細(xì)胞培養(yǎng)，并加入HPVl 1E7CTL表位肽刺激，48小時(shí)后 取小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平，結(jié)果參見圖2，圖2是用經(jīng)HPV11E7多 肽及TLR激動(dòng)劑刺激的BM-DC免疫小鼠，再用B16腫瘤細(xì)胞皮下荷瘤，然后分離脾臟 T細(xì)胞，與相應(yīng)多肽重新孵育后用ELISA測(cè)定細(xì)胞因子分泌情況。在分泌TNF- α水平上，PIC和CpG組顯著高于對(duì)照組(P < 0.05)，但與肽組相 比均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在分泌IFN-Y水平上，PIC、CpG和抗原肽組均顯著高于對(duì)照組 (P < 0.05),同時(shí)CpG組與抗原肽組相比亦有明顯差異(Ρ<0.05)。說明在促進(jìn)TNF-a分泌上，單用肽效果較微弱，但聯(lián)合PIC和CpG后效果即較為明顯，以CpG組為著，可 見PIC和CpG可上調(diào)肽促進(jìn)脾細(xì)胞TNF-α分泌的水平；而在促進(jìn)IFN_ Y分泌上，單用 肽即可見明顯促進(jìn)效果，聯(lián)用PIC后未見效果有明顯增加，但聯(lián)用CpG后發(fā)現(xiàn)，效果較 單用肽亦有明顯增加，因此，可見CpG可顯著上調(diào)肽促進(jìn)脾細(xì)胞IFN-Y分泌的水平。而 咪喹莫特組，在檢測(cè)TNF-α和IFN-Y的水平上，均未見明顯效果。B.體外實(shí)驗(yàn)將各不同處理組的DC與未經(jīng)任何處理小鼠的脾細(xì)胞混合培養(yǎng)，取培養(yǎng)48小時(shí) 后的上清行ELISA檢測(cè)，結(jié)果參見圖3，圖3是小鼠BM-DC用HPVl 1Ε7多肽及TLR激 動(dòng)劑刺激后，在體外與未處理的新鮮脾細(xì)胞共同孵育，再用ELISA測(cè)定細(xì)胞因子分泌情況。從分泌IFN- Y水平上看，咪喹莫特和CpG組效果較為明顯(P < 0.05)，同時(shí)在 分泌TNF-α水平上，咪喹莫特組效果仍較為明顯(P < 0.05)，其次以CpG組效果為較好。綜上所述，TLR配體與HPV11E7多肽聯(lián)合使用可促進(jìn)DC的成熟度，尤其聯(lián)用 CpG后可提高T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF- α和IFN_ Y的水平。因此認(rèn)為TLR9激動(dòng)劑 C pG對(duì)HPV11E7CTL表位肽在小鼠模型中的免疫應(yīng)答具有一定程度的上調(diào)作用，可作為 免疫佐劑以提高HPV11E7表位肽特異性的DC疫苗的免疫效應(yīng)。
權(quán)利要求
1.一種HPV多肽/DC混合疫苗，其特征在于，所述的混合疫苗由一份HPV11E77_15， 一份體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BM-DC)，一份TLR9激動(dòng)劑作為佐劑組 成。
2.—種HPV多肽/DC混合疫苗的制備方法，其特征在于，通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1)從小鼠骨髓提取樹突狀細(xì)胞(BM-DC)，進(jìn)一步體外培養(yǎng)；(2)先與免疫原性最強(qiáng)的一段HPVl1E7CTL表位肽HPVl 1E77_15，TLKDIVLDL共孵育；(3)再分別與TLR配體TLR9激動(dòng)劑共孵育；(4)檢測(cè)孵育后DC表面標(biāo)志改變以確認(rèn)其成熟度。
全文摘要
本發(fā)明提供一種TLR激動(dòng)劑在制備HPV多肽/DC混合疫苗，由一份HPV11E77-15，一份體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，一份TLR9激動(dòng)劑作為佐劑組成，通過從小鼠骨髓提取樹突狀細(xì)胞，進(jìn)一步體外培養(yǎng)，先與免疫原性最強(qiáng)的一段HPV11E7CTL表位肽共孵育，再分別與TLR配體CpG等共孵育，以促進(jìn)DC成熟，檢測(cè)孵育后DC表面標(biāo)志改變以確認(rèn)其成熟度，上述刺激成熟的DC疫苗可用于免疫小鼠。本發(fā)明將TLR配體與HPV11E7多肽聯(lián)合使用可促進(jìn)DC的成熟度，尤其聯(lián)用CpG后可提高T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的水平，可用于尖銳濕疣和宮頸癌的防治。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102008721SQ20101054739
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月16日
發(fā)明者劉倫飛, 周強(qiáng), 張巍巍, 朱可建, 王建有, 程浩, 茅曉紅, 陳賢禎 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)