專利名稱：乙型腦炎病毒疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種經(jīng)人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)制備的乙型腦炎病毒疫苗。具體而言，本發(fā)明涉及一種將乙型腦炎病毒接種于人二倍體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)馴化、適應(yīng)和擴(kuò)增工藝處理，乙型腦炎病毒在人二倍體細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，再經(jīng)濃縮、純化配制成一種乙型腦炎病毒疫苗。這種病毒疫苗可以預(yù)防嬰幼兒、兒童、青少年及成人因乙型腦炎病毒感染引起的乙型腦炎疾病。本發(fā)明還涉及這種病毒疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
乙型腦炎是中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性病毒感染的傳染性疾病，在流行地區(qū)年發(fā)病率高達(dá)10～100/10萬(wàn)，近30億人口生活在乙型腦炎流行區(qū)，該地區(qū)每年新生兒就超過(guò)7,000萬(wàn)。在亞洲的病毒性腦炎中，乙型腦炎是最嚴(yán)重的疾病。每年至少引起50,000臨床病例和10,000例病死，絕大多數(shù)發(fā)生于兒童中。在最近幾十年中，乙型腦炎的數(shù)起暴發(fā)流行越來(lái)越向曾經(jīng)是非流行的地區(qū)擴(kuò)大，同時(shí)伴隨很高的病死率和嚴(yán)重的持久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，因而在亞洲很多國(guó)家和地區(qū)，乙型腦炎成為嚴(yán)重地公共健康問(wèn)題。
流行性乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)簡(jiǎn)稱乙腦病毒，病毒顆粒呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑45-50nm，病毒顆粒由核心、包膜和刺突組成，屬黃病毒的一種?；?yàn)檎渾喂蒖NA，RNA包被于多肽的衣殼C中，組成病毒顆粒的核心。其包膜中有糖基化蛋白E和非糖基化蛋白prM/M。
在乙型腦炎傳染途徑中蚊子是乙腦病毒的主要傳播媒介，豬是主要中間宿主，人因被帶毒的蚊蟲叮咬而感染。目前還沒(méi)有治療乙型腦炎疾病的特效藥物，從環(huán)境方面控制其傳播的效果不理想。乙型腦炎疫苗的免疫接種是控制乙型腦炎疾病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施。
乙型腦炎疫苗有3類在大規(guī)模應(yīng)用，經(jīng)鼠腦組織培養(yǎng)制備的滅活疫苗、地鼠腎原代細(xì)胞或Vero細(xì)胞培養(yǎng)制備的滅活疫苗和地鼠腎原代細(xì)胞培養(yǎng)制備的減毒活疫苗。
由于乙型腦炎疫苗基礎(chǔ)免疫始于6月齡的健康嬰幼兒，這就要求疫苗首先必須要保證有足夠的安全為前提條件。上述乙型腦炎疫苗無(wú)論采用何種培養(yǎng)體系，均是經(jīng)動(dòng)物源性的組織或動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制成。這些疫苗的缺點(diǎn)在于首先，無(wú)法徹底去除動(dòng)物源性外源因子的污染。其次，無(wú)法進(jìn)一步增加抗原含量從而在人體中產(chǎn)生更高的免疫應(yīng)答反應(yīng)、提供更高、更久的免疫保護(hù)。其原因?yàn)槿邕M(jìn)一步增加病毒抗原含量時(shí)，伴隨的動(dòng)物源性物質(zhì)如雜蛋白、核酸及脂質(zhì)等也隨之增加，引起嚴(yán)重的超敏反應(yīng)，因此疫苗副反應(yīng)就加大。例如，經(jīng)鼠腦組織培養(yǎng)的滅活疫苗以疼痛、發(fā)紅、腫脹的局部副反應(yīng)約為20％，包括頭疼、發(fā)熱、肌痛、不適和胃腸道癥狀的全身性反應(yīng)為10～30％。1989年和1990年在丹麥及澳大利亞還分別發(fā)現(xiàn)31例和7例蕁麻疹和血管性水腫的嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)。經(jīng)地鼠腎原代細(xì)胞培養(yǎng)的滅活疫苗超過(guò)38℃的發(fā)熱高達(dá)12％，在減少了牛血清殘留量后，超過(guò)38℃的發(fā)熱減至6％(Tsai，Theodore F，Japanese encephalitis vaccines，http://www.cdc.gov.publication date01/01/1990)。而減毒活疫苗是用非清潔級(jí)地鼠腎原代細(xì)胞作為疫苗培養(yǎng)基質(zhì)，這難以避免鼠源的外源因子的污染，這種可能造成的污染又是難以用現(xiàn)行生物學(xué)方法檢出。因此，不能為世界衛(wèi)生組織疫苗制造檢定規(guī)程所接納(迮文遠(yuǎn)，計(jì)劃免疫學(xué)，上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2001年，484頁(yè))。雖然用Vero細(xì)胞培養(yǎng)制備的滅活疫苗的安全性有了顯著性提高，但Vero細(xì)胞超過(guò)232代次后在裸鼠體內(nèi)有致瘤現(xiàn)象(Levenbook IS，etal，Tumorigenicity of vero cells.J Biol Stand 1984 Oct；12(4)391-8)。因此，美國(guó)FDA要求用Vero細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗，生產(chǎn)過(guò)程中要有去除細(xì)胞的工藝，必須要保證成品中無(wú)殘余的細(xì)胞(FDA letterto vaccine manufacturers concerning the use of Vero cells.http://www.fda.gov/cber/letters.htm)。
鑒于上述原因，需要對(duì)現(xiàn)有乙型腦炎病毒疫苗細(xì)胞系進(jìn)行革命性地改造，尋找新的病毒培養(yǎng)細(xì)胞系，避免上述鼠腦組織、地鼠腎原代細(xì)胞和Vero細(xì)胞系存在的安全隱患，制備出能滿足始于嬰幼兒接種的乙型腦炎疫苗。
已證實(shí)，源于人的二倍體細(xì)胞由于其來(lái)源是相當(dāng)清楚，包括捐獻(xiàn)者的年齡、性別、種族、地域、體能及健康狀況、細(xì)胞直接來(lái)源的組織或器官、細(xì)胞世代數(shù)等。人二倍體細(xì)胞系經(jīng)過(guò)數(shù)十年的研究，其生長(zhǎng)特性、遺傳穩(wěn)定的特性、外源因子(細(xì)菌、真菌、支原體及病毒)污染檢查、致腫瘤陰性等特性被充分驗(yàn)證。更為重要的是人二倍體細(xì)胞本身是源于人體的細(xì)胞，當(dāng)用于疫苗制造時(shí)人二倍體細(xì)胞的殘余成分不會(huì)成為超敏反應(yīng)原，基本不會(huì)引起接種者超敏反應(yīng)。因此，從質(zhì)量控制的角度看，相比較于上述鼠腦組織、地鼠腎原代細(xì)胞和Vero細(xì)胞系，人二倍體細(xì)胞沒(méi)有潛在的不安全隱患，是制備疫苗理想的細(xì)胞系。
進(jìn)一步證實(shí)，用人二倍體細(xì)胞系制備疫苗已經(jīng)得到越來(lái)越多的應(yīng)用，例如用MRC-5和/或WI-38細(xì)胞系制備的風(fēng)疹病毒疫苗、用MRC-5細(xì)胞系制備的甲肝病毒疫苗、用FrhL-2細(xì)胞系制備的輪狀病毒疫苗、用MRC-5細(xì)胞系制備的水痘病毒疫苗、國(guó)際上公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)狂犬病疫苗也是人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)疫苗。因此，用人二倍體細(xì)胞制備乙型腦炎病毒疫苗能顯著性地提高現(xiàn)行乙型腦炎病毒疫苗的質(zhì)量。
本發(fā)明的核心內(nèi)容是，采用人二倍體細(xì)胞系作為乙型腦炎病毒培養(yǎng)繁殖的細(xì)胞基質(zhì)，同時(shí)將乙型腦炎病毒在人二倍體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行馴化適應(yīng)，并且病毒和細(xì)胞均有良好的穩(wěn)定性，進(jìn)而制備成乙型腦炎病毒疫苗。
綜上所述，本發(fā)明的乙型腦炎病毒疫苗重點(diǎn)解決了，用人二倍體細(xì)胞替代鼠腦組織、地鼠腎原代細(xì)胞和Vero細(xì)胞進(jìn)行乙型腦炎病毒培養(yǎng)，再進(jìn)一步制成疫苗。用人二倍體細(xì)胞制備的疫苗可顯著性地降低疫苗副反應(yīng)尤其是過(guò)敏反應(yīng)和動(dòng)物源性病毒的危害，去除潛在的安全性隱患，保證了疫苗在兒童和青少年和非疫區(qū)的成人中使用的安全性。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種新的乙型腦炎病毒疫苗及其制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種乙型腦炎病毒疫苗，其特征在于，該疫苗所含的乙型腦炎病毒抗原是乙型腦炎病毒經(jīng)人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)、繁殖、純化、提取獲得的。所述的乙型腦炎病毒疫苗是滅活疫苗，也包括減毒活疫苗、裂解疫苗和/或亞單位疫苗和與其它疫苗的聯(lián)合疫苗。
所述的乙型腦炎病毒疫苗是由乙型腦炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株、Nakayama株和乙腦病毒的其它分離株中任一株制備的。
所述的人二倍體細(xì)胞是2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL細(xì)胞系中的任一株。
本發(fā)明還涉及一種將乙型腦炎病毒馴化、適應(yīng)和擴(kuò)增于人二倍體細(xì)胞的方法。
換言之，本發(fā)明提供了將乙型腦炎病毒接種于人二倍體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)馴化、適應(yīng)和擴(kuò)增工藝處理，乙型腦炎病毒在人二倍體細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，再經(jīng)滅活、濃縮、純化配制成一種乙型腦炎病毒疫苗。本發(fā)明還提供了乙型腦炎病毒在人二倍體細(xì)胞內(nèi)馴化、適應(yīng)和擴(kuò)增的方法。這種用人二倍體細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗可以分別預(yù)防嬰幼兒、兒童、青少年及成人因乙型腦炎病毒感染引起的乙型腦炎疾病。
本發(fā)明中重點(diǎn)引入的概念和方法是對(duì)現(xiàn)行的乙型腦炎病毒疫苗進(jìn)行改造和升級(jí)使之達(dá)到更好的安全性和免疫效果。本發(fā)明是將人二倍體細(xì)胞替代鼠腦組織、地鼠腎原代細(xì)胞和Vero細(xì)胞用于乙型腦炎病毒培養(yǎng)，收獲的病毒液經(jīng)滅活、濃縮、純化后經(jīng)配制成為乙型腦炎病毒疫苗。這種用人二倍體細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗，除含有作為免疫原性的病毒抗原存在外，不含任何源于動(dòng)物組織或動(dòng)物細(xì)胞的殘余成分，從根本上排除了引起超敏反應(yīng)的動(dòng)物蛋白、核酸及脂質(zhì)等。由于安全性顯著性地提高，進(jìn)一步使得疫苗可以提高免疫劑量，增加疫苗保護(hù)效力，從而能克服現(xiàn)行的乙型腦炎病毒商品疫苗具有的免疫局限性及接種后的不良反應(yīng)。
本發(fā)明所用乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)毒種購(gòu)買于中國(guó)藥品生物制品檢定所。毒種名稱為SA14、SA14-14-2、P3、Nakayama。中國(guó)藥品生物制品檢定所負(fù)責(zé)制備和發(fā)放上述病毒毒種。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，乙型腦炎病毒培養(yǎng)可采用上述毒種SA14、SA14-14-2、P3、Nakayama中的任何一株。如果滿足需要，也可采用其它合適的毒種，此處給出的毒種僅僅是為了例示性說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明的乙型腦炎病毒培養(yǎng)體系是人二倍體細(xì)胞2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL細(xì)胞系中的任一株。如果滿足需要，也可采用其它合適的人二倍體細(xì)胞，此處給出的細(xì)胞僅僅是為了例示性說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明提供了將乙型腦炎病毒馴化、適應(yīng)和擴(kuò)增于人二倍體細(xì)胞的方法。具體而言，乙腦病毒在人二倍體細(xì)胞內(nèi)的病毒滴度逐漸提高，≥7.5lgPFU/ml，并趨向于穩(wěn)定。
本發(fā)明的乙型腦炎病毒疫苗每劑量為含有病毒蛋白5～90μg。至于用量的上限，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)疫苗人體臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)而最終確定。
本發(fā)明的人二倍體細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗具有良好的免疫原性，并且中和抗體滴度≥地鼠腎細(xì)胞和Vero細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗。
本發(fā)明的人二倍體細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗具有良好的保護(hù)效力，并且效力中和指數(shù)高于地鼠腎細(xì)胞和Vero細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗。
本發(fā)明的乙型腦炎病毒疫苗可以和A、C群腦膜炎球菌多糖與一蛋白載體偶聯(lián)形成的結(jié)合疫苗組成乙腦—流腦聯(lián)合疫苗。
本發(fā)明的乙型腦炎病毒疫苗還可進(jìn)一步和其它疫苗組成聯(lián)合疫苗，如無(wú)細(xì)胞百白破疫苗—滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗—Hib疫苗—乙型肝炎疫苗—腦膜炎球菌結(jié)合疫苗—乙型腦炎病毒疫苗，麻疹—乙腦聯(lián)合疫苗、麻疹—風(fēng)疹—腮腺炎—乙腦聯(lián)合疫苗、黃熱—乙腦聯(lián)合疫苗等。
本發(fā)明提供一種乙型腦炎病毒疫苗的制備方法，該疫苗在制備過(guò)程中病毒培養(yǎng)所用的細(xì)胞系是人二倍體細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中所述的人二倍體細(xì)胞系選自2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL細(xì)胞系中的任一株。而且所述的乙型腦炎病毒疫苗可以是滅活疫苗，而滅活疫苗是由乙型腦炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株或其它分離的乙型腦炎病毒株中任一株制備的。所述的乙型腦炎病毒疫苗也可以是減毒活疫苗、純化疫苗、裂解疫苗/或亞單位疫苗。
另外所述的乙型腦炎病毒疫苗還可以是與其它疫苗的聯(lián)合疫苗，包括麻疹—乙腦聯(lián)合疫苗、乙腦—流腦聯(lián)合疫苗、麻疹—風(fēng)疹—腮腺炎—乙腦聯(lián)合疫苗、黃熱—乙腦聯(lián)合疫苗。
經(jīng)過(guò)本發(fā)明的方法能夠制備出更高免疫原性和效力、更安全、更易被接種者接受的一種乙型腦炎病毒疫苗。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例描述本發(fā)明，將乙型腦炎病毒在人二倍體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行馴化、適應(yīng)和擴(kuò)增，將收獲的病毒液進(jìn)行濃縮和純化，再經(jīng)適當(dāng)配制成乙型腦炎病毒疫苗。用二倍體細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室檢定證實(shí)該種疫苗具有可靠的安全性和優(yōu)良的免疫原性及卓越的保護(hù)效力。
實(shí)施例1
人二倍體細(xì)胞的制備
人二倍體細(xì)胞的制備以MRC-5為例細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM(也可用其它適宜的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液如MEM、199培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基等)，加入4～10％的胎牛血清(無(wú)外源因子污染)和濃度100～200U/ml的卡那霉素(或慶大霉素)，調(diào)pH至7.0～8.0之間。細(xì)胞用柯氏瓶或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)于35～37℃，4～8天后培養(yǎng)成致密的單層細(xì)胞后，以1∶2的比例擴(kuò)增，直到擴(kuò)增生產(chǎn)批用量時(shí)，經(jīng)過(guò)3～5天培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)成致密的單層細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液。并用pH7.0～8.0的磷酸鹽緩沖液淋洗細(xì)胞表面，洗掉殘留的牛血清。準(zhǔn)備用于病毒的接種。
實(shí)施例2
乙型腦炎病毒在人二倍體細(xì)胞內(nèi)馴化、適應(yīng)和擴(kuò)增
以人二倍體細(xì)胞以MRC-5為例由于乙腦病毒在人二倍體細(xì)胞內(nèi)的病毒繁殖滴度較低，因此必須將乙腦病毒逐漸在人二倍體細(xì)胞內(nèi)馴化、適應(yīng)。將乙腦病毒P3株(或SA14等其它病毒株)接種于已長(zhǎng)滿單層的人二倍體細(xì)胞內(nèi)，于30～37℃繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到50～70％時(shí)收獲細(xì)胞上清液，即為在人二倍體細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的乙腦病毒液。依次進(jìn)行一代一代適應(yīng)。當(dāng)收獲的乙腦病毒液中的乙腦病毒滴度達(dá)到7.5lgPFU/ml以上時(shí)即作為用于乙腦疫苗生產(chǎn)用的種子病毒。按《中國(guó)生物制品規(guī)程》(化學(xué)工業(yè)出版社，2000年)要求經(jīng)各項(xiàng)試驗(yàn)檢測(cè)合格后即可用于疫苗的生產(chǎn)制備。
實(shí)施例3
乙型腦炎病毒在人二倍體細(xì)胞內(nèi)傳代穩(wěn)定性
按實(shí)施例2的試驗(yàn)步驟依次進(jìn)行，可觀察到乙腦病毒在人二倍體細(xì)胞內(nèi)的病毒滴度逐漸提高，≥7.5lgPFU/ml，并趨向于穩(wěn)定，各代次的病毒滴度見(jiàn)表1。
表1.乙型腦炎病毒在人二倍體細(xì)胞內(nèi)傳代穩(wěn)定性
實(shí)施例4
乙型腦炎病毒滅活疫苗制備
按實(shí)施例1制備人二倍體細(xì)胞，依實(shí)施例3制備疫苗生產(chǎn)用的病毒種子。依實(shí)施例3選擇病毒滴度達(dá)到疫苗生產(chǎn)要求的代次為疫苗生產(chǎn)用工作種子。將用磷酸鹽緩沖液淋洗過(guò)的細(xì)胞以MOI為0.1～0.00001的比例接種乙腦病毒于人二倍體細(xì)胞中。細(xì)胞維持液為含0.1～0.5％的人血白蛋白的DMEM細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，pH7.0～8.0之間。30～37℃培養(yǎng)，3天后收獲病毒上清液。(如用微載體培養(yǎng)可連續(xù)收獲)收獲后的病毒液病毒滴度達(dá)到7.5lgpfu/ml以上，無(wú)菌試驗(yàn)檢測(cè)陰性，可將收獲后的病毒液做適當(dāng)合并。合并后的液體為疫苗原液。加入適當(dāng)滅活劑1∶2000的甲醛溶液(或1∶4000的β-丙內(nèi)酯，或其它適宜的滅活劑，此處僅為示例)。滅活病毒后得到粗制疫苗。再用截留量10～30萬(wàn)分子量的超濾器濃縮疫苗10～50倍，進(jìn)行離子交換柱(DEAE-SepharoseFF)和凝膠過(guò)濾柱(Sepharose 4FF)經(jīng)二步柱層析，得到純化疫苗。加入人白保護(hù)劑，稀釋后即可制成疫苗。
實(shí)施例5
乙型腦炎病毒疫苗的安全性試驗(yàn)
對(duì)人二倍體細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗的安全性進(jìn)行考核，分別采用小鼠、豚鼠異常毒性試驗(yàn)考核其安全性。選用體重250～350g的清潔級(jí)豚鼠，每種疫苗用2只豚鼠，每只腹腔注射5.0ml的乙型腦炎病毒疫苗，分別于注射前、注射后7天稱體重，并隨時(shí)觀察疫苗接種后反應(yīng)。選用體重18～20g的清潔級(jí)小鼠，用5只小鼠，每只腹腔注射0.5ml的乙型腦炎病毒疫苗，分別于注射前、注射后7天稱體重，并隨時(shí)觀察疫苗接種后反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果列于表2。
表2.乙型腦炎病毒疫苗安全性試驗(yàn)
動(dòng)物安全性試驗(yàn)表明，用人二倍體細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗中沒(méi)有不安全急性毒性因素，可以保證人體使用的安全。
實(shí)施例6
乙型腦炎病毒疫苗的免疫原性試驗(yàn)比較
每種疫苗選12～14g小鼠20只，每只腹腔免疫0.5ml，免疫兩次，間隔7天。初免15天采血，2～8℃過(guò)夜。次日分離血清，56℃30分鐘滅活。用蝕斑減少中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定中和抗體滴度。乙型腦炎中和病毒株為SA14和P3株。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
表3.乙型腦炎病毒疫苗中和抗體滴度試驗(yàn)
中和抗體滴度試驗(yàn)表明人二倍體細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗具有良好的免疫原性，并且中和抗體滴度≥地鼠腎細(xì)胞和Vero細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗。
實(shí)施例6
乙型腦炎病毒疫苗的保護(hù)效力試驗(yàn)比較
采用免疫小白鼠中和抗體測(cè)定法。中和抗體測(cè)定采用蝕斑減少試驗(yàn)。參考疫苗(RA和RB)及中和試驗(yàn)陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。將待測(cè)疫苗和參考疫苗(R)均分別稀釋1∶32，分別腹腔免疫體重12～14g小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，間隔7天。第2次免疫后7天采血，分離血清，同組小鼠血清等量混合，于56℃滅活30分鐘，稀釋血清、分別與稀釋好的病毒(約200PFU/0.4ml)等量混合。同時(shí)將稀釋好的病毒再1∶2稀釋，作為病毒對(duì)照，置37℃水浴作用90分鐘，接種6孔板BHK21細(xì)胞，每孔0.4ml，37℃培養(yǎng)90分鐘，加入甲基纖維素的培養(yǎng)基覆蓋物，于CO2孵箱中培養(yǎng)5天，染色，蝕斑計(jì)數(shù)，計(jì)算蝕斑減少率。病毒對(duì)照組的蝕斑平均數(shù)應(yīng)在50～150之間，合格判定標(biāo)準(zhǔn)為T≥(RA+RB)/2-0.33，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
表4.乙型腦炎病毒疫苗保護(hù)效力試驗(yàn)
效力試驗(yàn)表明人二倍體細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗具有良好的保護(hù)效力，并且效力中和指數(shù)高于地鼠腎細(xì)胞和Vero細(xì)胞制備的乙型腦炎病毒疫苗。
權(quán)利要求
1、一種經(jīng)人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)制備的乙型腦炎病毒疫苗，其特征在于，該疫苗在制備過(guò)程中病毒培養(yǎng)所用的細(xì)胞系是人二倍體細(xì)胞。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型腦炎病毒疫苗，其特征在于，所述的乙型腦炎病毒疫苗在制備過(guò)程中病毒培養(yǎng)所用的人二倍體細(xì)胞系是2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL細(xì)胞系中的任一株。
3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型腦炎病毒疫苗，其特征在于，所述的乙型腦炎病毒疫苗是滅活疫苗。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型腦炎病毒疫苗，其特征在于，所述的乙型腦炎病毒疫苗還可是減毒活疫苗、純化疫苗、裂解疫苗/或亞單位疫苗。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型腦炎病毒疫苗，其特征在于，所述的乙型腦炎病毒疫苗還可和與其它疫苗的聯(lián)合疫苗，例如麻疹—乙腦聯(lián)合疫苗、乙腦—流腦聯(lián)合疫苗、麻疹—風(fēng)疹—腮腺炎—乙腦聯(lián)合疫苗、黃熱—乙腦聯(lián)合疫苗等。
6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的乙型腦炎病毒疫苗，其特征在于，所述的滅活疫苗是由乙型腦炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株或其它分離的乙型腦炎病毒株中任一株制備的。
7、一種乙型腦炎病毒疫苗的制備方法，其特征在于，該疫苗在制備過(guò)程中病毒培養(yǎng)所用的細(xì)胞系是人二倍體細(xì)胞。
8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的乙型腦炎病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述的人二倍體細(xì)胞系選自2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL細(xì)胞系中的任一株。
9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的乙型腦炎病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述的乙型腦炎病毒疫苗是滅活疫苗。
10、根據(jù)權(quán)利要求7所述的乙型腦炎病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述的乙型腦炎病毒疫苗是減毒活疫苗、純化疫苗、裂解疫苗/或亞單位疫苗。
11、根據(jù)權(quán)利要求7所述的乙型腦炎病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述的乙型腦炎病毒疫苗是與其它疫苗的聯(lián)合疫苗，包括麻疹—乙腦聯(lián)合疫苗、乙腦—流腦聯(lián)合疫苗、麻疹—風(fēng)疹—腮腺炎—乙腦聯(lián)合疫苗、黃熱—乙腦聯(lián)合疫苗。
12、根據(jù)權(quán)利要求9所述的乙型腦炎病毒疫苗，其特征在于，所述的滅活疫苗是由乙型腦炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株或其它分離的乙型腦炎病毒株中任一株制備的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乙型腦炎病毒疫苗及其制備方法，包括將乙型腦炎病毒接種于人二倍體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)馴化、適應(yīng)和擴(kuò)增工藝處理，乙型腦炎病毒在人二倍體細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，再經(jīng)濃縮、純化配制成一種乙型腦炎病毒疫苗。這種乙型腦炎病毒疫苗可以預(yù)防嬰幼兒、兒童、青少年及成人因乙型腦炎病毒感染引起的乙型腦炎疾病。
文檔編號(hào)A61K39/12GK1695736SQ200410037948
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2004年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月14日
發(fā)明者薛平 申請(qǐng)人:薛平